TW202342747A - 具有高穩定性和基因沉默活性的小干擾rna分子的修飾模式 - Google Patents

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Abstract

具有特定修飾模式以改進其干擾效率的小干擾RNA (siRNA)。該修飾模式各包含在每一siRNA之有義股及反義股中所定義之位置處的2’-O甲基修飾、2’-O-氟修飾及硫代磷酸酯(PS)鍵的組合，以及選擇性地5’磷酸酯修飾。

Description

具有高穩定性和基因沉默活性的小干擾RNA分子的修飾模式
參考相關申請案。本申請案係申請補充國際專利申請第PCT/CN2021/135465號於2021年12月3日提申之內容，其全部內容通過引用併入本文中。
本發明係關於一種具有高穩定性和基因沉默活性的小干擾RNA分子的修飾模式。
RNA干擾(RNAi)為一種藉由小干擾RNA (siRNA)介導的序列特異性轉錄後基因沉默過程。相當關注在影響RNAi以特異性地沉默標靶基因表達的能力，以便達到預期的治療效果。
siRNA治療劑所面臨的挑戰顯著。此係因siRNA之固有性質，例如為聚陰離子性質、易受核酸酶切割，以及由於細胞攝入不良及清除速度快而臨床應用困難。已採取對siRNA分子中之核苷酸進行修飾，以增強穩定性及抵抗核酸酶切割。然而，發現許多的siRNA修飾對其等之基因沉默活性具有負面影響。
據此，越來越需要開發具有期望的穩定性及基因沉默活性的有效siRNA。
本揭示內容係至少部分基於開發針對小干擾RNA的特定修飾模式，以在不影響基因沉默活性之情況下增強穩定性且核酸酶消化抗性，並減少脫靶效應。
據此，本揭示內容之一態樣的特點是修飾的小干擾RNA (siRNA)，其包含具有19個核苷酸的有義股及具有21個核苷酸的反義股。有義股、反義股或兩者含有一或多個硫代磷酸酯(PS)鍵。在一些情況下，有義股及反義股形成雙股siRNA，選擇性地在反義股之3’端處具有兩個核苷酸的懸突物。
在一些具體實施例中，反義股含有(i) 7至9個2’-氟修飾的核苷酸，以及(ii) 12至14個2’-O-甲基修飾的核苷酸。舉例而言，反義股在位置2-12、14-16及18之7或多者處可含有2’-氟修飾的核苷酸。替代地或另外，反義股在位置2或3及位置14及選擇性地位置18處可包含2’-氟修飾的核苷酸。在另一實例中，反義股在位置1、2-13及15-21之12或多者處可含有2’-O-甲基修飾的核苷酸。替代地或另外，反義股在位置1、13、17及19-21處可包含2’-O-甲基修飾的核苷酸。在一些情況下，反義股在位置1與2、位置2與3、位置19與20及/或位置20與21之間可含有PS鍵。
在一些情況下，本文揭示之化學上修飾的siRNA (例如，反義股、有義股或兩者)可進一步包含修飾的5’-磷酸酯。在一些實例中，反義股包含修飾的5’磷酸酯。在一些實例中，修飾的5’-磷酸酯為 E-乙烯基膦酸酯或硫代磷酸酯。
在本文揭示之任何修飾的siRNA中，有義股含有(i) 2至5個2’-氟修飾的核苷酸，以及(ii) 11至16個2-O-甲基修飾的核苷酸。舉例而言，有義股在位置5及7-11之二或多者處可含有2’-氟修飾的核苷酸。替代地或另外，有義股在位置5及7-10處或在位置5、7、9及11處包含2’-氟修飾的核苷酸。在另一實例中，有義股在位置1-6、8及10-19之11或多者處可含有2’-O-甲基修飾的核苷酸。替代地或另外，有義股在位置4、6及11-19處包含2’-O-甲基修飾的核苷酸。在實例中，有義股在位置8及10處可進一步包含2’-O-甲基修飾的核苷酸。在又其他實例中，有義股中之位置1-3之一或多者可含有2’-O-甲基修飾的核苷酸。或者，有義股中之位置1-3之一或多者為未修飾的。替代地或另外，有義股可含有2’-去氧核苷酸，其選擇性地位於位置9。在一些情況下，有義股在位置1與2、位置2與3、位置4與5、位置5與6、位置17與18及/或位置18與19之間可含有PS鍵。
在一些具體實施例中，本文揭示之修飾的siRNA的反義股(頂部)及有義股(底部)可具有下式之一者： (i)         5’-mffmmffmmffmmffmmfmmm-3’ 3’-mmmmmmmmmmdffmmmmmm-5’； (ii)        5’-mmfmfmfmfmmmmfmfmfmmm-3’ 3’-mmmmmmmmmffffmfmmmm-5’； (iii)       5’-mmfmfmfmfmmmmfmfmfmmm-3’ 3’-mmmmmmmmmffffmfmrrr-5’； (iv)       5’-mfmfmfmffmmmmfmfmfmmm-3’ 3’-mmmmmmmmmffffmfmrrr-5’ (v)        5’-mfmffmmffmmmmfmfmfmmm-3’ 3’-mmmmmmmmmffffmfmmmm-5’； (vi)       5’-mfmfmfmfmfmfmfmfmfmmm-3’ 3’-mmmmmmmmfmfmfmfmmmm-5’； (vii)      5’-mfmfmfmfmfmfmfmfmfmmm-3’ 3’-mmmmmmmmfmfmfmfmrrr-5’’或 (viii)     5’-mfmfmfmfmfmfmfmfmmmmm-3’ 3’-mmmmmmmmfmfmfmfmrrr-3’；以及 其中m代表2’-O-甲基核苷酸、f代表2’-氟核苷酸、d代表DNA殘基，且r代表未修飾的核苷酸。
在一些實例中，本文揭示之修飾的siRNA的反義股(頂部)及有義股(底部)可具有下式： (i)          5’-m*f*fmmffmmffmmffmmfm*m*m-3’ 3’-m*m*mmmmmmmmdffmmmm*m*m-5’； (ii)         5’-m*m*fmfmfmfmmmmfmfmfm*m*m-3’ 3’-m*m*mmmmmmmffffmfmm*m*m-5’； (iii)        5’-m*m*fmfmfmfmmmmfmfmfm*m*m-3’ 3’-m*m*mmmmmmmffffm*f*mrrr-5’； (iv)        5’-m*f*mfmfmffmmmmfmfmfm*m*m-3’ 3’-m*m*mmmmmmmffffm*f*mrrr-5’ (v)         5’-m*f*mffmmffmmmmfmfmfm*m*m-3’ 3’-m*m*mmmmmmmffffmfmm*m*m-5’； (vi)        5’-m*f*mfmfmfmfmfmfmfmfm*m*m-3’ 3’-m*m*mmmmmmfmfmfmfmm*m*m-5’； (vii)       5’-m*f*mfmfmfmfmfmfmfmfm*m*m-3’ 3’-m*m*mmmmmmfmfmfm*f*mrrr-5’’或 (viii)      5’-m*f*mfmfmfmfmfmfmfmmm*m*m-3’ 3’-m*m*mmmmmmfmfmfm*f*mrrr-3’；以及 其中m代表2’-O-甲基核苷酸、f代表2’-氟核苷酸、d代表DNA殘基、r代表未修飾的核苷酸，且*代表PS鍵。
在一些具體實施例中，本文揭示之任何修飾的siRNA的有義股可綴合至標靶部分體，例如，綴合至N-乙醯基半乳胺糖(GalNAc)。本文亦提供任何修飾的siRNA或包含其之醫藥組合物在製造用於沉默標靶基因表達及治療與標靶基因相關聯疾病之藥劑中的用途。
此外，本揭示內容亦提供一種醫藥組合物，其包含如本文揭示之任何修飾的siRNA及醫藥上可接受之載體。此醫藥組合物可用於沉默由siRNA靶向的基因。
在其他態樣中，本文提供一種用於調控基因表達之方法，其包含以本文揭示之任何修飾的siRNA或包含其之醫藥組合物接觸細胞。在一些具體實施例中，接觸步驟可藉由投予具有與感興趣之基因相關聯之疾病的受試者修飾的siRNA或醫藥組合物而進行。
本揭示內容之一或多個具體實施例的細節在以下描述中闡述。本揭示內容之其他特徵或優勢將從以下圖示及數個具體實施例之詳細描述以及從所附申請專利範圍中顯而易見。
RNA干擾或「RNAi」為雙股RNA (dsRNA)在被導入宿主細胞中時阻斷基因表達的過程(Fire等人(1998) Nature391，806-811)。RNAi中常使用短干擾RNA分子(siRNA)以抑制標靶基因的表達，從而達到預期的治療效果。
siRNA為雙股RNA，包括一條反義股及一條有義股，其等含有互補序列，並形成雙股結構。反義股之至少一部分與標靶mRNA內的區域互補，以經由RNAi阻斷mRNA的表達。siRNA分子之每一股可具有19-23個核苷酸。在一些情況下，每一股可具有磷酸化之5'端及羥基化之3'端。在一些情況下，反義股可具有一對懸突的核苷酸(例如，1或2個)。當siRNA被轉染至細胞中時，其被併入RNA誘導的沉默複合體(RNA-induced silencing complex，RISC)中，其包括核心蛋白質阿爾古(Argonaute，AGO)。隨後，siRNA解纏繞成單股RNA，且反義鏈仍與AGO結合以形成活性RISC，而有義股被降解。反義股與目標轉錄本(mRNA)一起形成鹼基配對，且AGO切割標靶以沉默其功能(基因表達)。
儘管siRNA為用於調節標靶基因表達以達到預期治療效果之具有前景的治療劑，但RNA分子通常易受到體內核酸酶消化的影響，其將削弱其等之臨床應用。將修飾導入RNA分子為增強RNA治療劑穩定性的常用方法。然而，修飾位置及/或修飾水平常會影響所得siRNA的基因沉默活性。因此，非常感興趣的是，針對siRNA設計適當的修飾模式，以增強穩定性及/或核酸酶消化抗性，同時保持期望的基因沉默活性。當相較於未修飾的siRNA對應物，此類修飾亦可減少脫靶效應。
據此，在一些態樣中，本文提供了針對siRNA之特定修飾模式(例如，特定核苷酸修飾與siRNA之有義股及反義股兩者中所定義之位置處的硫代磷酸酯(PS)鍵的組合)，包含此類修飾的siRNA之醫藥組合物，以及其用於沉默標靶基因之表達的用途。
除非另有明確說明，否則本文揭示之核苷酸在核酸鏈(例如，有義股或反義股)中的位置係指來自該核酸鏈之5’端的位置，亦即，以5’端核苷酸作為位置1。
I. siRNA 之修飾模式
在一些態樣中，本揭示內容係有關小干擾核酸分子(siRNA)的特定修飾模式。修飾模式係指修飾輪廓，包括在有義股及反義股中所定義之位置處的特定核苷酸修飾(例如，2’-O-甲基修飾的核苷酸、2’-氟修飾的核苷酸，或其組合)，及/或在有義股及反義股中所定義之位置處的PS鍵。在一些情況下，本文揭示之任何修飾的siRNA之反義股及/或有義股可進一步包含5’-磷酸酯修飾，例如，本文揭示之該等。具有此類修飾模式之siRNA相較於其等之未修飾的對應物顯示出類似或更好的基因沉默活性。此類修飾的siRNA相對於未修飾的對應物亦預期可更穩定及/或更具核酸酶消化抗性。
(A) siRNA 分子：
本揭示內容係有關修飾的siRNA分子，其等為能經由RNAi路徑誘導針對標靶基因轉錄本的高水平基因沉默的雙股RNA，且亦具有高穩定性及/或核酸酶消化抗性。此類修飾的siRNA相較於未修飾的對應物預期在治療上更有效。
修飾的siRNA分子包含有義股及反義股，其具有特定修飾模式。在本文揭示之任何修飾的siRNA分子中，反義股可含有15-30個核苷酸的長度，例如，18-25或19-23個核苷酸的長度。在一實例中，反義股包括21個核苷酸的長度。在另一實例中，反義股包括23個核苷酸的長度。有義股或其之一部分係與反義股或其之一部分(完全地或部分地)互補。在一些情況下，有義股具有與反義股相同的長度。在其他情況下，有義股比反義股短(例如，短1-5個核苷酸，例如短1、2、3、4或5個核苷酸)。在該情況下，反義股在5’端處及/或在3’端處可具有懸突物(例如，1-5個核苷酸)。
在一些具體實施例中，有義股含有19個核苷酸，且反義股含有21個核苷酸。有義股及反義股形成雙股siRNA分子，其在一些情況下，在反義股之3’端處具有兩個核苷酸的懸垂。
在一些具體實施例中，本文揭示之修飾的siRNA中之反義股可包含7-9個(例如，7、8或9個) 2’-氟修飾的核苷酸及12至14個(例如，12、13及14個) 2’-O-甲基修飾的核苷酸。替代地或另外，在修飾的siRNA中之有義股可含有2-5個(例如，2、3、4或5個) 2’-氟修飾的核苷酸及11-16個(例如，11、12、13、14、15或16個) 2’-O-甲基修飾的核苷酸。此修飾的siRNA在有義股中及/或在反義股中可進一步包含一或多個PS鍵。
