JP2006180878A - 呼吸器感染に関連したウイルスに特異的な核酸プライマーセットおよびプローブオリゴヌクレオチド - Google Patents
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Abstract
【解決手段】配列番号1〜配列番号26の配列に存在する10個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチドから選択される5種以上の呼吸器疾患を引き起こすウイルスの標的配列を同時に増幅させることができる核酸プライマーセット、該増幅された産物を検出するためのプローブオリゴヌクレオチド、該プライマーセットおよび該プローブオリゴヌクレオチドを利用したウイルスの同時検出方法である。
【選択図】図1
Description
本実施例では、13種のウイルス、すなわちはしかウイルス、エンテロウイルス、ライノウイルス、SARS−coV、VZV、アデノウイルス、HPIV1、HPIV2、HPIV3、IVA、IVB、RSVAおよびRSVBに特異的な標的配列を検出できるプライマーセットを設計した。
本実施例では、13種の呼吸器疾患と関連したウイルスを培養し、それらからゲノムを分離した後、配列番号1〜配列番号26のプライマーセットをプライマーとして使用した多重RT−PCRを行い、その産物をアガロースゲル上で確認した。
各ウイルスDNAゲノムは、50μl培養溶液に5N NaOH5.5μlを添加して最終濃度を0.5Nに調整した後、37℃で15分間変成させ、5N HClを5.5μl入れて中和させた後、H2Oで希釈した。ウイルスのRNAゲノムは、約600μlのTriZol−試薬を使用し、200μlの細胞上澄み液から分離した。エタノールで沈殿された最終沈殿物は、ジエチルピロカーボネート(DEPC)蒸溜水に再懸濁して−20℃に保管するか、または直ちにRT−PCRに使用した。
前記得られた13種のウイルス由来核酸試料をテンプレートとして、ヘキサマーやオリゴdTプライマーを使用してcDNAを合成し、反応は5×バッファ3、0.5μl RNase阻害剤0.5μl、dNTP 3μl、ランダムヘキサマー、スーパースクリプトII RTase(逆転写酵素)0.5μl、RNA 5μlを使用し、最終体積をDEPC処理蒸溜水を使用して15μlに調整し、37℃で40分、42℃で90分間反応させた後、95℃で5分間酵素を不活性化にした。前記cDNA10μl、dNTP4μl、配列番号1〜配列番号26を含むプライマーをそれぞれ1μl(20pmol/μl)ずつ、Taqポリメラーゼ0.5μlを含むPCR反応混合液を94℃で30秒、55℃で30秒、70℃で30秒の熱サイクルを30回行い、ウイルスゲノムから標的配列を増幅した。
得られたPCR産物をアガロースゲル上で電気泳動によって確認した。図1は、配列番号1〜配列番号26のプライマーセットを利用して多重PCRを介して標的核酸を増幅し、その増幅産物をアガロースゲル上で電気泳動した結果を表す図面代替写真である。図1に表したように、13個の標的配列を確認することができ、それは、多重PCR中で配列番号1〜配列番号26のプライマーセットは、相互標的配列特異性に影響を及ぼさないということを表す。図1で、各PCR産物の長さは、下記表2に表した通りである。
本実施例では、実施例2で増幅された増幅産物をマイクロアレイ上に固定化されているプローブとハイブリダイズさせ、そのハイブリダイゼーションの程度を検出することにより、特定のウイルス種から増幅された増幅産物の存否を確認した。
DNASTARプログラムを利用して各ウイルスゲノム増幅された領域からプローブを選択し、その配列は表3に表した通りである。
本実施例に使われるマイクロアレイは、アミン化合物で活性化された基板上に配列番号27〜配列番号50のプローブオリゴヌクレオチドを添加し、50℃で30分間反応させることによって固定化した。得られたマイクロアレイに、前記のような13種の各ウイルスから増幅された核酸が含まれている試料を前記ウイルスに特異的なオリゴヌクレオチドが固定化されているスポットに添加し、16℃で12時間ハイブリダイゼーション反応を行った。
ハイブリダイゼーション反応後、洗浄バッファで洗浄した後、540nmで蛍光を測定した。図2は、配列番号27〜配列番号50のプローブオリゴヌクレオチドが固定化されているマイクロアレイに標的増幅産物をハイブリダイズさせた結果を表す図面代替写真である。
Claims (13)
- 配列番号1の配列に存在する10個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチドから構成される群から選択され、長さが10bp〜100bpであるオリゴヌクレオチドおよび配列番号2の配列に存在する10個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチドから構成される群から選択され、長さが10bp〜100bpであるオリゴヌクレオチドと、
配列番号3の配列に存在する10個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチドから構成される群から選択され、長さが10bp〜100bpであるオリゴヌクレオチドおよび配列番号4の配列に存在する10個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチドから構成される群から選択され、長さが10bp〜100bpであるオリゴヌクレオチドと、
配列番号5の配列に存在する10個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチドから構成される群から選択され、長さが10bp〜100bpであるオリゴヌクレオチドおよび配列番号6の配列に存在する10個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチドから構成される群から選択され、長さが10bp〜100bpであるオリゴヌクレオチドと、
配列番号7の配列に存在する10個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチドから構成される群から選択され、長さが10bp〜100bpであるオリゴヌクレオチドおよび配列番号8の配列に存在する10個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチドから構成される群から選択され、長さが10bp〜100bpであるオリゴヌクレオチドと、
配列番号9の配列に存在する10個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチドから構成される群から選択され、長さが10bp〜100bpであるオリゴヌクレオチドおよび配列番号10の配列に存在する10個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチドから構成される群から選択され、長さが10bp〜100bpであるオリゴヌクレオチドと、
