CN115931786B - 一种用于检测有机磷农药的双信号传感器及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于检测有机磷农药的双信号传感器及其制备方法和应用，该传感器由巯基化的单链cDNA和FAM标记的aptamer修饰到Ag/Au NPs表面，获得纳米探针；纳米探针与乙酰胆碱酯酶(AChE)、胆碱氧化酶(CHO)、氯化乙酰胆碱(ACh)混合溶液构成双信号传感器。本发明将有机磷农药与AChE混合反应，然后加入CHO和ACh反应得到混合溶液，最后在溶液中加入纳米探针室温下反应，通过LSPR和荧光图谱得出有机磷农药的浓度，并进行LSPR和荧光成像分析。本发明利用两种不同的光学信号传感器对有机磷农药同时检测并成像，选择性好，灵敏度高，该检测方法极大地提高了有机磷农药检测的准确性。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于检测有机磷农药的双信号传感器及其制备方法和应用。
背景技术
有机磷农药(OPs)在减少作物损失、控制病虫害、提高农产品质量方面发挥着重要作用，在农业领域广泛使用。然而，OPs残留会对环境、生态系统和人类健康造成各种不利影响和持久的损害。例如，OPs可在人体中积累，对人体器官造成不可逆转的损伤。因此，建立快速、灵敏、准确的OPs残留检测方法是保障食品安全和公众安全的迫切需要。
目前，高效液相色谱、气相色谱、毛细管电泳、质谱、荧光、比色和化学发光等多种检测方法已被开发用于OPs的检测，具有优良的性能。但这些方法大多为单信号传感器，受到仪器条件、环境波动、干扰等诸多因素的影响，在实际OPs检测中存在假阳性或假阴性的问题。近年来，结合两种不同的信号对特定目标物检测的双信号传感器的引起了广泛关注。与传统的单信号传感器相比，双信号传感器通过两种不同信号的自校准和相互验证，可以极大提高实际目标物检测中的抗干扰能力和检测准确性。目前报道的双信号传感器大多是基于两个独立的单信号探针混合，并非单一纳米探针自身具有双信号响应。结合新颖的光学技术，设计一种具有双信号响应的多功能传感器用于OPs的灵敏检测及可视化成像，具有显著的优越性和应用前景。
发明内容
发明目的：针对现有检测技术存在信噪比、灵敏度和可视化方面的不足，本发明提供了一种基于局域表面等离子共振和荧光成像的双信号传感器，本发明的传感器可以利用两种不同的光学信号对有机磷农药同时检测并成像，选择性好，灵敏度高，极大地提高了有机磷农药检测的准确性。
本发明还提供所述用于检测有机磷农药的双信号传感器及其制备方法和应用。
技术方案：为了实现上述目的，本发明所述一种用于检测有机磷农药的双信号传感器，由巯基化的单链cDNA和FAM标记的aptamer修饰到Ag/Au NPs表面，获得纳米探针；纳米探针与AChE、CHO、ACh混合溶液构成双信号传感器。
其中，所述cDNA序列为：5’-SH-GGT GGG TG-3’，所述aptamer序列为：5’-FAM-CCTCCC TCC TTT TCC ACC CAC C-3’。
本发明所述的用于检测有机磷农药的双信号传感器的制备方法，包括如下步骤：
(1)Ag/Au NPs的制备：以银纳米粒子作为晶种溶液，向其中加入去离子水并加热至沸腾，在剧烈搅拌下加入氯金酸和盐酸羟胺，将溶液加热回流，待自然冷却至室温后，得到Ag/Au NPs溶液存储备用；
(2)功能纳米探针的制备：将BSPP加入到Ag/Au NPs溶液中，搅拌后离心洗涤后重新分散，将cDNA加入上述溶液中，振荡后离心洗涤后分散得到cDNA功能化Ag/Au NPs；继续加入aptamer至上述cDNA功能化Ag/Au NPs溶液中，孵育后离心洗涤后分散制得功能纳米探针；
(3)双信号传感器的构建：将AChE、CHO、ACh混合温育后加入步骤(2)得到的纳米探针溶液构建双信号传感器。
