CN105296356A - 一种刚地弓形虫卵囊的制备、纯化及保存方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种刚地弓形虫卵囊的制备、纯化及保存方法，包括以下步骤：A、弓形虫包囊的获得；B、弓形虫阴性猫的获得；C、弓形虫包囊饲喂猫；D、收集1-21天粪便；E、从粪便分离弓形虫卵囊：F、弓形虫卵囊的保存。本发明的弓形虫卵囊活性好，可长期保存于4度冰箱，保存期大于5年，能提供良好的弓形虫疫苗研究和制备素材；该方法人工操作简便易行，所采用的材料易于得到；制备及纯化弓形虫卵囊过程易于控制，范围较小，并对接触过的材料、器皿进行无害化处理，避免了对环境污染。

Description

一种刚地弓形虫卵囊的制备、纯化及保存方法

技术领域

本发明属于刚地弓形虫疫苗研究领域新技术，尤其涉及一种弓形虫卵囊制备、纯化及保存方法。

背景技术

弓形虫是一种专性细胞内寄生原虫，能寄生在除红细胞外的所有有核细胞内，随血液和淋巴液扩散至全身各部位。中间宿主广泛且无特异性，终末宿主仅限于猫或猫科动物。弓形虫病是一种危害巨大的人畜共患疾病，在中国属二类动物疫病。

弓形虫作为重要的机会性致病原虫，正常人和动物感染弓形虫后多呈隐性感染，一般不引起明显症状，但可在体内长期潜伏，但如果发生在胎儿、机体免疫功能受损或缺陷的患者(如器官移植、艾滋病及恶性肿瘤患者)，潜伏感染可以被激活，从而引起严重的甚至危及生命的疾病，对人类健康和畜牧业发展构成严重威胁。弓形虫病是人畜先天性疾病和流产的原因之一，还可引起脑炎和视网膜炎。

刚地弓形虫是寄生于猫的一种肠道球虫，猫科动物可以排泄刚地弓形虫卵囊，为终末宿主，恒温动物均为中间宿主。弓形虫的有性生殖和无性生殖阶段均可发生于猫，除猫以外的宿主只有无性生殖阶段。未孢子化的卵囊随猫科动物粪便排出，卵囊在温暖的环境和适宜的湿度中，孢子化形成两个子包囊。在每个子包囊内有四个子孢子。环境中的子孢子可在卵囊内存活数月。人或动物摄食孢子化的卵囊后，子孢子进入肠道内形成裂殖体。裂殖子在裂殖体内的数量从两个到几百个不等。侵染的宿主细胞破裂时，裂殖子从裂殖体内释放出来继续侵染其他细胞。

目前，对于弓形虫病的预防和治疗尚无有效方法，因此关于此方面也在进行积极的研究。弓形虫卵囊可在外界环境中长期保存，保存期较长，是良好的疫苗研究和制备素材，因此如何制备刚地弓形虫卵囊，如何纯化及保存刚地弓形虫卵囊也是目前科研人员一个重要的研究课题。

发明内容

为了提供弓形虫疾苗的制备素材，本发明的目的是提供一种工艺简单、操作方便制作成本低的弓形虫卵囊制备、纯化及保存方法。

本发明的技术方案是以下述方式实现的：

1、一种刚地弓形虫卵囊的制备、纯化及保存方法，包括以下步骤：

A、弓形虫包囊的获得；用不同种类的鲜肉作为样品并进行标号，将每种类样品制作若干张压片，10倍显微镜下“S”形检查压片、发现组织弓形虫包囊、记录样品标号、并标记为弓形虫包囊阳性样品，弓形虫包囊特征为圆形，包囊壁1μm，包囊内含有致密的呈香蕉状的缓殖子；

