JPWO2019168085A1 - 固定化細胞又はffpe組織切片から抗原性を増強した細胞核を脱離する方法並びにそのための抗原賦活剤及びキット - Google Patents
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Abstract
Ki−67抗原の賦活化に向かないとされる酵素による賦活化を検討し、MIB−1のエピトープを認識しない酵素(レアカッター酵素)で試料を前処理すると、サイトケラチンを含む他の抗原の抗原性も増強しつつ、Ki−67抗原の抗原賦活化を増強した。その結果、FFPE切片から抗原性を増強させたまま細胞核を脱離させ、その核に存在するKi−67タンパク質を標的とし、蛍光標識した抗体を反応させることで、より客観性、再現性、普遍性の高いKi−67陽性細胞の定量方法を完成させた。
Description
一方、その因子の有無と予後が相関する因子のことを予後因子という。Ki−67は現在予後因子とも考えられている。効果予測因子の検出には、主として腫瘍組織サンプルの免疫組織化学的方法(IHC法)が多用されている。腫瘍細胞の染色強度と染色された細胞の比率の両方を加味する方法(All red Score等)や染色強度を評価せず染色された腫瘍細胞の比率のみで判定する方法(J−Score等)のいずれかが用いられる。
HER2の場合、一般にIHC法で検査し、その結果が0あるいは1+の場合は陰性、3+の場合は陽性、2+の場合はFISH法(Fluorescence in situ hybridization)によって増幅の有無を調べ、増幅があれば陽性、なければ陰性と判定する。
ERの場合、All red Scoreでは3〜8が陽性とされる一方、染色細胞の比率で判定する場合は10%をカットオフ値とすることが多かったが、1%でも存在する場合は、ER陽性と判定すべきとの意見もある。
Ki−67の場合、組織全体で陽性割合を算出する方法、陽性細胞の集まるホットスポットと呼ばれる領域を選択して算出する方法等が混在している。
いずれにせよ、一定のカットオフ値を設定すれば、これらの効果予測因子が陽性と判断された場合、効果的な治療レジメンの指針となりうる。
1)ルミナルA(様)型:ER・PgR陽性、HER2陰性、Ki−67低値(<14〜20%)
2)ルミナルB(様)型(HER2陰性):ER・PgR陽性、HER2陰性、Ki−67高値(≧14〜20%)
3)ルミナルB(様)型(HER2陽性):ER・PgR陽性、HER2陽性
4)非ルミナル型:ER・PgR陰性、HER2陽性
5)トリプルネガティブ型:ER陰性、PgR陰性、HER2陰性
これらの分類は治療レジメンの選定にも影響し、例えばKi−67低値であるルミナルA(様)型と判断された場合、主として内分泌療法単独が選択され、一方Ki−67高値であるルミナルB(様)型(HER2陰性)と判断された場合は、主として内分泌療法と化学療法の併用が選択される(非特許文献6、10〜12)。
さらに、ホルマリン固定組織やトロンビン:(血漿)ファイブロネクチン固定組織の場合、MIB−1抗体は偽陽性や偽陰性の結果を生じる可能性があった(非特許文献9)
通常、FFPE組織から単一の細胞レベルで解析を行う場合、細胞間の接着を担う細胞外基質を切断して抗原を賦活化する必要がある。しかしながら、これらの酵素を用いた消化は、標的とする抗原の認識部位を切断する可能性があり、使用可能な抗体を制限する。そのため、上記の既存方法以外で細胞分散や、細胞核を脱離する方法が必要となる。
[1] 固定化された細胞群中のKi−67陽性細胞核を含む細胞を、抗Ki−67抗体を用いて検出する方法であって、
1)固定化された細胞群を配列番号2のペプチドを認識切断しない加水分解酵素で前処理して抗原を賦活化する工程、その後
2)抗Ki−67抗体を用いて染色する工程、及び
3)染色されたKi−67陽性細胞又はKi−67陽性細胞核を検出する工程を含む方法;
[2] 前記抗体が、MIB−1、DAKO−PC、Ki−S5及びA−0047からなる群から選択される少なくとも一種である[1]に記載の方法;
[3] 前記酵素が、トロンビン、Arg−C(クロストリパイン)ペプチターゼ、プロリンエンドペプチターゼ及びヒアルロニダーゼからなる群から選択される少なくとも一種である[1]又は[2]に記載の方法;
[4] 前記酵素が、トロンビン及び/又はヒアルロニダーゼであり、前記抗体が、MIB−1である[1]に記載の方法;
[5] 前記固定化された細胞群が、ホルマリン、グルタルアルデヒド、アルコール、アセトン及びそれらの組み合わせからなる群から選択される固定化剤で固定されている、[1]〜[4]のいずれか一項に記載の方法;
[6] 工程1)の前に熱処理により賦活化することを含む、[1]〜[5]のいずれか一項に記載の方法;
[8] さらに、抗サイトケラチン抗体を用いてサイトケラチンを染色(例えば、蛍光染色)し、染色された陽性細胞を検出することを含む、[1]〜[7]のいずれか一項に記載の方法;
[9] さらに抗エストロジェン受容体(ER)抗体及び/又は抗プロゲステロン受容体(PgR)抗体を用いてER及び/又はPgRを染色(例えば、蛍光染色)し、染色された陽性細胞又は陽性細胞核を検出(例えば、カウント)することを含む、[1]〜[8]のいずれか一項に記載の方法;
[10] さらにHER2遺伝子にハイブリダイズするプローブを用いて、HER2遺伝子が増幅されている細胞又は細胞核を検出することを含む、[1]〜[9]のいずれか一項に記載の方法。
[11] 前記固定化された細胞群が組織切片に含まれている、[1]〜[10]のいずれか一項に記載の方法;
[12] 前記組織切片が、包理剤で包理されており、
前記加水分解酵素で抗原を賦活化する工程の前に該包理剤を除去し、該組織切片を親水化する工程を含む、[11]に記載の方法;
[14] 水流、超音波などで生じるせん断応力により前記細胞を破砕して、細胞核を抽出する、[13]に記載の方法;
[15] 界面活性剤を含む緩衝液中で、前記細胞核を抽出する[13]又は[14]に記載の方法;
[16] 前記界面活性剤が、CHAPS、NP−40、およびTriton−X100から選択される少なくとも一種である、[15]に記載の方法;
[17] 前記染色されたKi−67陽性細胞又はKi−67陽性細胞核の数をカウントする、[1]〜[16]のいずれか一項に記載の方法;
[18]前記Ki−67陽性細胞又は前記Ki−67陽性細胞核を、蛍光染色し、フローサイトメトリーを用いてカウントする、[17]に記載の方法;
[19] 前記固定化された細胞又は前記組織切片が患者由来である、[1]〜[18]のいずれか一項に記載の方法;
[20] 前記固定化された細胞又は前記組織切片が患者の腫瘍組織由来である、[1]〜[18]のいずれか一項に記載の方法;
[21] 前記固定化された細胞又は前記腫瘍組織が、乳癌細胞又は乳癌組織である、[20]に記載の方法;
[22] がんの診断を補助するための、[20]又は[21]に記載の方法;
[23] がん治療の予後を診断するのを補助するための、[20]又は[21]に記載の方法;
[25] [20]又は[21]に記載の方法により、細胞群内のKi−67陽性細胞の割合を算定し、割合がカットオフ値以上の場合は内分泌療法と化学療法の併用を選択し、割合がカットオフ値未満の場合は、内分泌療法単独を選択して、患者に施し、癌を治療する方法。
[27] 配列番号2のペプチドを認識切断しない加水分解酵素を含む、Ki−67を免疫染色で検出する細胞又は組織試料に用いられる抗原賦活化剤;
[28] 前記酵素が、トロンビン、Arg−C(クロストリパイン)ペプチターゼ、プロリンエンドペプチターゼ及びヒアルロニダーゼからなる群から選択される少なくとも一種である、[27]に記載の抗原賦活化剤;
[29] 前記酵素がトロンビン及び/又はヒアルロニダーゼである、[28]に記載の抗原賦活化剤。
[31] 更に、ER及び/又はPgRを免疫染色して検出する細胞又は組織試料に用いられる[27]〜[30]のいずれか一項に記載の抗原賦活化剤;
[32] 更に、HER2遺伝子を増幅している細胞を検出する試料に用いられる[27]〜[31]のいずれか一項に記載の抗原賦活化剤;
配列番号2のペプチドを認識切断しない加水分解酵素と、
抗Ki−67抗体と
を含む、キット;
[34] 前記加水分解酵素は、トロンビン、Arg−C(クロストリパイン)ペプチターゼ、プロリンエンドペプチターゼ及びヒアルロニダーゼからなる群から選択される少なくとも一種である、[32]に記載のキット;
[35] 前記加水分解酵素は、トロンビン及び/又はヒアルロニダーゼである、[34]に記載のキット;
[36] 前記抗Ki−67抗体は、MIB−1、DAKO−PC、Ki−S5及びA−0047からなる群から選択される少なくとも一種である、[33]〜[35]のいずれか一項に記載のキット;
[37] 更に、Ki−67と組み合わせて、がんの診断を補助するため、又はがんの治療の予後を診断するのを補助するために用いられる他のマーカーを検出するためのリガンドを含む、[33]〜[36]のいずれか一項に記載のキット;
[38] 前記リガンドは、抗サイトケラチン抗体、抗ER抗体、抗PgR抗体、及びHER2遺伝子にハイブリダイズするプローブからなる群から選択される少なくとも一種である、[37]に記載のキット;
[39] 更に、核染色用の化合物を含む、[33]〜[38]のいずれか一項に記載のキット;
