CN114672577A - 一种检测具有耐AChE抑制剂性状的桔小实蝇的方法 - Google Patents

一种检测具有耐AChE抑制剂性状的桔小实蝇的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种检测具有耐乙酰胆碱酯酶AChE抑制剂性状的引物组和检测方法。所述的引物组包括检测野生型桔小实蝇的引物对和检测突变型桔小实蝇的引物对；其中所述的检测野生型桔小实蝇的引物对，其扩增的核苷酸片段的序列为SEQ ID NO：1，所述的检测突变型桔小实蝇的引物对，是检测具有耐乙酰胆碱酯酶抑制剂性状的桔小实蝇的引物对，其扩增的核苷酸片段的序列为SEQ ID NO：2。本发明的方法可直接根据电泳图谱准确鉴别待检测个体是否为具有耐乙酰胆碱酯酶AChE抑制剂性状的突变位点的野生型、纯合型或杂合型桔小实蝇；从而为桔小实蝇的科学防治、合理选药提供准确的判定标准。

Description

一种检测具有耐AChE抑制剂性状的桔小实蝇的方法
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种检测具有耐乙酰胆碱酯酶AChE抑制剂性状的桔小实蝇的方法。
背景技术
桔小实蝇是一种具有世界性分布的，钻蛀果蔬的重要检疫性害虫；可危害芒果、番石榴、木瓜、柑橘、杨桃、茄子、辣椒等46科、250 多种经济水果和蔬菜。桔小实蝇是我国的水果种植业的主要虫害。近年来由于全球气候变化、贸易交流增多，导致该虫的危害范围逐渐扩大，对全世界的果蔬产业构成巨大威胁。
化学防治是当前桔小实蝇防控的主要措施，其中，有机磷类杀虫剂毒死蜱和马拉硫磷由于其低毒、高效及价格便宜被大量用于桔小实蝇的防控。尤其是2008年我国彻底停止甲胺磷等5种高毒有机磷农药的使用,导致杀虫剂农药品种和数量上的不足，因此毒死蜱和马拉硫磷就成为有机磷类高毒农药的最主要代替品。
目前，毒死蜱和马拉硫磷主要是通过直接田间喷雾、作为毒杀剂与引诱剂混用诱杀成虫、或者和新型杀虫剂混配用于桔小实蝇防治。研究结果表明我国南北方桔小实蝇田间种群已经对毒死蜱和马拉硫磷产生了中高等抗性，这严重制约了桔小实蝇的防治有效性，而且对环境和食品安全造成严重威胁。
乙酰胆碱酯酶(Acetylcholinesterase,AChE)是有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂在昆虫体内的主要靶标，研究表明其氨基酸突变是害虫对杀虫剂产生抗性的主要原因。目前缺乏实蝇类害虫靶标抗性的简便快速的检测方法，研究乙酰胆碱酯酶基因突变的频率，有助于了解抗性基因在桔小实蝇田间种群中的状态，为预测桔小实蝇抗药性发展和治理提供科学依据。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测具有耐乙酰胆碱酯酶AChE抑制剂性状的桔小实蝇的方法。
通过设计基于等位基因特异性聚合酶链式反应(Allele Specific PCR,ASPCR)的特异性引物来检测具有耐乙酰胆碱酯酶AChE抑制剂性状的桔小实蝇。
本发明首先提供一种引物组，所述的引物组包括检测野生型桔小实蝇的引物对和检测突变型桔小实蝇的引物对；
所述的检测野生型桔小实蝇的引物对，其扩增的核苷酸片段的序列如下：
CGGCACTGCCACACTCGTTATATACAATGCGGACATAATGT CGGCTGTGGGTAATGTCATTGTGGCATCGTTTCAATATCGTGTGG GCGCTTTTGGTTTCCTGCACCTGTCACCCGCTATGCCTGGCTAC GAGGAGGAGGCACCCGGCAATGTGGGGTTGTGGGATCAGGCAT TGGCTATACGTTGGCTGAAAACGAATGCTCATGCTTTTGGCGGTAATCCCGAGTGGATGACACTTTTCGGTGAATCGGCTGGTTCGAG TTCGGTGAATGCGCAACTTGTATCGCCAGTGACGGCGGGTTTGG TCAAGCGTGGCATGATGCAATCGGGCACAATGAATGCGCCCTG GAGTCATATGACGTCGGAGAAGGCCGTAGAGATTGGCAAGGCG (SEQ ID NO：1)
所述的检测突变型桔小实蝇的引物对，是检测具有耐乙酰胆碱酯酶AChE抑制剂性状的桔小实蝇的引物对，其扩增的核苷酸片段的序列如下:
