CN112210624A - 一种高效三联检测中华鳖三种病原的lamp引物及试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种高效三联检测中华鳖三种病原的LAMP引物及试剂盒，包括微流控芯片检测用反应体系，所述微流控芯片检测用反应体系包括检测TSHSV的引物、检测TSFV的引物、检测SYJ15的引物，以及反应液；检测TSHSV的引物、检测TSFV的引物、检测SYJ15的引物分别预埋于微流控芯片上。本发明可以快速、准确的同时检测TSHSV，TSFV和SYJ15。

Description

一种高效三联检测中华鳖三种病原的LAMP引物及试剂盒

技术领域

本发明涉及病原菌检测技术领域，特别涉及一种高效三联检测中华鳖三种病原的LAMP引物及试剂盒。

背景技术

中华鳖(Trionyx sinensis)俗称甲鱼、水鱼或团鱼，分类学上隶属爬行纲(Reprilia)、龟鳖目(Chelonia)、鳖科(Trionychidae)、鳖属(Triomx)")，主要分布于中国、俄罗斯、日本、越南及其他东南亚等国家和地区，多栖息于江河、湖泊、塘、水库等水流平缓、鱼虾繁生的淡水水域。我国鳖病的研究起步相对较晚，上世纪80年代初期几乎没有开展相关的研究工作。随着集约化养鳖的迅速发展，鳖病的发生率和死亡率迅速上升，对养殖业造成巨大冲击，鳖病及其治疗的相关研究工作相继开展。中华鳖病具有易受环境因素影响、潜伏期长、病程长、继发感染普遍、并发症多和治愈困难等特点，其发病原因是致病病原、环境条件、中华鳖本身三者之间相互作用的结果。迄今，已经报道的中华鳖疾病有30多种，有腐皮病、红脖子病、红底板病、疥疮症、中华鳖腮腺炎病、中华鳖出血病、白斑病、水霉病、钟形虫病，锥形虫病、氨中毒症、脂肪代谢不良等。申请人近几年的研究表明，目前对中华鳖养殖危害最大的主要有中华鳖鳃腺炎(又包括病毒性和细菌性鳃腺炎)和中华鳖黄病毒病，相应的3种病原分别为病毒TSHSV(病毒性鳃腺炎病原)，中华鳖高致病性蜡样芽孢杆菌SYJ15(细菌性鳃腺炎病原)和TSFV(中华鳖黄病毒病病原)。建立3种病原的快速分子诊断检测技术，是中华鳖主要病害防控的重要技术支撑。目前病原分子诊断采用的技术主要是PCR技术，但由于其反应要在2个不同的温度区循环，对仪器要求高，成本也相对高昂，并且PCR技术仅1对扩增引物，易受干扰，特异性相对不足，且出结果时间较久，操作专业要求高，微量加量步骤多。并且多种致病因逐一检测，耗时久，操作繁琐，且浪费试剂。近年来发展起来的LAMP技术共有4条不同的特异性引物，故而检测结果准确度更高，但是由于是恒温反应，缺少类似PCR的热启动酶，在设备升温阶段容易产生非特异性扩增从而影响检测结果。

微流控芯片技术是通过生物学、化学、医学、电子、材料、机械等多学科交叉，将分子生物学、化学分析、医学等领域所涉及的样品前处理、分离及检测等过程集成到几平方厘米的芯片上，从而实现分析的微型化、自动化、集成化和便携化的技术，具有样品消耗少、检测速度快、操作简便、多功能集成、体积小和便于携带等优点，已在多个领域得到应用。此外，因其体积小巧、操作简单，极大地拓展了体外诊断的应用空间。

发明内容

本发明的目的在于提供一种高效三联检测中华鳖三种病原的LAMP引物及试剂盒。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种高效三联检测中华鳖三种病原的LAMP引物，包括检测TSHSV的引物、检测TSFV的引物和检测SYJ15的引物；