在一些實例中，反義股包括21個核苷酸。此反義股在位置2-12、14-16及18之7或多者處可具有2’-氟修飾的核苷酸。舉例而言，反義股在位置2或3以及位置14處可具有2’-氟修飾的核苷酸。在一些情況下，反義股在位置2、14及18處具有2’-氟修飾的核苷酸。或者，反義股在位置2、14及18處可具有2’-氟修飾的核苷酸。在特定實例中，反義股：(i) 在位置2、3、6、7、10、11、14、15及18處；(ii) 在位置3、5、7、9、14、16及18處；(iii) 在位置3、5、7、9、14、16及18處；(iv) 在位置2、4、6、8、9、14、16及18處；(v) 在2、4、5、、8、9、14、16及18處；(vi) 在位置2、4、6、8、10、12、14、16及18處；或者(vii) 在位置2、4、6、8、10、12、14或16處可具有2’-氟修飾的核苷酸。
此外，反義股在位置1、2-13及15-21之12或多者處可具有2’-O-甲基修飾的核苷酸。舉例而言，反義股至少在位置1、13、17及19-21處可包含2’-O-甲基修飾的核苷酸。在特定實例中，反義股：(i) 在位置1、4、5、8、9、12、13、16、17及19-21處；(ii) 在位置1、2、4、6、8、10-13、15、17及19-21處；(iii) 在位置1、2、4、6、8、10-13、15、17及19-21處；(iv) 在1、3、5、7、10-13、15、17及19-21處；(v) 在位置1、3、6、7、10-13、15、17及19-21處；(vi) 在1、3、5、7、9、11、13、15、17及19-21處；(vii) 在位置1、3、5、7、9、11、13、15及17-21處可具有2’-O-甲基修飾的核苷酸。
替代地或另外，反義股在位置1與2、位置2與3、位置19與20、位置20與21之間或者其組合可含有PS鍵。在特定實例中，反義股在位置1與2之間、位置2與3之間、位置19與20之間以及位置20-21之間可具有PS鍵。
在一些實例中，本文揭示之任何修飾的siRNA之有義股可包括19個核苷酸。此有義股在位置5及7-11之二或多者處可具有2’-氟修飾的核苷酸。舉例而言，有義股在位置5及7-10處可包含2’-氟修飾的核苷酸。或者，有義股在位置5、7、9及11處可包含2’-氟修飾的核苷酸。在特定實例中，有義股：(i) 在位置7及8處；(ii) 在位置5及7-10處；或者(iii) 在位置5、7、9及11處可具有2’-氟修飾的核苷酸。
此外，本文揭示之修飾的siRNA之任一者的有義股在位置1-6、8及10-19之11或多者處可具有2’-O-甲基修飾的核苷酸。舉例而言，有義股在位置4、6及11-19處可包含2’-O-甲基修飾的核苷酸。在一些情況下，有義股在位置8及10處可進一步包含2’-O-甲基修飾的核苷酸。在其他實例中，有義股在位置1-3處可包含2’-O-甲基修飾的核苷酸。或者，有義股在位置1-3之一或多者處(例如，所有的位置1-3處)可包含未修飾的核苷酸。在特定實例中，有義股：(i) 在位置1-6及10-19處；(ii) 在位置1-4、6及11-19處；(iii) 在位置4、6及11-19處；或者(iv) 在位置4、6、8、10及12-19處可含有2’-O-甲基修飾的核苷酸。
替代地或另外，有義股在位置1與2、位置2與3、位置4與5、位置5與6、位置17與18、位置18與19之間或者其組合可含有PS鍵。在一些實例中，有義股在位置1與2之間、在位置2與3之間、在位置17與18之間，以及在位置18與19之間可含有PS鍵。在其他實例中，有義股在位置4與5之間、在位置5與6之間、在位置17與18之間，以及在位置18與19之間可含有PS鍵。
(B) 5’- 磷酸酯修飾
在一些具體實施例中，本文揭示之任何修飾的siRNA在有義股處、在反義股處或兩者可進一步包含5’-磷酸酯修飾。在一些實例中，反義股包含5’-磷酸酯修飾，而有義股則無此修飾。在一些實例中，有義股包含5’-磷酸酯修飾，而反義股則無此修飾。在一些實例中，反義股及有義股兩者皆包含5’-磷酸酯修飾。
5’-磷酸酯修飾係指在5’端磷酸酯殘基中之適用部分體的一或多個取代。實例包括，但不限於， E-乙烯基膦酸酯(5′- E-VP)、 Z-乙烯基膦酸酯(5′- Z-VP)、5′-甲基膦酸酯、5′-C-甲基類似物，以及硫代磷酸酯。在一實例中，5’-磷酸酯修飾為5’-E-VP。在另一實例中，5’-磷酸酯修飾為硫代磷酸酯。參閱 圖 2B。
(C) 其他修飾
在一些具體實施例中，本文揭示之修飾的siRNA僅含有2’-氟修飾的核苷酸、2’-O-甲基修飾的核苷酸，以及PS鍵，選擇性地在有義股中之2’去氧核苷酸，如本文所揭示的不具有進一步之修飾。
或者，修飾的siRNA之反義股、有義股或兩者可進一步包含其他修飾，例如糖修飾、核鹼基修飾、骨架修飾，或其組合。舉例而言，有義股可含有2’-去氧核苷酸。當有義股具有19個核苷酸時，2’-去氧核苷酸可位於位置9。此類修飾可賦予一或多個期望的性質，例如，增強的細胞攝入、改進的對標靶核酸之親和力、增加的體內穩定性、增強體內穩定性(例如，核酸酶降解抗性)，及/或降低免疫原性。
在一實例中，本文揭示之修飾的siRNA (例如，在有義股及/或反義股中)在不同於PS核苷酸間鍵之位置處可具有修飾的骨架，包括該等保留磷原子的鍵(參閱，例如，美國專利第3,687,808；4,469,863；5,321,131；5,399,676；以及5,625,050號)，以及該等不具有磷原子的鍵(參閱，例如，美國專利第5,034,506；5,166,315；以及5,792,608號)。含磷之修飾骨架的實例包括，但不限於，具有3'-5'鍵聯或2'-5'鍵聯的硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、胺基烷基磷酸三酯、甲基及其他烷基膦酸酯，包括3'-亞烷基膦酸酯、5'-亞烷基膦酸酯及手性膦酸酯、次膦酸酯、氨基磷酸酯，包括3'-胺基氨基磷酸酯及胺基烷基氨基磷酸酯、硫代氨基磷酸酯、硫代烷基膦酸酯、硫代烷基磷酸三酯、硒代磷酸酯，以及硼酸磷酸酯。此類骨架亦包括具有相反極性的該等，亦即，3'至3'、5'至5'，或2'至2'鍵聯。透過短鏈烷基或環烷基核苷酸間鍵聯、混合的雜原子與烷基或環烷基核苷間鍵聯，或一或多個短鏈雜原子或雜環核苷酸間鍵聯而形成不包括磷原子的修飾骨架。此類骨架包括具有嗎啉代鍵聯的骨架(部分由核苷之糖部分所形成)；矽氧烷骨架；硫化物、亞碸及碸骨架；甲醯基及硫代甲醯基骨架；亞甲基甲醯基及硫代甲醯基骨架；核醣乙醯基骨架；含烯烴骨架；胺基磺酸鹽骨架；亞甲基亞胺基及亞甲基聯胺基骨架；磺酸鹽及磺醯胺骨架；醯胺骨架；以及其他混合了N、O、S及CH 2組分部分者。在一些實例中，本文揭示之修飾的siRNA不包括任何骨架修飾，除了本文揭示之PS核苷酸間鍵以外。
在另一實例中，本文揭示之修飾的siRNA (例如，在有義股及/或反義股中)包括一或多個取代的糖部分體。此類取代的糖部分體可在其等之2'位置包括下列基團之一者：OH；F；O-烷基、S-烷基、N-烷基、O-烯基、S-烯基、N-烯基；O-炔基、S-炔基、N-炔基，以及O-烷基-O-烷基。在彼等基團中，烷基、烯基及炔基可為取代的或未取代的C1至C10烷基或C2至C10烯基以及炔基。其等亦可在其等之2'位置處包括雜環烷基、雜環烷基芳基、胺基烷基胺基、聚烷基胺基、取代的甲矽烷基、RNA切割基團、報導子基團、螯合劑、用於改進寡核苷酸之藥物動力學性質的基團，或者用於改進寡核苷酸之藥效動態學性質的基團。較佳之取代的糖部分體包括具有2'-甲氧基乙氧基、2'-二甲基胺基氧基乙氧基，以及2'-二甲基胺基乙氧基乙氧基的該等。參閱Martin等人，Helv. Chim. Acta，1995，78，486-504。
替代地或另外，本文揭示之修飾的siRNA (例如，在有義股及/或反義股中)包括一或多種修飾的原始核鹼基(亦即，腺嘌呤、鳥嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶及尿嘧啶)。修飾的核鹼基包括在美國專利第3,687,808號、The Concise Encyclopedia of Polymer Science and Engineering，第858-859頁、Kroschwitz, J.I.編輯，John Wiley＆Sons，1990年、Englisch等人，Angewandte Chemie，國際版，1991，30，613，以及Sanghvi，Y. S.，第15章，Antisense Research and Applications，第289-302頁，CRC Press出版社，1993年中描述的該等。彼等核鹼基中之某些特別適合用於增加干擾RNA分子與其等之標靶位點的結合親和力。彼等包括5-取代的嘧啶、6-氮雜嘧啶以及N-2、N-6及O-6取代的嘌呤(例如，2-胺基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶及5-丙炔基胞嘧啶)。參閱Sanghvi等人編輯，Antisense Research and Applications，CRC Press，Boca Raton，1993，第276-278頁)。
替代地或另外，本文揭示之修飾的siRNA (例如，在有義股及/或反義股中)可包含一或多個鎖核酸(locked nucleic acid，LNA)。LNA常稱為不可及RNA (inaccessible RNA)，為一種修飾的RNA核苷酸，其中核醣部分體係以連接2'氧與4’碳之額外的橋聯進行修飾。此橋聯「鎖住」3’-內(North)構形中的核醣，其常在A型雙鏈中找到。LNA核苷酸可用於任何本文揭示之修飾的siRNA中。在一些實例中，在干擾RNA中有至多50% (例如，40%、30%、20%或10%)的核苷酸為LNA。
(D) siRNA 之示例性修飾模式
在一些實例中，在 圖 1所示之有義股中，本文揭示之修飾的siRNA可具有2’-氟及2’-O-甲基修飾模式之一者。在其他實例中，在 圖 1所示之反義股中，本文揭示之修飾的siRNA可具有2’-氟及2’-O-甲基修飾模式之一者。在特定實例中，在 圖 1所示之有義股及反義股中，本文揭示之修飾的siRNA可具有2’-氟及2’-O-甲基修飾模式之一者。亦如 圖 1所示，此修飾的siRNA可進一步包含有義股及/或反義股之PS鍵的修飾模式。亦參閱本文揭示之反義股及有義股的分子式。未表明PS鍵或其他骨架修飾的分子式表示涵蓋不具有骨架修飾的股以及具有任何類型之骨架修飾的股。
其他特定示例性修飾的siRNA係提供於以下實施例1及2中，其亦落入本揭示內容之範疇內。
在一些態樣中，本文所述之任何修飾的siRNA分子可被綴合至配體(標靶部分體)或包封至載劑中，其可促進修飾的siRNA遞送至期望的細胞/組織，及/或促進細胞攝入。適用之配體包括，但不限於，碳水化合物、胜肽、抗體、聚合物、小分子、膽固醇及適體(aptamer)。舉例而言，一或多個GalNAc部分體(例如，三-GalNAc部分體)可用作標靶部分體，用於將修飾的siRNA遞送至肝細胞。
(E) 標靶基因
如本文揭示之修飾的siRNA係用於抑制標靶基因的表達，其之轉錄本(mRNA)含有與修飾的siRNA中之反義股互補的區域。據此，可基於標靶基因之mRNA序列設計反義股及有義股的序列。在一些情況下，反義股可與標靶基因之mRNA內的標靶區域完全互補。在其他情況下，反義股可與標靶基因之mRNA內的標靶區域部分互補(例如，含有一或多個誤配(mismatch)或缺口(gap))，只要互補水平足以與標靶區域進行鹼基配對，其在本領域技術人員之知識範圍內。
在一些具體實施例中，本文揭示之修飾的siRNA的標靶基因為致病基因。舉例而言，標靶基因可為病原體(例如，病毒、細菌或真菌)的基因。在其他實例中，標靶基因係涉及疾病或病症，例如，癌症、免疫病症(例如，自體免疫疾病)、代謝病症或疾病、心血管病症或疾病，以及其他遺傳性病症或疾病。