CGGCACTGCCACACTCGCTGTATACAATGCGGACATAATGT CGGCTGTGGGTAATGTCATTGTGGCATCGTTTCAATATCGTGTGG GCGCTTTTGGTTTCCTGCACCTGTCACCCGCTATGCCTGGCTAC GAGGAGGAGGCACCCGGCAATGTGGGGTTGTGGGATCAGGCAT TGGCTATACGTTGGCTGAAAACGAATGCTCATGCTTTTGGCGGTAATCCCGAGTGGATGACACTTTTCGGTGAATCGGCTGGTTCGAG TTCGGTGAATGCGCAACTTGTATCGCCAGTGACGGCGGGTTTGG TCAAGCGTGGCATGATGCAATCGGGCACAATGAATGCGCCCTG GAGTCATATGACGTCGGAGAAGGCCGTAGAGATTGGCAAGGCG (SEQ ID NO：2)。
所述的引物组中还包含有用于作为质控功能的引物对，其扩增的序列如下：
CACTCCAATAAAGCCGACACTGATCATTTGATACACAACGG AAATCCGCAGAACACCACAAATGGCTTACCCGTGCTCATTTGGA TTTACGGTGGTGGCTTCATGACCGGCACTGCCACACTCGATATAT ACAATGCGGACATAATGTCGGCTGTGGGTAATGTCATTGTGGCA TCGTTTCAATATCGTGTGGGCGCTTTTGGTTTCCTGCACCTGTCA CCCGCTATGCCTGGCTACGAGGAGGAGGCACCCGGCAATGTGG GGTTGTGGGATCAGGCATTGGCTATACGTTGGCTGAAAACGAAT GCTCATGCTTTTGGCGGTAATCCCGAGTGGATGACACTTTTCGG TGAATCGGCTGGTTCGAGTTCGGTGAATGCGCAACTTGTATCGC CAGTGACGGCGGGTTTGGTCAAGCGTGGCATGATGCAATCGGG CACAATGAATGCGCCCTGGAGTCATATGACGTCGGAGAAGGCC GTAGAGATTGGCAAGGCG(SEQ ID NO：3)。
作为实施例的具体记载，所述的作为质控功能的引物对，其序列信息如下：
上游引物Ace-F：CACTCCAATAAAGCCGACACTGA(SEQ ID NO：4)；
下游引物Ace-R：CGCCTTGCCAATCTCTACGG(SEQ ID NO： 5)；
作为实施例的一种具体记载，所述的检测野生型桔小实蝇的引物对，其序列信息如下：
上游引物S-F:CGGCACTGCCACACTCGTTA(SEQ ID NO：6)、下游引物Ace-R，序列为：CGCCTTGCCAATCTCTACGG(SEQ ID NO：5)；
所述的检测突变型桔小实蝇的引物对，其序列信息如下：
上游引物R-F:CGGCACTGCCACACTCGCTG(SEQ ID NO：7)；
下游引物为Ace-R，序列为：CGCCTTGCCAATCTCTACGG(SEQ ID NO：5)。
本发明再一个方面还提供一种检测具有耐乙酰胆碱酯酶AChE 抑制剂性状的桔小实蝇的方法，所述的方法是使用上述的引物组进行检测。
所述的方法，其具体步骤如下：
1)提取待检测的桔小实蝇成虫的基因组DNA；
2)利用上述的引物组对提取的待检测的桔小实蝇基因组DNA 进行PCR扩增；
其中Ace-F(SEQ ID NO：4)、Ace-R(SEQ ID NO：5)和S-F (SEQ ID NO：6)引物组合(第一引物组合)在一个反应中进行扩增，而Ace-F(SEQ ID NO：4)、Ace-R(SEQ ID NO：5)和R-F(SEQ ID NO：7)引物组合(第二引物组合)在另一个反应中进行扩增；
3)将步骤2)获得的PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，通过电泳图谱与鉴定标准来比较，确定所检测的桔小实蝇是否具有耐乙酰胆碱酯酶AChE抑制剂性状。
其中PCR反应体系为25μL:10×rTaq Buffer 2.5μl，10mM dNTP 2μl，单头桔小实蝇样本的基因组DNA 1μl，20μM引物0.5 μl，5U/μlr Taq酶0.25μl，ddH2O补至25μl；
PCR反应程序(降落PCR)：94℃预变性3min；94℃变性30s： 72℃开始退火，每个循环下降1℃，72℃延伸30s，进行12个循环，然后在60℃条件下退火，72℃延伸30s，进行22个循环，每个循环30s；72℃延伸7min。