B、弓形虫阴性猫的获得；对2月龄健康猫进行微量采集足部血液，血液吸于滤纸上，用ELISA方法检测血清内抗弓形虫抗体，选出弓形虫抗体阴性猫；

C、弓形虫包囊饲喂猫；对弓形虫抗体阴性猫饲喂猫粮，待精神稳定后，饲喂弓形虫包囊阳性样品；

D、收集1-21天粪便：弓形虫抗体阴性猫食入弓形虫包囊阳性样品后，每日收取猫粪便，标记粪便日期，存放于4度冰箱；

E、从粪便分离弓形虫卵囊：

（1）将收集的粪便加适量清水湿润；

（2）继续加清水捣碎粪便结块直至均匀。

（3）用双层纱布将加水形成均匀液体的粪便过滤、并用清水冲洗；

（4）滤液倒入离心管中，离心；

（5）弃去上清液；

（6）在沉淀物中加入浓度为530g/L蔗糖溶液混匀；沉淀物与蔗糖溶液的体积比是：沉淀物：蔗糖溶液=1：10—40；

（7）将（6）中的混匀的液体混合物离心；

（8）用一次性移液管从（7）的离心管的上部取少量样品进行显微镜检查；

（9）如镜检发现卵囊，则用大口吸管轻吸离心管上部液体5ml，加清水至50ml，离心；

（10）去除上清，加2%硫酸按体积比，沉淀液：比硫酸溶液=1：10，放置摇床7天，等待卵囊孢子化，孢子化的弓形虫特征是每个包囊内有2个子孢子；

F、弓形虫卵囊的保存；将（10）中的孢子化的卵囊置于有螺旋口离心管内。

在上述刚地弓形虫卵囊的制备、纯化及保存方法中优选条件

D、收集1-10天粪便：弓形虫抗体阴性猫食入弓形虫包囊阳性样品后，每日收取猫粪便，标记粪便日期，存放于4度冰箱；

E、从粪便分离弓形虫卵囊：

（7）将（6）中的混匀的液体混合物离心，离心速度为2000转/分，时间为10分钟；

（9）如镜检发现卵囊，则用大口吸管轻吸离心管上部液体5ml，加清水至50ml，离心速度为2000转/分，时间为10分钟；

F、弓形虫卵囊的保存；将（10）中的孢子化的卵囊置于有螺旋口离心管内，离心管内含少量空气冰箱。

上述刚地弓形虫卵囊的制备、纯化及保存方法，还包括以下步骤：

G、卵囊污染材料的安全化处理。

一次性用品烧毁，其余物品用100度热水，浸泡5分钟或高压灭菌，压力为121Pa，时间为15min后再丢弃。

本发明的积极效果是：

1、弓形虫卵囊活性好，可长期保存于4度冰箱，保存期大于5年，能提供良好的弓形虫疫苗研究和制备素材。

2、该方法人工操作简便易行，所采用的材料易于得到。

3、制备及纯化弓形虫卵囊过程易于控制，范围较小，并对接触过的材料、器皿进行无害化处理，避免了对环境污染。

附图说明：

图1为本发明采用Olympus光学显微镜CX21，物镜10倍的弓形虫包囊图；

图2为本发明采用Olympus光学显微镜CX21，物镜40倍的弓形虫包囊图；

具体实施方式：

下面结合实施例和附图对本发明的技术方案作进一步说明

实施例一：

A、弓形虫包囊的获得：

购买新鲜猪肉500克、鸡肉500克、新鲜猪脑500克、鸡头全部，对样品进行标号，制作组织压片，每个样品制作10张压片，10倍显微镜下“S”形检查压片，发现组织弓形虫包囊，记录样品标号，并标记为弓形虫包囊阳性样品。弓形虫包囊特征为圆形，包囊壁1μm，包囊内含有致密的呈香蕉状的缓殖子。

B、弓形虫阴性猫的获得：

宠物市场随机购买2月龄健康猫，微量采集足部血液1滴，血液吸于滤纸上，ELISA方法（ELISA试剂盒购买于IDEXX）检测血清内抗弓形虫抗体，弓形虫抗体阳性猫送至宠物救助站，阴性猫保留；