检测TSHSV的引物包括：

外引物

TSHSV-F3：5’-ACCACACCTAAACTTAAACCT-3’(SEQ ID No.1)；

TSHSV-B3：5’-GAATCCTTTATTGGGCCTTAC-3’(SEQ ID No.2)；

内引物

TSHSV-FIP：5’-CCTTTTCGCGGAACTGAGGGGTACTTGGACTTTGAATTCGC-3’(SEQ ID No.3)；

TSHSV-BIP：5’-TTGCAGGAATGTTCCAGTGTACTCAAATTGGGCTGGTTGT-3’(SEQ ID No.4)；

检测TSFV的引物包括：

外引物

TSFV-F3：5’-ACTCCACTTGGACCTACC-3’(SEQ ID No.5)；

TSFV-B3：5’-AACTTTTTCCTTGAAAACCCT-3’(SEQ ID No.6)；

内引物

TSFV-FIP：

5’-TCTTTCACCACTCCATTGACCAATATGGAAGCTATGAAACAAAGAC-3’(SEQ ID No.7)；

TSFV-BIP：5’-CTGTCCCATCCTTGGGACCTATTGTTGTCCAAATGGAGTCG-3’(SEQ ID No.8)；

检测SYJ15的引物包括：

外引物

SYJ15-F3：5’-CTGATAGTSAAACGAGAACAA-3’(SEQ ID No.9)；

SYJ15-B3：5’-AGTTCTTTCCCCTGCTAGA-3’(SEQ ID No.10)；

内引物

SYJ15-FIP：

5’-CGCATGCACTTCTGCATTTCCAAAAATACTTCTACAAGTAGGACAC-3’(SEQ ID No.11)；

SYJ15-BIP：

5’-TCGTTCTTTGATATTGGTGGGAGGATAGTGAATGATCAATTGCGAC-3’(SEQ ID No.12)。

一种高效三联检测中华鳖三种病原的试剂盒，包括微流控芯片检测用反应体系，所述微流控芯片检测用反应体系包括权利要求1所述的检测TSHSV的引物、检测TSFV的引物、检测SYJ15的引物，以及反应液；检测TSHSV的引物、检测TSFV的引物、检测SYJ15的引物分别预埋于微流控芯片对应的检测孔内。

引物分别预埋于同一芯片(微流控芯片)上同一加样孔对应的不同检测孔内，然后模板和反应液混合后滴加到包埋各引物的加样孔内，加入到加样孔内，在仪器离心力的作用下通过4个微通道均匀的分布到4个检测孔—TSHSV、TSFV、SYJ15、内标，分别进行反应(如图1)。所述反应液的组分包括Tris-HCl、KCl、(NH₄)₂SO₄、MgSO₄、Tween-20、dNTPs、Bst酶、SuperScript IV反转录酶、逆转录酶抑制剂、SYBRGREEN荧光染料及金纳米颗粒。

微流控芯片检测用反应体系组成如下：

反应液：Tris-HCl 0.2μL，KCl 6.5μL，(NH₄)₂SO₄ 1.7μL，MgSO₄ 1.7μL，Tween-20 1.7μL，dNTPs 0.9μL，Bst酶1.4μL，SuperScript IV反转录酶0.1μL，逆转录酶抑制剂0.1μL，SYBRGREEN荧光染料0.9μL，金纳米颗粒1.8μL；

引物：TSHSV-F3引物0.5μL，TSHSV-B3引物0.5μL，TSHSV-FIP引物2μL，TSHSV-BIP引物2μL；

TSFV-F3引物0.5μL，TSFV-B3引物0.5μL，TSFV-FIP引物2μL，TSFV-BIP引物2μL；SYJ15-F3引物0.5μL，SYJ15-B3引物0.5μL，SYJ15-FIP引物2μL，SYJ15-BIP引物2μL。

反应液各组分的浓度为：Tris-HCl 20mM，KCl 40mM，(NH₄)₂SO₄ 100mM，MgSO₄80mM，Tween-20 1％，dNTPs 28mM，Bst酶8000U/mL，SuperScript IV反转录酶10000U/mL，逆转录酶抑制剂10mM，SYBRGREEN荧光染料1mM，金纳米颗粒4.0×10^-6mol/L。