所述的鉴定标准，如果第一引物组合的PCR产物，电泳图谱显示500和400bp两个条带；第二引物组合的PCR产物图谱只有500bp 的条带，则表明检测的桔小实蝇个体为不具有耐乙酰胆碱酯酶AChE 抑制剂性状的突变位点的纯合野生型桔小实蝇；
如果第一引物组合和第二引物组合的PCR产物图谱均含有500 和400bp的条带、则表明检测的桔小实蝇个体为具有耐乙酰胆碱酯酶AChE抑制剂性状的突变位点的杂合型桔小实蝇；
如果第一引物组合的PCR产物图谱只有500bp条带，而第二引物组合的PCR产物图谱有500和400bp的条带，则表明检测桔小实蝇个体为具有耐乙酰胆碱酯酶AChE抑制剂性状的突变位点的纯合型桔小实蝇。
本发明基于ASPCR技术，通过在特异性引物中3′端第三个位置引入额外的第二个错配优化特异性引物、通过使用降落PCR优化反应温度条件，可直接根据电泳图谱准确鉴别待检测个体是否为具有耐乙酰胆碱酯酶AChE抑制剂性状的突变位点的野生型、纯合型或杂合型桔小实蝇；从而为桔小实蝇的科学防治、合理选药提供准确的判定标准，为昆虫抗药性研究提供新的思路，同时也为植保基层人员进行基因检测提供简便易行的分子手段。
附图说明
图1：桔小实蝇乙酰胆碱酯酶突变区域的直接测序色谱图；
图2：桔小实蝇乙酰胆碱酯酶突变的ASPCR引物设计示意图；
图3：桔小实蝇乙酰胆碱酯酶突变区域PCR产物琼脂糖凝胶电泳图谱。其中利用引物组合1和引物组合2对桔小实蝇基因组DNA模板进行PCR扩增(泳道1，3，5为引物组合1；2，4，6为引物组合 2)，产物经1％琼脂糖电泳后获得的图谱。若PCR产物经电泳后，引物组合1显示两个条带、引物组合2显示一个条带，则表明检测桔小实蝇个体为突变的敏感纯合子(SS)；引物组合1和2均显示两个条带、则表明检测的桔小实蝇个体为突变的杂合子(RS)；引物组合1 显示1个条带、引物组合2显示两个条带，则表明检测桔小实蝇个体为突变的抗性纯合子(RR)。
图4：乙酰胆碱酯酶突变的ASPCR方法检测田间种群电泳图。
具体实施方式
本发明涉及的桔小实蝇野生型乙酰胆碱酯酶基因的CDS序列全长为2022bp(GenBank登录号为KF257933.1)。通过比较野生型桔小实蝇和具有耐乙酰胆碱酯酶AChE抑制剂性状的桔小实蝇，发明人确定发现桔小实蝇乙酰胆碱酯酶基因的CDS序列第640位核苷酸的突变会导致桔小实蝇对乙酰胆碱酯酶抑制剂毒死蜱和马拉硫磷产生抗性。
在上述发现的基础上，本发明基于ASPCR技术，利用引物与模板之间的碱基错配可以有效地抑制PCR反应，进而达到区分等位基因的目的，不需借助Sanger测序，可以直接通过琼脂糖凝胶判断基因型。
下面结合实施例和附图对本发明进行详细的描述。
实施例1桔小实蝇乙酰胆碱酯酶基因突变检测
2020年7月采自广东惠州番石榴果园对毒死蜱具有高水平抗性的桔小实蝇种群，检测其乙酰胆碱酯酶基因。根据桔小实蝇乙酰胆碱酯酶基因序列(GenBank：AY155500.1)，设计引物扩增完整CDS序列，目的片段为2200bp，引物序列如下：
正向引物L-F:GTTACATTTGGCGCACGTCG、
反向引物L-R:TTGCCTGTCTGTAGCTACTTGTGC；
使用
Figure BDA0003618015770000082
Reagent(Invitrogen)提取15头桔小实蝇成虫的总 RNA，采用TaKaRa公司反转录试剂盒(
Figure BDA0003618015770000083
RT reagent Kit with gDNA Eraser)进行cDNA合成。以cDNA为模板，使用上述引物对目的片段进行PCR扩增。
PCR扩增体系如下表1所述：
表1：PCR扩增体系表
Figure BDA0003618015770000081
PCR程序如下：95℃5min；34ⅹ(95℃30s，55℃30sec,72℃ 2min 30sec)；72℃，10min；4℃保存。
使用1％的琼脂糖凝胶电泳进行检测，将清晰单一目的条带的PCR原液送至上海生工公司进行测序。将测序结果与乙酰胆碱酯酶野生型参考序列(GenBank:AJ251838.1)进行比对，根据比对发现检测种群中存在乙酰胆碱酯酶突变,如图1所示，图1中箭头所示为突变位点。
实施例2利用ASPCR检测桔小实蝇乙酰胆碱酯酶突变位点
1、ASPCR引物组设计筛选
