CN110628765B

CN110628765B - 一种鸭圆环病毒串联重复序列及其应用

Info

Publication number: CN110628765B
Application number: CN201910853116.2A
Authority: CN
Inventors: 王鑫; 武专昌; 夏小静; 姜世金; 张兴林; 李浩然
Original assignee: Linyi University
Current assignee: Linyi University
Priority date: 2019-09-10
Filing date: 2019-09-10
Publication date: 2020-07-31
Anticipated expiration: 2039-09-10
Also published as: CN110628765A

Abstract

本发明提供一种鸭圆环病毒串联重复序列及其应用，属于生物工程及分子生物学技术领域。本发明首次发现了DuCV特异存在的QTR序列，此类型串联重复序列并未出现在其他圆环病毒中。QTR可作为基因I型和II型DuCV基因分型的新分子标志，同时本发明利用双荧光素酶报告系统和半锚定反向突变PCR技术证实了QTR作为DSE元件发挥调控mRNA稳定性的作用，并利用建立的DuCV亚基因组和微环反向遗传系统，明确了QTR调控病毒基因表达的重要作用。本发明为研究DuCV基因分型与病毒复制调控机制提供了重要的技术和理论基础。

Description

一种鸭圆环病毒串联重复序列及其应用

技术领域

本发明属于生物工程及分子生物学技术领域，具体涉及一种鸭圆环病毒串联重复序列及其应用。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

鸭圆环病毒(Duck circovirus，DuCV)能引起鸭免疫抑制性疾病，感染的鸭子主要表现为羽毛凌乱、生长迟缓、体重减轻，胸腺、法氏囊、脾脏、肝脏不同程度出血肿胀，淋巴细胞坏死等特征。DuCV为单股环状DNA病毒，DuCV基因组约为1.99kb，编码三种病毒蛋白：Rep、Cap和ORF3蛋白。Rep蛋白是调控病毒基因组复制的DNA复制酶，结合基因组茎环结构起始病毒DNA滚环复制，但病毒复制调控的其他机制目前并不清楚。

根据DuCV基因组序列和cap基因序列遗传进化分析，DuCV可划分为基因I型和基因II型2个基因型。最近发现基因I型和II型DuCV的ORF3第236位核苷酸T/A变异也是DuCV基因分型的重要标志。基因I型和II型DuCV基因组序列存在较多的差异，基因I型与II型毒株间ORF3同源性仅为77.8％-81.8％。是否存在其他的病毒基因分型分子标志，也尚不清楚。

DNA重复序列在基因组复制、基因组稳定性、基因表达调控中发挥重要作用。重复序列根据重复频次划分为轻度重复序列、中等重复序列、高度重复序列，根据重复序列组织形式划分为串联重复序列和分散重复序列。重复序列对反转录病毒、腺相关病毒和EB病毒复制和致病性中也发挥重要作用。然而，目前针对DuCV基因组中串联重复序列研究甚少。

发明内容

针对上述现有技术，本发明提供一种鸭圆环病毒串联重复序列及其应用。本发明首次利用生物信息学分析发现DuCV基因组存在特异的4拷贝串联重复序列(QTR)，并不存在其他圆环病毒中；且基因I型和II型DuCV的QTR也存在明显差异，因此其可作为精确快速的基因分型标志。另外，QTR作为转录终止信号的下游反应原件(DSE)，调控病毒mRNA的稳定性。QTR的发现及其转录调控功能对阐明DuCV基因组进化与病毒复制调控机制具有重要的意义。

本发明是通过如下技术方案实现的：

本发明的第一个方面，提供一种DuCV特异存在的QTR序列(分子标记，命名为特异DNA分子)，为序列表中序列1或2所示的DNA分子。

本发明的第二个方面，提供上述特异DNA分子的应用，所述应用包括下述1)-7)中任一项：

1)鉴定或辅助鉴定待测物是否为DuCV；

2)制备鉴定或辅助鉴定待测物是否为DuCV的产品；

3)鉴定或辅助鉴定待测DuCV基因分型；

4)制备鉴定或辅助鉴定待测DuCV基因分型的产品；

5)调控DuCV基因转录或制备调控DuCV基因转录的产品；

6)维持DuCV mRNA稳定性或制备维持DuCV mRNA稳定性的产品；

7)调控DuCV基因表达或制备调控DuCV基因表达的产品。

本发明的第三个方面，提供一种产品，所述产品包括：包含上述DNA分子的物质、检测上述DNA分子的物质、促进上述DNA分子表达的物质和抑制上述DNA分子表达的物质中的一种或多种。

