ES2327719T3 - Complejos de proteina oligomerica recombinante con potencial inmunogenico mejorado. - Google Patents
Complejos de proteina oligomerica recombinante con potencial inmunogenico mejorado. Download PDFInfo
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Abstract
Complejo de proteína oligomérica recombinante que comprende: - un antígeno de influenza oligomérico que puede generar una respuesta inmune contra un virus influenza, y - un dominio de oligomerización de cremallera de leucinas en el que cada subunidad de dicho antígeno de influenza oligomérico está unida al dominio de oligomerización de cremallera de leucinas y en el que dicho complejo de proteína oligomérica recombinante es un di-, tri- o tetrámero.
Description
Complejos de proteína oligomérica recombinante
con un potencial inmunogénico mejorado.
La presente invención se refiere a una proteína
quimérica que comprende un antígeno y un dominio de oligomerización.
La presente invención se refiere además a complejos de proteína
oligomérica recombinante que comprenden dicha proteína quimérica, y
al uso de los mismos para la fabricación de una vacuna.
Muchos de los antígenos de origen natural,
independientemente de su origen, son oligoméricos por naturaleza.
Algunos ejemplos no limitantes son Hsp16.3 de Mycobacterium
tuberculosis y varias toxinas bacterianas. Hsp16.3, un antígeno
inmunodominante de Mycobacterium tuberculosis con valor
serodiagnóstico, aparece como una estructura oligomérica,
presumiblemente basada en trímeros (Chang et al., 1996). La
toxina del cólera, así como la toxina termolábil estrechamente
relacionada de Escherichia coli, está compuesta por dos
subunidades, A y B, que forman un ensamblaje oligomérico AB_{5}.
La porción de la subunidad B de la toxina del cólera puede usarse
como un agente inmunizante en seres humanos, proporcionando
protección tanto frente al cólera como frente a la diarrea causada
por E. coli enterotoxigénica (Sanchez et al. 1990). De
una forma similar, el oligómero B, que es un constituyente de la
toxina pertussis, puede usarse para generar respuestas
inmunoprotectoras contra Bordetella pertussis.
Los antígenos virales también aparecen con
frecuencia como estructuras oligoméricas. Como ejemplos no
limitantes, puede citarse la glicoproteína B del virus herpes
simple tipo 1 (Lin et al., 1996) o la proteína no estructural
NS1 de flavivirus, que se ha usado en una vacuna recombinante
contra el dengue-2, y que existe normalmente como
un homodímero en células infectadas (Winkler et al., 1988).
Las moléculas de la envoltura del VIH-1 gp41 y
gp120, que pueden ser dianas interesantes para el desarrollo de
vacunas, forman igualmente una estructura oligomérica (Burton,
1997). Los antígenos predominantes del virus influenza también son
oligómeros. La hemaglutinina (HA) aparece de forma natural como un
homotrímero. La neuraminidasa (NA) aparece de forma natural como un
homotetrámero, compuesto por dos dímeros unidos por disulfuro que se
mantienen juntos por interacciones no covalentes (Laver y
Valentine, 1969; Bucher y Kilbourne, 1972; Varghese et al.,
1983; Ward et al., 1983). La proteína M2 de influenza también
aparece normalmente como un homotetrámero.
La mayoría de las vacunas en el mercado son
vacunas vivas inactivadas o atenuadas. Estas vacunas se producen
con frecuencia en cultivos de células animales, implicando un alto
nivel de riesgo biológico debido a la manipulación directa de virus
patógenos, y con un alto coste de producción debido a materias
primas caras y a procesos de producto complicados.
Aunque se supone que los antígenos oligoméricos
mantienen su estructura oligomérica en estas vacunas, éste no es
siempre el caso. Por ejemplo, en la preparación de vacunas divididas
de influenza, los antígenos oligómericos pueden perder su
estructura oligomérica durante la etapa de lisis viral. Para virus
influenza, existe una complicación adicional debido al hecho de que
experimentan una variación antigénica significativa en sus dos
antígenos de superficie hemaglutinina (HA) y neuraminidasa (NA)
(deriva antigénica).
Debido a la variabilidad de estas dos proteínas,
hasta ahora no se ha desarrollado una vacuna contra influenza de
amplio espectro y larga duración. La vacuna de influenza comúnmente
usada debe adaptarse casi todos los años para seguir la deriva
antigénica. Cuando se producen cambios más drásticos en el virus,
conocidos como cambios antigénicos, una vacuna anterior ya no es
protectora. Las presentes vacunas se basan en material de virus que
se ha producido en huevos de pollo. Aunque se ha descubierto que
estas preparaciones de vacunas son eficaces frente a una infección
por influenza causada por la cepa de virus homóloga, existen varios
inconvenientes, tales como el tiempo de producción, que hace
imposible comercializar una vacuna adaptada tras un aviso a corto
plazo. Además, considerando la deriva antigénica o incluso la
aparición súbita de una variante de cambio antigénico, existe el
riesgo añadido de seleccionar variantes antigénicas del virus por el
propio proceso de cultivo en los huevos (Koduhalli et al.,
1995).
Por lo tanto, se han destinado esfuerzos
considerables al desarrollo de vacunas recombinantes. Las vacunas
recombinantes pueden basarse en epítopos seleccionados y,
generalmente, son más seguras y más baratas de producir. Además,
como se describe por ejemplo en el documento WO9319185, en vacunas
recombinantes, el antígeno puede fusionarse a dominios
inmunoestimuladores para evitar o limitar el uso de un adyuvante en
la preparación de vacuna, o para reforzar la respuesta inmune de
epítopos débilmente inmunógenos. Se han desarrollado vacunas
recombinantes contra varias enfermedades importantes, tales como
sarampión, tétanos, tos ferina, TBC, hepatitis B, cólera e
influenza. Varias otras, tales como, por ejemplo, una vacuna
recombinante contra el VIH, están en desarrollo.
Como ejemplo, se han descrito vacunas
recombinantes contra virus influenza en los documentos WO9406468,
WO9407533, WO9518861 y WO9520660. Además, se ha desarrollado una
vacuna recombinante basada en la proteína de membrana M2, que tiene
la ventaja adicional de inducir una protección de amplio espectro a
largo plazo (Neirynck et al., 1999; documentos WO9303173,
WO9907839, WO9928478).
Tanto la NA (Laver y Valentine, 1969; Bucher y
Kilbourne, 1972; Varghese et al., 1983; Ward et al.,
1983) como la M2 (Sugrue y Hay, 1991) aparecen de forma natural
como homotetrámeros. Sin embargo, las preparaciones recombinantes
de NA producen homotetrámeros sólo en parte, siendo la parte
principal de la preparación monómeros y dímeros.
Aunque podría esperarse que los epítopos
antigénicos sean también, si no más, accesibles en estos mono- y
dímeros, sorprendentemente, se descubrió que las moléculas
tetraméricas eran considerablemente mejores en la generación de una
respuesta de anticuerpos específicos. Aunque pueden obtenerse
preparaciones tetraméricas de estas moléculas mediante una etapa de
purificación adicional de la proteína recombinante, tal como
cromatografía de exclusión por tamaño, dicha purificación
conduciría a una pérdida importante de rendimiento. Además, no
puede excluirse una disociación renovada del material purificado.
Por fusión de un dominio de oligomerización con el antígeno de
influenza, podría obtenerse una tetramerización espontánea de la
proteína de fusión, produciendo una proteína recombinante en una
forma casi puramente tetramérica. Sorprendentemente, se descubrió
que estos tetrámeros de fusión mostraban una capacidad antigénica
aumentada similar a la de la proteína recombinante tetramérica
purificada.
El objeto de la invención es proporcionar un
complejo de proteínas antigénicas recombinantes altamente
inmunógeno, preferiblemente un complejo de proteínas antigénicas de
influenza recombinantes.
Un primer aspecto de la invención es
proporcionar una proteína quimérica que comprende un antígeno,
obtenido de un complejo de proteínas oligoméricas de origen
natural, y un dominio de oligomerización. Dicho dominio de
oligomerización es heterólogo, es decir, procede de otra proteína
distinta a la del antígeno. El dominio de oligomerización está
dirigiendo la oligomerización de la proteína quimérica para formar
un complejo de proteínas oligoméricas recombinantes.