C、弓形虫包囊饲喂猫：

弓形虫抗体阴性猫饲喂猫粮，待精神稳定后，饲喂弓形虫包囊阳性样品，确保猫吃入至少50克/天阳性样品；

D、收集1-21天粪便：

猫食入组织后，每日收取猫粪便，标记粪便日期，存放于4度冰箱。

E、从粪便分离弓形虫卵囊；

（1）敞口烧杯收集粪便，加适量清水10m湿润；

（2）加清水200ml，用压舌片捣碎粪便结块直至均匀；

（3）双层纱布过滤、蒸馏水冲洗；

（4）滤液倒入300ml离心管中，离心，转速为2000转/分，时间10分钟，温度为4℃；

（5）弃去上清液，光学显微镜40倍目镜下单个视野卵囊多于20个，加一次清水漂洗，洗去粪便中的脂肪类物质，提高卵囊纯度；

（6）弃去上清液，得沉淀体积为30ml，在沉淀中加入溶度为530g/L蔗糖溶液300ml混匀；

（7）混合物离心，转速为2000转/分，时间为10分钟，温度为4℃；

（8）用一次性移液管从离心管的上部取少量样品30ul进行显微镜检查。

（9）如镜检发现卵囊，则用大口吸管轻吸离心管上部液体5ml，加清水至50ml，离心转速为2000转/分，时间为10分钟；

（10）去除上清留沉淀液0.5ml，加2%硫酸溶液5ml,放置摇床7天，等待卵囊孢子化；孢子化的弓形虫特征是每个包囊内有2个子孢子；

F、弓形虫卵囊的保存；将（10）中的孢子化的卵囊置于有螺旋口离心管内，离心管内含少量空气，空气与样品等体积的空气，密封，标记并保存于4℃冰箱，可存放5年以上。

由图1可以看出：采用Olympus光学显微镜CX21，物镜10倍的弓形虫包囊特征为圆形，包囊壁1μm，包囊内含有致密的呈香蕉状的缓殖子图；由图2可以看出：本发明采用Olympus光学显微镜CX21，物镜40倍的弓形虫包囊孢子化形成两个子包囊。

G、卵囊污染材料的安全化处理：

因弓形虫卵囊可直接感染给人和动物，因此对于接触过卵囊的材料、器皿需要进行无害化处理。一次性用品可烧毁，其他物品可用100度热水，浸泡5分钟或高压灭菌（121Pa，15min）后再丢弃。

Claims (3)

1.一种刚地弓形虫卵囊的制备、纯化及保存方法，包括以下步骤：

A、弓形虫包囊的获得；用不同种类的鲜肉作为样品并进行标号，将每种类样品制作若干张压片，10倍显微镜下“S”形检查压片、发现组织弓形虫包囊、记录样品标号、并标记为弓形虫包囊阳性样品，弓形虫包囊特征为圆形，包囊壁1μm，包囊内含有致密的呈香蕉状的缓殖子；

B、弓形虫阴性猫的获得；对2月龄健康猫进行微量采集足部血液，血液吸于滤纸上，用ELISA方法检测血清内抗弓形虫抗体，选出弓形虫抗体阴性猫；

C、弓形虫包囊饲喂猫；对弓形虫抗体阴性猫饲喂猫粮，待精神稳定后，饲喂弓形虫包囊阳性样品；

D、收集1-21天粪便：弓形虫抗体阴性猫食入弓形虫包囊阳性样品后，每日收取猫粪便，标记粪便日期，存放于4度冰箱；

E、从粪便分离弓形虫卵囊：

（1）将收集的粪便加适量清水湿润；

（2）继续加清水捣碎粪便结块直至均匀；

（3）用双层纱布将加水形成均匀液体的粪便过滤、并用清水冲洗；

（4）滤液倒入离心管中，离心；

（5）弃去上清液；

（6）在沉淀物中加入蔗糖溶液（530g/L）混匀；沉淀物与蔗糖溶液的体积比是：沉淀物：蔗糖溶液=1：10；

（7）将（6）中的混匀的液体混合物离心（2000转，10分钟，4℃）；

（8）用一次性移液管从（7）的离心管的上部取少量样品进行显微镜检查；

（9）如镜检发现卵囊，则用大口吸管轻吸离心管上部液体5ml，加清水至50ml，离心(2000转，10分钟)；

（10）去除上清，加2%硫酸按体积比，沉淀液：比硫酸溶液=1：10—40；放置摇床7天，等待卵囊孢子化，孢子化的弓形虫特征是每个包囊内有2个子孢子；

F、弓形虫卵囊的保存；将（10）中的孢子化的卵囊置于有螺旋口离心管内。

2.根据权利要求1所述的一种刚地弓形虫卵囊的制备、纯化及保存方法，特征在于：

所述D、收集1-10天粪便：弓形虫抗体阴性猫食入弓形虫包囊阳性样品后，每日收取猫粪便，标记粪便日期，存放于4度冰箱；

所述E、从粪便分离弓形虫卵囊：

（7）将（6）中的混匀的液体混合物离心，离心速度为2000转/分，时间为10分钟；

（9）如镜检发现卵囊，则用大口吸管轻吸离心管上部液体5ml，加清水至50ml，离心速度为2000转/分，时间为10分钟；

所述F、弓形虫卵囊的保存；将（10）中的孢子化的卵囊置于有螺旋口离心管内，离心管内含少量空气冰箱。

3.根据权利要求1所述的一种刚地弓形虫卵囊的制备、纯化及保存方法，特征在于：还包括以下步骤：

所述G、卵囊污染材料的安全化处理；

一次性用品烧毁，其余物品用100度热水，浸泡5分钟或高压灭菌，压力为121Pa，时间为15min后再丢弃。