各引物的浓度为：

TSHSV-F3引物90μM，TSHSV-B3引物90μM，TSHSV-FIP引物180μM，TSHSV-BIP引物180μM；

TSFV-F3引物90μM，TSFV-B3引物90μM，TSFV-FIP引物180μM，TSFV-BIP引物180μM；

SYJ15-F3引物90μM，SYJ15-B3引物90μM，SYJ15-FIP引物180μM，SYJ15-BIP引物180μM。

本发明的有益效果是：与现有技术相比，本发明具有如下优点：本发明以改良后的LAMP技术为基因扩增反应原理，在反应体系里加入金纳米颗粒，吸附ssDNA和蛋白酶，抑制升温过程中的非特异性反应，达到热启动的目的，避免在升温过程中的非特异性反应，反应的密闭性和微通道隔绝空气接触，避免气溶胶污染；结合改良后的LAMP技术与微流控芯片技术，既可以快速、准确的同时检测TSHSV，TSFV和SYJ15，反应试剂预埋于微流控芯片上，实现一样多指标检测，又使用户操作简便。

附图说明

图1是8样本芯片测试孔位图。

图2是微流控芯片检测仪图。

图3是TSHSV，TSFV和SYJ15引物敏感性扩增结果图；注：A图是TSHSV敏感性扩增结果，B图是TSFV敏感性扩增结果，图C是SYJ15敏感性扩增结果，每张图中扩增曲线从左到右依次是10⁶copies/μL、10⁵copies/μL、10⁴copies/μL、10³copies/μL、10²copies/μL；10¹copies/μL和10⁰copies/μL则没起来。

图4是TSHSV，TSFV和SYJ15引物重复性扩增图；注：A图是TSHSV重复性扩增结果，B图是TSFV重复性扩增结果，图C是SYJ15重复性扩增结果。

图5是TSHSV，TSFV和SYJ15引物特异性扩增图；注：A图是TSHSV特异性扩增结果，B图是TSFV特异性扩增结果，图C是SYJ15特异性扩增结果。

具体实施方式

下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。

本发明中，若非特指，所采用的原料和设备等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。

实施例1

先通过NCBI GenBank寻找目标序列，并针对目标序列设计引物，并将其分别固定在微流控芯片相应位置后对微流控芯片进行封装，与中华鳖肠、肾、性腺、腮腺、肝等病灶部位、环境样本和细胞培养物中提取的核酸模板混合反应后，加入到封装好的微流控芯片中，之后放入到带有离心功能、恒温功能及实时荧光检测的微流控芯片检测仪(MA2000)中，如图2，利用离心力驱动样品进入微流控芯片反应孔，进行恒温扩增。若样本中含有目的片段而得到恒温扩增，扩增产物与荧光物质进行有效的结合，通过荧光检测仪实时捕获荧光信号，直观的反应扩增产物的产生，根据实时荧光信号的出现时间、强度和位置，判断样本中是否含有TSHSV，TSFV和SYJ15。

具体的操作步骤如下：

1、微流控芯片检测体系中17μL反应液的组成如下：

所述TSHSV引物的浓度和体积为：90μM的TSHSV-F3引物0.5μL、90μM的TSHSV-B3引物0.5μL、180μM的TSHSV-FIP引物2μL、180μM的TSHSV-BIP引物2μL。

所述TSFV引物的浓度和体积为：90μM的TSFV-F3引物0.5μL、90μM的TSFV-B3引物0.5μL、180μM的TSFV-FIP引物2μL、180μM的TSFV-BIP引物2μL。

所述SYJ15引物的浓度和体积为：90μM的SYJ15-F3引物0.5μL、90μM的SYJ15-B3引物0.5μL、180μM的SYJ15-FIP引物2μL、180μM的SYJ15-BIP引物2μL。