[40] 更に、細胞を分散させるための緩衝液を含み、該緩衝液は、界面活性剤を含有する、[33]〜[39]のいずれか一項に記載のキット;
[41] 更に、熱処理抗原賦活化剤を含む、[33]〜[40]のいずれか一項に記載のキット;
[42] がんの診断を補助するための、[33]〜[41]のいずれか一項に記載のキット。
[43] がん治療の予後を診断するのを補助するための、[33]〜[41]のいずれか一項に記載のキット;
[44] 癌の治療レジメンを決定するための、[33]〜[41]のいずれか一項に記載のキット;
[45] 前記治療レジメンの決定は、細胞群内のKi−67陽性細胞の割合を算定し、割合がカットオフ値以上の場合は内分泌療法と化学療法の併用を選択し、割合がカットオフ値未満の場合は、内分泌療法単独を選択することによって行なわれる、キット;
界面活性剤を含有する細胞分散用緩衝液を含む、キット;
[47] 水流、超音波などで生じるせん断応力により固定化された細胞を破砕して、細胞核を抽出する方法であって、
該固定化された細胞を界面活性剤を含有する緩衝液に分散して該細胞の破砕を行う、方法;及び
[48] 固定化された細胞群中の目的の抗原が細胞核に存在する細胞を、該抗原の抗体を用いて検出する方法であって、
1)該固定化された細胞群を、該抗体の抗原認識部位を切断しない加水分解酵素で前処理して抗原を賦活化する工程、その後
2)該抗体を用いて該細胞を染色する工程、及び
3)染色された抗原陽性細胞又は抗原陽性細胞核を検出する工程を含む方法。
本発明より提供されるプロトコール(前処理試薬とプロセス)を用いることで、FFPE組織切片から標的抗原の抗原性を増強した細胞核の脱離を達成する。回収した分散細胞核は、単一の細胞核として解析することが可能である。例えば、核膜上や核内のタンパク質、核酸等が検出対象となり、色素(蛍光物質、化学発行物質、酵素など)による染色や、これらの色素により修飾された抗体を用いて検出することができる。特に、フローサイトメトリー解析により脱離核中の対象タンパク質の陽性核の割合(Ki−67陽性率等)を迅速に算出することが可能である。
Ki−67のカットオフ値は、病理医による、目視判定とカウントの工程を必要としていたため、ばらつきがあり、従来施設ごとに異なっていた。しかしながら本発明より提供されるプロトコール(前処理試薬とプロセス)を用いることで、ばらつきの少ない病理診断のカットオフ値の世界基準を提供することが可能である。
そして、かかるカットオフ値を用いて、患者にQOLの高い診断レジメンを提供することが可能である。
「抗体」は、完全長(IgG、IgA、IgM、IgD、IgE)イムノグロブリンであってもよく、その抗原結合認識領域を含む断片(いわゆる断片抗体(Fab、Fab’、F(ab’)2など))であってもよい。また「抗体」は、ヒト、マウス、ラット、ヤギ、ウマ、ラクダなど哺乳動物のほか、魚類(サメを含む)や鳥類(ニワトリ)に由来するものであってよい。
「MIB−1」又は「MIB−1抗体」は、Ki−67抗体をモノクローナル化したクローンの1つである。特に限定しないが、Dako社やImmunotech社から購入可能である。Ki−67中、PKEKAQALEDLAGFKELFQT(配列番号2)からなるエピトープを認識して結合する。
「抗Ki−67抗体」とは、Ki−67を認識し、これに結合する抗体を指し、MIB−1の他、MIB−2、MIB−5、MIB−7、MIB−21およびMIB−24などのMIB(登録商標)ファミリーに属する抗体、DAKO−PC、Ki−S5、A0047なども「抗Ki−67抗体」として用いることができ、それ以外の市販或いは臨床検査上使用されている同じ特性の抗体も「抗Ki−67抗体」として用いることができる。抗Ki−67抗体は、Ki−67抗原またはその一部を抗原として用い、公知の方法によって調製することができる。本発明で用いられる「抗Ki−67抗体」は、上記エピトープを認識する抗体を含むことが好ましい。
これに限定しないが、公知のデータベースにより(http://web.expasy.org/peptide_cutter/)、このような特性を有する蛋白分解酵素を知る事ができる(表1)。また、ある酵素がこのような特性を有するかは、MIB−1、又は同じエピトープを認識する他の抗体を用いて当該酵素が当該エピトープを切断するかを分析して確認することができる。
抗体が細胞内に浸潤するため或いは/及び細胞核の抽出のため、かかる酵素は細胞外マトリックスである、コラーゲンを認識切断できることが好ましい。これに限定しないが、トロンビン、Arg−C(クロストリパイン)ペプチターゼ(EC 3.4.22.8)、プロリンエンドペプチターゼ(EC 3.4.21.26)などが挙げられる。
本発明の目的には、ヒアルロニダーゼなどの蛋白以外の細胞外基質中の成分を加水分解する酵素も好ましい。ヒアルロニダーゼ(EC 3.2.1.35)は、ヒアルロン酸のβ‐1‐4結合を分解する加水分解酵素であり、配列番号2のペプチドを切断しない。ヒアルロニダーゼのこの特性により、抗体の細胞内への浸潤が促進される。このような酵素としてヒアルロニダーゼ、グリコシダーゼ(EC 3.2.1)、N−グリカナーゼ(EC 3.5.1.52)等を挙げることができ、ヒアルロニダーゼが好ましい。
また、上述した配列番号2のペプチドを認識切断しない蛋白酵素は、配列番号2のペプチドを切断し無い点でヒアルロニダーゼと共通する一方、両者は、全く異なる作用の酵素であるため、両者を組み合わせることで抗原不活化活性がより高まることが期待される。特に、トロンビンとヒアルロニダーゼの組み合わせは好ましい。
「標識酵素」は、特に限定しないが、アルカリフォスファターゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼが挙げられる。
「化学発光物質」は、特に限定しないが、ルミノール、AMPPD(登録商標)、CSPD(登録商標)、CDP−Star(登録商標)が挙げられる。
1)同一(FFPE)組織切片に対し、異なる蛍光波長の蛍光色素などの他のリガンドとの識別が可能になる標識で各リガンド(例えば、抗サイトケラチン抗体、抗ER抗体、抗PgR抗体、HER2遺伝子にハイブリダイズする核酸、あるいはそれらに結合する二次抗体又は核酸)を標識し、検出/定量してもよいし、或いは
2)同一組織ブロックから均質と仮定される複数の(FFPE)組織切片を作製し、各標的物質について染色(例えば、免疫蛍光染色、FISH)を行い検出/定量してもよい。
1) 薄切FFPE切片の脱パラフィン/親水化
2) 熱処理による抗原賦活化
3) 酵素による抗原の賦活化
4) 組織及び細胞を破砕して細胞核を抽出
超音波による破砕工程は、他の血液細胞よりリンパ球を優先的に破砕し、リンパ球の細胞壁のみならずリンパ球の核を破砕する際に有益である。従って、リンパ球の存在が他の細胞の分析の妨げになる場合など、リンパ球を優先的に破砕したい場合には、超音波による破砕工程を含むことが好ましい。
1)癌腫(Carcinoma):上皮組織由来の悪性腫瘍
2)肉腫(Sarcoma):非上皮組織由来の悪性腫瘍
3)その他:白血病など
に分類され、本願において「がん」とは癌腫を意味する。特に限定しないが、頭頸部癌(上顎癌、(上、中、下)咽頭癌、喉頭癌、舌癌、甲状腺癌)、胸部癌(乳癌、肺癌(非小細胞肺癌、小細胞肺癌))、消化器癌(食道癌、胃癌、十二指腸癌、大腸癌(結腸癌、直腸癌)、肝癌(肝細胞癌、胆管細胞癌)、胆嚢癌、胆管癌、膵癌、肛門癌、泌尿器の癌(腎癌、尿管癌、膀胱癌、前立腺癌、陰茎癌、精巣(睾丸)癌)、生殖器癌(子宮癌(子宮頸癌、子宮体癌)、卵巣癌、外陰癌、膣癌)、皮膚癌(基底細胞癌、有棘細胞癌)などのがん細胞がこれにあたる。
癌腫と肉腫を区別するために用いられる上皮性細胞のマーカーとしては、サイトケラチンが挙げられる。サイトケラチンは上皮細胞の主要な骨格タンパク質であり、約20〜30種類のサブタイプ(分子量40〜68KDa)が報告されている。上皮性細胞マーカーとしてサイトケラチンを検出するのに、公知の広いサブタイプを認識する抗体(ポリクローナル又はモノクローナル抗体)が用いられるが、各サブタイプに特異的に結合する公知の抗体を複数含むカクテルを用いてもよい。
プロゲステロン受容体(Progesterone receptor (PRまたはPgR)は、核内受容体スーパーファミリーのサブファミリー3グループCに属する核内タンパクである。11q22に存在する単一のPgR遺伝子によってコードされ、分子量の異なる2つのアイソフォームが知られている。
HER2タンパクは、正常細胞において細胞の増殖、分化などの調節に関与しているが、何らかの理由でHER2遺伝子の増幅や遺伝子変異が起こると、細胞の増殖・分化の制御ができなくなり、細胞は悪性化する。HER2遺伝子はがん遺伝子でもあり、多くの種類のがんで遺伝子増幅がみられる。
「組織切片」とはヒト又は非ヒト動物の単離された組織の切片をいう。生検で採取された「組織切片」であってよい。「組織切片」は単離後、凍結保存などされていてもよい。
キットは、更に、「細胞核を抽出する工程」で用いられる組織又は細胞を浸漬又は分散させるための緩衝液を含むことができ、好ましくはこの緩衝液は界面活性剤を含む。界面活性剤としては、好ましくはCHAPS、NP−40、Triton−X100が挙げられ、NP−40、Triton−X100がより好ましい。従って、本願発明によれば、水流又は超音波などで生じるせん断応力により細胞(通常、固定化された細胞)から細胞核を抽出するためのキットであって、界面活性剤を含有する細胞分散用緩衝液を含む、キットが提供される。