在一些實例中，修飾的siRNA沉默了涉及癌症之標靶基因的表達。示例性癌症相關聯之標靶基因包括，但不限於，HIF1A、HIF2、IGF1R、VEGF、EREG、KRAS、ALK、BRAF、NRAS、STAT3、CDH2、KIFL1、PIK3CA、Src、RAS、RAF，以及TP53。
在一些實例中，修飾的siRNA沉默了涉及纖維化之標靶基因的表達。示例性纖維化相關聯之標靶基因包括，但不限於，HIF1A、HIF1B、HIF2、TGF-β1，以及CTGF。
在一些實例中，修飾的siRNA沉默了涉及代謝疾病之標靶基因的表達。示例性代謝相關聯之標靶基因包括，但不限於，AGT、ApoC-III，以及apoB。
在一些實例中，修飾的siRNA沉默了涉及免疫疾病(例如，自體免疫疾病)之標靶基因的表達。示例性免疫疾病相關聯之標靶基因包括，但不限於，GATA-3、CCR3、TGF-β1、IL-6、TNF-α、IFN-γ、IL-1β、CCL2，以及CCL10。
在一些實例中，修飾的siRNA可靶向病毒之基因體或其中所表達的mRNA，例如，冠狀病毒(例如，SARS-CoV2)之基因體及/或mRNA。在一些情況下，修飾的siRNA可沉默病毒蛋白質(例如，B型肝炎病毒蛋白質(例如，HBx))的表達。
III. 醫藥組合物
如本文揭示之任何修飾的siRNA分子可配製成適用之醫藥組合物。如本文所述之醫藥組合物可進一步包含呈凍乾製劑或水溶液形式的醫藥上可接受之載體、賦形劑或穩定劑。Remington: The Science and Practice of Pharmacy 第20版(2000) Lippincott Williams and Wilkins, Ed. K. E. Hoover。此類載體、賦形劑或穩定劑可增強本文所述組合物中之活性成分的一或多個性質，例如生物活性、穩定性、生體可用率，以及其他藥物動力學及/或生物活性。
可接受之載體、賦形劑或穩定劑在所使用之劑量及濃度下對受體無毒，且可包含緩衝劑，例如，磷酸鹽、檸檬酸鹽，以及其他有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸及甲硫胺酸；防腐劑(例如，十八烷基二甲基芐基氯化銨；六甲基氯化銨；苯扎氯銨、芐索氯銨；苯酚、丁醇或芐醇；對羥基苯甲酸烷基酯，例如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯；鄰苯二酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇；苯甲酸酯、山梨酸酯及間甲酚)；低分子量(少於約10個殘基)多胜肽；蛋白質，例如，血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；胺基酸，例如甘胺酸、麩醯胺酸、天門冬醯胺酸、組胺酸、精胺酸或離胺酸；單醣、雙醣，以及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或右旋糖酐；螯合劑，例如EDTA；糖類，例如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成鹽相對離子，例如鈉；金屬錯合物(例如，鋅-蛋白錯合物)；及/或非離子性界面活性劑，例如TWEEN TM(聚山梨醇酯)、PLURONICS TM(非離子性界面活性劑)或聚乙二醇(PEG)。
在一些實例中，本文所述之醫藥組合物包括賦形劑，該賦形劑可包括，但不限於，三氯一氟甲烷、二氯二氟甲烷、二氯四氟乙烷、氯五氟乙烷、一氯二氟乙烷、二氟乙烷、四氟乙烷、七氟丙烷、八氟環丁烷、純水、乙醇、丙二醇、甘油、PEG (例如，PEG400、PEG 600、PEG 800及PEG 1000)、脫水山梨糖醇三油酸酯(sorbitan trioleate)、大豆卵磷脂、卵磷脂、油酸、聚山梨醇酯80 (Polysorbate 80)、硬脂酸鎂及月桂硫酸鈉、對羥基苯甲酸甲酯(methylparaben)、對羥基苯甲酸丙酯(propylparaben)、氯丁醇、苯扎氯銨、氯化十六烷基吡啶(cetylpyridinium chloride)、百里酚(thymol)、抗壞血酸、亞硫酸氫鈉(sodium bisulfite)、焦亞硫酸鈉(sodium metabisulfite)、EDTA、氫氧化鈉、三羥甲基氨基甲烷(tromethamine)、氨、HCl、H 2SO 4、HNO 3、檸檬酸、CaCl 2、CaCO 3、檸檬酸鈉、氯化鈉、乙二胺四乙酸二鈉(disodium EDTA)、糖精(saccharin)、薄荷醇(menthol)、甘胺酸、離胺酸、明膠、聚維酮K25 (povidone K25)、二氧化矽、二氧化鈦、氧化鋅、乳糖、乳糖單水合物、無水乳糖、甘露醇及右旋糖。
在其他實例中，本文所述之醫藥組合物可配製成持續釋放型製劑。持續釋放型製劑之適用實例包括固體疏水性聚合物之半滲透基質，該基質呈成形製品形式，例如膜或微膠囊。持續釋放型基質之實例包括聚酯、水凝膠(例如，聚(甲基丙烯酸2-羥基乙酯)或聚(乙烯醇))、聚乳酸交酯(美國專利第3,773,919號)、L-麩胺酸與7乙基-L-麩胺酸酯之共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物(例如，LUPRON DEPOT TM(由乳酸-乙醇酸共聚物及亮丙立德乙酸酯(leuprolide acetate)構成的可注射微球體))、蔗糖醋酸異丁酸酯，以及聚-D-(-)-3-羥基丁酸。
用於體內投予之醫藥組合物必須是無菌的。舉例而言，可透過無菌過濾膜過濾而易於完成滅菌。治療性組合物通常置於具有無菌存取口(sterile access port)的容器中，例如，靜脈注射溶液袋，或具有可被皮下注射針頭(hypodermic injection needle)刺穿的瓶塞之藥劑瓶，或可以手動操作的密封容器。
本文所述之醫藥組合物可為單位劑型，例如固體、溶液或懸浮液，或栓劑，用於藉由吸入或吹入(insufflation)、鞘內、肺內或腦內途徑、口服、腸胃外或直腸投予。
針對製備固體組合物，可將主要活性成分與醫藥載體混合，例如常規壓片成分，例如玉米澱粉、乳糖、蔗糖、山梨糖醇、滑石粉、硬脂酸、硬脂酸鎂、磷酸二鈣(dicalcium phosphate)或樹膠(gums)，以及其他醫藥稀釋劑，例如水，以形成含有本發明化合物之勻相混合物的固體預製劑組合物，或其無毒之醫藥上可接受之鹽。當該等預製劑組成物被稱為勻相時，係指將活性成分均勻地分散在整個組合物中，使得該組合物可易於細分為等效的單位劑型，例如粉劑、片劑、丸劑及膠囊劑。隨後，此固體預製劑組合物被細分為上述類型的單位劑型，其含有適用量之組合物的活性成分。
適用之表面活性劑特別包括非離子劑，例如聚氧乙烯山梨醇(例如，TWEEN ®20、40、60、80或85)以及其他山梨醇酐(例如，SPAN ®20、40、60、80或85)。具有表面活性劑之組合物將便於包含介於0.05與5%之間的表面活性劑，例如介於0.1與2.5%之間。應當理解，在必要時，亦可添加其他成分，例如甘露醇或其他醫藥上可接受之載劑。
適用之乳化劑可使用市售的脂肪乳劑，例如INTRALIPID™、LIPOSYN™、INFONUTROL™、LIPOFUNDIN™及LIPIPHYSAN™，製備。活性成分可溶於預先混合的乳化劑組合物或替代地其可溶於油脂(例如，大豆油、紅花油(safflower oil)、棉籽油(cottonseed oil)、芝麻油(sesame oil)、玉米油，或杏仁油(almond oil))中，且在與磷脂質(例如，卵磷脂(egg phospholipid)、大豆磷脂(soybean phospholipid)或大豆卵磷脂(soybean lecithin))及水混合後形成乳化劑。應當理解，可添加其他成分，例如甘油或葡萄糖，以調整乳化劑的張力。適用之乳化劑一般含有至多20%油脂，例如，介於5與20%之間。
用於吸入或吹入的醫藥組合物包括溶解或懸浮在藥學上可接受之水溶液或有機溶劑或者其混合物中的溶液及懸浮液，以及粉末。液體或固體組合物可含有如前述之適用醫藥上可接受之賦形劑。在一些具體實施例中，可藉由口服或鼻部呼吸途徑投予組合物，以達到局部或全身性效果。在一些具體實施例中，組合物由介於10 nm至100 mm之間的粒徑組成。
在較佳之無菌、藥學上可接受之溶劑中的組合物可藉由使用氣體而霧化。霧化的溶液可直接藉由霧化裝置吸入，或霧化裝置可附接至面罩、帳篷、氣管內導管及/或間歇性正壓呼吸機(呼吸器)上。可從能以適當方式遞送製劑的裝置較佳地經口或經鼻投予溶液、懸浮液或粉末組合物。
在一些具體實施例中，任何修飾的siRNA分子可被包封或附接在微脂體上，其可由本領域已知之方法製備，例如於Epstein等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688 (1985年)；Hwang等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4030 (1980年)；以及美國專利第4,485,045及4,544,545號中之描述。具有增強的循環時間之微脂體係揭示於美國專利第號5,013,556中。特別適用之微脂體可藉由逆相蒸發法而利用包含磷脂醯膽鹼、膽固醇及經PEG衍生之磷脂醯乙醇胺(PEG-PE)的脂質組合物產生。微脂體經由孔隙尺寸限定的過濾器擠出，以產生具有預期直徑的微脂體。
在一些具體實施例中，亦可將任何修飾的siRNA分子裹入(例如，藉由凝聚(coacervation)技術或藉由介面聚合)所製備之微膠囊中，例如，羥甲基纖維素或明膠微膠囊及聚(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊，分別地，在膠狀藥物遞送系統(例如，微脂體、白蛋白微球體、微乳液、奈米顆粒及奈米膠囊)中或在粗滴乳狀液(macroemulsion)中。此類技術係本領域中已知，參閱，例如，Remington，The Science and Practice of Pharmacy 第一版，Mack Publishing (2000年)。
包含本文揭示之修飾的siRNA分子之任何醫藥組合物可進一步包含一組分，該組分增強了組合物從胞內體及/或溶酶體運輸至細胞質。實例包括pH敏感劑(例如，pH敏感胜肽)。
在一些具體實施例中，本文之任何醫藥組合物可進一步包含基於組合物之意欲治療用途的第二治療劑。
IV. 抑制標靶基因表達
本文揭示之任何修飾的siRNA分子可用於抑制體內或體外的標靶基因表達。
為了實施本文揭示之方法，可經由適用途徑將有效量之本文所述醫藥組合物(其包含修飾的siRNA分子)投予有治療需求之受試者(例如，人類)，該適用之途徑例如靜脈內投予(例如，以推注)或藉由在一段時間內連續輸注、藉由肌肉內、腹膜內、脊髓內、皮下、關節內、滑膜內、鞘內、口服、吸入或局部途徑。市售的用於液體製劑之噴霧器，包括噴射噴霧器及超音波噴霧器可用於投予。液體製劑可直接霧化，而凍乾粉末可在重構後霧化。
如本文所用，「有效量」係指單獨或與一或多種其他活性劑組合而賦予受試者治療效果所需的每一活性劑的量。如本領域技術人員所認識的，有效量取決於所治療的特定病症、病症的嚴重程度，包括年齡、身體狀況、大小、性別及體重的個體患者參數、治療持續時間、並行治療之性質(若有的話)、特定的投予途徑，以及衛生從業人員的知識及專長內的類似因素。彼等因素為本領域普通技術人員習知，且僅透過常規實驗即可解決。通常較佳為使用單個組分或其組合的最大劑量，亦即，根據合理醫學判斷的最高安全劑量。
半衰期之類的經驗因素通常將有助於確定劑量。投予頻率可在治療過程中確定並調整，且通常但非必要地，基於目標疾病/病症之治療及/或抑制及/或改善及/或延遲。或者，修飾的siRNA之持續的連續型釋放製劑可能是合適的。用於達到持續釋放的各種製劑及裝置為本領域已知。