本发明的第四个方面，提供上述产品的应用，所述应用为如下1)-5)中任意一种：

1)鉴定或辅助鉴定待测物是否为DuCV；

2)鉴定或辅助鉴定待测DuCV基因分型；

3)调控DuCV基因转录；

4)维持DuCV mRNA稳定性；

5)调控DuCV基因表达。

本发明的第五个方面，提供一种检测待测物中是否含有DuCV的方法，所述方法包括对待测物的基因组DNA进行PCR扩增，得扩增产物；检测所述扩增产物；

若所述扩增产物含有上述特异DNA分子的片段，则所述待测物中含有DuCV。

本发明的第六个方面，提供一种检测鸭圆环病毒基因型的方法，所述方法包括：对待测物基因组DNA进行PCR扩增，得扩增产物；检测所述扩增产物；

若所述扩增产物含有上述SEQ ID NO.1的片段，则所述待测物为基因I型DuCV；

若所述扩增产物含有上述SEQ ID NO.2的片段，则所述待测物为基因II型DuCV；

若所述扩增产物同时含有上述SEQ ID NO.1和上述SEQ ID NO.2的片段，则待测物中同时含有基因I型DuCV和基因II型DuCV。

本发明的有益效果为：

本发明首次发现了DuCV特异存在的QTR序列，此类型串联重复序列并未出现在其他圆环病毒中。QTR可作为基因I型和II型DuCV基因分型的新型分子标志，利用双荧光素酶报告系统和半锚定反向突变PCR技术证实了QTR作为DSE元件发挥调控mRNA稳定性的作用，并利用建立的DuCV亚基因组和微环反向遗传系统，明确了QTR调控病毒基因表达的重要作用。本发明为研究DuCV基因分型与病毒复制调控机制提供了重要的技术和理论基础。因此具有较强的推广价值和应用价值。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1为本发明Dottup生物信息学工具分析DuCV重复序列相关图；其中，图1A为基因II型DuCV毒株基因组序列的dottup分析图，图1B为基因I型DuCV毒株基因组序列的dottup分析图，图1C为PCV1、PCV2、GoCV和PBFDV参考毒株基因组序列的dottup分析图；

图2为本发明串联重复序列QTR的序列、基因组定位及两基因型QTR序列比较分析相关图；其中，图2A为QTR在DuCV基因组中的定位图，图2B为基因I型和II型DuCV参考毒株QTR的序列及拷贝数组成图，图2C为基因I型和II型DuCV不同代表毒株QTR的序列比对结果图；

图3为本发明QTR转录调控作用分析相关图；其中，图3A为荧光素酶报告试验分析QTR增强子和沉默子功能图，图3B为荧光素酶报告试验分析QTR的polyA终止信号功能图；

图4为本发明QTR作为转录终止的DSE元件调控mRNA稳定性相关图；其中，图4A为QTR临近序列与polyA信号元件的比对分析图，图4B为QTR的RNA二级结构分析图，图4C为荧光素酶报告试验分析QTR的DSE元件功能相关图，图4D为QTR作为DSE元件调控荧光素酶基因mRNA稳定性的影响图；

图5为本发明QTR的DSE作用依赖于完整的4拷贝相关图；其中，图5A为半锚定突变PCR的流程示意图，图5B为半锚定突变PCR引物及菌液PCR鉴定引物的位置图，图5C为菌液PCR鉴定QTR突变重组子图，图5D为荧光素酶报告试验分析QTR不同拷贝数对DSE元件功能的影响图；

图6为本发明DuCV亚基因组模型分析QTR调控病毒基因表达的作用相关图；其中，图6A为亚基因组模型分析QTR对Rep基因表达调控的western blot图，图6B为亚基因组模型分析QTR对Cap基因表达调控的western blot图；

图7为本发明DuCV反向遗传模型分析QTR调控病毒基因转录的作用相关图；其中，图7A为DuCV微环反向遗传模型建立模式图，图7B为DuCV野生型和QTR敲除突变体微环反向遗传模型酶切鉴定电泳图，图7C为利用DuCV微环反向遗传模型分析QTR对Rep基因mRNA水平的动态变化图。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。