「内分泌療法」とは、ホルモン依存性の乳がんの増殖を促す女性ホルモン(エストロゲン)が働かないようにする治療法であり、これに限定しないが、抗エストロゲン剤、Lh−RHアゴニスト製剤、アロマターゼ阻害剤、プロゲステロン製剤などのホルモン剤を投与することを含む。
「化学療法」とは、抗がん作用を奏する化学物質を用いてがんを治療することをいう。これに限定しないが、DNA合成及び複製阻害剤であるアントラサイクリン系抗がん剤(ダウノルビシン(ダウノマイシン)、ドキソルビシン(アドリアマイシン)、エピルビシン、イダルビシンなど)、細胞増殖の抑制剤であるタキサン系抗がん剤(パクリタキセル(タキソール)、ドセタキセル(タキソテール)など)、DNAの複製を妨げるプラチナ(白金)製剤(シスプラチン、オキサリプラチン等)などを単投与または併用投与することを含み、好ましくはアントラサイクリン系抗がん剤とタキサン系抗がん剤を併用投与することを含む。本願明細書においては、「ホルモン剤」を投与する場合は、「内分泌療法」に含まれるものとする。
水流せん断による細胞核脱離観測
1.材料及び方法
乳癌組織のFFPE組織切片に脱パラフィン/親水化、熱処理による抗原賦活化を施し、水流せん断装置を用いて分散処理後、回収産物に免疫蛍光染色を行い顕微鏡観察した。
1−1.FFPE組織ブロック
Proteogenex社より購入した乳癌組織のFFPE組織ブロックを用いた。
1−2.FFPE切片の作成
Thermofisher社製滑走式ミクロトームを用いてFFPE組織ブロックを薄切して厚さ20μmの切片を作成した。
1−3.脱パラフィン/親水化
薄切したFFPE切片に十分量のキシレンを添加し、10分間静置後、キシレンを除去した。この工程を再度行い、完全にパラフィンを除去した。次いで、100%エタノール、95%エタノール、70%エタノール、50%エタノール、脱イオン水に順に3分間ずつ浸漬して親水化した。
1−4.熱処理による抗原賦活化
純水で10倍に希釈したナカライテスク社製Histo VT Oneを添加し、ヒートブロックで98℃下、20分間加熱した。加熱後、室温にて20分間静置して後、抗原賦活化液を除去した。
1−6.水流破砕
Sysmex社の水流せん断装置(RP−10)を用い、氷冷下、賦活化済組織を、TBS1mL中で10,000rpm、1分間破砕した。
1−7.免疫蛍光染色
10%正常ヤギ血清(和光)を添加した4%BSA/TBSを水流破砕による破砕物が入ったマイクロチューブに添加し、室温下30分間静置し、ブロッキング処理した。免疫蛍光染色は、1次抗体としてpan−サイトケラチン抗体(Abcam、ウサギポリクローナル抗体:Anti−wide spectrum Cytokeratin antibody(AB9377−500))を用い、2次抗体はAbcam社Goat anti−Rabbit Secondary Antibody Alexa 488を使用した。1次抗体反応時間は50分、2次抗体反応時間は30分であり、2次抗体反応時間経過時に細胞核を染色する色素DAPI Solution(和光)を添加した。反応は全て室温であり、2次抗体添加以降は遮光下にて行った。抗体希釈液には0.5%BSA/TBSを使用し、各工程の間には1回ずつ0.5%BSA/TBSによる洗浄操作を行った。スライドガラスにDAPI包埋剤(和光)を5μLのせ、その上に2次抗体反応後のサンプルを乗せた。その後、カバーガラスを被せ、5分間静置後、上から垂直に押し、カバーガラスの周囲をマニキュアでシールした。観察時まで遮光し、4℃下で保存した。
1−8.蛍光顕微鏡
顕微鏡観察には、EVOS オールインワン顕微鏡、蛍光顕微鏡(Thermoscientific)を使用した。観察時にはDAPIライトキューブ(Ex 357nm、Em 447nm)、GFPライトキューブ(Ex 470nm/Em 510nm)を使用した。接眼レンズは10倍、対物レンズは40倍を使用した。
図1に蛍光顕微鏡で観測した細胞核を示す。左の図に示す通り、円形状に核酸が存在し、右図に示す通り、サイトケラチンが核酸の周囲に存在している。よって、細胞核、骨格が破損せず円形を保ち、凝集することなく単一細胞核として回収されたことが確認された。
ホルマリン固定化乳癌細胞中のサイトケラチン及びKi−67由来シグナルの確認
1.材料及び方法
ホルマリンで固定化した乳癌細胞に熱処理による抗原賦活化を施し、免疫蛍光染色を行い、サイトケラチンとKi−67のシグナルをフローサイトメーターで確認した。
1−1.細胞
3種の乳癌細胞株、T47D、MDA−MB−231(図においてMB231又は231と表記)、及びSKBr3(図においてはSKBRと表記)を、ATCC(American Type Culture Collection)より入手し、使用した。
1−2.細胞培養とホルマリン固定
T47D細胞株はRPMI−1640培地、MDA−MB−231細胞株はLeibovitz’s L−15培地およびSKBr3細胞は、McCoy’s 5A培地で培養し、10%のウシ胎児血清(FBS)を補った。細胞が十分に増殖した後に培養液を吸引、PBSで洗浄したのちに、TrypLE Express(Thermofisher)を添加した。細胞を回収した後に遠心分離を行いPBSで洗浄した。さらにPBSで細胞を十分に懸濁後1×106個に分注し、遠心分離、PBS除去を行い、10%中性緩衝ホルマリン液(和光純薬)を添加後、4℃で24時間固定した。細胞は使用する前に、ホルマリン液を除去し、PBSで洗浄した。
1−4.熱処理による抗原賦活化
参考例1と同様の処理を行った。
1−7.免疫蛍光染色
10%正常ヤギ血清(和光)を添加した4%BSA/TBSを熱処理による抗原賦活化後の細胞が入ったマイクロチューブに添加し、室温下30分間静置し、ブロッキング処理した。免疫蛍光染色は、マウス抗体とラビット抗体の混合液を用いて2重染色した。1次抗体はKi−67抗体(Dako、クローン:MIB−1、マウスモノクローナル抗体)、及びpan−サイトケラチン抗体(Abcam、ウサギポリクローナル抗体(AB9377−500))を用い、2次抗体はThermofisher社Goat anti−Mouse Secondary Antibody Alexa 647、及びAbcam社Goat anti−Rabbit Secondary Antibody Alexa 488を使用した。1次抗体反応時間は50分、2次抗体反応時間は40分であり、2次抗体添加後20分後に細胞核を染色する色素DAPI Solution(和光)を添加した。反応は全て室温であり、2次抗体添加以降は遮光下行った。抗体希釈液には0.5%BSA/TBSを使用し、各工程の間には1回ずつ0.5%BSA/TBSによる洗浄操作を行った。また、ネガティブコントロール(アイソタイプコントロール)として1次抗体の代わりにそれぞれ対応する1次抗体と同種、同濃度の抗体を用いた。Ki−67はDako社のマウスIgG抗体を使用し、サイトケラチンはCellsignaling technology社のラビットIgG抗体を用いた。
1−8.フローサイトメーター測定
Falcon(登録商標)セルストレーナー 5mLチューブ用35μm(380メッシュ)(フローサイトメーター用)のフィルターを通過させた後に、指定容器に移し替えてフローサイトメーター(Sysmex:Space)で測定した。測定は、機器マニュアルに従って行った。
1−9.サイトケラチン及びKi−67陽性率の算出
得られた測定データの解析にはFLOWJO LLC社製のソフトFlowJo v10を用いた。データ解析はソフト添付の説明書に従い、以下の順で行った。前方散乱を横軸、側方散乱を縦軸としたスキャッタグラム上で、図2に示す主要な領域を選択した。次に、DAPIの蛍光強度を横軸、細胞(核)個数を縦軸として、主要な領域を細胞核としてゲーティングした(図3)。サイトケラチン及びKi−67の陽性率は全細胞核中のサイトケラチン陽性核数、及びKi−67陽性核数の割合として算出した。陽性核の閾値はアイソタイプコントロールの95パーセンタイル値とした。
図4に抗サイトケラチン抗体及び抗Ki−67抗体で検出した蛍光強度のヒストグラム(黒色実線)、及びそれらのアイソタイプコントロール抗体で検出した蛍光強度のヒストグラム(灰色破線)を重ね合わせたチャートを示す。いずれの細胞株でも、黒色のピークが灰色と比較し高い蛍光強度を示した。これらより、ホルマリン固定化乳癌細胞中のサイトケラチン及びKi−67の存在を確認した。
トロンビンでの抗原賦活化によるホルマリン固定化細胞中のKi−67シグナルの増強
1.材料及び方法
ホルマリンで固定化した乳癌細胞を用い、トロンビン処理の有無でのシグナル強度を比較した。
1−1.細胞
参考例2で用いた3種の乳癌細胞株を用いた。
1−2.細胞培養とホルマリン固定
参考例2と同様に行った。
1−4.熱処理による抗原賦活化
参考例1と同様の処理を行った。
1−5.酵素による抗原賦活化
熱処理による抗原賦活化後の細胞にトロンビン試薬(25mM Tris−HCl pH7.4、150mM NaCl、1000KU/L トロンビン、10mM CaCl2)を添加しヒートブロックで37℃下、20分間加熱した。
