CN114134235A - 一种基于可视化lamp技术检测桔小实蝇的方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种基于可视化LAMP技术检测桔小实蝇的方法，包括：1)以桔小实蝇线粒体COI基因中的含有多态性变异位点的区段为靶基因，设计特异性LAMP引物组；2)利用所述特异性LAMP引物组，以待测样本的全基因组DNA为底物，进行LAMP反应；3)所述LAMP反应结束后，根据检测用核酸染料的显色结果判断待测样本是否为桔小实蝇。本发明还提供了相应的引物组及应用。本发明提供的方法和引物组能够在73个果实蝇属的物种中精确检测桔小实蝇，且具有高灵敏性，可用于生物检疫中对检材的可视化快速检验。

Description

一种基于可视化LAMP技术检测桔小实蝇的方法及应用

技术领域

本发明涉及生物检疫技术领域，具体涉及一种基于可视化LAMP 技术检测桔小实蝇的方法及应用。

背景技术

实蝇科(Tephritidae)中许多种类具有重要经济影响，不但给发生 地区的水果和蔬菜生产造成重大损失，而且还严重影响着我国水果和 蔬菜的对外出口贸易。桔小实蝇属双翅目(Diptera)实蝇科 (Tephritidae)，广泛分布在亚洲南部、东南部和南太平洋的热带温带 地区。根据已有报道，桔小实蝇对46科的250多种植物的果实产生 危害，尚未见于报道的实际产生危害的果蔬种类更多。由于其危害巨 大，并且容易随寄主果实的调运从而远距离传播，从而严重影响了果 蔬生产和国际贸易，我国和许多国家及地区将其列为重要的进境植物 的检疫性有害生物。

长期以来，实蝇的鉴定主要是基于其形态特征而确定的，由于生 活环境不同，实蝇形态特征会随之发生相应的变化，给鉴定带来困难。 而且，在瓜果蔬菜的检疫过程中，检测到的通常是果蔬携带的实蝇幼 虫，通过传统形态学法很难对实蝇幼虫进行准确鉴定，这给实蝇的检 疫防控带来困难。

目前，虽然有一些现有技术提供了针对个别实蝇种别的鉴定方法， 例如，申请号为201410178620.4的中国专利申请公开了一种将针对 多种生物的引物组混合使用的环介导等温扩增检测方法，但该专利技 术仅针对辣椒实蝇、瓜实蝇、番石榴实蝇和桃实蝇设计混合引物用于 鉴别上述5种实蝇，没有涉及桔小实蝇的特异引物，不能用于检测桔 小实蝇。当前，对于桔小实蝇分子检测的方法主要是基于聚合酶链式 反应(PCR)的技术或实时荧光定量(Real-time PCR)进行的，均存 在试验周期较长、操作繁琐、受检测材料限制、对实验仪器及检测人 员的技术要求高等缺点，因此难以满足基层实验室的检测需求。

等温扩增技术即环介导等温扩增法(loop-mediated isothermalamplification，LAMP)，是2000年Notomi等开发的一种新的核酸等 温扩增方法。LAMP具有操作简单、快速、灵敏度高等优点，已广 泛应用于病毒、细菌、线虫等鉴定领域。LAMP技术具有如下特点； 1)灵敏度和特异性高：检出限仅为几个拷贝，与pcr相比高出几个数 量级。利用外引物和内引物与目的片段6个特异性部位准确结合发生 扩增反应，只有当引物与目的片段6个区域都匹配时才进行扩增；2) 检测速度快、扩增效率高：LAMP是恒温扩增反应，比PCR用时短， 60分钟内完成基本反应并检测扩增产物。加入环引物后，可缩短反 应时间至30分钟。通过链取代并形成不同环结构而大量扩增，促使 目的基因在反应时间内连续进行指数扩增，扩增数量高于PCR上千 倍；3)设备简单、操作简便：只需要如水浴锅、金属浴等恒温器即 可完成此实验，不需要购置昂贵的PCR仪，易于推广应用；4)产物 易检测：根据LAMP反应特性，判断产物结果的方法有琼脂糖凝胶 电泳检测法、浊度检测法和荧光比色检测法等。LAMP反应过程中产 生多种片段的扩增产物，其在电泳中会形成特异性的梯状条带，此为 电泳检测法。由于LAMP反应过程中产生大量的焦磷酸镁沉淀，通 过实时浊度计检测反应过程中焦磷酸镁沉淀产生的浊度实现定量检 测。通过SYBR green I、钙黄绿素(Calcein)荧光染料的颜色变化来 定性判断靶序列扩增与否，阳性为绿色，阴性为橙色，此为荧光比色 检测法。虽然，在申请号为201711141240.3的中国专利申请中公开 了一种快速可视化瓜实蝇分子检测方法，但是该专利是通过LAMP 技术来鉴定瓜实蝇，也不能用于桔小实蝇检测。因此，如何对桔小实 蝇进行精准、快速检测的问题仍然亟需解决。