本发明的一个具体实施方式中，提供一种DuCV特异存在的QTR序列(分子标记，命名为特异DNA分子)，为序列表中序列1或2所示的DNA分子。

本发明的又一具体实施方式中，提供上述特异DNA分子的应用，所述应用包括下述1)-7)中任一项：

1)鉴定或辅助鉴定待测物是否为DuCV；

2)制备鉴定或辅助鉴定待测物是否为DuCV的产品；

3)鉴定或辅助鉴定待测DuCV基因分型；

4)制备鉴定或辅助鉴定DuCV基因分型的产品；

5)调控DuCV基因转录或制备调控DuCV基因转录的产品；

6)维持DuCV mRNA稳定性或制备维持DuCV mRNA稳定性的产品；

7)调控DuCV基因表达或制备调控DuCV基因表达的产品。

具体的，所述应用1)和2)中，本发明系首次发现了DuCV特异存在的QTR序列，经试验证明，此类型串联重复序列并未出现在其他圆环病毒，如猪圆环病毒(PCV1和PCV2)、鹅圆环病毒GoCV、鹦鹉喙羽病病毒(PBFDV)等。因此可用于在待检物中区分鉴别是否存在DuCV。

所述应用3)和4)中，SEQ ID NO.1所示的DNA分子为基因I型DuCV特有QTR序列；SEQID NO.2所示的DNA分子为基因II型DuCV特有QTR序列；因此通过分析待测物中DNA序列，从而实现对两型鸭圆环病毒DuCV的分型检测。

所述应用5)中，本发明系首次证实了QTR序列具有转录终止的作用；具体的，本发明中通过试验证明：将QTR插入polyA信号下游，不影响荧光素酶活性，说明QTR不具有增强子的远距离转录激活能力；QTR插入启动子下游，荧光素酶活性显著降低，说明QTR具有转录抑制的作用；polyA信号敲除后，荧光素酶活性急剧降低，而QTR替换polyA信号并不能恢复荧光素酶活性水平，上述研究表明QTR具有不完全的polyA转录终止活性。

所述应用6)中，本发明首次明确了QTR具有茎环样RNA二级结构，并作为polyA信号的下游反应元件DSE，可用于调控mRNA的成熟与稳定性；

所述应用7)中，本发明使用DuCV亚基因组模型明确了QTR调控DuCV病毒基因表达的关键作用。本发明首次证明了QTR影响Rep基因的转录与表达。

本发明的又一具体实施方式中，提供一种产品，所述产品包括：包含上述DNA分子的物质、检测上述DNA分子的物质、促进上述DNA分子表达的物质和抑制上述DNA分子表达的物质中的一种或多种。

本发明的又一具体实施方式中，检测上述DNA分子的物质包含基于高通量测序方法和/或基于定量PCR方法和/或基于探针杂交方法检测上述DNA分子的物质。

本发明的又一具体实施方式中，所述促进上述DNA分子表达的物质包括上调上述DNA分子表达的启动子或促进上述DNA分子表达的质粒。

本发明的又一具体实施方式中，所述抑制上述DNA分子表达的物质包括上述DNA分子mRNA的RNA干扰分子或反义寡核苷酸、小分子抑制剂；

本发明的又一具体实施方式中，提供上述产品的应用，所述应用为如下1)-5)中任意一种：

1)鉴定或辅助鉴定待测物是否为DuCV；

2)鉴定或辅助鉴定待测DuCV基因分型；

3)调控DuCV基因转录；

4)维持DuCV mRNA稳定性；

5)调控DuCV基因表达。

本发明的又一具体实施方式中，提供一种检测待测物中是否含有DuCV的方法，所述方法包括对待测物的基因组DNA进行PCR扩增，得扩增产物；检测所述扩增产物；

本发明的又一具体实施方式中，提供一种检测鸭圆环病毒基因型的方法，所述方法包括：对待测物基因组DNA进行PCR扩增，得扩增产物；检测所述扩增产物；

以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例1 Dottup生物信息学工具分析DuCV重复序列

1.利用EMBOSS Program的dottup生物信息学工具，以DuCV毒株作为基因I型代表毒株，FJ0601毒株作为基因II型代表毒株，分析DuCV基因组重复序列，发现基因I和II型DuCV基因组中间区域存在串联4拷贝重复序列(QTR)，基因I型QTR每个大重复单元里还存在2个小的重复序列；

