CN103122382A - 一种土壤弓形虫检测试剂盒及其制备方法 - Google Patents

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张德林
王萌
王艳华
孟鹏
叶强
蒲元华
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Abstract

本发明公开了一种土壤弓形虫检测试剂盒及其制备方法，包括10×PCR反应液、引物混合物、嗜热DNA聚合酶、牛血清白蛋白、标准阳性模板，其特征在于，所述引物混合物包括：0.2pmol上游引物TX1、10pmol中间引物TX2、10pmol下游引物TX3。本发明是建立在分子生物学基础上，基于弓形虫高度保守的529bp重复序列基因，应用半套式PCR的方法检测土壤弓形虫的试剂盒，具有敏感性高、特异性强、操作简单等特点，解决了土壤中弓形虫卵囊检测的检出率低，工作量大，操作复杂及诊断技术不足等缺陷，可以用于检测土壤样本是否含有弓形虫卵囊并可进行土壤弓形虫分子流行病学调查，对周围环境进行及时监测。

Description

一种土壤弓形虫检测试剂盒及其制备方法
技术领域
本发明涉及检测土壤中弓形虫基因组DNA的半套式PCR扩增技术，具体说是一种检测土壤弓形虫的快速检测试剂盒，本发明包括该试剂盒的制备方法。 
背景技术
弓形虫卵囊因其特殊的囊壁结构，对酸、碱、光照等理化因子具有极强的抵抗能力，在土壤中数月乃至数年依然具有很强的感染性，土源性弓形虫病的爆发在世界上多个国家已有报道，因此土壤被认为是弓形虫病的巨大传染源。建立土壤弓形虫检测方法，定期对土壤的环境进行监测，对控制土源性弓形虫病的传播极为重要。 
土壤的成分复杂，且弓形虫卵囊含量较低，仅依靠物理方法分离虫体的检出率低，工作量大，会出现漏检的情况。而其他目前常用的诊断弓形虫病的方法包括凝集试验、酶联免疫吸附法只是针对动物血清中弓形虫抗体进行检测，不能用于土壤的检测，因此只能利用分子生物学检测方法检测土壤弓形虫。PCR方法是基于分子生物学基础上的灵敏、特异、高效的诊断技术，能在检测土壤弓形虫中起到重要作用。 
发明内容
本发明的目的是为了克服当前土壤弓形虫诊断技术中的不足，提供一种基于分子生物学领域的的高敏感性、高特异性、高效性的土壤弓形虫检测试剂盒，同时提供该试剂盒的制备方法。 
本发明实施例是这样实现的，一种土壤弓形虫检测试剂盒，包括10×PCR反应液、引物混合物、嗜热DNA聚合酶、牛血清白蛋白、标准阳性模板，其特征在于，所述引物混合物包括：0.2pmol上游引物TX1、10pmol中间引物TX2、10pmol下游引物TX3。 
进一步，该土壤弓形虫检测试剂盒针对弓形虫529bp重复序列基因设计引物，所述引物序列为： 
上游引物TX1: 5＇-CAGGGAGGAAGACGAAAGTTG-3＇ 
中间引物TX2: 5＇-CACAGAAGGGACAGAAGT-3＇ 
下游引物TX3: 5＇-CTGTGTCACGTAGACCTAAGG-3＇。 
进一步，所述10×PCR反应液包括10% 三羟甲基氨基乙烷(Tris-HCl, pH8.5)、500mM氯化钾(KCl)、15mM硫酸镁(MgSO4)、0.1%吐温20(Tween 20)和2mM 脱氧核苷酸混合物(dNTPs)。 
本发明实施例的另一目的在于提供一种上述土壤弓形虫检测试剂盒的制备方法，其特征在于，该制备方法包括以下步骤： 
⑴ 制备10×CRP反应液； 
⑵ 制备引物混合物； 
⑶ 制备标准阳性模板； 
(4)制备牛血清白蛋白溶液。 
进一步，制备10×CRP反应液：①配置Tris-HCl： 配置浓度为12.11% Tris，并用HCl调节pH8.5，备用；②配置含有终浓度为504.03mM的KCl 、15.12mM的MgSO4的混合溶液，并加入0.1% Tween 20和10.08%的Tris-HCl，备用；③将②中配置的溶液与25mM dNTPs按照体积比为124：1的比例混合； 
进一步，制备引物混合物：① 针对弓形虫529bp重复序列基因的一段高度保守的区域设计引物；② 混合引物中TX1：TX2：TX3为1：50：50按照如上体积比例混匀。 
进一步，制备标准阳性模板：①体重为20～25g小鼠每只按1×105～1×106弓形虫速殖子腹腔接种，经3～4日，小鼠出现精神沉郁、不食、被毛粗乱等症状时，脱颈致死小白鼠，浸泡于70～75%酒精内体表消毒；② 每只小鼠用2毫升PH7.2PBS 缓冲液冲洗腹腔收集虫体；③提取弓形虫基因组DNA，此为标准阳性模板。  
进一步，制备牛血清白蛋白溶液：配置含终浓度为20mg/L的牛血清白蛋白溶液。 
本发明是建立在分子生物学基础上，基于弓形虫高度保守的529bp重复序列基因，应用半套式PCR的方法检测土壤弓形虫的试剂盒，具有敏感性高、特异性强、操作简单等特点，解决了土壤中弓形虫卵囊检测的检出率低，工作量大，操作复杂及诊断技术不足等缺陷，可以用于检测土壤样本是否含有弓形虫卵囊并可进行土壤弓形虫分子流行病学调查，对周围环境进行及时监测。 
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。 
本发明提供了一种土壤弓形虫检测试剂盒，包括10×PCR反应液、引物混合物、嗜热DNA聚合酶、牛血清白蛋白、标准阳性模板。 
所述引物混合物包括：0.2pmol上游引物TX1、10pmol中间引物TX2、10pmol下游引物TX3。 
所述10×PCR反应液包括10% 三羟甲基氨基乙烷(Tris-HCl, pH8.5)、500mM氯化钾(KCl)、15mM硫酸镁(MgSO4)、0.1%吐温20(Tween 20)和2mM 脱氧核苷酸混合物(dNTPs)。 
下面结合实施例对本发明做进一步详细说明： 
实施例1 
⑴ 制备10×PCR反应液： 
①配置Tris-HCl：称取121.1g Tris于800mLddH2O中溶解，用HCl调节pH8.5，定容至1000mL，备用； 
② 称取4.66g KCl 、0.47g MgSO4·7H2O，并加入12.5mL①中配置的Tris-HCl以及12.5mL Tween 20，加dd H2O定容至，备用； 
③ 取124 mL ②中配置的溶液，加入1mL 25mM dNTPs，混匀。 
⑵ 制备引物混合物： 
① 针对弓形虫529bp重复序列基因的一段高度保守的区域，利 用Primer 5.0软件设计引物； 
② 混合引物包括TX1、TX2和TX3各1μL，混匀。 
⑶ 制备标准阳性模板： 
① 20～25克体重小鼠每只按1×105～1×106弓形虫速殖子腹腔接种，经3～4日，小鼠出现精神沉郁、不食、被毛粗乱等症状时，脱颈致死小白鼠，浸泡于70～75%酒精内体表消毒； 
② 每只小鼠用2毫升PH7.2PBS 缓冲液冲洗腹腔收集虫体； 
③提取弓形虫基因组DNA，此为标准阳性模板。 
检测时按照如下反应体系 
(4) LAMP反应 
反应条件为94 ℃，3 min→94℃，30 S；65 ℃，40 S；15个循环→72 ℃，8 min→94 ℃，30 S；58 ℃，40 S；35个循环→72 ℃，8 min；4℃，永久保存。 
反应后取5μL用琼脂糖凝胶电泳，观察结果。 
表1 半套式PCR特异性引物序列 
Figure BDA0000270794962
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。 