其中，步骤(2)中将BSPP加入到Ag/Au NPs溶液中，在室温搅拌下温育过夜，离心洗涤后重新分散于PBS中。
其中，步骤(2)中cDNA和aptamer为等摩尔加入。
其中，步骤(2)中将cDNA加入溶液后，室温下振荡20-24h，离心洗涤后分散于PBS中得到cDNA功能化Ag/Au NPs；继续加入aptamer至cDNA功能化Ag/Au NPs溶液中，30-37℃下温育6-10h，离心洗涤后分散于PBS中制得功能纳米探针。
其中，步骤(3)中纳米探针加入体系中的浓度为0.1-0.2nM。
本发明所述的双信号传感器在有机磷农药同时检测并成像中的应用。
其中，所述应用的过程为：传感器中加入不同浓度的有机磷农药，利用LSPR散射光谱仪和荧光光谱仪进行检测，分别得到LSPR散射峰位移和有机磷农药浓度的线性关系，荧光强度和有机磷农药浓度的线性关系；传感器中加入不同浓度的有机磷农药，滴加到氨基修饰的载玻片上，利用倒置显微镜进行LSPR和荧光成像分析。
作为优选，本发明基于局域表面等离子共振和荧光成像的双信号传感器检测有机磷农药，包含以下步骤，
1)Ag/Au NPs的制备；
2)功能纳米探针的制备；
3)双信号传感器的构建；
4)利用传感器检测不同浓度目标物的含量并成像。
所述步骤1)Ag/Au NPs的制备步骤如下：以5mL粒径为50nm的银纳米粒子作为晶种溶液，向其中加入5mL的去离子水并加热至沸腾，在剧烈搅拌下加入100μL氯金酸(0.1wt％)和100μL盐酸羟胺(20mM)，将溶液加热回流约8分钟，待自然冷却至室温后，4℃冰箱中存储备用。
所述步骤2)功能纳米探针的制备步骤如下：将1mg BSPP加入到1mL Ag/Au NPs溶液中，在室温搅拌下温育过夜，离心洗涤后重分散于PBS中。将5μL的cDNA(100μM)加入上述溶液中，室温下振荡24h，离心洗涤后分散于1mL PBS中得到cDNA功能化Ag/Au NPs。继续加入5μL的aptamer(100μM)至溶液中，37℃下温育6h，离心洗涤后分散于1mL PBS中制得功能纳米探针。
所述步骤3)双信号传感器的构建步骤如下：将含有20μL有机磷农药与20μL AChE(0.8mU mL-1)的混合溶液37℃温育30min，继续加入20μL CHO(10mU mL-1)和40μL ACh(0.2mM)于37℃温育30min，最后，将100μL纳米探针(0.1nM)加入上述溶液作为待检测溶液，室温下温育30min，用于LSPR和荧光双信号传感检测有机磷农药。
所述步骤4)利用传感器检测不同浓度目标物的含量并成像步骤如下：待检测溶液中加入不同浓度的有机磷农药，利用LSPR散射光谱仪和荧光光谱仪进行检测，分别得到LSPR散射峰位移和有机磷农药浓度的线性关系，荧光强度和有机磷农药浓度的线性关系。待检测溶液中加入不同浓度的有机磷农药，滴加到氨基修饰的载玻片上，利用倒置显微镜进行LSPR和荧光成像分析。
本发明将巯基化的单链cDNA和FAM标记的aptamer修饰到Ag/Au NPs表面，获得具有LSPR和FL双信号响应的功能纳米探针。纳米探针与AChE、CHO、ACh混合溶液(组成双信号传感器)用于OPs检测。当检测溶液中没有OPs，在AChE和CHO双酶体系催化下，ACh分解产生H2O2，引起传感器中Ag的蚀刻和FAM标记的aptamer的解离。当检测溶液中存在OPs，AChE的活性被抑制，阻止了H2O2的生成，以及进一步的Ag刻蚀和aptamer解离。利用传感器的LSPR散射峰位移、荧光强度变化和OPs浓度之间的标准曲线实现双信号对OPs定量检测。此外，LSPR和荧光光谱信号的变化通过可视化成像，呈现出两种差异显著的散射光和荧光颜色变化，可用于OPs的可视化检测。
本发明将有机磷农药与乙酰胆碱酯酶(AChE)混合反应，然后加入胆碱氧化酶(CHO)和氯化乙酰胆碱(ACh)反应得到混合溶液，最后在溶液中加入纳米探针室温下反应，通过LSPR和荧光图谱得出有机磷农药的浓度，并进行LSPR和荧光成像分析。本发明利用两种不同的光学信号对有机磷农药同时检测并成像，选择性好，灵敏度高，该方法极大地提高了有机磷农药检测的准确性。