一般而言，針對投予本文所述之任何修飾的siRNA分子，初始候選劑量可為約2 mg/kg。針對本揭示內容之目的，典型的每日劑量可為約0.1 µg/kg至3 µg/kg至30 µg/kg至300 µg/kg至3 mg/kg，至30 mg/kg至100 mg/kg或更多之任何範圍內，取決於上述因素。針對數天或更長時間的重複投予，取決於病況，持續治療直至出現預期的症狀抑制或直至達到足夠的治療水平，以減輕目標疾病或病症，或者其症狀。示例性投劑方案包括投予約2 mg/kg的初始劑量，隨後每週維持約1 mg/kg之siRNA的劑量，或隨後每隔一週維持約1 mg/kg的劑量。然而，其他劑量方案可能有用，其取決於從業人員希望達到的藥物動力學衰減模式。舉例而言，考量了每週投劑一至四次。在一些具體實施例中，可使用約3 µg/mg至約2 mg/kg (例如，約3 µg/mg、約10 µg/mg、約30 µg/mg、約100 µg/mg、約300 µg/mg、約1 mg/kg及約2 mg/kg)的投劑範圍。在一些具體實施例中，投劑頻率為每週一次、每2週一次、每4週一次、每5週一次、每6週一次、每7週一次、每8週一次、每9週一次或每10週一次；或者每月一次、每2個月一次或每3個月一次，或更長時間。此療法之進展很容易藉由常規技術及試驗進行監控。投劑方案可隨時間而變。
在一些具體實施例中，針對體重正常的成年患者，可投予約0.3至5.00 mg/kg之範圍內的劑量。特定劑量方案，亦即劑量、時間以及施用次數，將取決於特定個體及該個體的病史，以及個別試劑之性質(例如，試劑之半衰期，以及本領域習知之其他考量因素)。
針對本揭示內容之目的，如本文所述之修飾的siRNA之適當劑量將取決於疾病/病症的類型以及嚴重性、是否出於預防或治療目的而投予修飾的siRNA、先前的治療、患者的臨床病史以及對拮抗劑的反應，以及主治醫師的判斷。臨床醫生可投予修飾的siRNA分子，直至達到期望結果的劑量為止。在一些具體實施例中，期望的結果為腫瘤負荷減少、癌細胞減少，或增加的免疫活性。
確定劑量是否產生期望結果的方法對本領域技術人員將是顯而易見的。一或多種修飾的siRNA分子之投予可為連續的或間歇的，其取決於例如接受者的生理狀況、投予之目的為治療性的或預防性的，以及本領域技術人員已知之其他因素。修飾的siRNA分子之投予可在預定的時段內基本上連續進行，或者可以一系列間隔的劑量進行，例如在發展成目標疾病或病症之前、期間或之後。
如本文所用，「治療」乙詞係指將包括一或多種活性劑的組合物施用或投予受試者，其患有目標疾病或病症，該疾病/病症之症狀，或該疾病/病症的傾向，目的在於治療、治癒、減輕、緩解、改變、補救、改善、增進或影響疾病、疾病症狀，或疾病或疾病的傾向。
緩和目標疾病/病症包括延遲該疾病的進程或進展，或降低疾病嚴重性。緩和疾病不一定要有具有療效的結果。如本文所用，「延遲」目標疾病或病症的發展係指延緩(defer)、阻止(hinder)、減緩(slow)、推遲(retard)、穩定(stabilize)，及/或延長疾病的進程。延遲的時間長度可取決於被治療之個體及/或該疾病的病史。「延遲」或緩和疾病之發展的方法，或延遲該疾病發作的方法，係指在一給定時間框架內減低疾病一或多種症狀發展的機率及/或減低症狀之程度的方法(相較於未使用該方法的狀況而言)。通常基於透過能提供統計學上顯著結果之數量的受試者所進行的臨床研究來達成此類比較。
疾病的「發展」或「進程」係指疾病的初始表現及/或該疾病隨後的發展。疾病的發展可透過本領域技術人員習知之標準臨床技術而檢測及評估。然而，疾病的發展亦指無法覺察的疾病進程。針對本發明之目的，疾病發展或疾病進程係指症狀的生物演進。「發展」包括發生、復發及發作。如本文所用，一目標疾病或病症的「發作」或「發生」包含初始的發病及/或復發。
可使用醫學領域普通技術人員已知的常規方法將醫藥組合物投予受試者。此組合物亦可經由其他常規途徑投予，例如，口服、胃腸外、藉由吸入噴霧、局部、直腸、鼻、頰、陰道或經由植入的貯庫投予。如本文所用，「腸胃外」乙詞包括皮下、皮內、靜脈內、肌內、關節內、動脈內、腫瘤內、滑膜內、胸骨內、鞘內、病變內，以及顱內注射或輸注技術。此外，亦可經由可注射貯庫投予途徑，例如使用1、3或6個月的可注射貯庫或可生物降解材料及方法而投予受試者。在一些具體實施例中，組合物可經由鼻部途徑投予，例如，鼻內噴霧劑、鼻部噴霧劑，或鼻部滴劑。
可注射組合物可含有各種載體，例如，植物油、二甲基乙醯胺、二甲基甲醯胺、乳酸乙酯、碳酸乙酯、肉荳蔻酸異丙酯、乙醇，以及多元醇(甘油、丙二醇、液態聚乙二醇等)。針對靜脈內注射，可藉由滴注法投予修飾的siRNA，由此輸注含有干擾RNA及生理學上可接受之賦形劑的醫藥製劑。生理學上可接受之賦形劑可包括，例如，5%右旋糖、0.9%鹽水、林格氏溶液或其他適用之賦形劑。可將肌內製劑(例如，本文揭示之修飾的siRNA的適用可溶性鹽類形式的無菌製劑)溶解並在醫藥賦形劑(例如，注射用水、0.9%鹽水或5%葡萄糖溶液)中投予。
在一具體實施例中，經由位點特異性或標靶的局部遞送技術投予修飾的siRNA分子。位點特異性或標靶的局部遞送技術之實例包括治療性RNA分子或局部遞送導管的各種可植入貯庫來源，例如，輸液導管、留置導管或針導管、合成移植物、外膜、分流器以及支架或其他可植入設備、特定部位的載體、直接注射或直接施用。參閱，例如，PCT公開第WO 00/53211號以及美國專利第5,981,568號。
亦可使用含有聚核苷酸、表達載體或亞基因體聚核苷酸之治療性組合物的標靶遞送。受體介導之DNA遞送技術係描述於，例如，Findeis等人，Trends Biotechnol. (1993年) 11:202；Chiou等人，Gene Therapeutics: Methods And Applications Of Direct Gene Transfer (J. A. Wolff編輯) (1994年)；Wu等人，J. Biol. Chem. (1988年) 263:621；Wu等人，J. Biol. Chem. (1994年) 269:542；Zenke等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1990年) 87:3655；Wu等人，J. Biol. Chem. (1991年) 266:338中。
在一些具體實施例中，任何修飾的siRNA分子，或包含其之醫藥組合物可藉由肺部遞送系統投予，亦即，活性醫藥成分係投予至肺臟。肺部遞送系統可為吸入器系統。在一些具體實施例中，吸入器系統為加壓定量吸入器、乾燥粉末吸入器，或噴霧器。在一些具體實施例中，吸入器系統係具有隔片(spacer)。
在一些具體實施例中，加壓定量吸入器包括推動劑、共溶劑及/或界面活性劑。在一些具體實施例中，推動劑係選自於包含例如三氯一氟甲烷、二氯二氟甲烷、二氯四氟乙烷、氯五氟乙烷、一氯二氟乙烷、二氟乙烷、四氟乙烷、七氟丙烷、八氟環丁烷等氟化烴之群組。在一些具體實施例中，共溶劑係選自於包含純水、乙醇、丙二醇、甘油、PEG400、PEG 600、PEG 800及PEG 1000之群組。在一些具體實施例中，界面活性劑或潤滑劑係選自於包含脫水山梨糖醇三油酸酯、大豆卵磷脂、卵磷脂、油酸、聚山梨醇酯80、硬脂酸鎂及月桂硫酸鈉之群組。在一些具體實施例中，防腐劑或抗氧化劑係選自於包含對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯、氯丁醇、苯扎氯銨、氯化十六烷基吡啶、百里酚、抗壞血酸、亞硫酸氫鈉、焦亞硫酸鈉、硫酸氫鈉、EDTA之群組。在一些具體實施例中，pH調整劑或張力調整劑係選自於包含氫氧化鈉、三羥甲基氨基甲烷、氨、HCl、H 2SO 4、HNO 3、檸檬酸、CaCl 2、CaCO 3之群組。
在一些具體實施例中，乾燥粉末吸入器包括分散劑。在一些具體實施例中，分散劑或載體顆粒係選自於包含乳糖、乳糖單水合物、無水乳糖、甘露醇、右旋糖之群組，其等之粒徑為約1-100 µm。
在一些具體實施例中，噴霧器可包括共溶劑、界面活性劑、潤滑劑、防腐劑及/或抗氧化劑。在一些具體實施例中，共溶劑係選自於包含純水、乙醇、丙二醇、甘油、PEG (例如，PEG400、PEG600、PEG800及/或PEG 1000)之群組。在一些實例中，界面活性劑或潤滑劑係選自於包含脫水山梨糖醇三油酸酯、大豆卵磷脂、卵磷脂、油酸、硬脂酸鎂及月桂硫酸鈉之群組。在一些實例中，防腐劑或抗氧化劑係選自於包含對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯、氯丁醇、苯扎氯銨、氯化十六烷基吡啶、百里酚、抗壞血酸、亞硫酸氫鈉、焦亞硫酸鈉、硫酸氫鈉、EDTA之群組。在一些實例中，噴霧器進一步包括pH調整劑或張力調整劑，其係選自於包含氫氧化鈉、三羥甲基氨基甲烷、氨、HCl、H 2SO 4、HNO 3、檸檬酸、CaCl 2、CaCO 3之群組。
在一些具體實施例中，能產生抗HIF1a干擾RNA的DNA分子或包含其之醫藥組合物可用於沉默HIF1a的表達。在基因療法方案中，可將包含此DNA分子(例如，載體)之醫藥組合物以約100 ng至約200 mg之範圍內的DNA局部投予有治療需求之受試者。在一些具體實施例中，在基因療法方案期間，亦可使用約500 ng至約50 mg、約1 µg至約2 mg、約5 µg至約500 µg，以及約20 µg至約100 µg或更多之濃度範圍內的DNA。
在一些具體實施例中，能產生抗SARS-CoV干擾RNA的DNA分子或包含其之醫藥組合物可用於沉默SARS-CoV2基因。在基因療法方案中，可將包含此DNA分子(例如，載體)之醫藥組合物以約100 ng至約200 mg之範圍內的DNA局部投予有治療需求之受試者。在一些具體實施例中，在基因療法方案期間，亦可使用約500 ng至約50 mg、約1 µg至約2 mg、約5 µg至約500 µg，以及約20 µg至約100 µg或更多之濃度範圍內的DNA。
本文中使用的「約」或「大約」等詞係指在本領域普通技術人員所確定之特定值的可接受誤差範圍內，其將部分取決於該值是如何被測量或確定的，亦即，測量系統之限制。舉例而言，根據本領域中之實施，「約」可指在可接受的標準偏差內。或者，「約」可指一給定值之至多± 20%，較佳為至多± 10%，更佳為至多± 5%，且又更佳為至多± 1%的範圍。或者，特別是關於生物系統或過程，該詞可指一值在一個數量級內，較佳為在2倍以內。在申請案及申請專利範圍中所述之特定值的情況下，除非另有說明，否則「約」乙詞是隱含的，且在上下文中係指特定值在可接受的誤差範圍內。
欲藉由任何修飾的siRNA分子治療之受試者可患有或疑似患有與標靶基因相關聯之疾病，可藉由修飾的siRNA分子而達到抑制該疾病(參閱上面揭示的標靶基因)。「受試者」、「個體」及「患者」等詞在本文中可互換使用，且係指正在接受治療評估及/或接受治療的哺乳動物。受試者可為人類，但亦包括其他哺乳動物，特別是該等可用作人類疾病之實驗室模型的哺乳動物，例如小鼠、大鼠、兔、狗、猴等。需要治療的人類受試者可為患有、有風險或疑似患有目標疾病/病症(例如，腫瘤)的人類患者。
本文揭示之任何修飾的siRNA分子可用於治療與標靶基因相關聯之疾病或病症。示例性疾病包括，但不限於，癌症、纖維化、代謝疾病、心血管疾病、免疫疾病，或遺傳病症。
如本文揭示之任何修飾的干擾RNA可用於治療與干擾RNA標靶之基因相關聯的疾病或病症。實例包括，但不限於，實體瘤、癌症、缺血性心臟病、鬱血性心衰竭、急性肺損傷、肺動脈高壓、肺部纖維化、慢性阻塞性肺病、急性肝衰竭、肝臟纖維化與肝硬化、急性腎損傷、慢性腎病、肥胖症以及糖尿病。
任何本文揭示之修飾的siRNA可與一或多種額外的治療劑一起用於合併療法以治療目標疾病。如本文所用，合併療法乙詞包含依序投予彼等藥劑(例如，修飾的siRNA分子及額外的治療劑)，亦即，其中每一治療劑在不同時間點被投予，以及實質上同時投予彼等治療劑，或實質上同時投予至少兩種治療劑。依序或實質上同時投予每一藥劑可受到任何適當途徑的影響，該途徑包括，但不限於，口服途徑、靜脈內途徑、肌內、腫瘤內、皮下途徑、通過黏膜組織直接吸收，以及肺部遞送途徑。可藉由相同途徑或不同途徑投予該些藥劑。舉例而言，第一藥劑可藉由肺部遞送途徑投予，而第二藥劑可以靜脈內方式投予。