发明内容

本发明通过桔小实蝇的LAMP检测技术研究，开发了一套基于LAMP的桔小实蝇可视化快速分子检测技术，可有效解决幼虫鉴定 周期长的难题。

本发明首先提供了一种基于可视化LAMP技术检测桔小实蝇的 方法，，包括：

1)以桔小实蝇线粒体COI基因中的含有多态性变异位点的区段 为靶基因，设计特异性LAMP引物组；

2)利用所述特异性LAMP引物组，以待测样本的全基因组DNA 为底物，进行LAMP反应；

3)所述LAMP反应结束后，根据检测用核酸染料的显色结果判 断待测样本是否为桔小实蝇。

在根据本发明的一个实施方案中，所述靶基因的核苷酸序列为 SEQ ID NO:1。

在根据本发明的一个实施方案中，所述特异性LAMP引物组由 核苷酸序列为SEQID NO:2的F3引物、核苷酸序列为SEQ ID NO:3 的B3引物，核苷酸序列为SEQ ID NO:4的FIP引物，以及核苷酸序 列为SEQ ID NO:5的BIP引物组成。

在根据本发明的一个实施方案中，所述LAMP反应的条件为： 63℃40-60min，85℃灭活5min。

在根据本发明的一个实施方案中，应体系中聚合酶为Bst DNA 大片段聚合酶。

在根据本发明的一个实施方案中，所述检测用核酸染料为钙黄绿 素或SYBRGreen I，优选为SYBR Green I。

更优选地，所述方法还包括：反应体系配置好之后于试管内壁上 层设置一不与反应体系接触的隔膜，并将适量核酸染料(SYBR Green I)滴加在隔膜上，然后盖好盖子进行反应，在反应结束后通过离心 使核酸染料混进体系中。所述隔膜优选为锡箔或铝箔。上述操作实现 免开盖显色的操作，避免了操作中产生交叉污染的问题。

本发明的同时还提供了一种用于可视化检测桔小实蝇的LAMP 引物组，由核苷酸序列为SEQ ID NO:2的F3引物、核苷酸序列为SEQ ID NO:3的B3引物，核苷酸序列为SEQ IDNO:4的FIP引物，以及 核苷酸序列为SEQ ID NO:5的BIP引物组成。

本发明的另一方面提供了一种用于可视化检测桔小实蝇的试剂 盒，包含上述的引物组的试剂，以及检测用核酸染料，优选地，所述 检测用核酸染料为SYBR Green I。

本发明还提供了上述的方法、LAMP引物组、或者试剂盒在生物 检疫中的应用。

在根据本发明的一个实施方案中，所述生物检疫中以实蝇幼虫或 实蝇成虫为生物检材。

本发明的上述技术方案的有益效果如下：

上述方案中，解决了桔小实蝇幼虫难以鉴别的问题，用快速分子 检测加可视化方法，可以在1小时内获得检测结果。免开盖的可视化 检测方法可以有效避免气溶胶污染，能够准确显色。不需要昂贵的仪 器设备，一个简单的恒温装置就能实现反应，结果检测也非常简单， 直接肉眼观察绿色荧光即可，不像普通PCR方法需要进行凝胶电泳 观察结果，是一种适合现场、基层快速检测的方法。