本发明制备的双信号传感器具有青色的LSPR散射光和较弱的荧光。纳米探针与AChE、CHO、ACh溶液混合构成双信号传感器。在没有OPs的情况下，AChE水解ACh生成胆碱(choline)并被CHO氧化生成H2O2。H2O2氧化刻蚀探针生成银离子，导致探针LSPR散射光颜色由青色变为红色；同时，生成的银离子和aptamer特异性结合，FAM标记的aptame从探针上脱落，导致FAM的荧光强度显著增加。在存在OPs的情况下，OPs会抑制AChE的活性，阻碍了H2O2的生成，传感器中探针的LSPR和荧光信号几乎没有发生变化。利用OPs加入前后，探针LSPR和荧光两种信号的变化，实现对OPs的同时检测和成像。与传统的单信号传感器相比，双信号可视化传感器通过两种不同信号的自校准和相互验证，可以大大提高实际样检测的抗干扰能力和检测准确性。
本发明构建的传感器所用功能双信号传感器自身具有双信号读出，优于利用两个单独探针构建的传统双信号传感器，且样品检测仅需要温育即可，不需要离心以及过于繁琐的样品前处理步骤。同时双信号检测避免了单个信号检测存在的假阳性和假阴性，提高了实际样检测的准确性，成像有利于通过颜色变化达到对OPs的定性检测，提高了筛选效率。传感器具有较宽的检测范围和很好的灵敏度，一份样品可以完成两种信号的同时检测，降低了检测成本和样品体积。
本发明制备具有LSPR和荧光双信号读出的多功能纳米探针，并基于纳米探针首次构建了具有LSPR和荧光响应的双信号可视化传感器，用于OPs的检测和成像。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优点：
本发明以DNA功能化双金属Ag/Au NPs为功能纳米探针，设计了一种用于OPs检测和成像的LSPR/荧光双信号生物传感器。双金属纳米粒子具有比单组分纳米粒子优越的物理化学性质，可以大大提高检测的灵敏度和选择性。构建的LSPR/荧光双信号生物传感器可以根据双光谱和多模态成像同时对OPs进行定量和可视化检测，可获得多尺度信息，在低丰度和复杂的生物环境下对OPs进行准确定量，提高了筛选效率和准确性，降低检测成本和样品体积。
本发明构建的传感器所用功能纳米探针自身具有双信号读出，优于利用两个单独探针构建的传统双信号传感器，且OPs的检测仅需要温育即可，不需要过于繁琐的样品前处理步骤。利用LSPR光谱位移和FL强度变化，可以同时定量检测OPs。此外，LSPR和荧光信号变化也伴随着两种显著的散射和荧光颜色变化，用于OPs的可视化筛选。
附图说明
图1显示了局域表面等离子共振和荧光成像的双信号传感器检测有机磷农药的原理图；
图2中A显示了功能纳米探针(nanoprobe)，nanoprobe/AChE/CHO/ACh和nanoprobe/AChE/CHO/ACh/OPs溶液的LSPR散射光谱，B是nanoprobe(a)，nanoprobe/AChE/CHO/ACh(b)，nanoprobe/AChE/CHO/ACh/OPs(c)，DNA功能化Ag NPs(d)，DNA功能化Ag NPs/AChE/CHO/ACh(e)，DNA功能化Ag NPs/AChE/CHO/ACh/OPs(f)，DNA功能化Au NPs(g)，DNA功能化Au NPs/AChE/CHO/ACh(h)，DNA功能化Au NPs/AChE/CHO/ACh/OPs(i)的LSPR暗场成像，C是nanoprobe，nanoprobe/AChE/CHO/ACh和nanoprobe/AChE/CHO/ACh/OPs溶液的荧光光谱；