Preferentemente, el grado de oligomerización (dimérica, trimérica,
tetramérica o superior) de la proteína quimérica es idéntico al
grado de oligomerización del complejo de proteínas de origen
natural del que procede el antígeno, y el dominio antigénico de la
proteína quimérica se presenta en una estructura terciaria que es
similar o idéntica a la estructura terciaria del dominio antigénico
en la proteína de origen natural. Preferiblemente, dicho antígeno
es un antígeno de influenza. Más preferiblemente, dicho antígeno es
la neuraminidasa de influenza o la proteína M2 de influenza, o un
fragmento funcional de las mismas. Más preferiblemente, dicho
antígeno se selecciona del grupo que consiste en neuraminidasa de
influenza A, M2 de influenza A o proteína NB de influenza B. Los
especialistas en la técnica conocen dominios de oligomerización y
se han descrito, entre otros, en los documentos WO9637621,
WO9818943, WO9856906, WO9962953 y WO0069907. Preferentemente, el
dominio de oligomerización es una cremallera de leucina. Más
preferentemente, el dominio de oligomerización es una cremallera de
leucina procedente del factor de transcripción de levaduras
GCN4, o una forma modificada de la misma. Más
preferentemente, el dominio de oligomerización es una cremallera de
leucina modificada procedente del factor de transcripción de
levaduras GCN4, como se describe por Harbury et al. (1993).
Una realización preferida de la invención es la neuraminidasa de
influenza B o un fragmento funcional de la misma, tal como el
ectodominio de la neuraminidasa B, fusionado con un dominio de
oligomerización tal como una cremallera de leucina modificada,
procedente del factor de transcripción de levaduras GCN4,
como se describe por Harbury et al. (1993). Otra realización
preferida es la proteína NB de influenza B o un fragmento funcional
de la misma, fusionada con un dominio de oligomerización.
Un objetivo de la presente invención es
presentar el complejo de proteínas recombinantes en una conformación
que se asemeje a la conformación del complejo de proteínas de
origen natural. En los casos en los que el complejo de proteínas de
origen natural tiene una actividad enzimática definida, como en el
caso de la neuraminidasa de influenza, el complejo de proteínas
recombinantes tendrá una actividad enzimática comparable.
Aparte del dominio de oligomerización y del
antígeno, la proteína quimérica puede comprender otras secuencias
polipeptídicas, tales como secuencias enlazadoras o secuencias
polipeptídicas que aumenten la respuesta inmune. El especialista en
la técnica conoce dichas secuencias polipeptídicas que aumentan la
respuesta inmune e incluyen, como un ejemplo no limitante, una más
o más copias del fragmento d de la tercera proteína del complemento
(C3d; Dempsey et al., 1996) o el fragmento C de la toxina
tetánica o el fragmento A o B de la enterotoxina de Escherichia
coli o epítopos de células T procedentes del mismo patógeno que
el antígeno.
Otro aspecto de la invención es un complejo de
proteínas oligoméricas recombinantes que comprende una proteína
quimérica de acuerdo con la invención. Preferentemente, dicho
complejo de proteínas oligoméricas recombinantes es un dímero o un
tetrámero. Más preferentemente, dicho complejo de proteínas
oligoméricas recombinantes es un homodímero o un homotetrámero.
Preferiblemente, dicho complejo de proteínas oligoméricas genera una
respuesta inmune superior que la subunidad monomérica. Una
realización preferida de la invención es un complejo de proteínas
oligoméricas recombinantes que tiene una actividad enzimática
comparable a la del complejo de proteínas oligoméricas de origen
natural del que procede el antígeno incluido en la proteína
quimérica que forma dicho complejo de proteínas oligoméricas
recombinantes.
Otro aspecto más de la invención es un ácido
nucleico, que codifica una proteína quimérica de acuerdo con la
invención. Una realización preferida es un ácido nucleico que
comprende la secuencia presentada en la SEC ID Nº 1. Otra
realización preferida es un ácido nucleico que comprende la
secuencia presentada en la SEC ID Nº 3. Otra realización preferida
más es un ácido nucleico que comprende la secuencia presentada en la
SEC ID Nº 5.
Una realización especial es un ácido nucleico de
acuerdo con la invención que puede usarse en una vacunación con
ADN. El especialista en la técnica conoce vectores para la
vacunación con ADN y se describen, entre otros, en los documentos
WO9604394, WO9728259 y WO9908713. Se han descrito métodos para la
vacunación con ADN, entre otros, en el documento WO0012121.
Un aspecto adicional de la invención es un
vector de expresión que comprende un ácido nucleico de acuerdo con
la invención y que permite la expresión de una proteína quimérica de
acuerdo con la invención. Dicho vector de expresión puede ser
cualquier vector de expresión eucariota o procariota, como sabe el
especialista en la técnica. En una realización preferida, el vector
de expresión es pACGCN4NAs (Depósito en BCCM - (nº depósito LMBP
4270)), que comprende el dominio antigénico principal de NA, en el
que la parte N-terminal se ha sustituido por una
cremallera de leucina modificada procedente del factor de
transcripción de levaduras GCN4, que está imponiendo la
tetramerización (Harbury et al., 1993). Esta construcción se
fusiona con la señal de secreción de la hemaglutinina de influenza
y la construcción se coloca bajo el control del promotor de
polihedrina de baculovirus. Otra realización preferida es
pACsM2eGCN4 (nº depósito LMBP 4271), que comprende el ectodominio
de M2, fusionado en su extremo N-terminal con la
señal de secreción de GP67 de Baculovirus y en su extremo
C-terminal con la cremallera de leucina de
tetramerización modificada procedente del factor de transcripción
de levaduras GCN4 (Harbury et al., 1993). Otra
realización preferida más es pACsM2eGCN4C3d (Depósito en BCCM - (nº
déposito LMBP 4463)), en la que dicho ectodominio de M2, colocado
después de la señal de secreción de GP67 de Baculovirus y fusionado
con la cremallera de leucina de GCN4, se fusiona con el dominio
C3d.
Otro aspecto más de la invención es una célula
hospedadora transformada con un vector de expresión de acuerdo con
la invención. Dicha célula puede ser cualquier célula hospedadora
procariota o eucariota. El especialista en la técnica conoce
procedimientos de transformación.
Un aspecto adicional de la invención es el uso
de una proteína quimérica de acuerdo con la invención y/o el uso de
un complejo de proteínas oligoméricas recombinantes de acuerdo con
la invención para la preparación de una vacuna contra influenza.
Una realización especial es el uso de dicha proteína quimérica, en
el que dicha proteína quimérica comprende la SEC ID Nº 2, SEC ID Nº
4 o SEC ID Nº 6. La proteína quimérica también puede usarse para
generar anticuerpos monoclonales o policlonales usando
procedimientos conocidos por el especialista en la técnica, por lo
que dichos anticuerpos pueden usarse para fines de diagnóstico o
terapéuticos. Pueden ser especialmente útiles anticuerpos humanos o
humanizados como agentes terapéuticos para personas con una
respuesta inmune disminuida, tales como pacientes con VIH.
Otro aspecto más de la invención es una vacuna
contra influenza que comprende una proteína quimérica y/o un
complejo de proteínas oligoméricas recombinantes de acuerdo con la
invención.
Otro aspecto más de la invención es una es una
vacuna contra influenza que comprende una forma tetramérica
sustancialmente pura de un antígeno de influenza recombinante. En
una realización preferida, dicho antígeno de influenza recombinante
es neuraminidasa de influenza recombinante o un fragmento funcional
de la misma. En otra realización preferida, dicho antígeno de
influenza recombinante es M2 recombinante o un fragmento funcional
de la misma.
Más preferiblemente, dicha vacuna de influenza
se fusiona con un dominio de oligomerización heterólogo, más
preferiblemente, dicha vacuna de influenza se fusiona con la
cremallera de leucina de tetramerización modificada procedente del
factor de transcripción de levaduras GCN4 (Harbury et
al, 1993). Una realización preferida es una vacuna que
comprende una forma tetramérica sustancialmente pura de
neuraminidasa o un fragmento funcional de la misma, en la que dicha
forma tetramérica sustancialmente pura tiene una actividad
enzimática que es comparable a la neuraminidasa de influenza de
origen natural.