2.为分析QTR原件是否圆环病毒属保守性，利用dottup工具，选取DuCV亲缘关系较进的猪圆环病毒(PCV1和PCV2)、鹅圆环病毒GoCV、鹦鹉喙羽病病毒(PBFDV)进行基因组分析，并没有发现重复序列。

实施例2串联重复序列QTR的序列、基因组定位及两基因型QTR序列比较分析

1.分析QTR的DuCV基因组定位发现，QTR位于Rep和Cap基因的中间区域；

2.QTR序列分析发现，基因II型QTR长168bp，包括4个42bp串联重复单元，基因I型QTR长180bp，包括4个45bp串联重复单元，每个重复单元里含有2个7bp间隔重复单元；

基因I型QTR序列：

5’-cacttggcagggattaaacacttgggcagctcggttaaggttaggcacttggcagggagtaaacacttgggcagctcggttaaggttaggcacttggcagggattaaacacttgggcagctcggttaaggttaggcacttggcagggattaaacacttgggcagctcggttaaggttaga-3’(SEQ ID NO.1)

基因II型QTR序列：

5’-ttaaggtgaacactcgaaagggatatacacttgggcagctggttatggtgaacactcgaaagggatatacacttgggcagctggttatggtgaacactcgaaagggatatacacttgggcagctggttatggtgaacactcgacagggatatacacttgggcagctgg-3’(SEQ ID NO.2)

3.选取14个两基因型DuCV代表毒株，QTR序列比对分析发现基因I型毒株和II型DuCV毒株间QTR显著不同，且在各基因型间均相对保守。

实施例3 QTR转录调控作用分析

1.构建荧光素酶报告质粒：以DuCV毒株作为基因I型代表毒株，FJ0601毒株作为基因II型代表毒株，分别扩增基因I型DuCV QTR片段(G1-QTR)和基因II型DuCV QTR片段(G2-QTR)；

2.利用不同酶切位点和无缝克隆技术，分别将G1-QTR和G2-QTR正向或反向插入到luciferase基因的上游和下游调控区域

3.构建的荧光素酶报告质粒转染DEF细胞，同时转染pRL-TK质粒作为内参报告质粒，转染36h后，收集细胞，利用双荧光素酶检测系统检测荧光素酶活性。

4.转录调控功能分析：QTR插入polyA信号下游，不影响荧光素酶活性，说明QTR不具有增强子的远距离转录激活能力；QTR插入启动子下游，荧光素酶活性显著降低，说明QTR具有转录抑制的作用；polyA信号敲除后，荧光素酶活性急剧降低，而QTR替换polyA信号并不能恢复荧光素酶活性水平，说明QTR具有不完全的polyA转录终止活性。

实施例4 QTR作为转录终止的DSE元件调控mRNA稳定性

1.QTR邻近序列与polyA信号组成进行比对分析，发现Rep基因末端与QTR间存在CA信号，提示QTR可能是polyA信号的下游反应原件；

2.RNA茎环结构对polyA信号终止转录作用至关重要，利用RNAfold Web Server工具，进行QTR RNA二级结构分析，发现G1-QTR和G2-QTR均含有保守的茎环结构；

3.探究QTR的DSE作用，利用HpaI和BamHI敲除polyA信号的DSE元件，荧光素酶活性大大降低，而G1-QTR和G2-QTR正向或反向插入后，荧光素酶活性均显著恢复。

4.polyA信号对mRNA的多聚腺苷酸化和稳定性具有重要影响，因此进一步分析DSE对luciferase mRNA稳定性的影响。pGL3-promoter、pGL3ΔDSE和ΔDSE-G2-QTR转染DEF细胞，转染后36h，加300ug/ml CHX处理0h、3h、6h、9h，收集细胞；提取RNA，DNaseI消化后进行反转录反应；qPCR分析luciferase mRNA的动态变化和半衰期。

实施例5 QTR的DSE作用依赖于完整的4拷贝

多拷贝片段截短有较大难度，本发明利用半锚定反向PCR方法，进行质粒突变。

1.半锚定反向PCR技术进行拷贝数截短的技术路线图见图5A。

2.利用引物F和R进行半锚定反向突变PCR，如图5B。

1)反向PCR扩增，PCR体系:

PCR扩增条件：94℃预变性3min，然后98℃变性10s、68℃退火延伸6min，重复6个循环；

2)DpnI消化亲本质粒，在上述反应体系中加入2ul DpnI内切酶(10U/ul)，37℃消化1h；

3)末端磷酸化与连接环化，按下反应体系16℃连接1h。

3.半锚定反向突变PCR产物转化DH5a感受态，通过引物identify-F/R(如图5B)进行菌液PCR，核酸凝胶电泳分析不同拷贝数突变体(如图5C)；

4.荧光素酶报告试验分析发现随着拷贝数降低，QTR调控luciferase基因转录的作用大大降低，如图5D，说明QTR发挥DSE的作用依赖其完整的4个拷贝数。

实施例6 DuCV亚基因组模型分析QTR调控病毒基因表达的作用

1.将DuCV FJ0601株Rep-QTR亚基因组、Rep基因分别克隆至pCMV-HA和pCMV-HAΔpolyA载体中，分别命名为pRep-polyA、pRep、pRep-QTR，如图6A。同样方法建立Cap-QTR表达质粒及突变质粒，分别命名为pCap-polyA、pCap、pCap-QTR，如图6B。

2.表达质粒转染DEF后24h，收集细胞，western blot检测Rep和Cap的表达，发现pRep-QTR中Rep表达水平与pRep-polyA相近，但缺失的QTR后Rep表达明显缺失，Cap表达也表现出相似趋势，如图6A和6B，说明亚基因组中Rep和Cap表达依赖于QTR。

实施例7 DuCV反向遗传模型分析QTR调控病毒基因转录的作用

1.DuCV FJ0601株反向遗传模型的建立，利用微环DNA载体技术建立高度模拟DuCV环状基因组的反向遗传系统，如机制流程图7A：

1)利用高保真DNA聚合酶，扩增FJ0601基因组和MN0501载体的扩增，扩增体系：

PCR扩增条件：98℃预变性3min，然后98℃变性10s、60℃退火15s、72℃延伸2min，并重复30个循环，最后72℃延伸5min；

扩增引物：

FJ0601-F:CTCCCCGGGCGCGACCTAGAACCCGGTGAACTGACCAAACTTGA(SEQ ID NO.3)

FJ0601-R:TTACCCCAGTTGGGGGCATAAACGTGGTCCTGTCCTAACCTTAAC(SEQ ID NO.4)

MN501-attP-F:CCCCAACTGGGGTAACCTTTGAG(SEQ ID NO.5)MN501-attB-R:GTCGCGCCCGGGGAGCCCAAGGG(SEQ ID NO.6)。

2)DNA凝胶电泳，切胶回收定量；

3)Infusion cloning技术连接，构建真核表达质粒pmini-FJ0601

50℃孵育15min；

4)转化DH5a感受态，在Kan+抗性LB培养板中选择培养；

5)挑取单克隆，菌液PCR筛选阳性克隆，测序验证；

6)转化ZYCY3S2T感受态细胞，挑取单克隆至200μl LB培养基中，37℃培养2h；

7)摇菌，亲本质粒扩增：取2μl新鲜菌液接种到200ml LB培养基中，32℃培养12h；

8)诱导attB/P重组，产生minicircle FJ0601基因组克隆(MC-FJ0601)：补加400mlLB、1/1000volum Arabinose、50mg/ml Kan+，用1M NaOH调节pH至7.0，32℃继续培养5h，中间每间隔1.5h调节一次pH值；

9)质粒提取与验证重组效率：诱导后的菌液用无内毒素质粒大提试剂盒抽提质粒，BamHI单酶切验证，初步验证MC-FJ0601完全重组，无亲本质粒或RNA污染，如图7B。

2.构建QTR敲除的FJ0601反向遗传模型MC-FJ0601ΔQTR

利用反向突变PCR技术，在pmini-FJ0601基础上，敲除QTR，同上方法化至ZYCY3S2T感受态细胞并阿拉伯糖诱导产生MC-FJ0601ΔQTR，诱导重组效率见图7B。

反向突变PCR敲除QTR所用引物：

3.利用MC-FJ0601模型分析QTR对病毒基因表达的影响

将MC-FJ0601和MC-FJ0601ΔQTR转染DEF细胞，转染后不同时间点收集细胞，qPCR分析Rep mRNA的动态变化，发现MC-FJ0601ΔQTR组中Rep mRNA转录水平显著低于MC-FJ0601组，说明QTR影响Rep基因的转录与表达。