から構成される群から選択される一つ以上の核酸プライマーセット。 - 配列番号11の配列に存在する10個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチドから構成される群から選択され、長さが10bp〜100bpであるオリゴヌクレオチドおよび配列番号12の配列に存在する10個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチドから構成される群から選択され、長さが10bp〜100bpであるオリゴヌクレオチドと、
配列番号13の配列に存在する10個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチドから構成される群から選択され、長さが10bp〜100bpであるオリゴヌクレオチドおよび配列番号14の配列に存在する10個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチドから構成される群から選択され、長さが10bp〜100bpであるオリゴヌクレオチドと、
配列番号15の配列に存在する10個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチドから構成される群から選択され、長さが10bp〜100bpであるオリゴヌクレオチドおよび配列番号16の配列に存在する10個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチドから構成される群から選択され、長さが10bp〜100bpであるオリゴヌクレオチドと、
配列番号17の配列に存在する10個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチドから構成される群から選択され、長さが10bp〜100bpであるオリゴヌクレオチドおよび配列番号18の配列に存在する10個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチドから構成される群から選択され、長さが10bp〜100bpであるオリゴヌクレオチドと、
配列番号19の配列に存在する10個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチドから構成される群から選択され、長さが10bp〜100bpであるオリゴヌクレオチドおよび配列番号20の配列に存在する10個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチドから構成される群から選択され、長さが10bp〜100bpであるオリゴヌクレオチドと、
配列番号21の配列に存在する10個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチドから構成される群から選択され、長さが10bp〜100bpであるオリゴヌクレオチドおよび配列番号22の配列に存在する10個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチドから構成される群から選択され、長さが10bp〜100bpであるオリゴヌクレオチドと、
配列番号23の配列に存在する10個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチドから構成される群から選択され、長さが10bp〜100bpであるオリゴヌクレオチドおよび配列番号24の配列に存在する10個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチドから構成される群から選択され、長さが10bp〜100bpであるオリゴヌクレオチド、または配列番号25の配列に存在する10個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチドから構成される群から選択され、長さが10bp〜100bpであるオリゴヌクレオチドおよび配列番号26の配列に存在する10個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチドから構成される群から選択され、長さが10bp〜100bpであるオリゴヌクレオチドと、
から構成される群から選択される一つ以上のプライマーセットをさらに含む請求項1に記載の核酸プライマーセット。 - 試料から核酸を得るステップと、
請求項1または2に記載の核酸プライマーセットを利用して前記核酸を増幅するステップと、
前記増幅産物を検出するステップとを含み、標的ウイルスに特異的な増幅産物が存在する場合に、前記標的ウイルスが存在することが決定されることを特徴とする、ウイルスの検出方法。 - 前記試料から核酸を得るステップは、
試料からRNAを分離するステップと、
分離されたRNAからcDNAを得るステップと、
を含むことを特徴とする請求項3に記載の方法。 - 前記増幅するステップは、PCRによって行われることを特徴とする請求項3に記載の方法。
- 前記検出するステップは、前記増幅産物をプローブとハイブリダイズさせてハイブリダイゼーションの程度を検出するステップを含み、前記プローブは、配列番号27〜配列番号50の配列に存在する10個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチドおよびそれに相補的なオリゴヌクレオチドからなる群から選択される長さが10bp〜100bpである一つ以上のオリゴヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項3に記載の方法。
- 前記プローブは、配列番号27または28の配列に存在する10個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチドおよびそれに相補的なオリゴヌクレオチドであって、長さが10bp〜100bpである一つ以上のオリゴヌクレオチドと、
配列番号29または30の配列に存在する10個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチドおよびそれに相補的なオリゴヌクレオチドであって、長さが10bp〜100bpである一つ以上のオリゴヌクレオチドと、
配列番号31または32の配列に存在する10個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチドおよびそれに相補的なオリゴヌクレオチドであって、長さが10bp〜100bpである一つ以上のオリゴヌクレオチドと、
配列番号33または34の配列に存在する10個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチドおよびそれに相補的なオリゴヌクレオチドであって、長さが10bp〜100bpである一つ以上のオリゴヌクレオチドと、
配列番号35または36の配列に存在する10個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチドおよびそれに相補的なオリゴヌクレオチドであって、長さが10bp〜100bpである一つ以上のオリゴヌクレオチドと、
配列番号37または38の配列に存在する10個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチドおよびそれに相補的なオリゴヌクレオチドであって、長さが10bp〜100bpである一つ以上のオリゴヌクレオチドと、