图3中A显示了nanoprobe/AChE/CHO/ACh混合溶液与不同浓度(0、1、10、50、100、500pg mL-1)OPs温育30min的LSPR散射光谱，B是OPs浓度与LSPR散射峰位移的对应关系(内嵌图为标准曲线)，C是nanoprobe/AChE/CHO/ACh混合溶液与不同浓度OPs温育30min的LSPR暗场成像，图3D是该传感器基于LSPR信号检测的选择性实验；
图4中A显示了nanoprobe/AChE/CHO/ACh混合溶液与不同浓度(0、5、10、50、100、200、500ng mL-1)OPs温育30min的荧光光谱，B是OPs浓度与荧光强度的对应关系(内嵌图为标准曲线)，C是nanoprobe/AChE/CHO/ACh混合溶液与不同浓度OPs温育30min的荧光成像，图4D是该传感器基于荧光信号检测的选择性实验。
图5中A显示了nanoprobe/AChE/CHO/ACh混合溶液与500ng mL-1OPs温育0-40min的LSPR峰位移，B显示了nanoprobe/AChE/CHO/ACh混合溶液与500ng mL-1OPs温育0-40min的荧光强度变化。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
本实验中用到的试剂和仪器：
双(对磺苯基)苯基膦(BSPP)、乙酰胆碱酯酶(AChE)胆碱氧化酶(CHO)和氯化乙酰胆碱(ACh)购自Sigma-Aldrich(中国上海)。(3-氨基丙基)-三乙氧基硅烷(APTES)购自上海麦克林生化科技有限公司(中国上海)。柠檬酸三钠、盐酸羟胺、四水合氯金酸(HAuCl4·4H2O)和硝酸银购自国药化学试剂公司(中国上海)。有机磷农药标准品购自国家标准中心(中国北京)。50nm的银纳米粒子和50nm的金纳米粒子购自中镜科仪公司(中国北京)。
cDNA：5’-SH-GGT GGG TG-3’和aptamer:5’-FAM-CCT CCC TCC TTT TCC ACC CACC-3’由上海生工生物技术有限公司(中国上海)合成。
实施例中检测和成像使用到的仪器和条件：在配备有暗场聚光器(0.8<NA<0.92)，60X物镜(NA＝0.7)和彩色CCD(DP80，奥林巴斯，日本)的倒置显微镜IX73(奥林巴斯，日本)上获取LSPR暗场图像和荧光图像。将Acton SP2358光谱仪安装在显微镜上，用400BR模块电子倍增电荷耦合器件作为探测器(普林斯顿仪器，美国)，通过将光路切换到配备光栅的光谱仪(光栅密度：300线/mm；闪耀波长：600nm)来获取LSPR散射光谱。荧光光谱通过FluoroMax-4荧光光谱仪(Horiba，美国)测量。
本发明实施例中有机磷农药统一选用的是毒死蜱，但本申请的方案在具体应用时不限于毒死蜱，还可用于敌敌畏、对硫磷、甲基对硫磷等有机磷农药。
实施例中PBS溶液(pH 7.4)的组分为136.7mM NaCl，2.7mM KCl，8.72mM Na2HPO4和1.41mM KH2PO4。
实施例1
双信号传感器的构建
以下构建中的材料或者试剂的浓度均为初始浓度。
(1)Ag/Au NPs的制备：以5mL粒径为50nm的银纳米粒子作为晶种溶液，向其中加入5mL的去离子水并加热至沸腾，在剧烈搅拌下加入100μL氯金酸(0.1wt％)和100μL盐酸羟胺(20mM)，将溶液100℃加热回流约8分钟，待自然冷却至室温后，4℃冰箱中存储备用。
(2)功能纳米探针的制备：将1mg BSPP加入到上述1mL Ag/Au NPs溶液中，在室温搅拌下温育过夜，沉淀离心洗涤后重分散于1mL的PBS中。将5μL的cDNA(100μM)加入上述溶液中，室温下振荡24h，沉淀离心洗涤后分散于1mL PBS中得到cDNA功能化Ag/Au NPs。继续加入5μL的aptamer(100μM)至溶液中，37℃下温育6h，沉淀离心洗涤后分散于1mL PBS中制得功能纳米探针。