Otro aspecto más de la invención es el uso de
una proteína quimérica de acuerdo con la invención y/o el uso de un
complejo de proteínas oligoméricas recombinantes de acuerdo con la
invención para seleccionar inhibidores de la actividad biológica
del complejo de proteínas de origen natural. Una realización
preferida es dicho uso para seleccionar inhibidores de
neuraminidasa de influenza A o influenza B o inhibidores de M2 de
influenza A o de proteína NB de influenza B.
En particular, se describe lo siguiente.
- (i)
- Un complejo de proteínas oligoméricas recombinantes que comprende:
- \quad
- - un antígeno de influenza oligomérico que puede generar una respuesta inmune contra un virus influenza{}\hskip0.25cm y
- \quad
- - un dominio de oligomerización de cremallera de leucina
- \quad
- en el que cada subunidad de dicho antígeno de influenza oligomérico está unida al dominio de oligomerización de cremallera de leucina y
- \quad
- en el que dicho complejo de proteínas oligoméricas recombinantes es un di-, tri- o tetrámero.
- (ii)
- Un complejo de proteínas oligoméricas recombinantes como se ha expuesto en (i) anteriormente, en el que dicho dominio de oligomerización de cremallera de leucina es la cremallera de leucina de GCN4.
- (iii)
- Un complejo de proteínas oligoméricas recombinantes como se ha expuesto en cualquiera de (i) o (ii) anteriormente, en el que dicho antígeno de influenza es neuraminidasa de influenza, M2 de influenza A o NB de influenza B, o un fragmento de cualquiera de las mismas.
\global\parskip0.970000\baselineskip
- (iv)
- Un ácido nucleico que codifica una subunidad de un antígeno de influenza oligomérico y un dominio de oligomerización de cremallera de leucina como se ha expuesto en (i)-(iii) anteriormente.
- (v)
- Un ácido nucleico como se ha expuesto en (iv) anteriormente, que comprende la secuencia presentada en la SEC ID Nº 1, SEC ID Nº 3 o SEC ID Nº 5.
- (vi)
- Un vector de expresión que comprende un ácido nucleico como se ha expuesto en (iv)-(v) anteriormente.
- (vii)
- Una célula hospedadora que comprende un vector de expresión como se ha expuesto en (vi) anteriormente.
- (viii)
- Uso de un complejo de proteínas como se ha expuesto en (i)-(iii) anteriormente, o un ácido nucleico como se ha expuesto en (iv)-(v) anteriormente, para la preparación de una vacuna de influenza.
- (ix)
- Una vacuna de influenza que comprende un complejo de proteínas como se ha expuesto en (i)-(iii) anteriormente, o un ácido nucleico como se ha expuesto en (iv)-(v) anteriormente.
- -
- La expresión proteína quimérica, como se usa en este documento, significa que la proteína está compuesta por al menos dos polipéptidos, que no aparecen en la misma proteína de forma natural.
- -
- El término antígeno, como se usa en este documento, se refiere a un antígeno procedente de una proteína oligomérica de origen natural de un organismo o microorganismo patógeno, incluyendo virus, y puede usarse en un hospedador, preferiblemente, pero sin limitación, un hospedador humano, para generar una respuesta inmune contra dicho organismo o microorganismo patógeno.
- -
- Un complejo de proteínas oligoméricas recombinantes es un complejo de proteínas en el que al menos una de las subunidades es una proteína quimérica que comprende un dominio de oligomerización.
- -
- La expresión antígeno recombinante, como se usa en este documento, significa que dicho antígeno se produce por técnicas de ADN recombinante. El antígeno puede producirse en cualquier célula hospedadora procariota o eucariota, tal como, como un ejemplo no limitante, Escherichia coli, Bacillus subtilis, levaduras tales como Saccharomyces cerevisiae o Kluyveromyces sp., células fúngicas, células de insecto, células vegetales o células de mamífero.
- -
- La expresión actividad enzimática comparable significa que tanto el complejo de proteínas de origen natural como el complejo de proteínas oligoméricas recombinantes pueden realizar al menos una transformación bioquímica idéntica de al menos un sustrato, pero que la actividad específica de los complejos enzimáticos puede ser diferente. Una transformación bioquímica idéntica significa que el sustrato se transforma por la acción de la actividad enzimática en un producto final idéntico o productos finales idénticos.
- -
- La expresión forma tetramérica sustancialmente pura de un antígeno recombinante significa que dicho antígeno recombinante está al menos el 80%, preferiblemente al menos el 90% en la forma tetramérica.
- -
- Un fragmento funcional de neuraminidasa de influenza o de M2 de influenza es cualquier fragmento que puede generar una respuesta inmune contra un virus influenza. Como un ejemplo no limitante, un fragmento funcional de M2 de influenza es el ectodominio de M2.
- -
- A menos que se mencione explícitamente como vacuna de ADN, el término vacuna, como se usa en este documento, puede ser cualquier vacuna basada en proteínas, incluyendo vacunas inyectables así como vacunas de administración por vía mucosa.
Figura 1: Construcción de pACGCN4NAs
- \quad
- Phprom: promotor de polihedrina
- \quad
- sHA: señal de secreción de la hemaglutinina de influenza
- \quad
- GCN4: cremallera de leucina de GCN4 modificada
- \quad
- NA: neuraminidasa
- \quad
- bla: \beta-lactamasa
- \quad
- ori: origen de replicación
- \quad
- línea gris gruesa: región de homología de baculovirus
\global\parskip1.000000\baselineskip
Figura 2: Construcción de pACsM2eGCN4
- \quad
- Phprom: promotor de polihedrina
- \quad
- sGP67: señal de secreción de la proteína GP67 de baculovirus
- \quad
- M2e : parte extracelular de M2 (ectodominio de M2)
- \quad
- GCN4: cremallera de leucina de GCN4 modificada
- \quad
- bla: \beta-lactamasa
- \quad
- ori: origen de replicación
- \quad
- línea gris gruesa: región de homología de baculovirus
\vskip1.000000\baselineskip
Figura 3: Diagrama de flujo para la construcción
de pACsM2eGCN4C3d. Sólo se han indicado los sitios de restricción
relevantes para el procedimiento de clonación.
Figura 4: Respuesta de anticuerpos contra
diferentes subformas oligoméricas de neuraminidasa recombinante.
Figura 5: Supervivencia de ratones vacunados con
diferentes subformas oligoméricas de neuraminidasa recombinante
después de una exposición letal a virus influenza homólogo adaptado
a ratón.
Figura 6: Análisis de la expresión de GCN4NAs
por transferencia de Western.
Figura 7: Patrón de gradiente de sacarosa de
neuraminidasa secretada y GCN4NAs quimérica secretada.
Figura 8: Estructura propuesta de GCN4NAs basada
en la estructura conocida de sus dos dominios constituyentes.
Figura 9: GCN4NAs es un tetrámero como se
muestra por entrecruzamiento químico de sus subunidades.
- \quad
- Carril 1: incubación de 30 min de GCN4NAs con BS3 1,2 mM
- \quad
- Carril 2: incubación de 5 min de GCN4NAs con BS3 1,2 mM
- \quad
- Carril 3: incubación de 30 min de GCN4NAs con BS3 0,6 mM
- \quad
- Carril 4: incubación de 5 min de GCN4NAs con BS3 0,6 mM
- \quad
- Carril 5: incubación de 30 min de GCN4NAs con BS3 0,3 mM
- \quad
- Carril 6: incubación de 5 min de GCN4NAs con BS3 0,3 mM
- \quad
- Carril 7: GCN4NAs sin entrecruzante
- \quad
- Carril 8: PM
\vskip1.000000\baselineskip
Figura 10: Caracterización de la expresión de
sM2eGCN4.
Figura 11: Análisis mediante
SDS-PAGE al 12% de proteínas secretadas por células
Sf9 infectadas con baculovirus en medio TC100. Se disolvieron
proteínas precipitadas con TCA a partir de 800 \mul de medio en
tampón de carga.
Los carriles A1 y B1 se cargaron con proteínas
procedentes de células infectadas con baculovirus obtenidos por
recombinación con un vector de expresión vacío. Los carriles A2 y B2
se cargaron con proteínas procedentes de células infectadas con
baculovirus que contenían la información genética para la expresión
de sM2eGCN4C3d.