Claims (8)

1.一种土壤弓形虫检测试剂盒，包括10×PCR反应液、引物混合物、嗜热DNA聚合酶、牛血清白蛋白、标准阳性模板，其特征在于，所述引物混合物包括：0.2pmol上游引物TX1、10pmol中间引物TX2、10pmol下游引物TX3。
2.根据权利要求1所述的土壤弓形虫检测试剂盒，其特征在于，该土壤弓形虫检测试剂盒针对弓形虫529bp重复序列基因设计引物，所述引物序列为：
上游引物TX1: 5＇-CAGGGAGGAAGACGAAAGTTG-3＇
中间引物TX2: 5＇-CACAGAAGGGACAGAAGT-3＇
下游引物TX3: 5＇-CTGTGTCACGTAGACCTAAGG-3＇。
3.根据权利要求1所述的土壤弓形虫检测试剂盒，其特征在于，所述10×PCR反应液包括10% 三羟甲基氨基乙烷(Tris-HCl, pH8.5)、500mM氯化钾(KCl)、15mM硫酸镁(MgSO4)、0.1%吐温20(Tween 20)和2mM 脱氧核苷酸混合物(dNTPs)。
4.一种根据权利要求1所述土壤弓形虫检测试剂盒的制备方法，其特征在于，该制备方法包括以下步骤：
⑴ 制备10×CRP反应液；
⑵ 制备引物混合物；
⑶ 制备标准阳性模板；
(4)制备牛血清白蛋白溶液。 
5.根据权利要求4所述土壤弓形虫检测试剂盒的制备方法，其特征在于，
制备10×CRP反应液：①配置Tris-HCl： 配置浓度为12.11% Tris，并用HCl调节pH8.5，备用；②配置含有终浓度为504.03mM的KCl 、15.12mM的MgSO4的混合溶液，并加入0.1% Tween 20和10.08%的Tris-HCl，备用；③将②中配置的溶液与25mM dNTPs按照体积比为124：1的比例混合。
6.根据权利要求4所述土壤弓形虫检测试剂盒的制备方法，其特征在于，
制备引物混合物：① 针对弓形虫529bp重复序列基因的一段高度保守的区域设计引物；② 混合引物中TX1：TX2：TX3为1：50：50按照如上体积比例混匀。
7.根据权利要求4所述土壤弓形虫检测试剂盒的制备方法，其特征在于，
制备标准阳性模板：①体重为20～25g小鼠每只按1×105～1×106弓形虫速殖子腹腔接种，经3～4日，小鼠出现精神沉郁、不食、被毛粗乱等症状时，脱颈致死小白鼠，浸泡于70～75%酒精内体表消毒；② 每只小鼠用2毫升PH7.2PBS 缓冲液冲洗腹腔收集虫体；③提取弓形虫基因组DNA，此为标准阳性模板。 
8.根据权利要求4所述土壤弓形虫检测试剂盒的制备方法，其特征在于，制备牛血清白蛋白溶液：配置含终浓度为20mg/L的牛血清白蛋白溶液。 
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CN105296356A (zh) * 2015-12-02 2016-02-03 河南农业大学 一种刚地弓形虫卵囊的制备、纯化及保存方法

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