(3)双信号传感器的构建；将20μL AChE(0.8mU mL-1)溶液37℃温育30min，继续加入20μL CHO(10mU mL-1)和40μL ACh(0.2mM)于37℃温育30min，最后，将100μL纳米探针(0.1nM)加入上述溶液，室温下温育30min，构建用于LSPR和荧光双信号传感器检测有机磷农药。
实施例2
双信号传感器的构建
(1)Ag/Au NPs的制备；以5mL粒径为50nm的银纳米粒子作为晶种溶液，向其中加入5mL的去离子水并加热至沸腾，在剧烈搅拌下加入80μL氯金酸(0.1wt％)和80μL盐酸羟胺(20mM)，将溶液100℃加热回流约8分钟，待自然冷却至室温后，4℃冰箱中存储备用。
(2)功能纳米探针的制备；将1mg BSPP加入到上述1mL Ag/Au NPs溶液中，在室温搅拌下温育过夜，沉淀离心洗涤后重分散于1mL的PBS中。将4μL的cDNA(100μM)加入上述溶液中，室温下振荡20h，沉淀离心洗涤后分散于1mL PBS中得到cDNA功能化Ag/Au NPs。继续加入4μL的aptamer(100μM)至溶液中，37℃下温育10h，沉淀离心洗涤后分散于1mL PBS中制得功能纳米探针。
(3)双信号传感器的构建；将20μL AChE(1mU mL-1溶液37℃温育30min，继续加入20μL CHO(10mU mL-1)和40μL ACh(0.2mM)于37℃温育30min，最后，将100μL纳米探针(0.1nM)加入上述溶液，室温下温育30min，构建用于LSPR和荧光双信号传感器检测有机磷农药。
实施例3
双信号传感器的对应有机磷农药的检测：
采用实施例1的构建方法，根据实施例1中的步骤(3)，将含有20μL有机磷农药毒死蜱(OPs，500pg mL-1)与20μL AChE(0.8mU mL-1)的混合溶液37℃温育30min，继续加入20μLCHO(10mU mL-1)和40μL ACh(0.2mM)于37℃温育30min，最后，将100μL纳米探针(0.1nM)加入上述溶液作为待检测溶液，室温下温育30min，用于LSPR和荧光双信号传感检测OPs，其中以不加OPs作为对照。散射光谱仪(光栅密度：300线/mm；闪耀波长：600nm)用于OPs的LSPR光谱检测，荧光光谱仪设置激发光为495nm用于OPs的荧光光谱检测，在配备有暗场聚光器(0.8<NA<0.92)，60X物镜(NA＝0.7)和彩色CCD的倒置显微镜上获取LSPR暗场图像和荧光图像。
图1显示了双信号传感器检测有机磷农药的原理。在没有OPs的情况下，AChE水解ACh生成胆碱(choline)并被CHO氧化生成H2O2。H2O2氧化刻蚀探针生成银离子，导致探针LSPR散射光颜色由青色变为红色；同时，生成的银离子和aptamer特异性结合，FAM标记的aptame从探针上脱落，导致FAM的荧光强度显著增加。在存在OPs的情况下，OPs会抑制AChE的活性，阻碍了H2O2的生成，传感器中探针的LSPR和荧光信号几乎没有发生变化。利用OPs加入前后，探针LSPR和荧光两种信号的变化，实现对OPs的同时检测和成像。
图2A显示了待检测溶液不含OPs时，在AChE和CHO双酶体系催化下，ACh分解产生H2O2，引起银的刻蚀，LSPR散射峰位于635nm。当溶液中存在500pg mL-1OPs时，AChE活性被抑制，阻碍了H2O2的生成，LSPR散射峰蓝移至500nm。图2B显示相比于DNA功能化的Ag NPs和DNA功能化的Au NPs(按实施例1的步骤(1)和(2)的方法，其中Ag/Au NPs替换为Ag NPs或AuNPs)，DNA功能化的双金属Ag/Au NPs作为纳米探针用于OPs成像具有更显著的颜色变化，检测更灵敏。图2C显示了待检测溶液不含OPs时，在AChE和CHO双酶体系催化下，ACh分解产生H2O2，刻蚀生成的银离子和aptamer特异性结合，FAM标记的aptamer从nanoprobe上脱落，FAM的荧光恢复。当溶液中存在500pg mL-1OPs时，AChE活性被抑制，阻碍了H2O2的生成，aptamer并未脱落，FAM的荧光被猝灭。这些结果表明，检测溶液的LSPR和荧光双信号变化对OPs有很强的依赖性，所以本发明构建的传感器可用于OPs检测和成像，并可以利用该传感器检测不同浓度目标物的含量并成像。