1−7.免疫蛍光染色
参考例2と同様に行った。ここでは、1次抗体としてKi−67抗体(Dako、クローン:MIB−1、マウスモノクローナル抗体)、2次抗体としてThermofisher社Goat anti−Mouse Secondary Antibody Alexa 647を使用した。
1−8.フローサイトメーター測定
参考例2と同様に行った。
1−9.Ki−67陽性率の算出
参考例2と同様に行った。
図5に抗Ki−67抗体(黒色実線)及びアイソタイプコントロール抗体(灰色破線)で検出した蛍光強度を重ね合わせたチャートを示し、図6及び表2にKi−67陽性率の変化を示した。いずれの細胞株でも、トロンビンによる抗原賦活化を行うと蛍光強度が上昇し、それに伴いKi−67陽性率の増加が見られた。
ヒアルロニダーゼでの抗原賦活化によるホルマリン固定化細胞中のKi−67シグナルの増強
1.材料及び方法
ホルマリンで固定化した乳癌細胞を用い、ヒアルロニダーゼ処理の有無でのシグナル強度を比較した。
1−1.細胞
参考例2で用いたT47D細胞株を用いた。
1−2.細胞培養とホルマリン固定
参考例2と同様に行った。
1−4.熱処理による抗原賦活化
参考例1と同様の処理を行った。
1−5.酵素による抗原賦活化
熱処理による抗原賦活化後の細胞にヒアルロニダーゼ試薬(25mM Tris−HCl pH7.4、150mM NaCl、4000−10000KU/L ヒアルロニダーゼI―S、7500−30000KU/L ヒアルロニダーゼIV―S、27mM KCl)を添加しヒートブロックで37℃下、20分間加熱した。
1−7.免疫蛍光染色
参考例2と同様に行った。ここでは、1次抗体としてKi−67抗体(Dako、クローン:MIB−1、マウスモノクローナル抗体)、2次抗体としてThermofisher社Goat anti−Mouse Secondary Antibody Alexa647を使用した。
1−8.フローサイトメーター測定
参考例2と同様に行った。
1−9.Ki−67陽性率の算出
参考例2と同様に行った。
図7に抗Ki−67抗体(黒色実線)及びアイソタイプコントロール抗体(灰色破線)で検出した蛍光強度の重ね合わせチャートを示した。ヒアルロニダーゼ処理により蛍光強度が上昇し、それに伴いKi−67陽性率の増加が見られた。
FFPE組織切片中のサイトケラチン及びKi−67由来シグナルの確認
1.材料及び方法
乳癌組織のFFPE組織切片中のサイトケラチン及びKi−67のシグナルをフローサイトメーターにて確認した。
1−1.FFPE組織ブロック
参考例1で用いたFFPE組織ブロックを用いた。
1−2.FFPE切片の作成
Thermofisher社製滑走式ミクロトームを用いてFFPE組織ブロックを薄切して厚さ20μmの切片2枚を作成し、検討に用いた。
1−3.脱パラフィン/親水化
参考例1と同様に行った。
1−4.熱処理による抗原賦活化
参考例1と同様に行った。
1−6.水流破砕
参考例1と同様に行った。
1−7.免疫蛍光染色
参考例2と同様に行った。
1−8.フローサイトメーター測定
参考例2と同様に行った。
1−9.サイトケラチン及びKi−67陽性率の算出
得られた測定データの解析にはFLOWJO LLC社製のソフトFlowJo v10を用いた。データ解析は以下の順で行った。まず、DAPIの蛍光強度を横軸、細胞(核)個数を縦軸として、横軸の蛍光量が5〜150の領域を細胞核としてゲーティングした。サイトケラチン及びKi−67の陽性率は全細胞核中のサイトケラチン陽性核数、及びKi−67陽性核数の割合として算出した。陽性核の閾値はアイソタイプコントロールの95パーセンタイル値とした。
図8に抗サイトケラチン抗体及び抗Ki−67抗体で検出した蛍光強度のヒストグラム(黒色実線)、及びそれらのアイソタイプコントロール抗体で検出した蛍光強度のヒストグラム(灰色破線)を重ね合わせたチャートを示す。黒色のピークが灰色と比較し高い蛍光強度を示した。これらより、FFPE組織切片中のサイトケラチン及びKi−67の検出を確認した。
トロンビンでの抗原賦活化によるFFPE組織切片中のサイトケラチン及びKi−67シグナルの増強
1.材料及び方法
乳癌組織のFFPE組織切片を用い、トロンビン処理の有無でのシグナル強度を比較した。
1−1.FFPE組織ブロック
IProteogenex社より購入した、HC法によってKi−67陽性率が異なった2人の乳癌患者から得られた2種のFFPE組織ブロックを使用した。
1−2.FFPE切片の作成
Thermofisher社製滑走式ミクロトームを用いてFFPE組織ブロックを薄切して厚さ20μmの切片2枚を作成し、検討に用いた。
1−3.脱パラフィン/親水化
参考例1と同様に行った。
1−4.熱処理による抗原賦活化
参考例1と同様に行った。
1−5.酵素による抗原賦活化
実施例1と同様に行った。
1−6.水流破砕
参考例1と同様に行った。
1−7.免疫蛍光染色
参考例2と同様に行った。
1−8.フローサイトメーター測定
参考例2と同様に行った。
1−9.サイトケラチン及びKi−67陽性率の算出
参考例3と同様に行った。
図9Aに抗サイトケラチン抗体及び抗Ki−67抗体で検出した蛍光強度のヒストグラム(黒色実線)と、それらのアイソタイプコントロール抗体で検出した蛍光強度のヒストグラム(灰色破線)を重ね合わせたチャートを示す。いずれのFFPE切片でも、トロンビンによる処理を行うとサイトケラチン、Ki−67の蛍光強度がいずれも上昇し、それに伴い陽性率の増加が見られた(図9B)。
薄切切片の厚さによるサイトケラチン及びKi−67シグナル強度への影響
1.材料及び方法
FFPE切片の厚さによってサイトケラチン及びKi−67のシグナル強度に影響を及ぼすか確認した。
1−1.FFPE組織ブロック
参考例1で用いたFFPE組織ブロックを用いた。
1−2.FFPE切片の作成
Thermofisher社製滑走式ミクロトームを用いて同一FFPE組織ブロックより20μm 3枚、30μm 2枚、60μm 1枚の薄切サンプルを作成した。
1−3.脱パラフィン/親水化
参考例1と同様に処理した。
1−4.熱処理による抗原賦活化
参考例1と同様に処理した。
1−5.酵素による抗原賦活化
実施例1と同様に処理した。
1−6.水流破砕
参考例1と同様に行った。
1−7.免疫蛍光染色
参考例2と同様に行った。1−8.フローサイトメーター測定
参考例2と同様に行った。
1−9.サイトケラチン及びKi−67陽性率の算出
参考例3と同様に行った。
薄切切片の厚さとサイトケラチン及びKi−67の陽性率の変化を図10に示す。
20μm 3枚で検出効率が最も良好であったが、20〜60μmいずれの厚さにおいてもサイトケラチン(CK)及びKi−67(Ki67)の検出が可能であった。
フローサイトメーターによるKi−67陽性率とIHC法による陽性率の比較検討
1.材料及び方法
FFPE組織ブロックを用いてフローサイトメーターによるKi−67陽性率とIHC法による陽性率を比較した。
1−1.FFPE組織ブロック
Proteogenex社より購入した、IHC法によってKi−67陽性率が異なった19人の患者より得られた19種のFFPE組織ブロックを使用した。
1−2.FFPE切片の作成
参考例3と同様に行った。
1−3.脱パラフィン/親水化
参考例1と同様に処理した。
1−4.熱処理による抗原賦活化
参考例1と同様に処理した。
1−5.酵素による抗原賦活化
実施例1と同様に処理した。
1−6.水流破砕
参考例1と同様に行った。
1−7.免疫蛍光染色
参考例2と同様に行った。ここでは、1次抗体はKi−67抗体(Dako、クローン:MIB−1、マウスモノクローナル抗体)、及びpan−サイトケラチン抗体(Abcam、ウサギポリクローナル抗体)を用い、2次抗体としてThermofisher社Goat anti−Mouse Secondary Antibody Alexa 647、及びAbcam社Goat anti−Rabbit Secondary Antibody Alexa 488を使用した。
1−8.フローサイトメーター測定
参考例2と同様に行った。
1−9.フローサイトメーターによるKi−67陽性率の算出
参考例3と同様に行った。
1−10.IHC法によるKi−67陽性率算出
IHC法によるKi−67陽性率は1次抗体はKi−67抗体(Dako、クローン:MIB−1、マウスモノクローナル抗体)を用い、ホットスポット法により算出された。なお、鏡検者によるバラツキを考慮して病理医2名の平均値とした。
Ki−67陽性率におけるIHC法との相関性を図11に示す。
IHC法をX、本法をYとして相関性を確認した。また、陽性核のカットオフをアイソタイプコントロールの95パーセンタイル値としているため、切片は10と設定した。図11に示したようにY=0.5632X+10、相関係数0.7697と良好な結果が得られた。これより本法はFFPE組織切片中のKi−67を検出出来ているといえる。
各種消化酵素での抗原賦活化をした際のKi−67及びサイトケラチンの検出
1.材料及び方法
ホルマリンで固定化した乳癌細胞を用い、5種の異なる消化酵素での抗原賦活化について、Ki−67及びサイトケラチンのシグナル強度を比較した。
1−1.細胞
参考例2で用いた3種の乳癌細胞株を用いた。
1−2.細胞培養とホルマリン固定
参考例2と同様に行った。
1−4.熱処理による抗原賦活化
参考例1と同様の処理を行った。