如本文所用，除非本文另有說明，否則「依序」乙詞表示正常的順序或次序，例如，若一劑量方案包括投予組合物及抗病毒藥劑，則依序劑量方案可包括在投予抗病毒藥劑之前投予組合物、同時投予組合物、實質上同時投予組合物，或者之後投予組合物，但兩種藥劑皆以正常順序或次序投予。除非另有說明，否則「分開」乙詞係指保持彼此分離的狀態。除非另有說明，否則「同時」乙詞係指在相同時間發生或完成，亦即，在相同時間投予本發明之藥劑。「實質上同時」乙詞係指投予的藥劑彼此之間的差距在幾分鐘之內(例如，彼此在10分鐘之內)，且旨在包含聯合投予(joint administeraton)以及連貫投予(consecutive administeration)，但若該投予為連貫時，則其僅在時間上間隔很短(例如，醫藥從業人員分別投予兩種化合物所花費的時間)。如本文所用，同時投予及實質上同時投予係互換使用。依序投予係指暫時分開投予本文所述藥劑。
合併療法亦可包含將本文所述之藥劑進一步與其他生物上活性成分以及非藥物療法合併投予。應當理解，本文所述之組合物與第二治療劑的任何組合可以任何順序用於治療目標疾病。
可藉由本領域習知之方法評估目標疾病/病症之治療功效。
在一些具體實施例中，任何修飾的siRNA皆可用於抑制體外標靶基因的表達。為了進行此方法，修飾的siRNA (例如，經由編碼核酸，例如載體)可與體外培養的細胞接觸，例如，用於研究目的，例如用於研究疾病機制及/或用於候選藥物驗證。
V. 套組
本揭示內容可單獨使用或作為套組之一組分，該套組具有至少一種在體外或體內將siRNA導入測試樣本及/或受試者所必需的試劑。
舉例而言，套組之較佳組分包括本揭示內容之修飾的siRNA分子以及促使將siRNA導入如本文所述之感興趣細胞內的載劑(例如，使用脂質及本領域已知之其他轉染方法，參閱，例如，Beigelman等人，美國專利第6,395,713號)。
套組亦可用於標靶驗證，例如用於決定基因功能及/或活性，或用於藥物優化，以及用於藥物開法(參閱，例如，Usman等人，美國專利系列第60/402,996號)。此套組亦可包括指示說明，以允許套組使用者實施本揭示內容。此類套組可選擇性地包括亦如本文所述之一或多種第二治療劑。
在一些具體實施例中，套組可包含用於根據如本文所述之任何方法的指示說明。套組可進一步包含基於鑑定該個體是否具有該疾病或該疾病之風險而選擇適用於治療該個體之描述。
與使用修飾的siRNA分子以達到意欲治療效果相關的指示說明通常包括關於意欲治療之劑量、投劑方法以及投予途徑的資訊。容器可為單位劑量、批量包裝(例如，多劑量包裝)或次單位劑量。在本揭示內容之套組中提供的指示說明通常是在標籤或包裝插頁(例如，包括在套組中的紙張)上的書面指示說明，但亦可接受機器可讀取之指示說明(例如，磁性或光學存儲碟片，或者QR碼上所攜帶的指示說明)。
標籤或包裝插頁可表明組合物係用於意欲之治療用途。可提供指示說明以實施本文所述之任何方法。
本揭示內容之套組係置於適用的包裝中。適用的包裝包括，但不限於，槽、小瓶、瓶子、罐、軟性包裝(例如，密封的聚酯薄膜(Mylar)或塑膠袋)等。亦考慮了用於與特定裝置組合使用的包裝，例如吸入器、噴霧器、呼吸器、鼻部投予裝置(例如，霧化器)，或例如微型幫浦的輸注裝置。套組可具有無菌存取口(例如，容器可為靜脈內溶液袋或具有可被皮下注射針刺穿之瓶塞的小瓶)。容器亦可具有無菌存取口(例如，容器可為靜脈內溶液袋或具有可被皮下注射針刺穿之瓶塞的小瓶)。
套組可選擇性地提供附加組分，例如，緩衝液以及解釋資訊。通常，該套組包含在容器上或與容器相關聯的標籤或包裝插頁。在一些具體實施例中，本揭示內容提供包含上述套組之內容物的製品。
一般技術
除非另有說明，否則本發明之實踐將使用在本領域技術範圍內的分子生物學(包括重組技術)、微生物學、細胞生物學、生物化學，以及免疫學的常規技術。在文獻中完全解釋了此類技術，例如， Molecular Cloning: A Laboratory Manual，第二版(Sambrook等人，1989年) Cold Spring Harbor Press； Oligonucleotide Synthesis(M. J. Gait編輯，1984年)； Methods in Molecular Biology，Humana Press； Cell Biology: A Laboratory Notebook(J. E. Cellis編輯，1989年) Academic Press；Animal Cell Culture (R. I. Freshney編輯，1987年)；Introuction to Cell and Tissue Culture (J. P. Mather與 P. E. Roberts，1998年) Plenum Press；Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle、J. B. Griffiths，以及D. G. Newell編輯，1993-8年) J. Wiley and Sons；Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.)；Handbook of Experimental Immunology (D. M. Weir與C. C. Blackwell編輯): Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J. M. Miller與M. P. Calos編輯，1987年)；Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel等人編輯，1987年)；PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis等人編輯，1994年)；Current Protocols in Immunology (J. E. Coligan等人編輯，1991年)；Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons，1999年)；Immunobiology (C. A. Janeway與P. Travers，1997年)；Antibodies (P. Finch，1997年)；Antibodies: a practice approach (D. Catty編輯，IRL Press，1988-1989年)；Monoclonal antibodies: a practical approach (P. Shepherd與C. Dean編輯，Oxford University Press，2000年)；Using antibodies: a laboratory manual (E. Harlow與D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press，1999年)；The Antibodies (M. Zanetti與J. D. Capra編輯，Harwood Academic Publishers，1995年)； DNA Cloning: A practical Approach，第I及II卷(D.N. Glover編輯，1985年； Nucleic Acid Hybridization(B.D. Hames與S.J. Higgins編輯，1985年)； Transcription and Translation(B.D. Hames與S.J. Higgins編輯，1984年)； Animal Cell Culture(R.I. Freshney編輯，1986年)； Immobilized Cells and Enzymes(lRL Press)(1986年)；以及B. Perbal， A practical Guide To Molecular Cloning(1984年)；F.M. Ausubel等人(編輯)。
無需進一步闡述，據信本領域技術人員可基於上面的描述而最大限度地利用本揭示內容。因此，以下具體實施例將被解釋為僅具有說明性，而非以任何方式限制本揭示內容之其餘部分。針對本文參考之目的或主題，本文所引用之所有出版品係透過引用方式併入。
實施例 1 ：靶向 HIF1A 之化學上修飾的 siRNA 及其干擾效率
為了鑑定提供標靶基因(本實施例中的HIF-1A)優異干擾效率之siRNA的化學修飾模式，將兩種抗HIF-1A siRNA AI3及AT9各自以下表1及2所示之方式進行修飾。
表 1. 修飾的 HIF-1A AI3 siRNA 及其抑制 HIF-1A 表達的活性
siRNA 編號 股 序列(5'--3') Seq ID no. 表達水平(%)
AI3 S AGGCCACAUUCACGUAUAA 1 47.52%
AS UUAUACGUGAAUGUGGCCUGU 2
AI3-G1S S mA*mG*mGmCfCmAfCmAfUmUfCmAmCmGmUmAmUmAmA 3 67.67%
AS mU*fU*mAfUmAfCmGfUmGfAmAfUmGfUmGfGmCfCmU*mG*mU 4
AI3-G2S S mA*mG*mGmCmCfAmCfAdTfUmCmAmCmGmUmAmUmAmA 5 77.38%
AS mU*mU*fAmUfAmCfGmUfGmAfAmUfGmUfGmGfCmCfU*mG*mU 6
AI3-G3S S mA*mG*mGmCmCfAfCmAdTfUfCmAmCmGmUmAmUmAmA 7 83.51%
AS mU*mU*fAfUmAmCfGfUmGmAfAfUmGmUfGfGmCmCfU*mG*mU 8
AI3-G4S S mA*mG*mGmCmCmAfCfAdTmUmCmAmCmGmUmAmUmAmA 9 38.87%
AS mU*fU*fAmUmAfCfGmUmGfAfAmUmGfUfGmGmCfCmU*mG*mU 10
AI3-G5S S mA*mG*mGmCfCmAmCfAfUmUmCmAmCmGmUmAmUmAmA 11 77.38%
AS mU*mU*fAmUfAfCmGmUfGfAmAmUfGfUmGmGfCfCmU*mG*mU 12
AI3-G6S S mA*mG*mGmCfCfAmCmAfUfUmCmAmCmGmUmAmUmAmA 13 78.28%
AS mU*fU*mAfUfAmCmGfUfGmAmAfUfGmUmGfGfCmCmU*mG*mU 14
AI3-G7S S mA*mG*mGfCmCfAfCfAfUmUmCmAmCmGmUmAmUmAmA 15 75.96%
AS mU*fU*mAfUmAfCmGfUmGfAmAmUmGmUfGmGfCmCmU*mG*mU 16
AI3-G8S S mA*mG*mGmCfCmAfCfAfUfUmCmAmCmGmUmAmUmAmA 17 49.94%
AS mU*mU*fAmUfAmCfGmUfGmAmAmUmGfUmGfGmCfCmU*mG*mU 18
AI3-G9S S mA*mG*mGmCmCfAfCmAfUfUmCmAmCmGmUmAmUmAmA 19 86.85%
AS mU*fU*mAfUfAmCfGmUfGmAmAfUmGmUfGmGfCmCmU*mG*mU 20
AI3-G10S S mA*mG*mGmCfCfAfCfAfUmUmCmAmCmGmUmAmUmAmA 21 75.44%
AS mU*fU*mAfUmAfCmGfUmGfAmAmUmGmUmGfGmCfCmU*mG*mU 22
AI3-G1A S rArGrGmC*fC*mAfCmAfUmUfCmAmCmGmUmAmUmAmA 23 49.77%
AS mU*fU*mAfUmAfCmGfUmGfAmAfUmGfUmGfGmCfCmU*mG*mU 24
AI3-G2A S rArGrGmC*mC*fAmCfAdTfUmCmAmCmGmUmAmUmAmA 25 73.37%
AS mU*mU*fAmUfAmCfGmUfGmAfAmUfGmUfGmGfCmCfU*mG*mU 26
AI3-G3A S rArGrGmC*mC*fAfCmAdTfUfCmAmCmGmUmAmUmAmA 27 65.52%
AS mU*mU*fAfUmAmCfGfUmGmAfAfUmGmUfGfGmCmCfU*mG*mU 28
AI3-G4A S rArGrGmC*mC*mAfCfAdTmUmCmAmCmGmUmAmUmAmA 29 58.10%
AS mU*fU*fAmUmAfCfGmUmGfAfAmUmGfUfGmGmCfCmU*mG*mU 30