本发明提供的方法和引物组能够在果实蝇属的物种中精确检测 桔小实蝇，且具有高灵敏性，可用于生物检疫中对检材的可视化快速 检验。

附图说明

图1为部分序列比对结果示意图；

图2为引物设计页面示意图；

图3为扩增产物电泳检测扩增结果图谱；

图4为抽样选取其中一次的反应结果进行电泳检测结果图谱；

图5为荧光显色结果图谱，具体地：从左到右依次编号为1-4桔小实蝇5-8 具条实蝇9-12南瓜实蝇13-15空白对照。

图6重复验证引物组特异性结果图谱，具体地：1-3桔小实蝇，4-7具条 实蝇，8-9空白对照；

图7为检验引物组灵敏度的结果照片；

图8为SYBR Green I的显色效果示意图。

具体实施方式

为使本发明要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚，下面 将结合附图及具体实施例进行详细描述。

实施例1引物设计

基于桔小实蝇线粒体COI基因上的一段长度为633bp的片段 (SEQ ID NO:1)。序列如下：

SEQ ID NO:1：

TGAGCAGGAATAGTAGGAACATCCCTTAGAATTTTAGTCCG AGCTGAACTCGGTCACCCAGGAGCTTTAATCGGTGACGATCAA ATTTATAATGTAATTGTAACAGCTCATGCTTTCGTAATAATTTTCT TTATAGTTATACCAATTATAATTGGTGGATTTGGAAATTGACTTGT TCCTTTAATATTAGGAGCTCCCGATATAGCATTTCCACGAATGAA TAATATAAGATTTTGATTATTACCTCCTTCCCTTACATTACTATTAG TAAGAAGTATAGTAGAAAACGGAGCTGGTACAGGTTGAACAGT TTACCCACCCCTATCATCTGTTATTGCACACGGAGGAGCTTCAG TTGACCTAGCTATTTTTTCACTTCACTTAGCGGGTATTTCCTCAA TTTTAGGAGCAGTAAATTTCATTACAACAGTAATTAATATACGAT CGACAGGAATCACCTTTGATCGAATACCTCTATTCGTTTGAGCA GTTGTATTAACAGCTTTATTACTTTTATTATCATTACCAGTTTTAG CGGGGGCTATTACTATACTACTAACAGACCGAAACTTAAATACTT CCTTTTTTGACCCTGCTGGAGGAGGAGATCCTATTCTTTACCAA CATTTATTT

比对NCBI数据库下载的73个果实蝇属的物种的1426条相同位 置的序列。记录该片段中有较高多态性的变异位点，设计对桔小实蝇 特异性引物。图1展示了部分序列比对情况，以桔小实蝇为参考序列， 对比另外11个物种的序列，得到桔小实蝇序列主要的变异位点。

利用PrimerExplorer V5在线设计引物(网址链接为 http://primerexplorer.jp/lampv5e/index.html)，设计对桔小实蝇有特异性 的引物。去掉相似度较高的引物，得到多套潜在特异性引物，经过反 复验证，淘汰不能扩增或不够特异的引物，筛选出一套具有100％成 功扩增桔小实蝇，且不扩增供试的其他实蝇类的引物组合。图2为引 物设计页面。

桔小实蝇特异性LAMP扩增引物，序列如下：

F3(SEQ ID NO:2)：

TGATTATTACCTCCTTCCCTTAC

B3(SEQ ID NO:3)：

CGAATAGAGGTATTCGATCAAAG

FIP(SEQ ID NO:4)：

GTGCAATAACAGATGATAGGGGT-TAGTAGAAAACGGAGCT GGT

BIP(SEQ ID NO:5)：

CTTCACTTAGCGGGTATTTCCTCGTGATTCCTGTCGATCGTA T

实施例2引物的有效性检测

针对在多个地区采集的桔小实蝇种群分别进行LAMP反应，由 于来自不同的地区的桔小实蝇个体在遗传信息存在一定的变异，如果 引物在目标个体上都能成功扩增，则说明引物有效。以诱集器监测诱 捕的实蝇为检测对象(表1)。所有供试昆虫均经过成虫形态鉴定验 证(将幼虫饲养为成虫后鉴定验证)和DNA条形码鉴定。