1−5A.酵素による抗原賦活化(トロンビン)
実施例1と同様に処理した。
1−5B.酵素による抗原賦活化(トリプシン)
トリプシン試薬(25mM TBS pH7.4、 1M CaCl2、1mg/mLトリプシン)250μLを、熱処理による抗原賦活化をした細胞に添加し、37℃下、20分間加熱した。酵素処理後はTBSで洗浄して酵素を取り除いた。
1−5C.酵素による抗原賦活化(プロテイナーゼK)
600 mAnson U/mLプロテイナーゼK(タカラバイオ)を25mM TBS pH7.4で40倍(v/v)に希釈し、プロテイナーゼK溶液とした。プロテイナーゼK溶液250μLを、熱処理による抗原賦活化をした細胞へ添加し、37℃下、20分間加熱した。酵素処理後はTBSで洗浄して酵素を取り除いた。
1−5D.酵素による抗原賦活化(ディスパーゼ)
ディスパーゼ(和光)を25mM TBS pH7.4に溶解し、ディスパーゼ溶液(3,000PU/mL)とした。ディスパーゼ溶液250μLを抗原賦活化した細胞へ添加し37℃下、20分間加熱した。反応終了後は、1M EDTA溶液(和光)を2μL添加して転倒混和した後、TBSで洗浄して酵素を取り除いた。
1−5E.酵素による抗原賦活化(プロリンエンドペプチダーゼ)
プロリンエンドペプチダーゼ(東洋紡)を25mM TBS pH7.4に溶解し、プロリンエンドペプチダーゼ溶液(10U/mL)とした。プロリンエンドペプチダーゼ溶液250μLを、熱処理による抗原賦活化をした細胞へ添加し、37℃下、20分間加熱した。反応終了後は、TBSで洗浄して酵素を取り除いた。
1−7.免疫蛍光染色
参考例2と同様に行った。ここでは、1次抗体はKi−67抗体(Dako、クローン:MIB−1、マウスモノクローナル抗体)、及びpan−サイトケラチン抗体(Abcam、ウサギポリクローナル抗体)を用い、2次抗体としてThermofisher社Goat anti−Mouse Secondary Antibody Alexa 647、及びAbcam社Goat anti−Rabbit Secondary Antibody Alexa 488を使用した。
1−8.フローサイトメーター測定
参考例2と同様に行った。
1−9.サイトケラチン及びKi−67陽性率の算出
参考例2と同様に行った。
図12A及びBに、抗Ki−67抗体又は抗サイトケラチン抗体で検出した蛍光強度のヒストグラム(黒色実線)とそれらのアイソタイプコントロール抗体で検出した蛍光強度のヒストグラム(灰色破線)を重ね合わせたチャートを示した。サイトケラチンはいずれのタンパク質分解酵素を用いた場合でも、検出可能であった(図12B)。それに対して、配列番号2のアミノ酸配列を認識切断しうるトリプシン、ディスパーゼ、及びプロテイナーゼKの3種のタンパク質分解酵素を用いた場合は、シグナルが減少し、Ki−67の陽性率が著しく低下した。一方、配列番号2のアミノ酸配列を認識切断しないトロンビン及びプロリンエンドペプチダーゼはKi−67の陽性率が上昇し、Ki−67抗原の抗原性を増強していることが示された(図12A)。
各種消化酵素を使用した際の乳癌組織のFFPE切片中のKi−67及びサイトケラチンの検出
1.材料及び方法
乳癌組織のFFPE切片を5種の異なる消化酵素にて抗原賦活化し、Ki−67及びサイトケラチンのシグナル強度を比較した。
1−1.FFPE組織ブロック
参考例1で用いたFFPE組織ブロックを用いた。
1−2.FFPE切片の作成
参考例3と同様に行った。
1−3.脱パラフィン/親水化
参考例1と同様に処理した。
1−4.熱処理による抗原賦活化
参考例1と同様に処理した。
1−5A.酵素による抗原賦活化(トロンビン)
実施例1と同様に行った。
1−5B.酵素による抗原賦活化(トリプシン)
実施例6と同様に行った。
1−5C.酵素による抗原賦活化(プロテイナーゼK)
実施例6と同様に行った。
1−5D.酵素による抗原賦活化(ディスパーゼ)
実施例6と同様に行った。
1−5E.酵素による抗原賦活化(プロリンエンドペプチダーゼ)
実施例6と同様に行った。
1−6.水流破砕
参考例1と同様に行った。
1−7.免疫蛍光染色
参考例2と同様に行った。ここでは、1次抗体はKi−67抗体(Dako、クローン:MIB−1、マウスモノクローナル抗体)、及びpan−サイトケラチン抗体(Abcam、ウサギポリクローナル抗体)を用い、2次抗体としてThermofisher社Goat anti−Mouse Secondary Antibody Alexa 647、及びAbcam社Goat anti−Rabbit Secondary Antibody Alexa 488を使用した。
1−8.フローサイトメーター測定
参考例2と同様に行った。
1−9.サイトケラチン及びKi−67陽性率の算出
参考例3と同様に行った。
図13A及びBに抗Ki−67抗体又は抗サイトケラチン抗体で検出した蛍光強度のヒストグラム(黒色実線)とそれらのアイソタイプコントロールで検出した蛍光強度のヒストグラム(灰色破線)を重ね合わせたチャートを示す。サイトケラチンはいずれのタンパク質分解酵素を用いた場合でも、検出可能であった(図13B)。それに対して、実施例6と同様に配列番号2のペプチドを認識切断しうるトリプシン、ディスパーゼ、プロテイナーゼKの酵素を使用した際にはKi−67抗体(黒色実線)の蛍光強度が大幅に減少していた(図13A)。
認識部位の異なる抗体を用いたKi−67の検出
1.材料及び方法
乳癌組織のFFPE組織切片中のサイトケラチン及びKi−67のシグナルをフローサイトメーターにて確認した。Ki−67抗体は、MIB−1クローンとこれと認識部位の異なる抗体としてS5クローンとを使用した。
1−1.FFPE組織ブロック
参考例1で用いたFFPE組織ブロックを用いた。
1−2.FFPE切片の作成
参考例3と同様に行った。
1−3.脱パラフィン/親水化
参考例1と同様に処理した。
1−4.熱処理による抗原賦活化
参考例1と同様に処理した。
1−5.酵素による抗原賦活化処理
実施例1と同様に処理した。
1−6.水流破砕
参考例1と同様に行った。
1−7.免疫蛍光染色
参考例2と同様に行った。ここでは、1次抗体としてKi67 MIB−1抗体(Dako、マウスモノクローナル抗体)もしくはKi67 S5抗体(Millipore、マウスモノクローナル抗体)、及びpan−サイトケラチン抗体(Abcam、ウサギポリクローナル抗体)を用い、2次抗体としてThermofisher社Goat anti−Mouse Secondary Antibody Alexa 647、及びAbcam社Goat anti−Rabbit Secondary Antibody Alexa 488を使用した。
1−8.フローサイトメーター測定
参考例2と同様に行った。
1−9.サイトケラチン及びKi−67陽性率の算出
参考例3と同様に行った。
図14に、抗Ki−67抗体又は抗サイトケラチン抗体で検出した蛍光強度のヒストグラム(黒色実線)と、それらのアイソタイプコントロールで検出した蛍光強度のヒストグラム(灰色)を重ね合わせたチャートを示す(上段:Ki−67;下段:サイトケラチン)。Ki−67抗体のピークがアイソタイプコントロールと比較し高い蛍光強度を示した。これにより、FFPE組織切片中のサイトケラチン及びKi−67の検出を確認し、Ki−67のMIB−1クローンに限らず、S5クローンでも検体中のKi−67を検出可能であることが示唆された。
公知の方法によるFFPE組織切片中のKi−67シグナルの検出
1.材料及び方法
公知の先行文献法(非特許文献4:Cytometry 27:283−289)により乳癌組織のFFPR組織切片中のサイトケラチン及びKi―67シグナルの検出を行った。
1−1.FFPE組織ブロック
参考例1で用いたFFPE組織ブロックを用いた。
1−2.FFPE切片の作成
参考例3と同様に行った。
1−3.脱パラフィン/親水化
参考例1と同様に処理した。
1−5.酵素による抗原賦活化(トリプシン):既存法
親水化処理した組織切片にトリプシン試薬(25mM PBS pH7.4、1mg/ml CaCl2、1mg/mLトリプシン)250μLを添加し37℃下、70分間加熱した。酵素処理後はPBSで洗浄して酵素を取り除いた。
1−7.免疫蛍光染色
10%正常ヤギ血清(和光)を添加した4%BSA/TBSを酵素による抗原賦活化後の試料が入ったマイクロチューブに添加し、室温下30分間静置し、ブロッキング処理した。免疫蛍光染色は1次抗体としてKi67 MIB−1抗体(Dako、マウスモノクローナル抗体)もしくはKi67 S5抗体(Millipore、マウスモノクローナル抗体)、及びサイトケラチン抗体(Abcam、ラビットポリクローナル抗体)を用い、2次抗体はThermofisher社Goat anti−Mouse Secondary Antibody Alexa 647、及びAbcam社Goat anti−Rabbit Secondary Antibody Alexa 488を使用した。1次抗体反応時間は4℃オーバーナイトで反応させた。
2次抗体は40分間反応させ、2次抗体添加後20分後に細胞核を染色する色素DAPI Solution(和光)を添加した。2次抗体添加以降は全て室温で遮光下にて行った。抗体希釈液には0.5%BSA/TBSを使用し、各工程の間には1回ずつ0.5%BSA/TBSによる洗浄操作を行った。また、ネガティブコントロールとして1次抗体の代わりにそれぞれ対応する1次抗体と同種、同濃度の抗体を用いた。マウス抗体はDako社のマウスIgG抗体を使用し、ラビット抗体はCellsignaling technology社のラビットIgG抗体を用いた。
