CN106978513B - 用于检测竹鼠圆环病毒的pcr引物及其试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了用于检测竹鼠圆环病毒的PCR引物，包括引物CP1和引物CP2，它们分别具有序列表中SEQ.ID.No.1和SEQ.ID.No.2的碱基序列。据此，发明人还制备了相应的PCR试剂盒并建立相应的PCR检测方法，该试剂盒含有引物CP1和引物CP2、DNA提取试剂、PCR扩增试剂、竹鼠圆环病毒阳性对照和阴性对照。实验表明，本发明具有特异、敏感、快速、简便的特点，弥补了目前临床上检测该病毒的技术空缺，可作为养殖场、基层实验室等场所开展快速检测的良好方法。
Description
技术领域
本发明属于圆环病毒检测技术领域，尤其涉及用于检测竹鼠圆环病毒的PCR引物及其试剂盒。
背景技术
圆环病毒为无囊膜、二十面体对称的动物病毒，其基因组为单股环状DNA，是目前已知最小的致病性动物病毒。圆环病毒常呈潜伏感染，易侵害动物免疫系统，导致机体免疫力下降，使动物对多种病原易感性增加，并使动物发病。
随着我国特种动物养殖业的迅速发展，竹鼠养殖业得以不断壮大，而目前国内外在竹鼠圆环病毒性疾病领域的研究和报道还处于空白状态，临床上针对竹鼠圆环病毒病及由此引起的继发性疾病的防治也处于被动甚至空白状态。迄今，国内外没有任何关于该病毒的基因参考序列。本课题组根据竹鼠病毒宏基因组学结果发现，竹鼠圆环病毒与世界上已经报道的圆环病毒比较，该病毒与英国从发病的狐狸体内分离的圆环病毒同源性最高，但全基因组也只有66.4％的同源性，衣壳蛋白氨基酸的同源性只有55.0％。国际病毒分类委员会提出，圆环病毒新的种的界定标准为：全基因组同源性小于75％，衣壳蛋白氨基酸的同源性小于70％即为一种新的圆环病毒，所以目前我们分离到的竹鼠圆环病毒是一种完全没有报道的新的圆环病毒。因此，急需一种快速检测竹鼠圆环病毒病的方法，来对发病竹鼠进行及时诊治。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种特异、敏感、快速、简便的用于检测竹鼠圆环病毒的PCR引物及其试剂盒。
为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：
用于检测竹鼠圆环病毒的PCR引物，包括引物CP1和引物CP2，它们分别具有以下碱基序列：
引物CP1 5′-AGAGGGTCGAAGATGAAAGG-3′，
引物CP2 5′-AGGTGGGGGGTCCCATTCT-3′。
用于检测竹鼠圆环病毒的PCR试剂盒，该试剂盒含有引物CP1和引物CP2，它们分别具有以下碱基序列：
引物CP1 5′-AGAGGGTCGAAGATGAAAGG-3′，
引物CP2 5′-AGGTGGGGGGTCCCATTCT-3′。
引物CP1和引物CP2的摩尔比为1∶1。
引物CP1和引物CP2的浓度均为20μM。
该试剂盒还含有以下试剂：DNA提取试剂、PCR扩增试剂、竹鼠圆环病毒阳性对照和阴性对照。
DNA提取试剂为AXYGEN体液病毒DNA/RNA小量试剂盒，PCR扩增试剂为2×Es TaqMasterMix。
竹鼠圆环病毒阳性对照为竹鼠圆环病毒衣壳蛋白基因片段cDNA的质粒，阴性对照为竹鼠圆环病毒阴性的昆明小鼠血清。
针对竹鼠圆环病毒检测和诊断的缺乏有效可靠技术的问题，发明人设计并制备了用于检测竹鼠圆环病毒的PCR引物，包括引物CP1和引物CP2，它们分别具有序列表中SEQ.ID.No.1和SEQ.ID.No.2的碱基序列。据此，发明人还制备了相应的PCR试剂盒并建立相应的PCR检测方法，该试剂盒含有引物CP1和引物CP2、DNA提取试剂、PCR扩增试剂、竹鼠圆环病毒阳性对照和阴性对照。实验表明，本发明具有特异、敏感、快速、简便的特点，弥补了目前临床上检测该病毒的技术空缺，可作为养殖场、基层实验室等场所开展快速检测的良好方法。
附图说明
图1是本发明PCR检测方法退火温度试验检测结果图，图中：1.50℃；2.52℃；3.55℃；4.60℃；5.ddH2O；M：DL 2000DNA分子质量标准。