配列番号39または40の配列に存在する10個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチドおよびそれに相補的なオリゴヌクレオチドであって、長さが10bp〜100bpである一つ以上のオリゴヌクレオチドと、
配列番号41または42の配列に存在する10個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチドおよびそれに相補的なオリゴヌクレオチドと、
配列番号43または44の配列に存在する10個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチドおよびそれに相補的なオリゴヌクレオチドであって、長さが10bp〜100bpである一つ以上のオリゴヌクレオチドと、
配列番号45または46の配列に存在する10個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチドおよびそれに相補的なオリゴヌクレオチドであって、長さが10bp〜100bpである一つ以上のオリゴヌクレオチドと、
配列番号47または48の配列に存在する10個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチドおよびそれに相補的なオリゴヌクレオチドであって、長さが10bp〜100bpである一つ以上のオリゴヌクレオチドと、
配列番号49または50の配列に存在する10個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチドおよびそれに相補的なオリゴヌクレオチドであって、長さが10bp〜100bpである一つ以上のオリゴヌクレオチドと、
から構成される群から選択される一つ以上のオリゴヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項6に記載の方法。 - 前記プローブは、配列番号27〜配列番号50のオリゴヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項6に記載の方法。
- 前記プローブは、マイクロアレイの基板上に固定化されていることを特徴とする請求項6〜8のいずれか1項に記載の方法。
- 配列番号27〜配列番号50の配列に存在する10個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチドおよびそれに相補的なオリゴヌクレオチドからなる群から選択される長さが10bp〜100bpである一つ以上のオリゴヌクレオチドを含む、はしかウイルス、エンテロウイルス、ライノウイルス、SARS関連コロナウイルス(SARS−coV)、ヘルペス・ゾスターウイルス(VZV)、アデノウイルス、ヒトパラインフルエンザウイルス1(HPIV1)、ヒトパラインフルエンザウイルス2(HPIV2)、ヒトパラインフルエンザウイルス3(HPIV3)、インフルエンザウイルスA(IVA)、インフルエンザウイルスB(IVB)、呼吸器多核体ウイルスA(RSVA)および呼吸器多核体ウイルスB(RSVB)のうち一つ以上を検出するためのプローブオリゴヌクレオチド。
- 配列番号27または28の配列に存在する10個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチドおよびそれに相補的なオリゴヌクレオチドであって、長さが10bp〜100bpである一つ以上のオリゴヌクレオチドと、
配列番号29または30の配列に存在する10個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチドおよびそれに相補的なオリゴヌクレオチドであって、長さが10bp〜100bpである一つ以上のオリゴヌクレオチドと、
配列番号31または32の配列に存在する10個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチドおよびそれに相補的なオリゴヌクレオチドであって、長さが10bp〜100bpである一つ以上のオリゴヌクレオチドと、
配列番号33または34の配列に存在する10個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチドおよびそれに相補的なオリゴヌクレオチドであって、長さが10bp〜100bpである一つ以上のオリゴヌクレオチドと、
配列番号35または36の配列に存在する10個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチドおよびそれに相補的なオリゴヌクレオチドであって、長さが10bp〜100bpである一つ以上のオリゴヌクレオチドと、
配列番号37または38の配列に存在する10個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチドおよびそれに相補的なオリゴヌクレオチドであって、長さが10bp〜100bpである一つ以上のオリゴヌクレオチドと、
配列番号39または40の配列に存在する10個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチドおよびそれに相補的なオリゴヌクレオチドであって、長さが10bp〜100bpである一つ以上のオリゴヌクレオチドと、
配列番号41または42の配列に存在する10個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチドおよびそれに相補的なオリゴヌクレオチドと、
配列番号43または44の配列に存在する10個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチドおよびそれに相補的なオリゴヌクレオチドであって、長さが10bp〜100bpである一つ以上のオリゴヌクレオチドと、
配列番号45または46の配列に存在する10個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチドおよびそれに相補的なオリゴヌクレオチドであって、長さが10bp〜100bpである一つ以上のオリゴヌクレオチドと、
配列番号47または48の配列に存在する10個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチドおよびそれに相補的なオリゴヌクレオチドであって、長さが10bp〜100bpである一つ以上のオリゴヌクレオチドと、
配列番号49または50の配列に存在する10個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチドおよびそれに相補的なオリゴヌクレオチドであって、長さが10bp〜100bpである一つ以上のオリゴヌクレオチドと、
から構成される群から選択される一つ以上のオリゴヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項10に記載のプローブオリゴヌクレオチド。 - 配列番号27〜配列番号50のオリゴヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項10に記載のプローブオリゴヌクレオチド。
- 請求項10〜12のうちいずれか1項に記載のプローブオリゴヌクレオチドが固定化されているマイクロアレイ。
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