其中，本试剂盒选用8样本芯片，即1个加样孔对应4个检测孔，第1检测孔位包埋扩增TSHSV序列的引物(SEQ ID No.1-SEQ ID No.4)，第2检测孔包埋扩增TSFV序列的引物(SEQ ID No.5-SEQ ID No.8)，第3检测孔包埋扩增SYJ15序列的引物(SEQ ID No.9-SEQ IDNo.12)，第4检测孔包埋内参引物，如图1，冻干。内参指：人工合成的靶基因片段(非TSHSV/TSFV/SYJ15核酸片段)，指微流控芯片上用来质控恒温扩增过程是否正常的对照。实施例内参选择植物Expa2基因(NCBI序列登录号：AF442772)。

内参引物为：

F3：5’-GAGCGTGTGGTTATGGGAAT-3’(SEQ ID No.13)

B3：5’-GTTCGGCAAAGCGAAGTTC-3’(SEQ ID No.14)

FIP：5’-CCGCAGCTTAGCCCATTGTTGACTGTACAGCCAAGGGTACG-3’(SEQ ID No.15)

BIP：5’-ACGATGGCAAATGGTGCCTTCCGCAAAAATTTGTCGCCGTCA-3’(SEQ ID No.16)。

所述TSHSV的核酸序列为NCBI登录号MH447987序列，TSFV的核酸序列为(SEQ IDNo.17)，SYJ15的核酸序列为NCBI登录号CP020940序列。

取11μL含TSHSV序列的核酸样品，其核酸序列为MH447987；取11μL含TSFV序列的核酸样品，其核酸序列为SEQ ID No.17，TSFV分离自中华鳖病鳖(病鳖来自杭州市余杭区某甲鱼养殖厂)，为一种新发现的黄病毒；取11μL的SYJ15的核酸样品，其核酸序列为CP020940。三核酸充分混匀，然后将反应液17μL与TSHSV，TSFV和SYJ15模板核酸33μL混合，加入到芯片的加样孔，再将加样孔用封口膜封住，上机；

温度设定为63.5℃，反应时间设定为30min。

2、微流控芯片上机扩增：

由于本方法采用的是恒温扩增，不需要经过PCR扩增的变性、退火和延伸等变温过程，整个反应过程在恒温条件下完成，扩增程序：温度设定为63.5℃，反应时间设定为30min。运行程序：低速离心转速为1600r/min，低速离心时间为10sec，高速离心转速为4600r/min，高速离心时间为30sec。

3、微流控芯片结果判断：

3.1微流控芯片检测仪阈值线设置

阈值线一般情况设置为800(可根据实际情况进行调整，设定原则以阈值线刚好超过非典型S型扩增曲线的最高点，且Ct值显示为30)，仪器配套软件自动分析结果。

3.2质量控制

内标出现扩增曲线，且在Ct值<30时，实验结果有效。

3.3结果判定

3.3.1实验成立条件

阳性对照：Ct<30，阳性对照的反应孔(1、2、3)和内标反应孔(4)有明显的典型S型扩增曲线。

阴性对照：Ct<30，阴性对照的反应孔(1、2、3)均无扩增曲线，内标反应孔(4)有明显的典型S型扩增曲线。

3.3.2判定标准

阳性：反应时间30分钟内，项目检测孔位出现明显扩增曲线，且Ct值<30，判定该孔对应的检测项目为阳性。

阴性：反应时间30分钟内，项目检测孔位未出现明显扩增曲线，判定该孔对应的检测项目为阴性。

在微流控芯片检测仪上进行微流控芯片的恒温扩增，仪器会进行实时荧光检测，根据荧光检测的有效扩增曲线进行判读，任意一检测孔中有标准的S型的扩增曲线，则该孔判断为阳性，即该样本中含有对应检测孔的病毒核酸；没有扩增曲线的检测孔判断为阴性，即该样本不含有对应检测孔的病毒核酸。