图2是本发明PCR检测方法特异性试验结果图，图中：1.竹鼠圆环病毒；2.ddH2O；3.竹鼠内源性反转录病毒；4.竹鼠细小病毒；M：DL 2000DNA分子质量标准。
图3是本发明PCR检测方法敏感性试验结果图，图中：1：未稀释的模板(78ng/μL)DNA扩增结果；2～5依次为10-1～10-4倍比稀释模板DNA扩增结果；M：DL 2000DNA分子质量标准。
图4是本发明PCR检测方法的临床检测结果图，图中：1.阳性；2.检测样品；3.阴性对照；M：DL 2000DNA分子质量标准。
具体实施方式
实施例1 引物设计
根据前期病毒宏基因组学测序结果得到的竹鼠圆环病毒基因序列(其全长序列见SEQ.ID.No.4)的保守区域设计引物，得到一对位于衣壳蛋白基因的引物CP1和CP2(见表1)，送深圳华大基因合成，用DEPC处理水溶解，-20℃保存。
表1 引物序列
实施例2 PCR反应体系与反应程序的建立
1、DNA模板制备
均匀剪取发病竹鼠的心、肝、脾、肺、肾等组织与抽滤除菌DMEM按体积比1∶5的比例研磨制成病料悬液，分装到1.5ml EP管内，经3次冻融后，将病料悬液8000rpm 4℃离心5min，取上清200μL，同时等量吸取阳性对照与阴性对照(见实施例6)并编号。按照AXYGEN体液病毒DNA/RNA小量试剂盒提取模板DNA，产物直接用于PCR反应或置于-20℃保存。
2、PCR扩增反应
按PCR反应体系(见表2)配制反应混合物放入TaKaRa PCR仪，PCR反应程序：预变性：95℃5min；扩增32个循环(包括：变性：94℃30sec；退火：60℃45sec；延伸：72℃1min)；最后延伸：72℃7min。反应结束后，取PCR产物5μL点样于1％琼脂糖凝胶加样孔内(含0.5μg/ml溴化乙锭)电泳进行鉴定，如电泳结果在817bp处出现扩增条带，同时阴、阳性成立，即表明待检样品中有竹鼠圆环病毒。
表2 PCR反应液组份
实施例3 PCR检测方法退火温度确定
用提取好的样品DNA做模板，设置不同的退火温度，然后其他条件均设置成相同进行PCR，PCR完成后取产物5μL点样于1％琼脂糖凝胶加样孔内(含0.5μg/ml溴化乙锭)。电泳后的凝胶于紫外分析仪下观察结果，以确定其最佳退火温度，结果显示退火温度从50℃-60℃，PCR产物结果均很特异(图1)，最终确定检测方法的退火温度设为60℃。
实施例4 特异性实验
用前述已建立的PCR方法，分别以竹鼠圆环病毒、竹鼠细小病毒、竹鼠内源性反转录病毒、ddH2O分别为病毒核酸模板进行PCR试验，按表2的体系配制反应液，按照实施例2的方法进行特异性试验。结果显示只有竹鼠圆环病毒能进行特异性扩增，其它病毒不能扩增出目的条带(图2)。结果表明，本发明检测方法具有很高的特异性。
实施例5 灵敏度实验
用蛋白质核酸测定仪测定了模板DNA浓度为78ng/μL，对模板DNA进行10倍倍比稀释然后进行PCR，32个PCR循环后，检测该方法的敏感性，最终测定该方法的最低检测量为78pg(图3)。
实施例6 试剂盒组装
根据以上实施例的研究结果，组装检测试剂盒以方便使用。
1、引物为CP1和CP2，浓度均为20μM。
2、DNA提取试剂：使用总DNA纯化试剂为AXYGEN体液病毒DNA/RNA小量试剂盒。
3、PCR扩增试剂：普通的2×Es Taq MasterMix(天根生物公司生产)。
4、竹鼠圆环病毒阳性对照和阴性对照
阳性对照：将需扩增的衣壳蛋白基因的目的序列(SEQ.ID.No.3)经PCR扩增并克隆进pMD-18T，构成并测序验证100％同源，最后制备目的片段重组质粒pMD-C1，在含氨苄青霉素的LB细菌培养液中进行培养，收获菌液提取质粒作为阳性对照。
阴性对照：无菌采集的竹鼠圆环病毒阴性的昆明小鼠血清。
实施例7 临床应用
对临床上疑似患竹鼠圆环病毒的病鼠进行解剖采样检测，使用前述试剂盒按照本发明的PCR检测方法进行。结果显示，临床检测样品扩增出815bp的特异性带，为竹鼠圆环病毒阳性(图4)。
SEQUENCE LISTING
<110> 广西壮族自治区兽医研究所
<120> 用于检测竹鼠圆环病毒的PCR引物及其试剂盒
<130> 用于检测竹鼠圆环病毒的PCR引物及其试剂盒