AI3-G5A S rArGrGmC*fC*mAmCfAfUmUmCmAmCmGmUmAmUmAmA 31 79.28%
AS mU*mU*fAmUfAfCmGmUfGfAmAmUfGfUmGmGfCfCmU*mG*mU 32
AI3-G6A S rArGrGmC*fC*fAmCmAfUfUmCmAmCmGmUmAmUmAmA 33 86.25%
AS mU*fU*mAfUfAmCmGfUfGmAmAfUfGmUmGfGfCmCmU*mG*mU 34
AI3-G7A S rArGrGfC*mC*fAfCfAfUmUmCmAmCmGmUmAmUmAmA 35 74.23%
AS mU*fU*mAfUmAfCmGfUmGfAmAmUmGmUfGmGfCmCmU*mG*mU 36
AI3-G8A S rArGrGmC*fC*mAfCfAfUfUmCmAmCmGmUmAmUmAmA 37 39.32%
AS mU*mU*fAmUfAmCfGmUfGmAmAmUmGfUmGfGmCfCmU*mG*mU 38
AI3-G9A S rArGrGmC*mC*fAfCmAfUfUmCmAmCmGmUmAmUmAmA 39 102.34%
AS mU*fU*mAfUfAmCfGmUfGmAmAfUmGmUfGmGfCmCmU*mG*mU 40
AI3-G10A S rArGrGmC*fC*fAfCfAfUmUmCmAmCmGmUmAmUmAmA 41 96.37%
AS mU*fU*mAfUmAfCmGfUmGfAmAmUmGmUmGfGmCfCmU*mG*mU 42
S，有義股；AS，反義股；m，2’-O-甲基；f，2’-氟；r，無修飾的RNA殘基；d，DNA殘基；*，硫代磷酸酯(PS)核苷酸間鍵聯。
表 2. 修飾的 HIF-1A AT9 siRNA 及其抑制 HIA-1 A 表達的活性
siRNA 編號 股 有義股序列(5'--3') Seq ID No. 表達水平(%)
AT9 S UGAGGAAGUACCAUUAUAA 43 36.35%
AS UUAUAAUGGUACUUCCUCAAU 44
AT9-G1S S mU*mG*mAmGfGmAfAmGfUmAfCmCmAmUmUmAmUmAmA 45 29.73%
AS mU*fU*mAfUmAfAmUfGmGfUmAfCmUfUmCfCmUfCmA*mA*mU 46
AT9-G2S S mU*mG*mAmGmGfAmAfGdTfAmCmCmAmUmUmAmUmAmA 47 90.54%
AS mU*mU*fAmUfAmAfUmGfGmUfAmCfUmUfCmCfUmCfA*mA*mU 48
AT9-G3S S mU*mG*mAmGmGfAfAmGdTfAfCmCmAmUmUmAmUmAmA 49 84.67%
AS mU*mU*fAfUmAmAfUfGmGmUfAfCmUmUfCfCmUmCfA*mA*mU 50
AT9-G4S S mU*mG*mAmGmGmAfAfGdTmAmCmCmAmUmUmAmUmAmA 51 43.13%
AS mU*fU*fAmUmAfAfUmGmGfUfAmCmUfUfCmCmUfCmA*mA*mU 52
AT9-G5S S mU*mG*mAmGfGmAmAfGfUmAmCmCmAmUmUmAmUmAmA 53 86.06%
AS mU*mU*fAmUfAfAmUmGfGfUmAmCfUfUmCmCfUfCmA*mA*mU 54
AT9-G6S S mU*mG*mAmGfGfAmAmGfUfAmCmCmAmUmUmAmUmAmA 55 66.97%
AS mU*fU*mAfUfAmAmUfGfGmUmAfCfUmUmCfCfUmCmA*mA*mU 56
AT9-G7S S mU*mG*mAfGmGfAfAfGfUmAmCmCmAmUmUmAmUmAmA 57 80.66%
AS mU*fU*mAfUmAfAmUfGmGfUmAmCmUmUfCmCfUmCmA*mA*mU 58
AT9-G8S S mU*mG*mAmGfGmAfAfGfUfAmCmCmAmUmUmAmUmAmA 59 39.96%
AS mU*mU*fAmUfAmAfUmGfGmUmAmCmUfUmCfCmUfCmA*mA*mU 60
AT9-G9S S mU*mG*mAmGmGfAfAmGfUfAmCmCmAmUmUmAmUmAmA 61 99.54%
AS mU*fU*mAfUfAmAfUmGfGmUmAfCmUmUfCmCfUmCmA*mA*mU 62
AT9-G10S S mU*mG*mAmGfGfAfAfGfUmAmCmCmAmUmUmAmUmAmA 63 76.31%
AS mU*fU*mAfUmAfAmUfGmGfUmAmCmUmUmCfCmUfCmA*mA*mU 64
AT9-G1A S rUrGrAmG*fG*mAfAmGfUmAfCmCmAmUmUmAmUmAmA 65 36.86%
AS mU*fU*mAfUmAfAmUfGmGfUmAfCmUfUmCfCmUfCmA*mA*mU 66
AT9-G2A S rUrGrAmG*mG*fAmAfGdTfAmCmCmAmUmUmAmUmAmA 67 83.12%
AS mU*mU*fAmUfAmAfUmGfGmUfAmCfUmUfCmCfUmCfA*mA*mU 68
AT9-G3A S rUrGrAmG*mG*fAfAmGdTfAfCmCmAmUmUmAmUmAmA 69 93.95%
AS mU*mU*fAfUmAmAfUfGmGmUfAfCmUmUfCfCmUmCfA*mA*mU 70
AT9-G4A S rUrGrAmG*mG*mAfAfGdTmAmCmCmAmUmUmAmUmAmA 71 48.07%
AS mU*fU*fAmUmAfAfUmGmGfUfAmCmUfUfCmCmUfCmA*mA*mU 72
AT9-G5A S rUrGrAmG*fG*mAmAfGfUmAmCmCmAmUmUmAmUmAmA 73 78.46%
AS mU*mU*fAmUfAfAmUmGfGfUmAmCfUfUmCmCfUfCmA*mA*mU 74
AT9-G6A S rUrGrAmG*fG*fAmAmGfUfAmCmCmAmUmUmAmUmAmA 75 82.74%
AS mU*fU*mAfUfAmAmUfGfGmUmAfCfUmUmCfCfUmCmA*mA*mU 76
AT9-G7A S rUrGrAfG*mG*fAfAfGfUmAmCmCmAmUmUmAmUmAmA 77 78.10%
AS mU*fU*mAfUmAfAmUfGmGfUmAmCmUmUfCmCfUmCmA*mA*mU 78
AT9-G8A S rUrGrAmG*fG*mAfAfGfUfAmCmCmAmUmUmAmUmAmA 79 64.47%
AS mU*mU*fAmUfAmAfUmGfGmUmAmCmUfUmCfCmUfCmA*mA*mU 80
AT9-G9A S rUrGrAmG*mG*fAfAmGfUfAmCmCmAmUmUmAmUmAmA 81 87.86%
AS mU*fU*mAfUfAmAfUmGfGmUmAfCmUmUfCmCfUmCmA*mA*mU 82
AT9-G10A S rUrGrAmG*fG*fAfAfGfUmAmCmCmAmUmUmAmUmAmA 83 80.48%
AS mU*fU*mAfUmAfAmUfGmGfUmAmCmUmUmCfCmUfCmA*mA*mU 84
S，有義股； AS，反義股； m，2’-O-甲基； f，2’-氟； r，未修飾的核苷酸； d，去氧核醣核苷酸； *，硫代磷酸酯(PS)核苷酸間鍵聯。
表 1及 表 2中列出了針對AI3及AT9之每一者的20種修飾的siRNA，並研究了其等在抑制標靶基因表達上的活性。將每一種修飾的siRNA以及未修飾的對照以10 nM的濃度轉染至人類肝細胞癌(HepG2)細胞中。在轉染後24小時，經由RT-qPCR檢測轉染細胞中之HIF-1A mRNA水平。以未轉染細胞中之HIF-1A mRNA水平當作100%，計算轉染細胞中之HIF-1A mRNA表達水平(%)。結果提供在上 表 1及 2中。
以下提供試驗方法的簡要描述：
HepG2 細胞之培養
在37°C之5% CO 2下，將人類肝細胞癌(HepG2)細胞株維持在含有10%胎牛血清(Gibco，ThermoFisher Scientific)、200單位/mL青黴素加上200單位/mL鏈黴素的最低必需培養基(Gibco，ThermoFisher Scientific，USA)中。
HepG2 細胞中之 siRNA 轉染
將HepG2細胞以5×10 5個細胞/孔接種於24孔培養盤中。在培養18小時後，將培養基更換為500 ul新鮮生長培養基。每一孔之siRNA及RNAiMax的複合組合物係製備如下：(1) 將1ul之siRNA添加至50 ul之Opti-MEM中；(2) 將1.5 ul之RNAiMax添加至50 ul之Opti-MEM中；(3) 輕輕混合(1)及(2)，並在室溫下培養10分鐘。藉由將100ul之siRNA/RNAiMax複合物添加至每一孔中而進行轉染。在RNA純化前，將細胞培養24小時。
RT-qPCR
根據製造商之方案，以RNeasy套組(Qiagen)萃取總RNA。在LightCycler 480 (Roche Diagnostics)上，使用搭配了iTaq通用探針一步驟套組(Bio-Rad)的一步驟即時定量PCR進行HIF1A mRNA水平的量化。在384孔培養盤中，以10 ul之總體積(具有50 ng之總RNA、各500 nM之正向、反向引子及探針、0.25 ul之反轉錄酶，以及2×iTaq Master Mix)進行三重複的RT-qPCR。HIF1A及GAPDH之引子及探針( 表 4)係由Integrated DNA Technologies合成。循環條件按照製造商推薦的循環參數：50°C 10分鐘，95°C 2分鐘，以及40次循環的95°C 15秒及60°C 1分鐘。使用ΔΔCt方法計算基因表達倍數變化。HIF1A mRNA以構成性地表達的GAPDH mRNA進行正規化。
進一步設計AI3及AT9 siRNA的更多修飾模式並在HepG2細胞中進行篩選，如表3所列。
表 3. 修飾的 HIF1A AI3 與 AT9 siRNA 及其抑制活性
siRNA 編號 股 序列(5'--3') Seq ID No. HIF1A 表達水平(%)
AI3 S AGGCCACAUUCACGUAUAA 1 58.24%
AS UUAUACGUGAAUGUGGCCUGU 2
AI3-G4S S mA*mG*mGmCmCmAfCfAdTmUmCmAmCmGmUmAmUmAmA 9 49.65%
AS mU*fU*fAmUmAfCfGmUmGfAfAmUmGfUfGmGmCfCmU*mG*mU 10
AI3-G8A S rArGrGmC*fC*mAfCfAfUfUmCmAmCmGmUmAmUmAmA 37 55.10%
AS mU*mU*fAmUfAmCfGmUfGmAmAmUmGfUmGfGmCfCmU*mG*mU 38
AI3-G12S S mA*mG*mGmCmCmAfCfAfUmUmCmAmCmGmUmAmUmAmA 85 65.82%
AS mU*fU*fAmUmAfCfGmUmGfAfAmUmGfUfGmGmCfCmU*mG*mU 86
AI3-G15S S mA*mG*fGmCmCmAfCfAdTmUmCmAmCmGmUmAmUmAmA 87 98.17%
AS mU*mU*fAmUmAfCfGmUmGfAfAmUmGfUfGmGmCfCmU*mG*mU 88
AI3-G16S S mA*mG*mGmCmCmAfCfAdTfUmCmAmCmGmUmAmUmAmA 89 62.42%
AS mU*fU*fAmUmAfCfGmUfGmAfAmUmGfUfGmGmCfCmU*mG*mU 90
AI3-G17S S mA*mG*mGmCmCmAfCfAdTmUmCmAmCmGmUmAmUmAmA 91 65.22%
AS mU*fU*mAmUfAmCfGfUmGfAfAmUmGfUfGmGmCfCmU*mG*mU 92