1−8.フローサイトメーター測定
参考例2と同様に行った。
1−9.フローサイトメーターによるサイトケラチン及びKi−67陽性率の算出
参考例3と同様に行った。
図15(上段:Ki−67;下段:サイトケラチン)に示すとおり、非特許文献4に記載された既存法では、Ki−67のS5クローンを使用した場合、検出することができたが、MIB−1クローン抗体を用いたサンプルではKi−67由来の蛍光ピークが大幅に減少しており、Ki−67を検出することができなかった。
FFPE切片中のER及びPgRの検出
1.材料及び方法
ER及びPgRの陽性及び陰性が既知となっているFFPE組織切片を用い、トロンビンで抗原賦活化し、水流破砕により細胞核を抽出し、フローサイトメーターを用いてER及びPgRのシグナル確認を行った。
1−1.FFPE組織ブロック
ER及びPgRの陽性試料として、Proteogenex社より購入したER陽性検体(All red Score ER7)、及びPgR陽性検体(All red Score PgR8)を用い、ER及びPgRの陰性試料として、ER及びPgR陰性検体(All red Score ER0及びPgR0)のFFPE組織切片を用いた。
1−2.FFPE切片の作成
参考例3と同様にして作成した。
1−3.脱パラフィン/親水化
参考例1と同様に処理した。
1−4.熱処理による抗原賦活化
参考例1と同様に処理した。
1−5.酵素による抗原賦活化
熱処理による抗原賦活化後、ER陽性検体は、トロンビンで抗原賦活化した。また、PgR陽性検体とER及びPgR陰性検体は、トロンビンまたはプロリンエンドペプチダーゼで抗原賦活化した。トロンビンでの抗原賦活化は実施例1と同様に行い、プロリンエンドペプチダーゼでの抗原賦活化は実施例6と同様に行った。
1−6.水流破砕
参考例1と同様に行った。
1−7.免疫蛍光染色
10%正常ヤギ血清(和光)を添加した4%BSA/TBSを水流破砕後の試料が入ったマイクロチューブに添加し、室温下30分間静置し、ブロッキング処理した。免疫蛍光染色は1次抗体としてER抗体(Abcam、クローン:SP1、ウサギモノクローナル抗体)もしくはPgR抗体(Thermofisher、クローン:SP2、ウサギモノクローナル抗体)を用い、2次抗体はAbcam社Goat anti−Rabbit Mouse Secondary Antibody Alexa 488を使用した。1次抗体は室温で45分間反応させた。2次抗体は室温で40分間反応させ、2次抗体添加後20分後に細胞核を染色する色素DAPI Solution(和光)を添加した。
1−8.フローサイトメーター測定
参考例2と同様に行った。
1−9.ER及びPgR陽性率の算出
得られた測定データの解析にはFLOWJO LLC社製ソフトFlowJo v10を用いた。DAPIの蛍光量を横軸、細胞(核)個数を縦軸として、横軸の蛍光量が5〜150の領域を細胞核としてゲーティングした。ER及びPgRの陽性率は、全細胞核中のER陽性核数及びPgRの陽性核数の割合として算出した。陽性核の閾値はアイソタイプコントロールの90パーセンタイル値とした。
図16に抗ER抗体又は抗PgR抗体で検出した蛍光強度のヒストグラム(黒色実線)と、それらのアイソタイプコントロール抗体で検出した蛍光強度のヒストグラム(灰色破線)を重ね合わせたチャートを示す。ER陽性及びPgR陽性FFPE組織切片を配列番号2のペプチドを認識切断しない酵素で処理しても、黒色のピークが灰色と比較し高い蛍光強度を示し、ER及びPgRは共に検出された。一方で、ER及びPgR陰性FFPE組織切片ではER及びPgRは検出されなかった。
異なる熱処理抗原賦活化剤を用いた場合の、固定化乳癌細胞中のKi−67及びサイトケラチンのシグナルの比較
1.材料及び方法
ホルマリンで固定化した乳癌細胞株MDA−MB−231を3種類の抗原賦活化剤を用いて熱処理による抗原賦活化をし、トロンビン酵素処理後、免疫蛍光染色を行い、サイトケラチンとKi−67をフローサイトメーターで検出した。
1−1.細胞
ATCC(American Type Culture Collection)より入手した乳癌細胞株MDA−MB−231を用いた。
1−2.細胞培養とホルマリン固定
参考例2と同様に行った。
1−4A.熱処理による抗原賦活化(Histo VT ONE)
参考例1と同様の処理を行った。
1−4B.熱処理による抗原賦活化(抗原賦活化液pH9)
抗原賦活化液pH9(ニチレイバイオサイエンス)を使用した。処理の手順及び条件は参考例1と同様にして行った。
1−4C.熱処理による抗原賦活化(イムノセイバー)
抗原賦活化液イムノセイバー(日新EM)を使用した。処理の手順及び条件は参考例1と同様にして行った。
1−5.酵素による抗原賦活化
実施例1と同様に処理した。
1−7.免疫蛍光染色
参考例2と同様に行った。
1−8.フローサイトメーター測定
参考例2と同様に行った。
1−9.サイトケラチン及びKi−67の陽性率の算出
参考例3と同様に行った。
図17に抗Ki−67抗体又は抗サイトケラチン抗体で検出した蛍光強度のヒストグラム(黒色実線)と、それらのアイソタイプコントロール抗体で検出した蛍光強度のヒストグラム(灰色破線)を重ね合わせたチャートを示す(上段:Ki−67;下段:サイトケラチン)。いずれの賦活化液でも、黒色のピークが灰色と比較し高い蛍光強度を示した。これらより、ホルマリン固定化細胞中のサイトケラチン及びKi−67の検出を確認し、賦活化液を変更しても有用であることを確認した。
細胞核を抽出する工程における各種破砕方法の、FFPE組織切片中のサイトケラチン及びKi−67の検出への影響
1.材料及び方法
乳癌組織のFFPE組織切片を用い、3種の破砕方法、及び破砕方法の組み合わせを用いて細胞核を抽出し、フローサイトメーターを用いてサイトケラチン及びKi−67のシグナル強度を比較した。
1−1.FFPE組織ブロック
参考例1で用いたFFPE組織ブロックを用いた。
1−2.FFPE切片の作成
参考例3と同様に行った。
1−3.脱パラフィン/親水化
参考例1と同様に行った。
1−4.熱処理による抗原賦活化
参考例1と同様に行った。
1−5.酵素による抗原賦活化
実施例1と同様に処理した。
1−6A.マッシャー
ニッピ社のバイオマッシャー(登録商標)IIを用い、氷冷下、TBS1mL中で酵素処理後の組織を20回すり潰した。
1−6B.乳鉢
乳鉢と乳棒を用い、TBS1mL中で酵素処理後の組織をすり潰した。
1−6C.超音波破砕
SONICS&MATERIALS社の超音波破砕装置(VCX130PB)を用い、氷冷下、TBS1mL中で酵素処理後の組織を出力強度40%で20秒間破砕した。
1−6D.水流破砕と超音波破砕の組み合わせ
Sysmex社の水流せん断装置(RP−10)を用い、氷冷下、TBS1mL中で酵素処理後の組織を10,000rpm、1分間破砕した。さらに、SONICS&MATERIALS社の超音波破砕装置(VCX130PB)を用い、氷冷下、TBS1mL中で水流破砕後の組織を出力強度20%で30秒間破砕した。
1−7.免疫蛍光染色
参考例2と同様に行った。
1−8.フローサイトメーター測定
参考例2と同様に行った。
1−9.サイトケラチン及びKi−67陽性率の算出
得られた測定データの解析にはFLOWJO LLC社製ソフトFlowJo v10を用いた。DAPIの蛍光量を横軸、細胞(核)個数を縦軸として、横軸の蛍光量が5〜150の領域を細胞核としてゲーティングした。サイトケラチン及びKi−67の陽性率は、全細胞核中のサイトケラチン陽性核数及びKi−67の陽性核数の割合として算出した。陽性核の閾値はアイソタイプコントロールの90パーセンタイル値とした。
図18に抗サイトケラチン抗体又は抗Ki−67抗体で検出した蛍光強度のヒストグラム(黒色実線)と、それらのアイソタイプコントロール抗体で検出した蛍光強度のヒストグラム(灰色破線)を重ね合わせたチャートを示す。いずれの破砕方法でも、黒色実線のピークが灰色破線と比較して高い蛍光強度を示した。これらより、各種の破砕方法を用いてFFPE組織切片中のサイトケラチン及びKi−67の検出が可能であることを確認した。
超音波破砕によるリンパ球の優先的破砕
1.材料及び方法
ホルマリンで固定化した乳癌細胞株及びリンパ芽球性細胞株を用い、超音波破砕が細胞核の取得に影響を及ぼすかを確認した。
1−1.細胞
ATCC(American Type Culture Collection)より乳癌細胞株SKBr3及びMDA−MB−231、並びにリンパ芽球性細胞株Jurkatを入手して、使用した。
1−2.細胞培養とホルマリン固定
1−4.熱処理による抗原賦活化
参考例1と同様に処理した。
1−5.酵素による抗原賦活化処理
実施例1と同様に処理した。
1−6.超音波破砕
SONICS&MATERIALS社の超音波破砕装置(VCX130PB)を用い、氷冷下、TBS1mL中で酵素処理後の細胞を出力強度20%で30秒間破砕した。
1−7.細胞核染色
細胞核を染色する色素DAPI Solution(和光)を添加し、遮光20分間反応した。
1−8.フローサイトメーター測定