LAMP反应检测步骤如下：

a)取待测昆虫的全身或部分组织样品，使用DNeasy Blood& Tissue试剂盒(QIAGEN)，参考试剂盒说明操作提取基因组DNA。

b)利用两对特异性扩增引物：FIP/BIP和F3/B3进行LAMP反 应，其中所述的F3核酸序列如SEQ ID No.1所示，所述的B3核酸序 列如SEQ ID No.2所示，所述的FIP核酸序列如SEQ ID No.3所示， 所述的BIP核酸序列如SEQ ID No.4所示。

LAMP反应体系：

20uL反应体系：10×ThermoPol缓冲液2ul,MgSO₄(100mmol/L) 0.8ul,dNTP混合液(10mmol/L)2.8ul,FIP/BIP(10um/L)各4ul, F3/B3(10um/L)各0.5ul,Betaine(5mol/L)1.0ul,Bst DNA大片段聚合 酶(8U/uL)0.8ul,DNA模板1ul，加水至20uL。

反应条件:

63℃40-60min，85℃灭活5min。

c)可视化检测反应产物：

反应体系配置好之后在试管内壁上层放置一片锡箔纸，滴1ul核 酸染料(SYBRGreen I)在锡箔纸上，盖好盖子，反应结束后用手掌 型离心机离心，让核酸染料混进体系中。如果颜色变绿，说明发生了 扩增。阴性对照的体系颜色为棕色。

表1供试昆虫

检测结果如下：

由于不同地区的桔小实蝇在遗传结构上或多或少有变异，如果引 物对这些位点不能扩增，则影响检验效果，本试验对采集自不同地区 的桔小实蝇进行扩增验证，通过7个地区36头桔小实蝇的验证，扩 增率为100％。

图3为电泳检测扩增结果图谱，有梯状条带的表示成功得到扩增 产物。

实施例3特异性检测

通过检测不同种类的实蝇，验证LAMP引物的特异性。非桔小 实蝇的昆虫如表2所示，所有样品经过测序比对，已确保物种鉴定无 误。去离子水代替DNA模板作为空白对照。

表2非桔小实蝇的昆虫

图4为抽样选取其中一次的反应结果进行电泳检测结果，如图4 所示的，桔小实蝇扩增成功，而其他实蝇未扩增，符合预期。

图5荧光显色结果如下：从左到右依次编号为1-4桔小实蝇5-8 具条实蝇9-12南瓜实蝇13-15空白对照。从结果来看，引物具有高 度特异性。

图6换新的DNA模板重复验证引物特异性，结果如下：1-3桔 小实蝇，4-7具条实蝇，8-9空白对照。

实施例4灵敏度检测

使用超微量紫外分光光度计(Nano-200)检测桔小实蝇DNA模 板初始浓度，取1μL模板加入9μL ddH₂O进行10倍梯度稀释，选 取稀释后分别为：2.5×10^-2ng/μL、2.5×10^-3ng/μL、2.5×10^-4ng/μL、 2.5×10^-5ng/μL、2.5×10^-6ng/μL、2.5×10^-7ng/μL和2.5×10^-8ng/μL的模 板做扩增，结果如图7所示，在2.5×10^-8ng/μL的模板浓度下荧光强 度仍然能与空白对照区分。结论认为，该方法的最低检测浓度可以达 到2.5×10^-8ng/μL。