AI3-G18S S mA*mG*mGmCmCmAfCfAdTfUmCmAmCmGmUmAmUmAmA 93 78.82%
AS mU*fU*mAfUfAmCmGfUfGmAfAmUmGfUfGmGmCfCmU*mG*mU 94
AI3-G19S S mA*mG*mGmCmCmAfCfAdTfUmCmAmCmGmUmAmUmAmA 95 67.83%
AS mU*fU*mAmUfAmCmGfUfGmAfAmUmGfUfGmGmCfCmU*mG*mU 96
AI3-G22A S rArGrGmC*fC*mAfCfAfUfUmCmAmCmGmUmAmUmAmA 97 80.29%
AS mU*fU*mAfUmAfCmGfUfGmAmAmUmGfUmGfGmCfCmU*mG*mU 98
AI3-G24S S mA*mG*mGmCfCmAfCfAfUfUmCmAmCmGmUmAmUmAmA 99 87.26%
AS mU*mU*fAmUfAmCmGfUfGmAmAmUmGfUmGmGfCfCmU*mG*mU 100
AI3-G25S S mA*mG*mGmCfCmAfCfAfUfUmCmAmCmGmUmAmUmAmA 101 50.93%
AS mU*fU*mAfUfAmCmGfUfGmAmAmUmGfUmGfGmCfCmU*mG*mU 102
AI3-G26S S mA*mG*fGmCmCmAfCfAfUfUmCmAmCmGmUmAmUmAmA 103 72.03%
AS mU*mU*fAmUfAmCfGmUfGmAmAmUmGfUfGmGmCfCmU*mG*mU 104
AI3-G29S S mA*mG*mGfCmCmAfCfAdTfUmCmAmCmGmUmAmUmAmA 105 88.27%
AS mU*fU*mAfUmAfCmGfUfGmAfAmUmGfUmGmGfCmCmU*mG*mU 106
AT9-G1S S mU*mG*mAmGfGmAfAmGfUmAfCmCmAmUmUmAmUmAmA 45 55.86%
AS mU*fU*mAfUmAfAmUfGmGfUmAfCmUfUmCfCmUfCmA*mA*mU 46
AT9-G1A S rUrGrAmG*fG*mAfAmGfUmAfCmCmAmUmUmAmUmAmA 65 52.24%
AS mU*fU*mAfUmAfAmUfGmGfUmAfCmUfUmCfCmUfCmA*mA*mU 66
AT9-G31A S rUrGrAmG*fG*mAfAmGfUmAfCmCmAmUmUmAmUmAmA 107 53.71%
AS mU*fU*mAfUmAfAmUfGmGfUmAfCmUfUmCfCmUmCmA*mA*mU 108
AT9-G32A S rUrGrAmG*fG*mAfAmGfUmAfCmCmAmUmUmAmUmAmA 109 61.27%
AS mU*mU*mAfUmAfAmUfGmGfUmAfCmUfUmCfCmUmCmA*mA*mU 110
S，有義股； AS，反義股； m，2’-O-甲基； f，2’-氟； r，未修飾的核苷酸； d，去氧核醣核苷酸； *，硫代磷酸酯(PS)核苷酸間鍵聯。
表 4. 用於 RT-qPCR 以檢測 HIF1A 之相對表達水平的引子及探針
基因 引子/ 探針 序列
HIF1A HIF1A_F 5’-CTCTGATCATCTGACCAAAACTCA-3’ (SEQ ID NO: 137)
HIF1A_R 5’-CAACCCAGACATATCCACCTC-3’ (SEQ ID NO: 138)
HIF1A_探針 5’-/56FAM/TGGCAAGCA/ZEN/TCCTGTACTGTCCTG /3IABkFQ/-3’ (SEQ ID NO: 139)
GAPDH GAPDH_F 5’-ACATCGCTCAGACACCATG-3’ (SEQ ID NO: 140)
GAPDH_R 5’-TGTAGTTGAGGTCAATGAAGGG-3’ (SEQ ID NO: 141)
GAPDH_探針 5’-56FAM/AAGGTCGGA/ZEN/GTCAACGGATTTGGT C/3IABkFQ/-3’ (SEQ ID NO: 142)
表 3顯示了以濃度為0.5 nM之每一種鑑定的siRNA轉染的細胞中對應的HIF1A表達水平。從化學修飾之體外篩選研究中確定了抗HIF-1A AI3 siRNA的四種修飾模式相對於未修飾的AI3具有類似或更高的干擾效率。具有彼等修飾模式之修飾的AI3 siRNA包括AI3-G4S、AI3-G8S、AI3-G8A及AI3-G25S。同樣地，從體外篩選試驗中確定了四種修飾的AT9 siRNA相對於未修飾的AT9具有類似的干擾效率。實例包括AT9-G1S、AT9-G1A、AT9-G8S及AT9-G31A。
實施例 2 ：靶向 SARS-CoV-2 之化學上修飾的 siRNA 及其干擾效率
為了進一步鑑定及驗證具有期望的生物學特徵之siRNA的額外化學修飾模式，將靶向SARS-CoV-2病毒之基因體RNA及亞基因體mRNA的兩種siRNA (C6及C8)進行 表 5中所列模式的修飾。
表 5. 修飾的 SARS-CoV-2 siRNA 及其抑制活性
siRNA 編號 股 序列(5'--3') Seq ID no. 表達水平(%)
C6 S CUGUCAAACCCGGUAAUUU 111 16.50%
AS AAAUUACCGGGUUUGACAGUU 112
C6-G4S S mC*mU*mGmUmCmAfAfAdCmCmCmGmGmUmAmAmUmUmU 113 100.00%
AS mA*fA*fAmUmUfAfCmCmGfGfGmUmUfUfGmAmCfAmG*mU*mU 114
C6-G8S S mC*mU*mGmUfCmAfAfAfCfCmCmGmGmUmAmAmUmUmU 115 59.30%
AS mA*mA*fAmUfUmAfCmCfGmGmGmUmUfUmGfAmCfAmG*mU*mU 116
C6-G8A S rCrUrGmU*fC*mAfAfAfCfCmCmGmGmUmAmAmUmUmU 117 4.90%
AS mA*mA*fAmUfUmAfCmCfGmGmGmUmUfUmGfAmCfAmG*mU*mU 118
C6-G22A S rCrUrGmU*fC*mAfAfAfCfCmCmGmGmUmAmAmUmUmU 119 6.50%
AS mA*fA*mAfUmUfAmCfCfGmGmGmUmUfUmGfAmCfAmG*mU*mU 120
C6-G25S S mC*mU*mGmUfCmAfAfAfCfCmCmGmGmUmAmAmUmUmU 121 13.70%
AS mA*fA*mAfUfUmAmCfCfGmGmGmUmUfUmGfAmCfAmG*mU*mU 122
C6-G1S S mC*mU*mGmUfCmAfAmAfCmCfCmGmGmUmAmAmUmUmU 123 20.10%
AS mA*fA*mAfUmUfAmCfCmGfGmGfUmUfUmGfAmCfAmG*mU*mU 124
C6-G1A S rCrUrGmU*fC*mAfAmAfCmCfCmGmGmUmAmAmUmUmU 125 6%
AS mA*fA*mAfUmUfAmCfCmGfGmGfUmUfUmGfAmCfAmG*mU*mU 126
C6-G31A S rCrUrGmU*fC*mAfAmAfCmCfCmGmGmUmAmAmUmUmU 127 14.10%
AS mA*fA*mAfUmUfAmCfCmGfGmGfUmUfUmGfAmCmAmG*mU*mU 128
C8 S GCCACUAGUCUCUAGUCAA 129 2%
AS UUGACUAGAGACUAGUGGCUU 130
C8-G25S S mG*mC*mCmAfCmUfAfGfUfCmUmCmUmAmGmUmCmAmA 131 12%
AS mU*fU*mGfAfCmUmAfGfAmGmAmCmUfAmGfUmGfGmC*mU*mU 132
S，有義股； AS，反義股； m，2’-O-甲基； f，2’-氟； r，未修飾的核苷酸； d，去氧核醣核苷酸； *，硫代磷酸酯(PS)核苷酸間鍵聯。
將靶向SARS-CoV-2的每一種修飾的siRNA以及未修飾的對應物轉染至Vero E6細胞中。簡言之，以siRNA候選物反轉染Vero細胞，接著接種於24孔培養盤中。在轉染後24小時，以MOI為0.1之SARS-CoV-2病毒感染siRNA轉染的細胞。在培養1小時後，移除接種物，並以磷酸緩衝鹽液(PBS)洗滌細胞。添加新鮮培養基，並繼續培養24小時。在培養24小時後，藉由針對E (套膜)基因的RT-qPCR確定Vero E6細胞中由siRNA所減弱的SARS-CoV-2 RNA基因體。
以NucleoSpin RNA迷你套組(Macherey-Nagel，Düren，Germany)萃取總細胞RNA。藉由病毒E基因的反轉錄定量聚合酶鏈反應(RT-qPCR)而確定病毒RNA的量，其係於QuantStudio 5 Real-Time PCR System (Applied Biosystems)上使用iTaq通用探針一步驟RT-PCR套組(Bio-Rad)進行。靶向SARS-CoV-2的引子及探針如下：正向引子，5 '-ACAGGTACGTTAATAGTTAATAGCGT-3 '(SEQ ID NO:143)；反向引子，5 '-ACATTGCAGCAGTACGCACACA-3 '(SEQ ID NO: 144)；以及探針，5 '-ACACTAGCCATCCTTACTGCGCTTCG-3 '(SEQ ID NO: 145)。以含有部分E片段的質體作為計算病毒載量(拷貝數/μl)的標準品。
在每一種siRNA濃度為20 nM時，相較於未修飾的siRNA，C6及C8 siRNA有五種修飾模式被確定維持良好的沉默效率。以下修飾的siRNA包括五種修飾模式：C6-G8A、C6-G22A、C6-G25S、C6-G1A及C6-G31A。
在siRNA末端處之硫代磷酸酯(PS)核苷酸間鍵聯以保護siRNA免於核酸酶降解不會影響siRNA的干擾效率，如 表 6所示。
表 6. 修飾的 C6 及 C8 siRNA 之干擾效率的驗證。
siRNA 編號 股 序列(5'--3') Seq ID No. 表達水平(%)
C6-G25S S mC*mU*mGmUfCmAfAfAfCfCmCmGmGmUmAmAmUmUmU 121 3.60%
AS mA*fA*mAfUfUmAmCfCfGmGmGmUmUfUmGfAmCfAmG*mU*mU 122
C6-G25S-2 S mC*mU*mGmUfCmAfAfAfCfCmCmGmGmUmAmAmU *mU *mU 133 1.00%
AS mA*fA*mAfUfUmAmCfCfGmGmGmUmUfUmGfAmCfAmG*mU*mU 134
C8-G25S S mG*mC*mCmAfCmUfAfGfUfCmUmCmUmAmGmUmCmAmA 131 18.60%
AS mU*fU*mGfAfCmUmAfGfAmGmAmCmUfAmGfUmGfGmC*mU*mU 132
C8-G25S-2 S mG*mC*mCmAfCmUfAfGfUfCmUmCmUmAmGmUmC *mA *mA 135 20.00%
AS mU*fU*mGfAfCmUmAfGfAmGmAmCmUfAmGfUmGfGmC*mU*mU 136
S，有義股； AS，反義股； m，2’-O-甲基； f，2’-氟； r，未修飾的核苷酸； d，去氧核醣核苷酸； *，硫代磷酸酯(PS)核苷酸間鍵聯。
實施例 3 ：靶向 HBx 轉錄本之具有 5’- 磷酸酯修飾之化學上修飾的 siRNA 及其干擾效率
為了研究是否5’磷酸酯修飾可改進具有如本文揭示之化學修飾模式之siRNA的干擾效率，進一步以 E-乙烯基膦酸酯或硫代磷酸酯修飾靶向所有B型肝炎病毒轉錄本之X開放閱讀框(HBx)中之高度保留序列的示例性siRNA之反義股的5’端。示例性抗HBx siRNA之序列及修飾係顯示於 表 7中。用於5’-磷酸酯修飾之E-乙烯基膦酸酯及硫代磷酸酯的化學結構係顯示於 圖 2A中。
表 7. 靶向 HBx 之修飾的 siRNA
siRNA 編號 股 序列(5'--3') Seq ID No.