针对实施例1中确定的桔小实蝇乙酰胆碱酯酶基因突变位点，设计引物组，并经过实验筛选和优化获得了具有高扩增效率和特异性的 ASPCR引物组。通过该引物组的扩增，可直接利用电泳胶图条带鉴定突变。该引物组包括桔小实蝇通用引物组(用作质控)和1个野生型特异性引物和1个突变型特异性引物(图2)。
作为质控功能的引物对，其上游引物Ace-F的序列为：CACTCCAATAAAGCCGACACTGA；
下游引物Ace-R的序列为：CGCCTTGCCAATCTCTACGG；
所述的野生型特异性引物为：
S-F:CGGCACTGCCACACTCGTTA
下游引物为Ace-R，序列为：CGCCTTGCCAATCTCTACGG；
所述的突变型特异性引物为：
R-F:CGGCACTGCCACACTCGCTG
其中，通用引物组为对照，避免由于实验操作导致的PCR扩增失败(即每个PCR产物的凝胶电泳均有相应条带，质控引物对)，野生型特异性引物为检测未突变的等位基因，突变型特异性引物为检测突变的等位基因,二者的区别为3′末位碱基和第三位碱基不一致。每个桔小实蝇个体的基因组DNA，进行两个PCR管反应，分别包含以下引物对：
①1对通用引物和1个野生型特异性引物；
②1对通用引物和1个突变型特异性引物。
即每个PCR管中包括2个上游引物和1个下游引物，下游引物 Ace-R，既可以和上游引物Ace-F进行PCR反应，也可以和野生型(S-F) 或突变型(R-F)特异性引物进行PCR反应。其中，通用引物为对照，即每个PCR产物的凝胶电泳应均有相应条带(～500bp)，S-F和R-F引物的PCR产物分别为野生型和突变型条带。
2、ASPCR检测方法的特异性和重复性分析
为验证所设计筛选的引物的特异性，随机使用2020年广西桔小实蝇种群8个个体的基因组为模板，进行普通PCR和ASPCR反应，采用直接测序和ASPCR结果进行对比验证。
1)单头桔小实蝇成虫基因组DNA提取
使用碱性方法。分别将8个桔小实蝇个体的后足，放入含有氧化锆/硅珠和10μLNaOH(0.2M)的PCR离心管中，并将样品用涡旋振捣器匀浆2min，70℃孵育10min。将10μL中和液(360mM Tris-HCl,pH7.5,10mM EDTA)和80μL ddH2O加入每个离心管中，编号1-8。
2)ASPCR反应
反应体系为：基因组DNA溶液1μl，10mM正反引物各0.5μl， 5U/μlr Taq酶0.25μl，10×rTaq Buffer(缓冲液)2.5μl，10mM dNTP 2μl，ddH20补至25μl。每个个体的gDNA样本分别为2个PCR管，引物组合分别为Ace-F+Ace-R+S-F(第一引物组合)，Ace-F+ Ace-R+R-F(第二引物组合)。
PCR扩增的扩增条件：94℃预变性3分钟；94℃变性30秒：72℃开始退火，每个循环下降1℃，72℃延伸30秒，进行12个循环，然后在60℃条件下退火，72℃延伸30秒，进行22个循环，每个循环 30秒；72℃延伸7分钟。
琼脂糖凝胶电泳检测。准备1％的琼脂糖凝胶。取5μl PCR扩增产物进行电泳，电压100V，30min后在紫外线下观察拍照。
ASPCR反应结果分析：利用建立的ASPCR反应方法，分别以发生乙酰胆碱酯突变的桔小实蝇纯合子，杂合子个体以及未发生突变个体的基因组DNA为模板，进行基因扩增，检测结果如图3所示。结果表明，以含有纯合子的DNA为模板时，引物组合Ace-F+Ace-R+ S-F,PCR产物图谱只有500bp的条带，引物组合S-F+R-F，PCR产物图谱含有500bp和400bp的条带；以含有突变位点杂合子的DNA 为模板时，引物组合Ace-F+Ace-R+S-F和引物组合S-F+R-F的PCR 产物图谱均含有500bp和400bp的条带；以不含有突变位点的个体 DNA为模板时，引物组合Ace-F+Ace-R+S-F,PCR产物图谱含有500 和400bp的条带，引物组合S-F+R-F，PCR产物图谱只有500bp 的条带。
(3)ASPCR反应准确性验证实验
单头桔小实蝇成虫基因组DNA的提取
取用1)中提取的1-8号gDNA样品做为常规PCR反应中的模板。常规PCR反应体系为：基因组DNA溶液1μl，10mM引物0.5μl， 5U/μlr Taq酶0.25μl，10×rTaq Buffer(缓冲液)2.5μl，10mM dNTP 2μl，ddH20补至25μl。正反引物为Ace-F和Ace-R。
PCR扩增的扩增条件：94℃预变性3分钟；94℃变性30秒：72℃开始退火，每个循环下降1℃，72℃延伸30秒，进行12个循环，然后在60℃条件下退火，72℃延伸30秒，进行22个循环，每个循环 30秒；72℃延伸7分钟。PCR产物送至上海生工公司进行DNA测序，根据DNA测序结果判断是否含有SV突变。