RT-qPCR检测Rep mRNA水平方法如下：

1)DEF细胞转染MC-FJ0601和MC-FJ0601ΔQTR不同时间点，吸弃培养基，PBS溶液洗3次，每孔加入1ml Trizol，吹打混匀后移至1.5ml EP管中，室温裂解10min；

2)加入200μl氯仿，涡旋振荡混匀15s，室温静置5min；

3)4℃、12000rpm、15min离心，将上层水相转移到新的EP管中；

4)加入等体积异丙醇，颠倒混匀，4℃静置10min；

5)4℃、12000rpm、10min离心，白色沉淀即为RNA；

6)弃上清，75％乙醇(DEPC水配制，4℃预冷)洗一次；

7)吸弃残留液体后，开盖室温干燥15min左右，RNA沉淀完全透明；

8)根据沉淀量加入适量DEPC水溶解RNA，测浓度和纯度后进行逆转录；

9)在冰上将1μl DNase I、1μl 10×Reaction Buffer+MgCl₂和1μg RNA溶液加到新的EP管中，RNase-free ddH2O补足至10μl，混匀；

10)37℃水浴30min，去除基因组DNA；

11)加入1μl 50mM EDTA，65℃水浴10min；

12)按照下列体系向上述EP管中再加入各组分，总体积20μl：

混匀后，42℃水浴反应60min，70℃加热5min终止反应；

利用DuCV-Rep-qF/R引物进行PCR扩增检测Rep基因mRNA的变化：

DuCV-Rep-qF	TGTTATCTTTGGGCGTGG(SEQ ID NO.9)
		DuCV-Rep-qR	CATTTCCCGAGTAACCGTC(SEQ ID NO.10)

PCR扩增条件：95℃预变性5min，然后95℃变性30s、60℃退火30s、72℃延伸30s并重复27个循环，最后72℃延伸10min。

本发明首次发现了DuCV 4拷贝串联重复序列QTR，通过实施例1证实QTR仅存在于DuCV基因组中，利用Dottup工具可精确快速区分DuCV基因I型和II型。通过实施例2展示了基因I型和II型DuCV QTR的序列组成、基因组定位及序列差异特点。通过实施例3确认了QTR具有转录终止的作用。通过实施例4明确了QTR具有茎环样RNA二级结构，并作为polyA信号的下游反应元件DSE，调控mRNA的成熟与稳定性。通过实施例5建立了半锚定反向突变PCR方法，并对QTR进行截短，证实了QTR作用依赖于完整的4拷贝。通过实施例6利用DuCV亚基因组模型明确QTR调控病毒基因表达的关键作用。通过实施例7首次基于微环载体技术建立DuCV反向遗传。

应注意的是，以上实例仅用于说明本发明的技术方案而非对其进行限制。尽管参照所给出的实例对本发明进行了详细说明，但是本领域的普通技术人员可根据需要对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 临沂大学

<120> 一种鸭圆环病毒串联重复序列及其应用

<130>

<160> 10

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 180

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

cacttggcag ggattaaaca cttgggcagc tcggttaagg ttaggcactt ggcagggagt 60

aaacacttgg gcagctcggt taaggttagg cacttggcag ggattaaaca cttgggcagc 120

tcggttaagg ttaggcactt ggcagggatt aaacacttgg gcagctcggt taaggttaga 180

<210> 2

<211> 168

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

ttaaggtgaa cactcgaaag ggatatacac ttgggcagct ggttatggtg aacactcgaa 60

agggatatac acttgggcag ctggttatgg tgaacactcg aaagggatat acacttgggc 120

agctggttat ggtgaacact cgacagggat atacacttgg gcagctgg 168

<210> 3

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

ctccccgggc gcgacctaga acccggtgaa ctgaccaaac ttga 44

<210> 4

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

ttaccccagt tgggggcata aacgtggtcc tgtcctaacc ttaac 45

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

ccccaactgg ggtaaccttt gag 23

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 6

gtcgcgcccg gggagcccaa ggg 23

<210> 7

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 7

gttaaggtta ggacaggacc acgtttatg 29

<210> 8

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 8

taaagacata aaacaacaac gtggtctca 29

<210> 9

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 9

tgttatcttt gggcgtgg 18

<210> 10

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 10

catttcccga gtaaccgtc 19

Claims

1.DNA分子在制备维持DuCV mRNA稳定性的产品中的应用；

其中，所述DNA分子为序列表中序列1或2所示的DNA分子；

所述DNA分子作为转录终止的下游反应元件调控mRNA的稳定性。