实施例4
基于LSPR信号检测不同浓度的有机磷农药
采用实施例1的构建方法，根据实施例1中的步骤(3)，分别将含有20μL不同浓度OPs(0、1、10、50、100、500pg mL-1)与20μL AChE(0.8mU mL-1)的混合溶液37℃温育30min，继续加入20μL CHO(10mU mL-1)和40μL ACh(0.2mM)于37℃温育30min，最后，将100μL纳米探针(0.1nM)加入上述溶液作为待检测溶液，室温下温育30min，利用LSPR散射光谱仪和倒置显微镜进行LSPR光谱和暗场成像分析(检测和成像条件同实施例3)。
图3A显示了不同OPs浓度下，检测溶液中传感器的LSPR散射光谱。图3B显示了传感器LSPR散射峰位移与OPs浓度对数值的拟合曲线，在1pg mL-1～500pg mL-1范围内，LSPR散射峰位移值与OPs的对数浓度呈现良好的线性关系，检测限为0.33pg mL-1。图3C显示了不同OPs浓度下，检测溶液中传感器显著的LSPR暗场散射光颜色变化，可用于有OPs可视化成像。
根据实施例1中的步骤，分别将20μL浓度为5μg mL-1其他杀虫剂如溴氰菊酯、氯噻虫胺、吡虫嗪、噻虫嗪、吡虫啉、啶虫脒以及20μL浓度为50pg mL-1的OPs加入传感器，图3D显示了该传感器采用LSPR信号对OPs检测具有良好的选择性。
实施例5
基于荧光信号检测不同浓度的有机磷农药
采用实施例1的构建方法，根据实施例1中的步骤(3)，分别将含有20μL不同浓度OPs(0、5、10、50、100、200、500ng mL-1)与20μL AChE(0.8mU mL-1)的混合溶液37℃温育30min，继续加入20μL CHO(10mU mL-1)和40μL ACh(0.2mM)于37℃温育30min，最后，将100μL纳米探针(0.1nM)加入上述溶液作为待检测溶液，室温下温育30min，利用荧光光谱仪和倒置显微镜进行荧光光谱和暗场成像分析(检测和成像条件同实施例3)。
图4A显示了不同OPs浓度下，检测溶液的荧光光谱。图4B显示了传感器荧光强度变化与OPs浓度对数值的拟合曲线，在5ng mL-1～500ng mL-1范围内，检测溶液位于518nm荧光强度值与OPs的对数浓度呈现良好的线性关系，检测限为1.67ng mL-1。图4C显示了不同OPs浓度下，检测溶液显著的荧光颜色变化，可用于有OPs可视化成像。
实施例4和5说明本发明构建的传感器及其检测方法具有较宽的检测范围和很好的灵敏度。
根据实施例1中的步骤，分别将20μL浓度为5μg mL-1其他杀虫剂如溴氰菊酯、氯噻虫胺、吡虫嗪、噻虫嗪、吡虫啉、啶虫脒以及20μL浓度为50ng mL-1的OPs加入传感器，图4D显示了该传感器采用荧光信号对OPs检测具有良好的选择性。
实施例6
实际样品检测
为了进一步评估开发的双信号传感方法在实际应用中的可靠性，采用标准添加方法在南京湖水和自来水样品中测试OPs含量。水样以13000rpm离心30min以除去不溶物，再通过0.22μm纤维素膜过滤器过滤后，将已知浓度的OPs加入处理后的水样，进行加标回收实验，每个浓度的样品测试3次，采用实施例3的检测方法。实验结果如表1所示，这些结果表明可接受的回收率和相对标准偏差，表明此双信号传感器可用于检测实际样品的测定。
表1显示了通过加标回收法测定湖水和自来水样中有机磷农药的检测结果
实施例7