- \quad
- A: Detección mediante análisis de transferencia de Western usando el anticuerpo monoclonal 2C9 (Neirynck et al., 1999).
- \quad
- B: Se tiñeron proteínas con SyproOrange (Molecular Probes, Eugene, OR., Estados Unidos). Una flecha indica la posición de la proteína recombinante sM2eGCN4C3d.
- \quad
- M1 = Marcadores de peso molecular de proteínas preteñidos "Benchmark" (Gibco BRL, Bethesda, MD., Estados Unidos). M2 = marcadores de peso molecular de proteínas de Molecular Probes (Eugene, OR., Estados Unidos).
\vskip1.000000\baselineskip
Figura 12: Cromatografía de filtración en gel en
una columna Superdex 200 HR (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala,
Suecia).
- \quad
- (A) Perfil de elución después de la separación de una mezcla de proteínas de referencia para calibración.
- \quad
- (B) Perfil de elución de sM2eGCN4C3d recombinante parcialmente purificada; se analizaron fracciones por{}\hskip0.5cm transferencia de Western como se describe en la leyenda de la figura 11.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura 13: sM2eGCN4C3d es un tetrámero como se
muestra por entrecruzamiento químico de sus subunidades.
Análisis de transferencia de Western de
sM2eGCN4C3d antes (carril 1) y después del tratamiento con agente
entrecruzante BS3 4, 6 y 12 mM (carriles 2, 3 y 4, respectivamente).
Las proteínas se desnaturalizaron en tampón de Laemmli en presencia
de DTT como agente reductor y se separaron en un gel de
SDS-poliacrilamida de gradiente del
5-14%. La transferencia de las proteínas se siguió
de exploración con un anticuerpo monoclonal anti-M2
2C9, seguido de un anticuerpo secundario (conjugado de rata
anti-IgG de ratón con peroxidasa; Sigma Chemical
Company, St. Louis, MO., Estados Unidos). Se revelaron las señales
positivas después de la adición de solución de sustrato
quimioluminiscente "Renaissance" (NEN Life Science Products,
Boston, MA, Estados Unidos).
Figura 14: Respuesta de anticuerpos contra
sM2eGCN4C3d
Se inyectó i. p. a ratones PBS + adyuvante o
sM2eGCN4C3d + adyuvante y las inyecciones se repitieron dos veces a
intervalos de 2 semanas (consúltese el Ejemplo 13). Se extrajo suero
10 días después de cada inyección y se determinaron los títulos de
anticuerpos usando péptido M2e o sM2eGCN4C3d para la inmovilización.
Vac, b1 y b2: sueros extraídos después de la primera inyección,
primer refuerzo y segundo refuerzo, respectivamente.
Figura 15: Supervivencia de ratones después de
una exposición a virus influenza adaptado a ratón
Se inmunizaron ratones Balb/c tres veces con PBS
o 10 \mug de sM2eGCN4C3d (consúltese el Ejemplo 13) y se
expusieron a virus X47 homólogo adaptado a ratón.
\vskip1.000000\baselineskip
Todas las amplificaciones por PCR se realizaron
usando la polimerasa Vent (New England Biolabs, Beverly, MA,
Estados Unidos), con un total de 10 ciclos y 200 ng de plásmido para
todas las reacciones. Las condiciones de ciclado eran según se
especifica para las amplificaciones individuales. Los
oligonucleótidos usados para las construcciones se muestran en la
Tabla I.
El vector de transferencia de baculovirus
pAC2IVNAs (que contiene la secuencia de ADNc de la neuraminidasa N2
del virus influenza A/Victoria/3/75 cuyo anclaje de membrana se
sustituyó por la secuencia señal escindible de la hemaglutinina;
descrito en detalle en Deroo et al., 1996) se usó como molde
para generar dos productos de PCR usando las parejas de cebadores
BACfor/GCN4nh (desnaturalización: 94ºC, 1 min; hibridación 57ºC, 1
min; síntesis 75ºC, 30 s) y GCN4cooh/BACrev (desnaturalización:
94ºC, 1 min; hibridación 59ºC, 1 min; síntesis 75ºC, 2 min 30 s),
que se digirieron posteriormente con PstI/HindIII y BcII/XbaI,
respectivamente. Después, los fragmentos resultantes y un fragmento
de ADN sintético fosforilado en su extremo 5' (pareja de
oligonucleótidos complementarios GCN4pos/GCN4neg) se ligaron con el
fragmento de vector de 10089 pb PstI/XbaI de pAC2IVNAs. La
secuencia insertada en el vector de transferencia de baculovirus
obtenido de este modo (pACGCN4NAs), codifica el dominio principal
antigénico y catalítico de la neuraminidasa (NA) precedido por una
cremallera de leucina de GCN4 modificada que promueve la formación
de una proteína tetramérica (Harbury et al., 1993) y por la
señal de secreción de la hemaglutinina de influenza (sHA). La
expresión del gen de fusión está controlada por el promotor de
polihedrina de baculovirus (Phprom). El baculovirus
recombinante correspondiente (denominado AcNPV[GCN4NAs]) se
generó por cotransfección con fosfato de calcio de células de
insecto Sf9 con ADN de baculovirus BaculoGold (Pharmingen, San
Diego, CA., Estados Unidos), siguiendo el procedimiento que se
describe en King y Possee (1992). La construcción se resume en la
Figura 1.
\vskip1.000000\baselineskip
Después de la amplificación por PCR de la señal
de secreción de GP67 de baculovirus (cebadores GP67s y GP67a;
desnaturalización: 94ºC, 1 min; hibridación 62ºC, 1 min; síntesis
75ºC, 45 s) a partir de pACGP67A (vector de transferencia de
baculovirus adquirido en Pharmingen, San Diego, CA., Estados Unidos)
y de la digestión con SpeI/HindIII, el fragmento se subclonó en la
secuencia de vector SpeI/HindIII de pUCC3d (descrito en el ejemplo
3), dando como resultado pUCsgp. Después de la digestión de pUCsgp
con HindIII/NaeI, la señal de secreción de GP67 se fusionó con el
fragmento M2e (que codifica el ectodominio de la proteína M2)
obtenido por amplificación por PCR (cebadores M2Ss y UM2ECa;
desnaturalización: 94ºC, 1 min; hibridación: 62ºC, 1 min; síntesis:
75ºC, 20 s) y posterior tratamiento con HindIII. Esta construcción,
denominada pUCsgpM2e, se usó como molde para generar un nuevo
fragmento de PCR (cebadores GP67s y M2rev; desnaturalización: 94ºC,
1 min; hibridación 56ºC, 1 min; síntesis 75ºC, 30 s) que se digirió
con SpeI y BspEI. Después, el fragmento de PCR GCN4 obtenido de
pACGCN4NAs (cebadores GCNfor y GCNrev; desnaturalización: 94ºC, 1
min; hibridación 58ºC, 1 min; síntesis 75ºC, 30 s) se ligó junto
con el primer fragmento con el fragmento de vector SpeI/BgIII de
9610 pb de pACGP67A. En el vector de transferencia de baculovirus
resultante pACsM2eGCN4, la secuencia que codifica el ectodominio de
M2 (M2e) se fusiona en su extremo C-terminal con una
cremallera de leucina de GCN4 modificada que es capaz de inducir la
tetramerización (Harbury et al., 1993) y está precedida por
la señal de secreción de GP67 (sGP67) y por el promotor de
polihedrina (Phprom). El baculovirus recombinante
correspondiente (designado AcNPV[sM2eGCN4]) se generó por
cotransfección con fosfato de calcio de células de insecto Sf9 con
ADN de baculovirus BaculoGold (Pharmingen, San Diego, CA., Estados
Unidos), siguiendo el procedimiento que se describe en King y Possee
(1992). La construcción se resume en la Figura 2.
\vskip1.000000\baselineskip
El plásmido pSG5.C3d3.YL (Dempsey et al,
1996) se obtuvo por cortesía del Dr. D. T. Fearon, Departamento de
Medicina, Escuela de Medicina de la Universidad de Cambridge,
Cambridge, Reino Unido. La información genética de C3d se amplificó
primero y se subclonó en el vector pUC18 (Norrander et al.,
1983) de la forma siguiente: La secuencia de C3d se amplificó por
PCR (cebadores C3ds y C3da, pSG5.C3d3.YL como molde;
desnaturalización: 94ºC, 30 s; hibridación: 60ºC, 20 s; síntesis:
72ºC, 2 min) seguido de escisión con SpeI y BgIII para permitir la
inserción en el vector intermedio pUC18f digerido con SpeI/BgIII.