4、敏感性及检测限的验证

4.1实验材料

试剂：反应液；1×10⁶copies/μL、1×10⁵copies/μL、1×10⁴copies/μL、1×10³copies/μL、1×10²copies/μL、1×10¹copies/μL、1×10⁰copies/μL的带有TSHSV，TSFV和SYJ15基因片段的质粒；阴性对照；阳性对照。

仪器：恒温扩增仪；掌上离心机；移液器。

4.2检测体系

参照上述的检测体系进行实验操作，然后把上好样的芯片放进恒温扩增仪进行试验检测，扩增结果可如图3检测限的结果看，TSHSV(3A)，TSFV(3B)和SYJ15(3C)引物的最低检测限均是1×10²copies/μL的质粒，此时的Ct小于30min，说明灵敏度很高。

5、重复性的验证

5.1实验材料

试剂：反应液；TSHSV，TSFV和SYJ15引物1×10⁴copies/μL的质粒；阴性对照；阳性对照。

仪器：恒温扩增仪；掌上离心机；移液器。

5.2检测体系

参照上述检测体系进行实验操作，然后把芯片放进恒温扩增仪进行试验检测。

5.3扩增结果

图4是TSHSV，TSFV和SYJ15重复性实验扩增结果图。下表是TSHSV，TSFV和SYJ15的Ct值的变异系数(CV，％)。

经计算，引物TSHSV的Ct值的变异系数(CV，％)为1.2％，重复性好，小于5％，符合要求；引物TSFV的Ct值的变异系数(CV，％)为1.5％，重复性好，小于5％，符合要求；引物SYJ15的Ct值的变异系数(CV，％)为3.9％，重复性好，小于5％，符合要求。

6、特异性的验证

6.1实验材料

试剂：试剂：反应液；TSHSV核酸，TSFV核酸和SYJ15核酸；阴性对照。

仪器：恒温扩增仪；掌上离心机；移液器。

6.2检测体系

参照上述1中的检测体系进行实验操作，然后把芯片放进恒温扩增仪进行试验检测。

6.3扩增结果

TSHSV，TSFV和SYJ15特异性实验扩增结果可参考图5，从TSHSV的扩增结果可知，除TSHSV核酸扩增结果为阳性，TSFV、SYJ15核酸和阴性对照均无扩增曲线，说明TSHSV引物只能特异性地扩增检测出中华鳖出血综合征病毒核酸，特异性好，一般不会与TSFV和SYJ15产生交叉反应。从TSFV的扩增结果可知，除TSFV核酸扩增结果为阳性，TSHSV、SYJ15和阴性对照均无扩增曲线，说明TSFV引物只能特异性地扩增检测出TSFV核酸，特异性好，一般不会与TSHSV和SYJ15产生交叉反应。从SYJ15的扩增结果可知，除SYJ15核酸扩增结果为阳性，TSHSV、TSFV和阴性对照均无扩增曲线，说明SYJ15引物只能特异性地扩增检测出SYJ15核酸，特异性好，一般不会与TSHSV和TSFV产生交叉反应。

以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。

SEQUENCE LISTING

<110> 浙江省农业科学院；宁波爱基因科技有限公司

<120> 一种高效三联检测中华鳖三种病原的LAMP引物及试剂盒

<130> 2020.10

<160> 17

<170> PatentIn version 3.3

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<213> 人工序列（Artificial sequence）

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<212> DNA

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ctgatagtsa aacgagaaca a 21

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<213> 中华鳖(Trionyx sinensis)

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ttgctgaggg gagaagaagc gcgagtgata ttctaaccat gatagggaaa acacctgaat 300

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gtgccctcct tgattgaatt gggagtgata gggacggcag ttttggccac agtagtagaa 1320

ggcggagctc ctgtgttttg gaatacaact acagctgttg cagtatcaca gttaatcaaa 1380

ggaaattggc ttgcaggagc tccgttagca tacacagtca tgaggaattc aagccgcata 1440

acagttagaa ggggtggtgc tgcaggaaga acccttggag taatgtggaa agagacgctc 1500

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gtccataagg tcaacgcatt tacaaaagga ggatttggcc acgagaatcc aagacttgtt 1800