X32-G25S-PS6 S mG*mG*mAmGfGmCfUfGfUfAmGmGmCmAmUmAmAmAmA 146
AS mU*fU*mUfUfA*mU*mGfCfCmUmAmCmAfGmCfCmUfCmC*mU*mU 147
X32-G25S-PS6-VP S mG*mG*mAmGfGmCfUfGfUfAmGmGmCmAmUmAmAmAmA 148
AS 5'-E-VP mU*fU*mUfUfA*mU*mGfCfCmUmAmCmAfGmCfC mUfCmC*mU*mU 149
X32-G25S-PS6-5S S mG*mG*mAmGfGmCfUfGfUfAmGmGmCmAmUmAmAmAmA 150
AS P*mU*fU*mUfUfA*mU*mGfCfCmUmAmCmAfGmCfCmUfCmC*mU*mU 151
S，有義股； AS，反義股； m，2’-O-甲基； f，2’-氟； 5'-E-VP，5’-E-乙烯基膦酸酯 P*, 5’-硫代磷酸酯 *，硫代磷酸酯(PS)核苷酸間鍵聯。
在37°C之5% CO 2下，將人類肝細胞癌細胞株Hep3B維持在含有10%胎牛血清(Gibco，ThermoFisher Scientific)的DMEM培養基(Gibco，ThermoFisher Scientific，USA)中。
將Hep3B細胞以4×10 4個細胞/孔接種於24孔培養盤中。按照先前關於HepG2細胞所述之相同方法，在培養18小時後，將Hep3B細胞以每一種修飾的抗HBx siRNA進行轉染。參閱上述實施例2。隨後，將細胞培養24小時，並以RNeasy套組(Qiagen)從siRNA轉染的Hep3B細胞中萃取總RNA。使用Maxima第一股cDNA合成套組(Thermo Fisher Scientific)及所萃取的100 ng總細胞RNA進行反轉錄反應。使用SYBR Green I Master (Roche Diagnostics)及1:5稀釋的cDNA在LightCycler 480進行qPCR。用於檢測HBx轉錄本的引子組係顯示於 表 8中。每一樣本以三重複方式進行分析，以確定平均閾值循環(Ct)值。使用ΔΔCt方法計算基因表達倍數變化。每一基因之mRNA水平以構成性地表達的GAPDH mRNA進行正規化，其用作持家(housekeeping)對照。
表 8. 用於量化 HBx 表達的 RT-qPCR 引子。
基因 引子 序列
HBx HBx_F 5’-CCGTCTGTGCCTTCTCATCTGC-3’ (SEQ ID NO: 152)
HBx_R 5’-ACCAATTTATGCCTACAGCCTCC-3’ (SEQ ID NO: 153)
GAPDH GAPDH_F 5’-CATCACTGCCACCCAGAAGA-3’ (SEQ ID NO: 154)
GAPDH_R 5’-CCTGCTTCACCACCTTCTTG-3’ (SEQ ID NO: 155)
人類肝細胞癌細胞株Hep3B細胞含有完整的B型肝炎病毒基因體，因此能表達HBx轉錄本。將有或無5’磷酸酯修飾的抗HBx siRNA (10或1.2 nM siRNA)轉染至Hep3B細胞中24小時，並藉由RT-qPCR量化HBx轉錄本的表達。如 圖 2B所示，具有 E-乙烯基膦酸酯(X32-G25S-PS6-VP)或硫代磷酸酯(X32-G25S-PS6-5S)之5’-磷酸酯修飾的HBx siRNA相較於無5’-磷酸酯修飾(X32-G25S-PS6)的HBx siRNA對應物改進了siRNA干擾效率以降低HBx轉錄本的表達。
其他具體實施例
本說明書中揭示之所有特徵可以任何組合形式進行組合。本說明書中揭示之每一特徵可由作用於相同、等同或相似目的之替代特徵所代替。因此，除非另有明確說明，否則所揭示之每一特徵僅為等效或類似特徵之通用系列的實例。
從上面的描述中，本領域技術人員可輕易地確定本揭示內容之基本特徵，且在不脫離本發明之精神及範疇的情況下，可對本發明進行各種改變與修改，以使其適應各種用途及條件。因此，其他具體實施例亦落入申請專利範圍內。
等同物
儘管本文已描述並闡明了數個發明具體實施例，但是本領域普通技術人員將容易想出用於執行功能及/或獲得結果的各種其他手段及/或結構及/或本文所述之一或多個優點，且此類變化及/或修改中之每一者被認為落入本文所述之發明具體實施例的範疇內。更一般地，本領域技術人員將容易理解到，本文所述之所有參數、尺徑、材料及配置目的為示例性的，且實際參數、尺徑、材料及/或配置將取決於具體應用或使用本發明之教示的應用。本領域技術人員將認識到或能使用不超過常規實驗來確定如本文所述之特定創造性具體實施例的許多等同物。因此，應當理解的是，前述具體實施例僅以示例之方式呈現，且在所附之申請專利範圍及其等同物的範疇內，發明具體實施例可以不同於具體描述及請求保護之方式實施。本揭示內容之發明具體實施例涉及如本文所述之每一單獨特徵、系統、製品、材料、套組及/或方法。此外，若此類特徵、系統、製品、材料、套組及/或方法不相互矛盾，則二或多個此類特徵、系統、製品、材料、套組及/或方法的任何組合皆包括在本揭示內容之發明範疇內。
本文定義及使用之所有定義應理解為掌控了字典定義、透過引用併入之文獻中的定義，及/或定義術語之普通含義。
本文揭示之所有參考文獻、專利及專利申請案皆透過引用方式併入本文，並涉及每個被引用的主題，於某些情況下其可包含整個文件。
在本說明書及申請專利範圍中使用的定冠詞「一」及「一個」，除非明確指出相反意思，否則應理解為「至少一個」。
在本說明書及申請專利範圍中使用的片語「及/或」應被理解為係指所結合的元件中的「一個或二個」，亦即，在某些情況下所述元件結合存在，而在另一情況下則分開存在。以「及/或」列出的多個元件應以相同方式解釋，亦即，「一或多個」元件如此地連接。除了以「及/或」子句特別標識之元件外，其他元件可選擇性地存在，不論與該等特別標識之元件相關或不相關。因此，作為非限制性的實例，當結合例如「包含」的開放式語言使用時，對「A及/或B」的引用可在一具體實施例中僅指A (選擇性地包括除了B之外的元件)；在另一具體實施例中則僅指B (選擇性地包括除了A之外的元件)；在另一具體實施例中則指A與B兩者(選擇性地包括其他元件)；等等。
如本說明書及申請專利範圍中所使用的，「或」應理解為具有與上述定義之「及/或」相同的含義。舉例而言，當於一列表中分離項目時，「或」或「及/或」應被解釋為包括性的，亦即，包括數量或元件列表中的至少一者，但亦包括多於一者，以及選擇性地，額外未列出之項目。只有明確指示出相反的意思，例如「只有一個」或「確切為一個」，或，當用於申請專利範圍中「由～組成」時，將指的是僅列出之一或多個元件。一般而言，當前面放有例如「任一」、「之一」、「只有之一」或「確切為一個」等排他性術語時，本文所用之術語「或」應僅被解釋為表示排他性的替代語(亦即，「一個或另一個，但不是二者」)。當「基本上由～組成」用於申請專利範圍中時，應具有其在專利法領域所使用之普通含義。
如本說明書及申請專利範圍中所使用的，片語「至少一個」對於一個或多個元件的列表，應當被理解為係指從元件列表中的任何一個或多個元件選擇出的至少一個元件，但不一定包括具體列在元件列表中的各個及每個元件中的至少一個，且並不排除元件列表中的元件之任何組合。此定義亦允許選擇性地存在除了在片語「至少一個」所指的元件列表中具體標識的元件之外的元件，不論與該等特定標識的元件相關或不相關的元件。因此，作為非限制性實例，「A與B中的至少一個」(或等效地，「A或B中的至少一個」或等同地「A及/或B中的至少一個」)，在一具體實施例中，可指至少一個，選擇性地包括多於一個，A，而沒有B的存在(且選擇性地包括除了B之外的元件)；在另一個具體實施例中，指至少一個，選擇性地包括多於一個，B，而沒有A的存在(且選擇性地包括除了A之外的元件)；在又另一具體實施例中，指至少一個，選擇性地包括多於一個，A，以及至少一個，選擇性地包括多於一個，B (且選擇性地包括其他元件)；等等。
亦應當理解的是，除非明確地指出相反者，否則在本文所主張的任何包括多於一個步驟或動作的方法中，方法的步驟或動作之順序不一定限於在所述之該方法的步驟或動作之順序。
無
下列圖示構成本說明書的一部分，並被涵蓋以進一步證實本揭示內容的某些態樣，其可藉由參考圖示並結合本文呈現之特定具體實施例的詳細描述而更好地理解。
圖 1為小干擾RNA (siRNA)之示例性修飾模式的圖。m：2’-O-甲基。f：2’-O岩藻糖基。核苷酸之間的條形(bar)表示PS核苷酸間(internucleotide)鍵聯。PS鍵可存在於siRNA分子之任一端或兩端。
圖 2A-2B包括顯示5’-磷酸酯修飾及相關聯之干擾功效的圖。 圖 2A：示例性5’-磷酸酯修飾5’- E-乙烯基膦酸酯及5’-硫代磷酸酯的化學結構。 圖 2B：條形圖顯示了相較於無5’-磷酸酯修飾的siRNA對應物(X32-G25S-PS6)，在反義股中具有5’- E-乙烯基膦酸酯修飾(X32-G25S-PS6-VP)或在反義股中具有5’-硫代磷酸酯修飾(X32-G25S-PS6-5S)之抗HBx siRNA的改進的基因沉默活性。
無
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Claims (23)

  1. 一種修飾的小干擾RNA (siRNA)，其包含具有19個核苷酸的有義股及具有21個核苷酸的反義股， 其中(a) 該反義股含有(i) 7至9個2’-氟修飾的核苷酸，以及(ii) 12至14個2’-O-甲基修飾的核苷酸；以及(b) 該有義股含有(i) 2至5個2’-氟修飾的核苷酸，以及(ii) 11至16個2’-O-甲基修飾的核苷酸； 其中該有義股、該反義股或兩者含有一或多個硫代磷酸酯(PS)鍵； 以及 其中該有義股及該反義股形成雙股siRNA，選擇性地在該反義股之3’端處具有兩個核苷酸的懸突物。
  2. 如請求項1之修飾的siRNA，其中該反義股含有修飾的5’-磷酸酯。
  3. 如請求項2之修飾的siRNA，其中該修飾的5’-磷酸酯為 E-乙烯基膦酸酯或硫代磷酸酯。
  4. 如請求項1-3中任一項之修飾的siRNA，其中該反義股在位置2-12、14-16及18之7或多者處含有2’-氟修飾的核苷酸。
  5. 如請求項4之修飾的siRNA，其中該反義股在位置2或3及位置14以及選擇性地位置18處包含2’-氟修飾的核苷酸。
  6. 如請求項1-5中任一項之修飾的siRNA，其中在(a)中，該反義股在位置1、2-13及15-21之12或多者處含有2’-O-甲基修飾的核苷酸。
  7. 如請求項6之修飾的siRNA，其中該反義股在位置1、13、17及19-21處包含2’-O-甲基修飾的核苷酸。
  8. 如請求項1-7中任一項之修飾的siRNA，其中在(b)中，該有義股在位置5及7-11之二或多者處含有2’-氟修飾的核苷酸。
  9. 如請求項8之修飾的siRNA，其中該有義股在位置5及7-10處或在位置5、7、9及11處包含2’-氟修飾的核苷酸。
  10. 如請求項1-9中任一項之修飾的siRNA，其中該有義股在位置1-6、8及10-19之11或多者處含有2’-O-甲基修飾的核苷酸。
  11. 如請求項10之修飾的siRNA，其中該有義股在位置4、6及11-19處包含2’-O-甲基修飾的核苷酸。
  12. 如請求項11之修飾的siRNA，其中該有義股在位置8及10處更包含2’-O-甲基修飾的核苷酸。
  13. 如請求項10-12中任一項之修飾的siRNA，其中該有義股中之位置1-3之一或多者含有2’-O-甲基修飾的核苷酸。
  14. 如請求項10-12中任一項之修飾的siRNA，其中該有義股中之位置1-3之一或多者為未修飾的。
  15. 如請求項1-14中任一項之修飾的siRNA，其中該有義股含有2’-去氧核苷酸，其選擇性地位於位置9。
  16. 如請求項1-15中任一項之修飾的siRNA，其中該反義股在位置1與2、位置2與3、位置19與20及/或位置20與21之間含有PS鍵。
  17. 如請求項1-16中任一項之修飾的siRNA，其中該有義股在位置1與2、位置2與3、位置4與5、位置5與6、位置17與18及/或位置18與19之間含有PS鍵。
  18. 如請求項1之修飾的siRNA，其中(a)之反義股及(b)之有義股具有下式： (i) 5’-mffmmffmmffmmffmmfmmm-3’ 3’-mmmmmmmmmmdffmmmmmm-5’； (ii) 5’-mmfmfmfmfmmmmfmfmfmmm-3’ 3’-mmmmmmmmmffffmfmmmm-5’； (iii) 5’-mmfmfmfmfmmmmfmfmfmmm-3’ 3’-mmmmmmmmmffffmfmrrr-5’； (iv) 5’-mfmfmfmffmmmmfmfmfmmm-3’ 3’-mmmmmmmmmffffmfmrrr-5’ (v) 5’-mfmffmmffmmmmfmfmfmmm-3’ 3’-mmmmmmmmmffffmfmmmm-5’； (vi) 5’-mfmfmfmfmfmfmfmfmfmmm-3’ 3’-mmmmmmmmfmfmfmfmmmm-5’； (vii) 5’-mfmfmfmfmfmfmfmfmfmmm-3’ 3’-mmmmmmmmfmfmfmfmrrr-5’’或 (viii) 5’-mfmfmfmfmfmfmfmfmmmmm-3’ 3’-mmmmmmmmfmfmfmfmrrr-3’；以及 其中m代表2’-O-甲基核苷酸、f代表2’-氟核苷酸、r代表未修飾的核苷酸，且d代表DNA殘基。
  19. 如請求項18之修飾的siRNA，其中(a)之反義股及(b)之有義股具有下式： (i) 5’-m*f*fmmffmmffmmffmmfm*m*m-3’ 3’-m*m*mmmmmmmmdffmmmm*m*m-5’； (ii) 5’-m*m*fmfmfmfmmmmfmfmfm*m*m-3’ 3’-m*m*mmmmmmmffffmfmm*m*m-5’； (iii) 5’-m*m*fmfmfmfmmmmfmfmfm*m*m-3’ 3’-m*m*mmmmmmmffffm*f*mrrr-5’； (iv) 5’-m*f*mfmfmffmmmmfmfmfm*m*m-3’ 3’-m*m*mmmmmmmffffm*f*mrrr-5’ (v) 5’-m*f*mffmmffmmmmfmfmfm*m*m-3’ 3’-m*m*mmmmmmmffffmfmm*m*m-5’； (vi) 5’-m*f*mfmfmfmfmfmfmfmfm*m*m-3’ 3’-m*m*mmmmmmfmfmfmfmm*m*m-5’； (vii) 5’-m*f*mfmfmfmfmfmfmfmfm*m*m-3’ 3’-m*m*mmmmmmfmfmfm*f*mrrr-5’’或 (viii) 5’-m*f*mfmfmfmfmfmfmfmmm*m*m-3’ 3’-m*m*mmmmmmfmfmfm*f*mrrr-3’；以及 其中m代表2’-O-甲基核苷酸、f代表2’-氟核苷酸、r代表未修飾的核苷酸、d代表DNA殘基，且*代表PS鍵。
  20. 如請求項1-19中任一項之修飾的siRNA，其中該有義股係綴合至標靶部分體，其選擇性地為N-乙醯基半乳胺糖(GalNAc)。
  21. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1-20中任一項之siRNA及醫藥上可接受之載體。
  22. 一種用於調控基因表達之方法，其包含以如請求項1-20中任一項之siRNA或如請求項21之醫藥組合物接觸細胞，其中siRNA靶向感興趣之基因。
  23. 如請求項22之方法，其中該接觸步驟係藉由投予具有與該感興趣之基因相關聯之疾病的受試者siRNA或該醫藥組合物而進行。
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