采用实施例1的构建方法，根据实施例1中的步骤(3)，将含有20μL OPs(500ng mL-1)与20μL AChE(1mU mL-1)的混合溶液37℃温育30min，继续加入20μL CHO(10mU mL-1)和40μL ACh(0.2mM)于37℃温育30min，最后，将100μL纳米探针(0.1nM)加入上述溶液作为待检测溶液，室温下温育0-40min，用LSPR和荧光双信号考察传感器检测时间的影响。由图5可知，本发明的传感器的检测响应时间为30min，响应速度非常快。
Claims (8)
1.一种用于检测有机磷农药的双信号传感器的制备方法，其特征在于，由巯基化的单链cDNA和6-羧基荧光素FAM标记的aptamer修饰到Ag/Au NPs表面，获得纳米探针；纳米探针与乙酰胆碱酯酶AChE、胆碱氧化酶CHO、氯化乙酰胆碱ACh混合溶液构成双信号传感器；
所述cDNA序列为： 5’-SH-GGT GGG TG-3’，所述aptamer序列为：5’-FAM- CCT CCC TCCTTT TCC ACC CAC C -3’；
所述用于检测有机磷农药的双信号传感器的具体制备步骤如下：
（1）Ag/Au NPs的制备：以银纳米粒子作为晶种溶液，向其中加入去离子水并加热至沸腾，在剧烈搅拌下加入氯金酸和盐酸羟胺，将溶液加热回流，待自然冷却至室温后，得到Ag/Au NPs溶液存储备用；
（2）功能纳米探针的制备：将双(对磺苯基)苯基膦BSPP加入到Ag/Au NPs溶液中，搅拌后离心洗涤后重新分散，将cDNA加入上述溶液中，振荡后离心洗涤后分散得到cDNA功能化Ag/Au NPs；继续加入aptamer至上述cDNA功能化Ag/Au NPs溶液中，孵育后离心洗涤后分散制得功能纳米探针；
（3）双信号传感器的构建：将AChE、CHO、ACh混合温育后加入步骤（2）得到的纳米探针溶液构建双信号传感器。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中将BSPP加入到Ag/Au NPs溶液中，在室温搅拌下温育过夜，离心洗涤后重新分散于PBS中。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中cDNA和aptamer为等摩尔加入。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中将cDNA 加入溶液后，室温下振荡20-24 h，离心洗涤后分散于PBS中得到cDNA功能化Ag/Au NPs；继续加入aptamer至cDNA功能化Ag/Au NPs溶液中，30-37 °C下温育6-10h，离心洗涤后分散于PBS中制得功能纳米探针。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（3）中纳米探针加入体系中的浓度为0.1-0.2 nM。
6.一种权利要求1所述的用于检测有机磷农药的双信号传感器的制备方法所制备的双信号传感器。
7.一种权利要求6所述的双信号传感器在有机磷农药同时检测并成像中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述应用的过程为：传感器中加入不同浓度的有机磷农药，利用LSPR散射光谱仪和荧光光谱仪进行检测，分别得到LSPR散射峰位移和有机磷农药浓度的线性关系，荧光强度和有机磷农药浓度的线性关系；传感器中加入不同浓度的有机磷农药，滴加到氨基修饰的载玻片上，利用倒置显微镜进行LSPR和荧光成像分析。
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2022
- 2022-08-25 CN CN202211026026.4A patent/CN115931786B/zh active Active
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN115931786A (zh) | 2023-04-07 |
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