参考例2と同様に行った。
図19に、前方散乱を横軸、側方散乱を縦軸とした各細胞株のスキャッタグラムを示す。乳癌細胞SKBr3及びMDA−MB−231において、超音波破砕の有無により、主要な細胞核領域の位置が変化しないことを確認した。一方で、リンパ球Jurkatにおいて、超音波破砕により主要な細胞核領域が消失した。したがって、上皮細胞は、超音波破砕により破壊されず、リンパ球芽球性細胞が優先的に超音波破砕されることが示唆された。
界面活性剤の添加による解析細胞核数の増加
1.材料及び方法
乳癌組織のFFPE組織切片を用い、超音波破砕時に界面活性剤を添加し、細胞核の取得に変化を及ぼすかを確認した。
1−1.FFPE組織ブロック
Proteogenex社より購入した、IHC法によってKi−67陽性率が異なった2人の乳癌患者から得られた2種のFFPE組織ブロックを使用した。
1−2.FFPE切片の作成
参考例3と同様に行った。
1−3.脱パラフィン/親水化
参考例1と同様に行った。
1−4.熱処理による抗原賦活化
参考例1と同様に行った。
1−5.酵素による抗原賦活化処理
実施例1と同様に処理した。
1−6.超音波破砕
SONICS&MATERIALS社の超音波破砕装置(VCX130PB)を用い、氷冷下、TBS、1%CHAPS(和光)を含むTBS、1%NP−40(和光)を含むTBS、または1%Triton−X100(和光)を含むTBS1mL中で酵素による抗原賦活化後の組織及び細胞を出力強度20%で30秒間破砕した。
1−7.細胞核染色
細胞核を染色する色素DAPI Solution(和光)を添加し、遮光20分間反応した。
1−8.フローサイトメーター測定
参考例2と同様に行った。
図20に、界面活性剤を無添加の緩衝液中で超音波破砕した場合と、上記各種界面活性剤を添加した緩衝液中で超音波破砕した場合とで、前方散乱を横軸、側方散乱を縦軸としたスキャッタグラムを示し、表3にフローサイトメーター測定時の総解析細胞核数を示した。界面活性剤の添加により、総解析細胞核数が増加することが確認された。
異なる病理医によるKi−67陽性細胞の測定
1.材料及び方法
2名の病理医によって算出されたIHC法によるFFPE組織切片中のKi−67陽性率の相関性を確認した。
1−1.FFPE組織ブロック
Proteogenex社より購入した、IHC法によってKi−67陽性率が異なった38人の患者から得られた38種のFFPE組織ブロックを使用した。
1−10.IHC法によるKi−67陽性率算出
実施例5で言及したのと同様に実施した。
図21に結果を示す。同一サンプルであっても病理医によって、Ki−67陽性率が異なる値となり、ばらつきが比較的大きいことがわかった。
各種消化酵素での抗原賦活化後の認識部位の異なる抗Ki−67抗体での検出
1.材料及び方法
ホルマリンで固定化した乳癌細胞を用い、3種の消化酵素(トロンビン、ディスパーゼ、プロテイナーゼK)の何れかで抗原賦活化後、蛍光免疫染色し、フローサイトメーターを用いてKi−67及びサイトケラチンを検出した。
1−1.細胞
参考例2で用いた3種の乳癌細胞株を用いた。
1−2.細胞培養とホルマリン固定
参考例2と同様に行った。
1−4.熱処理による抗原賦活化
参考例1と同様の処理を行った。
1−5A.酵素による抗原賦活化(トロンビン)
実施例1と同様に処理した。
1−5B.酵素による抗原賦活化(ディスパーゼ)
実施例6と同様に処理した。
1−5C.酵素による抗原賦活化(プロテイナーゼK)
実施例6と同様に処理した。
1−7.免疫蛍光染色
参考例2と同様に行った。ここでは、1次抗体はKi−67抗体(Millipore、クローン:S5(Ki−S5)、マウスモノクローナル抗体)、及びpan−サイトケラチン抗体(Abcam、ウサギポリクローナル抗体)を用い、2次抗体としてThermofisher社Goat anti−Mouse Secondary Antibody Alexa 647、及びAbcam社Goat anti−Rabbit Secondary Antibody Alexa 488を使用した。
1−8.フローサイトメーター測定
参考例2と同様に行った。
1−9.Ki−67陽性率の算出
参考例3と同様に行った。
図22A及びBに抗Ki−67抗体(Ki−S5)又は抗サイトケラチン抗体で検出した蛍光強度のヒストグラム(黒色実線)とそれらのアイソタイプコントロールで検出した蛍光強度のヒストグラム(灰色破線)を重ね合わせたチャートを示す。いずれの酵素で抗原賦活化した場合でも、黒色実線のピークが灰色破線と比較して高い蛍光強度を示した。これらより、いずれの酵素で抗原賦活化した場合でも、抗Ki−67抗体(Ki−S5)及び抗サイトケラチン抗体の抗原認識部位が保持され、Ki−67及びサイトケラチンの検出が可能であることを確認した。
FFPE組織切片中のサイトケラチン及びKi−67陽性核判定における閾値の検討
1.材料及び方法
FFPE組織切片中のサイトケラチン及びKi−67由来のシグナルをフローサイトメーターにて検出し、陽性核の閾値を変化させた際の陽性率を算出した。
1−1.FFPE組織ブロック
参考例1で用いたFFPE組織ブロックを用いた。
1−2.FFPE切片の作成
参考例3と同様に行った。
1−3.脱パラフィン/親水化
参考例1と同様に行った。
1−4.熱処理による抗原賦活化
参考例1と同様に行った。
1−5.酵素による抗原賦活化
実施例1と同様に行った。
1−6.水流破砕と超音波破砕の組み合わせ
Sysmex社の水流せん断装置(RP−10)を用い、氷冷下、TBS1mL中で酵素処理後の組織を10,000rpm、1分間破砕した。さらに、SONICS&MATERIALS社の超音波破砕装置(VCX130PB)を用い、氷冷下、TBS1mL中で水流破砕後の組織を出力強度20%で30秒間破砕した。
1−7.免疫蛍光染色
参考例2と同様に行った。
1−8.フローサイトメーター測定
参考例2と同様に行った。
1−9.サイトケラチン及びKi−67陽性率の算出
得られた測定データの解析にはFLOWJO LLC社製ソフトFlowJo v10を用いた。DAPIの蛍光量を横軸、細胞(核)個数を縦軸として、横軸の蛍光量が5〜150の領域を細胞核としてゲーティングした。サイトケラチン及びKi−67の陽性率は、全細胞核中のサイトケラチン陽性核数及びKi−67の陽性核数の割合として算出した。陽性核の閾値はアイソタイプコントロールの60、70、80、90及び95パーセンタイル値とした。陽性率はフローサイトメーターによる検出値−(100−閾値)で算出した。
図23に閾値を変化させ、抗サイトケラチン抗体及び抗Ki−67抗体で検出した蛍光強度のヒストグラム(黒色実線)と、それらのアイソタイプコントロール抗体で検出した蛍光強度のヒストグラム(灰色破線)を重ね合わせたチャートを示す。いずれの閾値を用いた場合でも陽性率が算出された。従って、サイトケラチン及びKi−67陽性率は閾値に依らず算出される事が可能である。
FFPE組織切片中のHER2の検出
1.材料及び方法
HER2陽性(検体A:Score 3+)及び陰性(検体B:Score 0)が既知となっているFFPE組織切片をそれぞれ用い、水流破砕及び超音波破砕により細胞核を抽出し、FISH法によりHER2の増幅を確認した。
1−1.FFPE組織ブロック
参考例1で用いたFFPE組織ブロックを用いた。
1−2.FFPE切片の作成
参考例3と同様に行った。
1−3.脱パラフィン/親水化
参考例1と同様に行った。
1−4.熱処理による抗原賦活化
参考例1と同様に行った。
1−5.酵素による抗原賦活化
実施例1と同様に行った。
1−6.水流破砕と超音波破砕の組み合わせ
Sysmex社の水流せん断装置(RP−10)を用い、氷冷下、TBS1mL中で酵素処理後の組織を10,000rpm、1分間破砕した。さらに、SONICS&MATERIALS社の超音波破砕装置(VCX130PB)を用い、氷冷下、TBS1mL中で水流破砕後の組織を出力強度20%で30秒間破砕した。
1−7.FISHによるHER2の検出
組織破砕後のサンプルをスライドガラスに乗せ、乾燥後、10%中性緩衝ホルマリンに室温で10分間浸漬した。スライドガラスをTBSで洗浄し、風乾後、パスビジョン(R)HER−2 DNAプローブキット(アボット)を用いてFISH染色を行った(操作は、キット添付書類に従った)。
1−8.蛍光顕微鏡
顕微鏡観察には、オールインワン蛍光顕微鏡BZ−X710(キーエンス)を使用した。観察時にはDAPIフィルタ(Ex 360nm、Em 460nm)、TRITCフィルタ(Ex 545nm、Em 605nm)使用した。対物レンズは20倍を使用した。
図24に蛍光顕微鏡で観測した細胞核を示す。HER2陽性FFPE組織切片中においてHER2由来の蛍光シグナルが検出でき、一方でHER2陰性FFPE組織切片中において、検出されないことを確認した。
本発明より提供されるプロトコール(所定の酵素による抗原賦活化を含む前処理プロセス含む)を用いることで、FFPE組織切片から標的抗原の抗原性を増強した細胞核の脱離を達成する。回収した分散細胞核は、単一の細胞核として解析することが可能である。例えば、核膜上や核内のタンパク質、核酸等が解析対象となり、色素(蛍光)染色による形態の観察や、酵素もしくは蛍光色素で標識した抗体、核酸等のリガンドを用いることで、これらの対象を検出できる。本願発明の方法、抗原賦活剤及びキットは、顕微鏡での形態観測、IHC、EIA、CLEIA、デジタルPCRでの解析や、イメージングサイトメーター又はフローサイトメーターによるサイトメトリー解析に利用することができる。特に、本願発明の好ましい実施形態によれば、フローサイトメトリー解析による脱離核中の対象タンパク質の陽性核の割合(特にKi−67陽性率)の算出に利用することが可能である。