实施例5荧光显色方法

Green I染色法

SYBR Green I(别名Green-DNADye核苷酸胶体染料)是常用 的核酸染料。由于该染料进入反应体系会抑制扩增，所以必须在反应 结束后添加。为了避免开盖造成气溶胶污染，采用免开盖的方式检测。 具体方法如下：在试管中配置好反应体系后，在管内放入锡箔纸，使 其悬空，在锡箔纸上滴1uL的Green I染料，反应结束后离心，让染 料与产物混合，观察是否呈绿色(阳性结果)，阴性结果为棕色。

自然光下SYBR Green I的显色效果如图8所示，Green1可以明 确区分阳性(绿色)和阴性结果(棕色)。因此，在显色环节采用免 开盖的方式可以成功观测到试验结果。

以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普 通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以做出若 干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 青岛农业大学

<120> 一种基于可视化LAMP技术检测桔小实蝇的方法及应用

<130> 案卷号

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 633

<212> DNA

<213> 桔小实蝇(Dacus dorsalis)

<400> 1

tgagcaggaa tagtaggaac atcccttaga attttagtcc gagctgaact cggtcaccca 60

ggagctttaa tcggtgacga tcaaatttat aatgtaattg taacagctca tgctttcgta 120

ataattttct ttatagttat accaattata attggtggat ttggaaattg acttgttcct 180

ttaatattag gagctcccga tatagcattt ccacgaatga ataatataag attttgatta 240

ttacctcctt cccttacatt actattagta agaagtatag tagaaaacgg agctggtaca 300

ggttgaacag tttacccacc cctatcatct gttattgcac acggaggagc ttcagttgac 360

ctagctattt tttcacttca cttagcgggt atttcctcaa ttttaggagc agtaaatttc 420

attacaacag taattaatat acgatcgaca ggaatcacct ttgatcgaat acctctattc 480

gtttgagcag ttgtattaac agctttatta cttttattat cattaccagt tttagcgggg 540

gctattacta tactactaac agaccgaaac ttaaatactt ccttttttga ccctgctgga 600

ggaggagatc ctattcttta ccaacattta ttt 633

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tgattattac ctccttccct tac 23

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cgaatagagg tattcgatca aag 23

<210> 4

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gtgcaataac agatgatagg ggttagtaga aaacggagct ggt 43

<210> 5

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cttcacttag cgggtatttc ctcgtgattc ctgtcgatcg tat 43

Claims (10)

1.一种基于可视化LAMP技术检测桔小实蝇的方法，其特征在于，包括：

1)以桔小实蝇线粒体COI基因中的含有多态性变异位点的区段为靶基因，设计特异性LAMP引物组；

2)利用所述特异性LAMP引物组，以待测样本的全基因组DNA为底物，进行LAMP反应；

3)所述LAMP反应结束后，根据检测用核酸染料的显色结果判断待测样本是否为桔小实蝇。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述靶基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:1。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述特异性LAMP引物组由核苷酸序列为SEQID NO:2的F3引物、核苷酸序列为SEQ ID NO:3的B3引物，核苷酸序列为SEQ ID NO:4的FIP引物，以及核苷酸序列为SEQ ID NO:5的BIP引物组成。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述LAMP反应的条件为：63℃40-60min，85℃灭活5min。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，反应体系中聚合酶为Bst DNA大片段聚合酶。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述检测用核酸染料为钙黄绿素或SYBRGreenI，优选为SYBR Green I。

7.一种用于可视化检测桔小实蝇的LAMP引物组，其特征在于，由核苷酸序列为SEQ IDNO:2的F3引物、核苷酸序列为SEQ ID NO:3的B3引物，核苷酸序列为SEQ ID NO:4的FIP引物，以及核苷酸序列为SEQ ID NO:5的BIP引物组成。

8.一种用于可视化检测桔小实蝇的试剂盒，其特征在于，包含有如权利要求7所述的引物组的试剂，以及检测用核酸染料；优选地，所述检测用核酸染料为SYBR GreenI。

9.如权利要求1-6中任一项所述的方法、权利要求7所述的LAMP引物组、或者如权利要求8所述的试剂盒在生物检疫中的应用。

10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述生物检疫中以实蝇幼虫或实蝇成虫为生物检材。

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