试验样品PCR产物测序峰图表明5,6号个体在突变位点处的核苷酸为野生型A，表明未发生突变；而2、7、8号个体在突变位点处的核苷酸为双峰A/G，表明为突变杂合子，1、3、4个体在突变位点处的核苷酸为突变型G，表明为突变纯合子(表2)。
表2：桔小实蝇乙酰胆碱酯酶突变的DNA测序
Figure BDA0003618015770000121
检测结果表明总体的突变频率为56.25％。PCR扩增产物的DNA 测序结果与ASPCR检测结果一致，表明本发明所建立的桔小实蝇乙酰胆碱酯酶突变位点的ASPCR检测方法准确性高，准确率达到100％。
序列表
<110> 青岛农业大学
<120> 一种检测具有耐AChE抑制剂性状的桔小实蝇的方法
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 391
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cggcactgcc acactcgtta tatacaatgc ggacataatg tcggctgtgg gtaatgtcat 60
tgtggcatcg tttcaatatc gtgtgggcgc ttttggtttc ctgcacctgt cacccgctat 120
gcctggctac gaggaggagg cacccggcaa tgtggggttg tgggatcagg cattggctat 180
acgttggctg aaaacgaatg ctcatgcttt tggcggtaat cccgagtgga tgacactttt 240
cggtgaatcg gctggttcga gttcggtgaa tgcgcaactt gtatcgccag tgacggcggg 300
tttggtcaag cgtggcatga tgcaatcggg cacaatgaat gcgccctgga gtcatatgac 360
gtcggagaag gccgtagaga ttggcaaggc g 391
<210> 2
<211> 391
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gtcggagaag gccgtagaga ttggcaaggc g 391
<210> 3
<211> 498
<212> DNA
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<400> 3
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aatggcttac ccgtgctcat ttggatttac ggtggtggct tcatgaccgg cactgccaca 120
ctcgatatat acaatgcgga cataatgtcg gctgtgggta atgtcattgt ggcatcgttt 180
caatatcgtg tgggcgcttt tggtttcctg cacctgtcac ccgctatgcc tggctacgag 240
gaggaggcac ccggcaatgt ggggttgtgg gatcaggcat tggctatacg ttggctgaaa 300
acgaatgctc atgcttttgg cggtaatccc gagtggatga cacttttcgg tgaatcggct 360
ggttcgagtt cggtgaatgc gcaacttgta tcgccagtga cggcgggttt ggtcaagcgt 420
ggcatgatgc aatcgggcac aatgaatgcg ccctggagtc atatgacgtc ggagaaggcc 480
gtagagattg gcaaggcg 498
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cactccaata aagccgacac tga 23
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cgccttgcca atctctacgg 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