そして、このばらつきの少ない指標を用いて、患者に最適な診断レジメンを提供することが可能である。抗がん剤治療はそれ自体患者に対する負担も大きく、患者にあった治療レジメンを治療開始前に決めることは患者のQOL(QualityofLife)を保つ上でも重要である。本願発明の場合、外科手術前の化学治療(術前抗がん剤治療)の治療レジメンに応用できるだけなく、外科手術で腫瘍摘出後の(予後)治療レジメンにも応用できる。
Claims (47)
- 固定化された細胞群中のKi−67陽性細胞核を含む細胞を、抗Ki−67抗体を用いて検出する方法であって、
1)固定化された細胞群を配列番号2のペプチドを認識切断しない加水分解酵素で前処理して抗原を賦活化する工程、その後
2)抗Ki−67抗体を用いて免疫染色する工程、及び
3)染色されたKi−67陽性細胞又はKi−67陽性細胞核を検出する工程を含む、方法。 - 前記抗体が、MIB−1、DAKO−PC、Ki−S5及びA−0047からなる群から選択される少なくとも一種である、請求項1に記載の方法。
- 前記酵素が、トロンビン、Arg−C(クロストリパイン)ペプチターゼ、プロリンエンドペプチターゼ及びヒアルロニダーゼからなる群から選択される少なくとも一種である、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記酵素が、トロンビン及び/又はヒアルロニダーゼであり、前記抗体が、MIB−1である、請求項1に記載の方法。
- 前記固定化された細胞群が、ホルマリン、グルタルアルデヒド、アルコール、アセトン及びそれらの組み合わせからなる群から選択される固定化剤で固定されている、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 工程1)の前に熱処理により賦活化することを含む、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- さらに細胞核を特異的に染色し、染色された細胞核を検出することを含む、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- さらに、抗サイトケラチン抗体を用いてサイトケラチンを免疫染色し、染色された陽性細胞を検出することを含む、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
- さらに抗エストロジェン受容体(ER)抗体及び/又は抗プロゲステロン受容体(PgR)抗体を用いてER及び/又はPgRを免疫染色し、染色された陽性細胞又は陽性細胞核を検出することを含む、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
- さらにHER2遺伝子にハイブリダイズするプローブを用いて、HER2遺伝子が増幅されている細胞又は細胞核を検出することを含む、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。
- 前記固定化された細胞群が組織切片に含まれている、請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法。
- 前記組織切片が、包理剤で包理されており、
前記加水分解酵素で抗原を賦活化する工程の前に、該包理剤を除去し、該組織切片を親水化する工程を含む、請求項11に記載の方法。 - 工程1)と工程2)の間に、前記細胞を破砕して細胞核を抽出する工程を含む、請求項11又は請求項12に記載の方法。
- せん断応力により前記細胞を破砕して、細胞核を抽出する、請求項13に記載の方法。
- 界面活性剤を含む緩衝液中で、前記細胞核を抽出する請求項13又は14に記載の方法。
- 前記界面活性剤が、CHAPS、NP−40、およびTriton−X100から選択される少なくとも一種である、請求項15に記載の方法。
- 前記染色されたKi−67陽性細胞又はKi−67陽性細胞核の数をカウントする、請求項1〜16のいずれか一項に記載の方法。
- 前記Ki−67陽性細胞又は前記Ki−67陽性細胞核を、蛍光染色し、フローサイトメトリーを用いてカウントする、請求項1〜17のいずれかに記載の方法。
- 前記固定化された細胞又は前記組織切片が患者由来である、請求項1〜18のいずれか一項に記載の方法。
- 前記固定化された細胞又は前記組織切片が患者の腫瘍組織由来である、請求項1〜18のいずれか一項に記載の方法。
- 前記固定化された細胞又は前記腫瘍組織が、乳癌細胞又は乳癌組織である、請求項20に記載の方法。
- がんの診断を補助するための、請求項20又は21に記載の方法。
- がん治療の予後を診断するのを補助するための、請求項20又は21に記載の方法。
- 癌の治療レジメンを決定するための方法であって、請求項20又は21に記載の方法により、細胞群内のKi−67陽性細胞の割合を算定し、割合がカットオフ値以上の場合は内分泌療法と化学療法の併用を選択し、割合がカットオフ値未満の場合は、内分泌療法単独を選択する方法。
- 請求項20又は21に記載の方法により、細胞群内のKi−67陽性細胞の割合を算定し、割合がカットオフ値以上の場合は内分泌療法と化学療法の併用を選択し、割合がカットオフ値未満の場合は、内分泌療法単独を選択して、患者に施し、癌を治療する方法。
- 固定化された腫瘍細胞群又は腫瘍組織を配列番号2のペプチドを認識切断しない加水分解酵素で前処理してKi−67を賦活化する方法。
- 配列番号2のペプチドを認識切断しない加水分解酵素を含む、Ki−67を免疫染色で検出する細胞又は組織試料に用いられる抗原賦活化剤。
- 前記酵素が、トロンビン、Arg−C(クロストリパイン)ペプチターゼ、プロリンエンドペプチターゼ及びヒアルロニダーゼからなる群から選択される少なくとも一種である、請求項27に記載の抗原賦活化剤。
- 前記酵素がトロンビン及び/又はヒアルロニダーゼである、請求項28に記載の抗原賦活化剤。
- 配列番号2のペプチドを認識切断しない加水分解酵素を含む、Ki−67及びサイトケラチンを免疫染色で同時検出する細胞又は組織試料に用いられる抗原賦活化剤。
- さらにER及び/又はPgRを免疫染色して検出する細胞又は組織試料に用いられる、請求項27〜30のいずれか一項に記載の抗原賦活化剤。
- さらに、HER2遺伝子を増幅している細胞を検出する試料に用いられる、請求項27〜31のいずれか一項に記載の抗原賦活化剤。
- 固定化された細胞中のKi−67陽性細胞を検出するためのキットであって、
配列番号2のペプチドを認識切断しない加水分解酵素と、
抗Ki−67抗体と
を含む、キット。 - 前記加水分解酵素は、トロンビン、Arg−C(クロストリパイン)ペプチターゼ、プロリンエンドペプチターゼ及びヒアルロニダーゼからなる群から選択される少なくとも一種である、請求項33に記載のキット。
- 前記加水分解酵素は、トロンビン及び/又はヒアルロニダーゼである、請求項34に記載のキット。
- 前記抗Ki−67抗体は、MIB−1、DAKO−PC、Ki−S5及びA−0047からなる群から選択される少なくとも一種である、請求項33〜35のいずれか一項に記載のキット。
- 更に、Ki−67と組み合わせて、がんの診断を補助するため、又はがんの治療の予後を診断するのを補助するために用いられる他のマーカーを検出するためのリガンドを含む、請求項33〜36のいずれか一項に記載のキット。
- 前記リガンドは、抗サイトケラチン抗体、抗ER抗体、抗PgR抗体、及びHER2遺伝子にハイブリダイズするプローブからなる群から選択される少なくとも一種である、請求項37に記載のキット。
- 更に、核染色用の化合物を含む、請求項33〜38のいずれか一項に記載のキット。
- 更に、細胞を分散させるための緩衝液を含み、該緩衝液は、界面活性剤を含有する、請求項33〜39のいずれか一項に記載のキット。
- 更に、熱処理抗原賦活化剤を含む、請求項33〜40のいずれか一項に記載のキット。
- がんの診断を補助するための、請求項33〜41のいずれか一項に記載のキット。
- がん治療の予後を診断するのを補助するための、請求項33〜41のいずれか一項に記載のキット。
- 癌の治療レジメンを決定するための、請求項33〜41のいずれか一項に記載のキット。
- 前記治療レジメンの決定は、細胞群内のKi−67陽性細胞の割合を算定し、割合がカットオフ値以上の場合は内分泌療法と化学療法の併用を選択し、割合がカットオフ値未満の場合は、内分泌療法単独を選択することによって行なわれる、キット。
- せん断応力により固定化された細胞を破砕して細胞核を抽出するためのキットであって、
界面活性剤を含有する細胞分散用緩衝液を含む、キット。 - 水流、超音波などで生じるせん断応力により固定化された細胞を破砕して、細胞核を抽出する方法であって、
該固定化された細胞を界面活性剤を含有する緩衝液に分散して該細胞の破砕を行う、方法。
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