Este último se ha generado por inserción de un sitio de restricción
SpeI en un PUC18 abierto con SmaI, usando el adaptador
5'TCACTAGTGA3', y por inserción de un sitio de restricción BgIII en
el vector abierto con HindII, usando el adaptador 5'CAGATCTG3'. El
resultado de clonar el fragmento de PCR en pUC18f era el plásmido
pUCC3d. El plásmido de partida pSG5.C3d3.YL también se escindió con
XbaI, seguido de generación de extremos romos con ADN polimerasa de
T4 y de una digestión posterior con BspEI, que proporcionaba un
fragmento de 680 pb. Este último se insertó en el vector pUCC3d
previamente escindido con SpeI, enromado con ADN polimerasa de T4 y
después cortado con BspEI. El resultado era el plásmido pUCC3dEEF.
Partiendo del plásmido pACsM2eGCN4 (ejemplo 2) y usando los
cebadores GP67s y GCNrev2, la secuencia codificante de sM2eGCN4 se
amplificó por PCR (desnaturalización: 94ºC, 1 min; hibridación:
57ºC, 1 min; síntesis: 75ºC, 30 s) y después se trató con SpeI y
BamHI. El fragmento resultante se insertó en pACGP67A digerido con
SpeI/BamHI (vector de transferencia de baculovirus adquirido en
Pharmingen, San Diego, CA., Estados Unidos). Esto proporcionaba la
construcción intermedia pACsM2eGCN4f. El plásmido mencionado
anteriormente pUCC3dEEF se digirió con BgIII y EcoRI para
proporcionar un fragmento de 1094 pb que codifica C3dEEF, que se
subclonó en pACsM2eGCN4f abierto con BamHI y EcoRI. Esto
proporcionaba el plásmido pACsM2eGCN4C3d. En este vector de
transferencia de baculovirus, el promotor de polihedrina
(Phprom) está seguido de un gen de fusión multicomponente
que codifica la señal de secreción de GP67 (sGP67), el ectodominio
M2e (M2e), la cremallera de leucina de GCN4, el dominio C3d de
ratón y un marcador "EEF" C-terminal. El
baculovirus correspondiente (designado AcNPV[sM2eGCN4C3d])
se generó por cotransfección con fosfato de calcio de células de
insecto Sf9 con ADN de baculovirus BaculoGold (Pharmingen, San
Diego, CA., Estados Unidos), siguiendo el procedimiento que se
describe en King y Possee (1992). La construcción se resume en la
Figura 3.
\vskip1.000000\baselineskip
Se produjo NA recombinante secretada (NAs)
mediante un sistema de expresión de baculovirus y, posteriormente,
se purificó de acuerdo con Deroo et al. (1996). Después de la
filtración en gel Superdex 200, que es la etapa final del
procedimiento de purificación descrito en Deroo et al.
(1996), las fracciones correspondientes a NAs monomérica, dimérica
y tetramérica se combinaron por separado y se concentraron por
ultrafiltración usando dispositivos Centriplus (límite de 10 kDa)
(Amicon, Danvers, MA., Estados Unidos). Después se inmunizaron
grupos de 12 ratones Balb/c hembra (SCK Mol, Bélgica) tres veces
mediante inyección subcutánea de 1 \mug de una subforma
oligomérica específica en presencia de un adyuvante poco reactógeno,
como se describe en Deroo et al. (1996). Dos semanas después
de cada inmunización, se extrajo sangre de la vena de la cola y se
preparó el suero. Las muestras de suero se analizaron
posteriormente mediante ELISA. Con este fin, se recubrieron placas
de 96 pocillos con NA escindida con pronasa purificada (Deroo et
al., 1993) y se incubaron con diluciones de suero de 2 veces.
Se midieron los títulos de anticuerpos séricos por adición de
anticuerpo de cabra anti-[IgG de ratón] conjugado con fosfatasa
alcalina (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO., Estados Unidos) y
fosfato de p-nitrofenilo (Sigma Chemical Co., St.
Louis, MO., Estados Unidos) como sustrato. El título de anticuerpos
séricos se corresponde con el valor log_{2} del factor de dilución
que daba una DO de 0,5 por encima del control. Los ratones
inmunizados con NAs tetramérica muestran una respuesta de
anticuerpos superior durante todo el régimen de inmunización
(Figura 4). Después de 2 inmunizaciones, se detectó una diferencia
de \sim17 veces a favor de los ratones inmunizados con NAs
tetramérica en comparación con los que recibieron una dosis
equivalente de NAs dimérica, y una diferencia de \sim137 veces en
comparación con el grupo inmunizado con una dosis equivalente de
NAs monomérica. La diferente entre vacunas tetraméricas y
monoméricas aumentaba aún más después de la tercera inmunización,
hasta un factor de \sim360.
\vskip1.000000\baselineskip
Se inmunizaron grupos de 12 ratones Balb/c
hembra por vía subcutánea con diferentes subformas oligoméricas de
neuraminidasa secretada purificada (NAs), como se resume en el
ejemplo 4. Tres semanas después de la tercera inyección, los
ratones se expusieron a una dosis potencialmente letal de virus
influenza adaptado a ratón (cepa de genoma reordenado X47) como se
describe en Deroo et al. (1996). No se observó letalidad
entre los animales que recibieron una vacuna de NAs tetramérica.
Por el contrario, sólo el 75% y el 50% de los animales inmunizados
con NAs dimérica y monomérica, respectivamente, sobrevivieron a la
exposición (Figura 5).
\vskip1.000000\baselineskip
Se inocularon células de insecto Sf9 en fase de
crecimiento logarítmico con el baculovirus indicado a una
multiplicidad de infección elevada (>10). Las células se
transfirieron posteriormente a medio TC100 sin suero (Gibco BRL,
Bethesda, MD., Estados Unidos) y se incubaron adicionalmente durante
48 h antes de recoger el sobrenadante. Las proteínas se
precipitaron por adición de un volumen equivalente de acetona
(pre-equilibrada a -20ºC) y posteriormente se
analizaron mediante un SDS-PAGE reductor al 12%
seguido de transferencia de Western. Se visualizaron las bandas
usando un anticuerpo policlonal de IgG de conejo contra
neuraminidasa escindida con pronasa, seguido de incubación con un
anticuerpo secundario (conjugado de cabra anti-[IgG de conejo] con
fosfatasa alcalina; Sigma Chemical Co., St. Louis, MO., SA) y
solución de sustrato BCIP/NBT. La neuraminidasa fusionada con GCN4
secretada (GCN4NAs), después de la desnaturalización, es claramente
visible como una banda de -55 kDa (Figura 6).
\vskip1.000000\baselineskip
Se produjeron neuraminidasa secretada (NAs) y
neuraminidasa fusionada con GCN4 secretada (GCN4NAs), como se
resume en el ejemplo 4, por infección de células Sf9 con el
baculovirus recombinante descrito en Deroo et al. (1996) o con
AcNPV[GCN4NAs], respectivamente. Se concentró el sobrenadante
recogido (10 ml) usando dispositivos Centriplus (límite de 10 kDa)
(Amicon, Danvers, MA., Estados Unidos) hasta \sim1 ml y se
complementó posteriormente con 1 volumen de Tris.Cl 100 mM pH 7,4,
NaCl 200 mM, Triton X-100 al 0,2%, que contiene un
combinado inhibidor de proteasas (Complete, Roche Molecular
Biochemicals, Basel, Suiza). Como alternativa, cuando se trabajaba
con grandes volúmenes de sobrenadante recogido (200 ml), se
precipitó la GCN4NAs con sulfato de amonio. El material que
precipitaba a una saturación de (NH_{4})_{2}SO_{4} de
entre el 60% y el 80% se recogió por centrifugación (10000 g, 60
min) y se disolvió en Tris.Cl 50 mM pH 7,4, NaCl 100 mM, Triton
X-100 al 0,2% que contenía un combinado inhibidor
de proteasas (Complete, Roche Molecular Biochemicals, Basel, Suiza).