cggcactgcc acactcgtta 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
cggcactgcc acactcgctg 20

Claims (10)

1.一种引物组，其特征在于，所述的引物组包括检测野生型桔小实蝇的引物对和检测突变型桔小实蝇的引物对；其中所述的检测野生型桔小实蝇的引物对，其扩增的核苷酸片段的序列为SEQ ID NO：1，或在SEQ ID NO：1上经过取代、缺失、添加一个或数个核苷，由SEQID NO：1衍生的片段；
所述的检测突变型桔小实蝇的引物对，是检测具有耐乙酰胆碱酯酶抑制剂性状的桔小实蝇的引物对，其扩增的核苷酸片段的序列为SEQ ID NO：2；或在SEQ ID NO：2上经过取代、缺失、添加一个或数个核苷，由SEQ ID NO：2衍生的片段。
2.如权利要求1所述的引物组，其特征在于，所述的引物组还包含有用于质控功能的引物对；其扩增的序列的核苷酸序列为SEQ ID NO：3。
3.如权利要求2所述的引物组，其特征在于，所述的用于质控功能的引物对，其上游引物的序列为SEQ ID NO：4；下游引物的序列为SEQ ID NO：5。
4.如权利要求1所述的引物组，其特征在于，所述的检测野生型桔小实蝇的引物对，其上游引物序列为SEQ ID NO：6，下游引物序列为SEQ ID NO：5。
5.如权利要求1所述的引物组，其特征在于，所述的检测突变型桔小实蝇的引物对，其上游引物序列为SEQ ID NO：7，下游引物序列为SEQ ID NO：5。
6.一种ASPCR扩增检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中包含有权利要求1-5任一项所述的引物组。
7.一种检测具有耐乙酰胆碱酯酶抑制剂性状的桔小实蝇的方法，其特征在于，所述的方法是使用权利要求1-5任一项所述的引物组进行检测；其检测步骤如下：
1)提取待检测的桔小实蝇成虫的基因组DNA；
2)利用上述的引物组对提取的待检测的桔小实蝇基因组DNA进行PCR扩增；
其中序列为SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6的引物组合作为第一引物组合在一个反应中进行扩增，而序列为SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：7的引物组合作为第二引物组合在另一个反应中进行扩增；
3)将步骤2)获得的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，通过电泳图谱与鉴定标准来比较，确定所检测的桔小实蝇是否具有耐乙酰胆碱酯酶抑制剂性状。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的检测方法中，PCR反应体系为25μL:10×rTaq Buffer 2.5μl，10mM dNTP 2μl，单头桔小实蝇样本的基因组DNA 1μl，20μM引物0.5μl，5U/μlr Taq酶0.25μl，ddH2O补至25μl。
9.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的检测方法中，PCR反应程序如下：94℃预变性3min；94℃变性30s：72℃开始退火，每个循环下降1℃，72℃延伸30s，进行12个循环，然后在60℃条件下退火，72℃延伸30s，进行22个循环，每个循环30s；72℃延伸7min。
10.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的鉴定标准如下：
如果第一引物组合的PCR产物，电泳图谱显示500和400bp两个条带；第二引物组合的PCR产物图谱只有500bp的条带，则表明检测的桔小实蝇个体为不具有耐乙酰胆碱酯酶AChE抑制剂性状的突变位点的纯合野生型桔小实蝇；
如果第一引物组合和第二引物组合的PCR产物图谱均含有500和400bp的条带、则表明检测的桔小实蝇个体为具有耐乙酰胆碱酯酶抑制剂性状的突变位点的杂合型桔小实蝇；
如果第一引物组合的PCR产物图谱只有500bp条带，而第二引物组合的PCR产物图谱有500和400bp的条带，则表明检测桔小实蝇个体为具有耐乙酰胆碱酯酶抑制剂性状的突变位点的纯合型桔小实蝇。
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