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attggtagac gaattgcgaa actgaaagca cagttcaaag agacatggtt tgaagatgaa 2340

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gcttcatcat tggtcaatgg agtggtgaaa gagctgtccc atccttggga cctagtagat 2460

gaggtaacca gaacagtcat gacagacacg actccatttg gacaacaaag ggttttcaag 2520

gaaaaagttg acacacgagc agtctctcca cgtgcaggaa ctagagccat tatgggcgca 2580

gtgaacaaat ggctgtggag gagatacatc tcgcagggcc tgaaaccaag attgtgcaca 2640

agagaagaat tcatagcaaa agtaaattca aatgcagcaa taggagcagt gtttgaagat 2700

gaaaatcaat ggagtgatgc aaaatcagca gtggaagatc ccaggttttg ggaactagta 2760

gatatggagc gcaacctgca cctgaaagga cagtgtgaga cctgtgtata caacatgatg 2820

ggaaagagag aaaagaaaca aacagaattt ggcgaagcaa aaggcagtcg agccatttgg 2880

tatatgtggc taggagcaag gttcctagag tttgaagcat taggattcct gaatgaagac 2940

cattggatgg ctagatatca ctctggagca ggagtagagg gattaggact tcaacggttg 3000

ggatatgtca tcagagacat ggcagagtta gaagggaaat actacgcaga tgacacagct 3060

ggatgggaca caaggataac ccaagaagac cttgaagacg aggaagccat catagattac 3120

atgcagccaa ttcattccca actggcgaga gcaatcatgg agctcactta taaaaataaa 3180

gttgtgaggg tgatgagacc agggaaagga cgaaccctga tggatgtgat ctcacggaag 3240

tgccagagag ggagtggtca agtggtgaca tatgcactca acacccacac caatatcaaa 3300

gttcaactga ttagattcat ggaggctgaa ggagtcatct caggagagga agtcgagaag 3360

ataacaccta cagcactgag agaaatggaa gagtggttag atcacgaagg agaggatgtt 3420

ttagcccgga tggcaattag tggggatgac gtagtggtca aagcgaagga ccaaagattt 3480

gccactgcac ttttccacct aaatgaaatg tcaaagacaa ggaaggacat gcctgagtgg 3540

gaagcgtcca gtggatggga tcaatgggag agagttccat tctgttcaca ccactttcat 3600

gagttgaagt tgaaggatgg acgcatgata gtagtccctt gtagaaatca acatgagcta 3660

gtgggaagag cacgtgtgtc accaggaaga ggatggagtt tgattgaaac agcagccctc 3720

agcaaggctt atgggcaaat gtggcaactc atgtacttcc atagaagaga tcttcggctg 3780

atggcattcg cgatatcatc ttcagtacca atcaattggg tgcctacagg aagaacaacc 3840

tggtcattac atggaaaagg agagtggatg accaacgagg acatgttaga agtgtggaat 3900

agagtatgga tatatgacaa cccccatatg aagaataaac agccagttga agattggaga 3960

gacatcccgt tcattcgcaa gggtaatgac atagcttgtg gcagcctcat tggcttgaca 4020

gcgagagcca catgggcgaa gaacataaga gtagccgtga atcaggttag atcattaata 4080

ggagtaaatg aaagatatgt ggactacctt gtagcaatgg gaagataccg ccaaaatgaa 4140

gagcaagctc caggagcttg ggaaaaac 4168

Claims (6)