Esta solución que contenía GCN4NAs se dializó contra el mismo
tampón.
Después de la centrifugación para eliminar
componentes insolubles (10 min a 14000 rpm), se cargó una muestra
de 1 ml en un gradiente continuo de sacarosa de 30 ml (5%-25%)
preparado en Tris.Cl 10 mM pH 7,4, NaCl 100 mM, Triton
X-100 al 0,1% y complementado con inhibidores de
proteasas Complete. Los gradientes se centrifugaron a 10ºC en un
rotor SW28 Beckman durante 16 h a 28000 rpm. Después se recogieron
fracciones de 1,5 ml del fondo del gradiente y se analizaron por
ELISA y por actividad enzimática. El ELISA se realizó en placas de
96 pocillos recubiertas con una fracción de IgG de conejo generada
contra neuraminidasa escindida con pronasa purificada (consúltese
el ejemplo 6). Se añadieron fracciones de gradiente a las placas y
se detectó la NAs unida por adición de IgG de conejo
anti-NA escindida con pronasa conjugada con biotina.
Las placas se revelaron por incubación de las mismas con conjugado
de estreptavidina-fosfatasa alcalina (Gibco BRL,
Bethesda, MD., Estados Unidos) y fosfato de
p-nitrofenilo como sustrato. Se leyeron los valores
de DO a 405 nm. El análisis de la actividad enzimática se realizó
como se describe en Deroo et al. (1996). El perfil obtenido
con NAs después de la centrifugación en gradiente de sacarosa
concuerda con el perfil de filtración en gel de NAs purificada
descrito en Deroo et al. (1996) y, típicamente, da como
resultado dos picos principales que se corresponden con NAs
tetramérica catalíticamente activa y NAs dimérica catalíticamente
inactiva, respectivamente, representando esta última forma
aproximadamente 2/3 de la cantidad total de NAs secretada (Figura
7). La cantidad de NAs monomérica estaba por debajo de los niveles
de detección en esta preparación experimental. Por el contrario, la
GCN4NAs se secretaba completamente como una proteína tetramérica
catalíticamente activa, sin cantidades detectables de formas
oligoméricas de menor orden. Su sedimentación a la misma velocidad
que la NAs tetramérica recombinante indica una masa molecular
similar. Las actividades enzimáticas específicas relativas de las
proteínas purificadas por gradiente de sacarosa se comparan en la
Tabla II. Se muestra un modelo del complejo de proteínas
tetraméricas recombinantes en la figura 8.
\vskip1.000000\baselineskip
Se concentraron muestras de GCN4NAs parcialmente
purificada obtenida por centrifugación en gradiente de sacarosa,
como se describe en el ejemplo 7, usando dispositivos Microcon
(límite de 10 kDa) (Amicon, Danvers, MA., Estados Unidos) y se
dializaron usando un Spectra/Por SispoDialyzer (límite de 8 kDa)
(Spectrum, Rancho Dominguez, CA, Estados Unidos) durante una noche
contra PBS para eliminar el tampón Tris. Se obtuvieron
entrecruzantes en Pierce (Rockford, IL, Estados Unidos). Se añadió
bis(sulfosucinimidil)suberato (BS3) a partir de una
solución madre 20 mM en DMSO recién preparada a concentraciones
finales de 2 a 6 mM. Las reacciones se incubaron durante 1 hora a
temperatura ambiente y se inactivaron durante 15 minutos por adición
de tampón Tris, pH 8, a una concentración final de 300 mM. Después
del entrecruzamiento, se añadió un volumen equivalente de tampón de
carga SDS 2x (SDS al 5%, DTT 100 mM, glicerol al 20%, EDTA 5 mM,
tampón Tris 50 mM, pH 8) y la muestra se llevó a ebullición durante
5 minutos. Se realizó un análisis de SDS PAGE en un aparato
MiniProtean II (BioRad, Hercules, CA, Estados Unidos) usando geles
premoldeados de gradiente del 4-15%. La
electrotransferencia de geles de SDS PAGE sobre membranas de
nitrocelulosa (NC) se realizó usando una celda Mini
Trans-Blot (BioRad, Hercules, CA, Estados Unidos) y
requería 45 min a 100 V. Después de eso, las membranas de NC se
bloquearon en PBS que contenía BSA al 2% durante 2 h. Las
transferencias se incubaron con suero de conejo
anti-NA (consúltese el ejemplo 6) diluido (1/5000)
en PBS que contenía BSA al 1% y Tween-20 (PBT) al
0,1%. Después de retirar por lavado los anticuerpos no unidos, se
añadió suero de cabra anti-IgG de conejo conjugado
con fosfatasa alcalina (Organon Teknika, West Chester, PA, Estados
Unidos) a una dilución de 1/7000 en PBT. La detección se realizó
con NBT/BCIP (Roche Diagnostics, Indianápolis, IN, Estados Unidos).
Se usó como referencia un marcador de peso molecular preteñido de
amplio intervalo (BioRad, Hercules, CA, Estados Unidos).
La incubación de GCN4NAs en presencia del
entrecruzante BS3 daba como resultado la formación de oligómeros
unidos covalentemente, como se representa en la figura 9. Las
especies entrecruzadas principales tienen una masa molecular
estimada de 250 kDa y 115 kDa, que se corresponden con tetrámeros y
dímeros entrecruzados, respectivamente. La presencia de las formas
diméricas disminuía con el aumento de la concentración de
entrecruzante. Este resultado confirma los datos obtenidos por
sedimentación y por actividad enzimática, indicando todos que la
GCN4NAs existe en solución como tetrámero.
\vskip1.000000\baselineskip
Se inocularon células de insecto Sf9 en fase de
crecimiento logarítmico con baculovirus AcNPV[sM2eGCN4]
(ejemplo 2) o virus de control a una multiplicidad de infección
elevada (>10). Posteriormente, las células se transfirieron a
medio TC100 sin suero (Gibco BRL, Bethesda, MD., Estados Unidos) y
se incubaron adicionalmente durante 48 h antes de recoger el
sobrenadante. Las proteínas se precipitaron por adición de un
volumen equivalente de acetona (pre-equilibrada a
-20ºC), se disolvieron en tampón de carga y se separaron mediante
SDS-PAGE reductor al 15%, seguido de transferencia
de Western. Las bandas se visualizaron usando el anticuerpo
monoclonal 2C9 dirigido contra el dominio M2e (Neirynck et
al. 1999), seguido de incubación con un anticuerpo secundario
(de cabra anti-[IgG de ratón]) conjugado con fosfatasa alcalina;
(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO., Estados Unidos) y solución de
sustrato BCIP/NBT. Después de la desnaturalización, se detectó la
M2e fusionada con GCN4 secretada (sM2eGCN4) como una banda de
\sim10,5 kDa (Figura 10).
\vskip1.000000\baselineskip
Se inocularon células de insecto Sf9 en fase de
crecimiento logarítmico con baculovirus AcNPV[sM2eGCN4C3d]
(consúltese el ejemplo 3) o virus de control ("infección
simulada") a una multiplicidad de infección elevada (>10).
Posteriormente, las células se transfirieron a medio TC100 sin suero
(Gibco BRL, Bethesda, MD., Estados Unidos) y se incubaron
adicionalmente durante 48 h antes de recoger el sobrenadante. Las
proteínas se analizaron por precipitación con TCA enfriado en hielo
y, posteriormente, se separaron mediante SDS-PAGE
reductor al 12% seguido de tinción con SyproOrange (Molecular
Probes, Eugene, OR., Estados Unidos). La sM2eGCN4C3d secretada se
reveló como una banda de \sim41 kDa, que no estaba presente en el
medio de células Sf9 con infección "simulada" (Figura 11).
Para la infección "simulada" se ha generado un baculovirus por
cotransfección con fosfato de calcio de células Sf9 con un vector
de transferencia pACGP67A sin inserto para expresión y ADN de
baculovirus BaculoGold (Pharmingen, San Diego, CA., Estados Unidos),
siguiendo el procedimiento que se describe en King y Possee
(1992).