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
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tctccatggt ctgcatgggg aagtttatcc aagtcccctt tactacaatt tttttgaact 1680
tgtagtatct gaatggaggc tgatgctggt aggtctggtt gcctgagatg gccataaatt 1740
gggagagctt gaattgaaga tgatccatgt tccacagcag gggagtctca atgggggggt 1800
ccatgttgtc cccgcctccc accattgtgg gggtcttatt ggcggctggc cagtctgttg 1860
tgacgaccct gtggaatctg atgtggaagg tcctaaatcg agcccttgca cggcgtctga 1920
caagtcttcc atttctacgt ctataatgca gtcttgcccg ggcaagtctc cgcctgcggt 1980
atctgcggtt tcggtttcca tagcgacgcc gcctgaaata gatatgcaaa tgtttagcgc 2040
atgcgcggag acggtgtgtc gaggtgccgg gcatagtatt acccggcacc ttgacacgga 2100
cacggtccca aa 2112
Claims (7)
1.用于检测竹鼠圆环病毒的PCR引物，其特征在于包括引物CP1和引物CP2，它们分别是以下碱基序列：
引物CP1 5′-AGAGGGTCGAAGATGAAAGG-3′，
引物CP2 5′-AGGTGGGGGGTCCCATTCT-3′。
2.一种用于检测竹鼠圆环病毒的PCR试剂盒，其特征在于该试剂盒含有引物CP1和引物CP2，它们分别是以下碱基序列：
引物CP1 5′-AGAGGGTCGAAGATGAAAGG-3′，
引物CP2 5′-AGGTGGGGGGTCCCATTCT-3′。
3.根据权利要求2所述的用于检测竹鼠圆环病毒的PCR试剂盒，其特征在于：所述引物CP1和引物CP2的摩尔比为1:1。
4.根据权利要求3所述的用于检测竹鼠圆环病毒的PCR试剂盒，其特征在于：所述引物CP1和引物CP2的浓度均为20μM。
5.根据权利要求2所述的用于检测竹鼠圆环病毒的PCR试剂盒，其特征在于该试剂盒还含有以下试剂：DNA提取试剂、PCR扩增试剂、阳性对照和阴性对照。
6.根据权利要求5所述的用于检测竹鼠圆环病毒的PCR试剂盒，其特征在于：所述DNA提取试剂为AXYGEN体液病毒DNA/RNA小量试剂盒，PCR扩增试剂为2×Es Taq MasterMix。
7.根据权利要求5所述的用于检测竹鼠圆环病毒的PCR试剂盒，其特征在于：所述阳性对照为竹鼠圆环病毒衣壳蛋白基因片段cDNA的质粒，阴性对照为竹鼠圆环病毒阴性的昆明小鼠血清；所述竹鼠圆环病毒衣壳蛋白基因片段为SEQ.ID.No.3的碱基序列。
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Application publication date: 20170725 Assignee: Tianhe Xinpei Technology Co.,Ltd. Assignor: GUANGXI VETERINARY Research Institute Contract record no.: X2023980045488 Denomination of invention: PCR primers and their kits for detecting bamboo mouse circovirus Granted publication date: 20200922 License type: Common License Record date: 20231101 |