1.一种高效三联检测中华鳖三种病原的LAMP引物，其特征在于，包括检测TSHSV的引物、检测TSFV的引物和检测SYJ15的引物；

检测TSHSV的引物包括：

外引物

TSHSV-F3：5’-ACCACACCTAAACTTAAACCT-3’；

TSHSV-B3：5’-GAATCCTTTATTGGGCCTTAC-3’；

内引物

TSHSV-FIP：5’-CCTTTTCGCGGAACTGAGGG-GTACTTGGACTTTGAATTCGC-3’；

TSHSV-BIP：5’-TTGCAGGAATGTTCCAGTGTAC-TCAAATTGGGCTGGTTGT-3’；

检测TSFV的引物包括：

外引物

TSFV-F3：5’-ACTCCACTTGGACCTACC-3’；

TSFV-B3：5’-AACTTTTTCCTTGAAAACCCT-3’；

内引物

TSFV-FIP：

5’-TCTTTCACCACTCCATTGACCAAT-ATGGAAGCTATGAAACAAAGAC-3’；

TSFV-BIP：5’-CTGTCCCATCCTTGGGACCTA-TTGTTGTCCAAATGGAGTCG-3’；

检测SYJ15的引物包括：

外引物

SYJ15-F3：5’-CTGATAGTSAAACGAGAACAA-3’；

SYJ15-B3：5’-AGTTCTTTCCCCTGCTAGA-3’；

内引物

SYJ15-FIP：

5’-CGCATGCACTTCTGCATTTCC-AAAAATACTTCTACAAGTAGGACAC-3’；

SYJ15-BIP：

5’-TCGTTCTTTGATATTGGTGGGAG-GATAGTGAATGATCAATTGCGAC-3’。

2.一种高效三联检测中华鳖三种病原的试剂盒，其特征在于，包括微流控芯片检测用反应体系，所述微流控芯片检测用反应体系包括权利要求1所述的检测TSHSV的引物、检测TSFV的引物、检测SYJ15的引物，以及反应液；检测TSHSV的引物、检测TSFV的引物、检测SYJ15的引物分别预埋于微流控芯片对应的检测孔内。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述反应液的组分包括Tris-HCl、KCl、(NH₄)₂SO₄、MgSO₄、Tween-20、dNTPs、Bst酶、SuperScript IV反转录酶、逆转录酶抑制剂、SYBRGREEN荧光染料及金纳米颗粒。

4.根据权利要求2或3所述的试剂盒，其特征在于，微流控芯片检测用反应体系组成如下：反应液：Tris-HCl 0.2μL，KCl 6.5μL，(NH₄)₂SO₄ 1.7μL，MgSO₄ 1.7μL，Tween-20 1.7μL，dNTPs 0.9μL，Bst酶1.4μL，SuperScriptIV反转录酶0.1μL，逆转录酶抑制剂0.1μL，SYBRGREEN荧光染料0.9μL，金纳米颗粒1.8μL；

引物：TSHSV-F3引物0.5μL，TSHSV-B3引物0.5μL，TSHSV-FIP引物2μL，TSHSV-BIP引物2μL；

TSFV-F3引物0.5μL，TSFV-B3引物0.5μL，TSFV-FIP引物2μL，TSFV-BIP引物2μL；

SYJ15-F3引物0.5μL，SYJ15-B3引物0.5μL，SYJ15-FIP引物2μL，SYJ15-BIP引物2μL。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，反应液各组分的浓度为：Tris-HCl20mM，KCl 40mM，(NH₄)₂SO₄ 100mM，MgSO₄ 80mM，Tween-20 1％，dNTPs 28mM，Bst酶8000U/mL，SuperScript IV反转录酶10000U/mL，逆转录酶抑制剂10mM，SYBRGREEN荧光染料1mM，金纳米颗粒4.0×10^-6mol/L。

6.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，各引物的浓度为：

TSHSV-F3引物90μM，TSHSV-B3引物90μM，TSHSV-FIP引物180μM，TSHSV-BIP引物180μM；

TSFV-F3引物90μM，TSFV-B3引物90μM，TSFV-FIP引物180μM，TSFV-BIP引物180μM；

SYJ15-F3引物90μM，SYJ15-B3引物90μM，SYJ15-FIP引物180μM，SYJ15-BIP引物180μM。

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