Mediante transferencia de Western, la
sM2eGCN4C3d se visualizó de nuevo como una banda de \sim41 kDa
usando el anticuerpo monoclonal anti-M2e 2C9
(Neirynck et al., 1999), seguido de incubación con un
anticuerpo secundario (conjugado de rata anti-[IgG de ratón] con
peroxidasa; Sigma Chemical Co., St. Louis, MO., Estados Unidos) y
solución de sustrato de quimioluminiscente "Renaissance" (NEN
Life Science Products, Boston, MA., Estados Unidos). Se detectó la
misma banda cuando se usó anticuerpo monoclonal de rata YL 1/2
contra el marcador "EEF" (Abcam Ltd, Cambridge, Reino Unido) o
anticuerpo policlonal de oveja contra la proteína 3 del complemento
de ratón (Biogenesis, Poole, Reino Unido). Se usaron los siguientes
anticuerpos secundarios: monoclonales de ratón
anti-cadenas ligeras kappa y lambda de rata (clones
RT-39 y RL-6) conjugados con
fosfatasa alcalina y de burro anti-IgG de oveja
conjugado con fosfatasa alcalina, respectivamente (Sigma, St. Louis,
MO., Estados Unidos).
Para una caracterización adicional, las
proteínas transferidas se tiñeron con negro amido, la banda de
\sim41 kDa se aisló por corte de la membrana y el análisis de
secuencia N-terminal se realizó de acuerdo con Bauw
et al. (1987). Los primeros cuatro aminoácidos se
identificaron como serina, leucina, leucina y treonina,
respectivamente. Este resultado demuestra que la escisión de la
secuencia señal de GP67 se ha llevado a cabo correctamente y
confirma que la banda de \sim41 kDa es sin ninguna duda
sM2eGCN4C3d.
\vskip1.000000\baselineskip
Se produjo sM2eGCN4C3d recombinante secretada
mediante un sistema de expresión de baculovirus como se describe en
el ejemplo 10. Se llevaron a cabo las siguientes etapas de
purificación, que se resumen en la Tabla III: En primer lugar, se
fraccionó el medio bruto mediante precipitación diferencial con
sulfato de amonio. Se añadió sulfato de amonio al medio, enfriado
en hielo, hasta una saturación del 45% y las proteínas precipitadas
se retiraron por centrifugación (rotor Sorvall SS34, 1 hora a 15000
rpm, 4ºC). La concentración de (NH_{4})_{2}SO_{4} se
aumentó hasta una saturación del 95% y el precipitado resultante se
recogió por centrifugación. El sedimento se volvió a disolver en
tampón Tris.Cl 50 mM, pH 7,2 (aproximadamente 1/20 del volumen
original del medio) y se desalinizó sobre una columna HiPrep
Sephadex G25 (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Suecia)
equilibrada en Tris.Cl 50 mM, pH 7,2. La solución de proteína
desalinizada se cargó en una columna Q-Sepharose FF
(a: 9 cm, d: 1,5 cm; Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Suecia)
equilibrada en tampón Tris 50 mM, pH 7,2 y la elución fue mediante
un gradiente salino de NaCl de 200 a 400 mM en tampón Tris 20 mM, pH
7,2. Se usó una alícuota de 100 \mul de cada fracción para
análisis: Se precipitaron las proteínas mediante TCA a partir de
alícuotas de 100 \mul de cada fracción en la preparación para un
análisis mediante SDS-PAGE al 12% seguido de
transferencia de Western y exploración con el anticuerpo monoclonal
anti-M2e 2C9 (Neirynck et al., 1999),
(consúltese ejemplo 9), usando como anticuerpo secundario (conjugado
de rata anti-[IgG de ratón] con peroxidasa; Sigman Chemical Co.,
St. Louis, MO., Estados Unidos) y solución de sustrato
quimioluminiscente "Renaissance" (NEN Life Science Products,
Boston, MA., Estados Unidos). Se combinaron las fracciones positivas
y la solución se concentró usando dispositivos de ultrafiltración
Vivaspin-30 y Centricon-100
(Millipore Corporation, Bedford, MA., Estados Unidos).
Aproximadamente el 99% de la proteína
recombinante quedó retenida en la membrana
Centricon-100, sugiriendo que la masa molecular del
oligómero sM2eGCN4C3d era superior a 100 kDa, como se esperaba para
un tetrámero.
Para verificar adicionalmente el estado
oligomérico de sM2eGCN4C3d, se cargaron 150 \mul de la proteína
recombinante concentrada parcialmente purificada en una columna de
filtración en gel Superdex 200 HR (Amersham Pharmacia Biotech,
Uppsala, Suecia), equilibrada en PBS y se resolvieron a un caudal de
0,4 ml/min. Esta columna Superdex 200 se había calibrado
previamente usando una mezcla de proteínas altamente purificadas
(kits de calibración HMW y LMW (Amersham Pharmacia Biotech,
Uppsala, Suecia). Como se muestra en la Figura 12, se detectó
solamente sM2eGCN4C3d en fracciones casi coincidentes con las de la
aldolasa (masa molecular teórica 179 kDa), como puede esperarse
para la sM2eGCN4C3d tetramérica.
\vskip1.000000\baselineskip
Se incubaron muestras (10 \mul) de sM2eGCN4C3d
parcialmente purificada (aproximadamente 0,5 \mug en PBS;
consúltese el ejemplo 11) con el entrecruzante BS3 (Pierce,
Rockford, IL, Estados Unidos) a concentraciones finales de 4 a 12
mM. El entrecruzante se añadió a partir de una solución madre 40 mM
en DMSO recién preparada. Las reacciones se incubaron durante 10
minutos a temperatura ambiente y se inactivaron durante 15 minutos
por adición de tampón Tris 1 M, pH 7,5, a una concentración final de
300 mM. Después de la incubación, se añadió un volumen equivalente
de tampón de carga SDS 2x (SDS al 5%, DTT 100 mM, glicerol al 20%,
EDTA 5 mM, tampón Tris 50 mM, pH 8) y las muestras se llevaron a
ebullición durante 5 minutos. El análisis de
SDS-PAGE se realizó en un aparato MiniProtean II
(BioRad, Hercules, CA, Estados Unidos) usando geles premoldeados de
gradiente del 4-15%. La electrotransferencia de
geles de SDS-PAGE sobre membranas de nitrocelulosa
(NC) se realizó usando una celda Mini Trans-Blot
(BioRad, Hercules, CA, Estados Unidos) y requería 1 hora a 100 V.
Después de eso, las membranas de NC se bloquearon durante una noche
a 4ºC en PBS que contenía BSA al 2%. Las transferencias se
incubaron con anticuerpo monoclonal anti-M2e 2C9 en
TBT-T (tampón Tris 50 mM, pH 7,0, NaCl 50 mM y
Tween-20 al 0,1%). Después de eliminar por lavado
los anticuerpos no unidos, la transferencia se exploró con un
anticuerpo secundario (conjugado de rata anti-[IgG de ratón] con
peroxidasa; Sigma Chemical Co., St. Louis, MO.; Estados Unidos) y
las señales positivas se revelaron después de la adición de solución
de sustrato quimioluminiscente "Renaissance" (NEN Life Science
Products, Boston, MA., Estados Unidos). Se usaron proteínas
marcadoras de peso molecular preteñidas de amplio intervalo (BioRad,
Hercules, CA, Estados Unidos) como referencia. Como se muestra en
la figura 13, el tratamiento de sM2eGCN4C3d con el entrecruzante BS3
dio como resultado la formación de oligómeros unidos
covalentemente. La especie entrecruzada principal tenía una masa
molecular estimada de aproximadamente 164 kDa, mientras que el
monómero tenía una masa molecular de aproximadamente 41 kDa. Este
resultado confirma los datos obtenidos por ultrafiltración y
filtración en gel, indicando todos que sM2eGCN4C3d existen en
solución como tetrámero.
\vskip1.000000\baselineskip
Se produjo sM2eGCN4C3d recombinante secretada
mediante un sistema de expresión de baculovirus y se purificó como
se resume en los ejemplos 10 y 11. Las fracciones que contenían
proteína recombinante se concentraron usando dispositivos de
ultrafiltración Vivaspin-30 y
Centricon-100 (Millipore Corporation, Bedford, MA.,
Estados Unidos). Para llevar la sM2eGCN4C3d a tampón PBSA (NaCl 171
mM, KCI 3,4 mM, Na_{2}HPO_{4} 10 mM, KH_{2}PO_{4} 1,8 mM),
este último tampón se añadió a la solución de proteína concentrada
(\sim200 \mul) para llevar el volumen de la muestra a 2 ml,
después de lo cual la solución se concentró de nuevo (\sim10
veces) usando un Centricon-100. Esta etapa se
repitió dos veces.
Se inmunizaron grupos de 7 ratones Balb/c hembra
(Charles River Laboratories, Sulzfeld Alemania) a la edad de 8
semanas mediante inyección intraperitoneal de 10 \mug de
sM2eGCN4C3d en presencia de adyuvante Ribi (25 \mug de
monofosforil lípido A y 25 \mug de
trehalosa-6,6-dimicolato; consúltese
Neirynck et al., 1999) por ratón. Los ratones de control
recibieron adyuvante dispersado en solución salina tamponada con
fosfato. Los animales se alojaron en un entorno de temperatura
controlada con ciclos de 12 h de luz/oscuridad y recibieron
alimento y agua ad libitum. Se administraron dos inyecciones
de refuerzo a intervalos de dos semanas complementado 10 \mug de
sM2eGCN4C3d con 25 \mug de monofosforil lípido A y 25 \mug de
péptido adyuvante (consúltese Neirynck et al., 1999) por
ratón. Diez días después de cada inmunización, se extrajo sangre de
la vena de la cola y se preparó el suero. Las muestras de suero se
analizaron posteriormente por ELISA. Con este fin, se recubrieron
placas de 96 pocillos durante una noche a 37ºC con 50 \mul de
péptido M2e 2 \mug/ml en tampón bicarbonato de sodio 50 mM, pH
9,7 y después se bloquearon con 200 \mul de PBS que contenía BSA
al 1% durante 1 hora. Como alternativa, se recubrieron placas de 96
pocillos durante una noche a 4ºC con 50 \mul de anticuerpos
policlonales anti-proteína del complemento 3 de
ratón 10 \mug/ml (ab3163, Biogenesis Ltd, Poole, Reino Unido) y
se bloquearon con 150 \mul de PBS que contenía BSA al 1% durante 1
hora. Con el último recubrimiento, se permitió la captura de
sM2eGCN4C3d a partir de medio de células de insecto durante 1 hora
y 30 minutos a temperatura ambiente. Después del lavado, una serie
de diluciones 1/2 de las diferentes muestras de suero, partiendo de
una dilución 1/50, se cargaron en pocillos recubiertos con péptido o
proteína sM2eGCN4C3d. Se detectaron los anticuerpos unidos con un
anticuerpo marcado con peroxidasa dirigido contra la IgG1 e IgG3 de
ratón (Southern Biotechnology Associates, Inc.), respectivamente,
diluido 1/6000 en PBS que contenía BSA al 1% y
Tween-20 al 0,05%. Después del lavado, las placas de
microtitulación se incubaron durante 20 minutos con sustrato
líquido de 3,3',5,5'-tetrametilbenzidina para
peroxidasa (Sigma, St. Louis, MO., Estados Unidos). La reacción se
interrumpió por adición de H_{3}PO_{4} 1 M y se midió la
absorbancia a 450 nm. Para obtener el valor para la reactividad
específica contra M2e, la absorbancia obtenida para suero preinmune
a una dilución dada se restó de la absorbancia de sueros
post-vacunación y post-refuerzo de
la dilución correspondiente. Como se presenta en las figuras 14A y
C, se indujeron anticuerpos anti-M2e de los isotipos
IgG1 e IgG3 en ratones vacunados y con inyección de refuerzo. Como
se muestra en las figuras 14B y D, se obtuvieron perfiles similares
de respuestas de anticuerpos cuando se exploraron proteínas
sM2eGCN4C3d recombinantes con antisueros de ratones vacunados y con
inyecciones de refuerzo. Por lo tanto, puede concluirse que la
sM2eGCN4C3d puede inducir eficazmente una respuesta de anticuerpos
antigénicos en ratones.
\vskip1.000000\baselineskip
Se inmunizaron grupos de 7 ratones Balb/c hembra
libres de patógenos (Charles River Laboratories Sulzfeld, Alemania)
por vía intraperitoneal con sM2eGCN4C3d, como se describe en el
ejemplo 13. Dos semanas después de la última inmunización, los
ratones se expusieron por vía intranasal a 14 DL_{50} de X47
adaptado a ratón (m. a.) (Neirynck et al., 1999). Como se
presenta en la figura 15, las vacunas de sM2eGCN4C3d protegían
frente a una dosis letal de virus influenza A m. a. homólogo.
Los valores máximos de la actividad enzimática y
las lecturas de ELISA obtenidas después de la centrifugación en
gradiente de sacarosa se usaron para deducir una estimación
aproximada de las actividades específicas relativas. La actividad
enzimática específica de GCN4NAs asciende a al menos el 70% de la de
la forma tetramérica de la proteína NAs no fusionada.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
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Evidence that the mature form of the flavivirus nonstructural
protein NS1 is a dimer. Virology, 1988, vol. 162,
187-196 [0052]
\global\parskip0.000000\baselineskip
<100> VLAAMS INTERUNIVERSITAIR INSTITUUT
VOOR BIOTECHNOLOGIE VZW
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Complejos de proteínas oligoméricas
recombinantes con un potencial inmunógeno aumentado
\vskip1.000000\baselineskip
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<130> TDR/Tet/V078
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<160> 22
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\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 3.1
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<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1350
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> parte de pACGCN4Nas
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<220>
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<221> CDS
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<222> (1)..(1350)
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<223>
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<400> 1
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<211> 449
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<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> parte de pACGCN4Nas
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<400> 2
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> parte de pACsM2eGCN4
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<220>
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<223> cebador BACfor
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<212> ADN
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<223> parte de GCN4nh
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<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 54
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\hskip1cm21
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\vskip0.400000\baselineskip
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> cebador M2rev
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<400> 13
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<223> cebador M2Ss
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<400> 14
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<210> 15
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<223> cebador UM2ECa
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<223> cebador GCN4for
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<223> cebador GCN4rev
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<223> cebador GCNrev2
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<210> 19
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> cebador GCN4pos
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> cebador GCN4neg
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<400> 20
\hskip1cm29
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<210> 21
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<211> 35
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> cebador C3ds
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<400> 21
\hskip1cm30
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<210> 22
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<211> 38
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> cebador C3da
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\hskip1cm31
Claims (9)
1. Complejo de proteína oligomérica recombinante
que comprende:
- \quad
- - un antígeno de influenza oligomérico que puede generar una respuesta inmune contra un virus influenza,{}\hskip0.25cm y
- \quad
- - un dominio de oligomerización de cremallera de leucinas
- \quad
- en el que cada subunidad de dicho antígeno de influenza oligomérico está unida al dominio de oligomerización de cremallera de leucinas y
- \quad
- en el que dicho complejo de proteína oligomérica recombinante es un di-, tri- o tetrámero.
2. Complejo de proteína oligomérica recombinante
de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicho dominio de
oligomerización de cremallera de leucinas es la cremallera de
leucinas GCN4.
3. Complejo de proteína oligomérica recombinante
de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, en el que
dicho antígeno de influenza es neuraminidasa de influenza, la M2 de
influenza A, o la NB de influenza B, o un fragmento de cualquiera
de los mismos.
4. Ácido nucleico que codifica una subunidad de
un antígeno de influenza oligomérico y un dominio de oligomerización
de cremallera de leucinas de acuerdo con las reivindicaciones
1-3.
5. Ácido nucleico de acuerdo con la
reivindicación 4, que comprende la secuencia presentada en la SEC ID
Nº 1, SEC ID Nº 3, o SEC ID Nº 5.
6. Vector de expresión que comprende un ácido
nucleico de acuerdo con las reivindicaciones
4-5.
7. Célula hospedadora que comprende un vector de
expresión de acuerdo con la reivindicación 6.
8. Uso de un complejo de proteínas de acuerdo
con la reivindicación 1-3 o un ácido nucleico de
acuerdo con las reivindicaciones 4-5 para la
preparación de una vacuna de influenza.
9. Vacuna de influenza que comprende un complejo
de proteínas de acuerdo con las reivindicaciones 1-3
o un ácido nucleico de acuerdo con las reivindicaciones
4-5.
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