KR20130001886A

KR20130001886A - 검출 감도가 향상된 금 나노로드의 국지화된 표면 플라즈몬 공명 센서, 이의 제조방법 및 이를 이용한 생체물질 검출방법

Info

Publication number: KR20130001886A
Application number: KR1020110062791A
Authority: KR
Inventors: 심상준
Original assignee: 고려대학교 산학협력단
Priority date: 2011-06-28
Filing date: 2011-06-28
Publication date: 2013-01-07
Also published as: KR101222893B1

Abstract

본 발명은 금 나노로드의 종횡비, 크기를 최적화하고, 금 나노로드 표면을 개질하여 나노수준으로 소형화되고, 입체장애 감소로 인한 검출한계가 우수하며, 우수한 감도를 가지는 금 나노로드의 국지화된 표면 플라즈몬 공명 센서 및 이의 제조방법에 관한 것으로서, 금 나노로드 및 상기 금 나노로드 표면에 형성되는 자기조립단분자층을 포함하고, 상기 자기조립단분자층은 말단이 티올기이고, 카르복실기와 하이드록실기가 결합되어 있는 유기 흡착제에 의해서 형성되는 것을 특징으로 하며, 본 발명에 따른 금 나노로드의 국지화된 표면 플라즈몬 공명 센서는 가장 최적화된 종횡비, 크기 등의 물성을 가지며, 표면을 유기흡착제로 개질한 금 나노로드를 이용한 것으로서, 센서 크기에 있어서 나노수준 규모로의 소형화가 가능하고, 검출 감도에 있어서는 입체장해를 감소시켜 검출한계의 현저한 향상을 유도할 수 있다. 따라서, 복잡한 혼합물의 검출, 암의 조기발견, 감염 및 신경질환 등의 조기 예방에 본 발명에 따른 금 나노로드 센서가 다양하게 활용될 수 있다.

Description

검출 감도가 향상된 금 나노로드의 국지화된 표면 플라즈몬 공명 센서, 이의 제조방법 및 이를 이용한 생체물질 검출방법{Localized surface plasmon resonance sensor of gold nonorod with improving sensitivity, method of preparing the same and method of detecting bioproduct using the same}

본 발명은 금 나노로드의 국지화된 표면 플라즈몬 공명 센서에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 금 나노로드의 종횡비, 크기를 최적화하고, 금 나노로드 표면을 개질하여 나노수준으로 소형화되고, 입체장애 감소로 인한 검출한계가 우수하며, 우수한 감도를 가지는 금 나노로드의 국지화된 표면 플라즈몬 공명 센서 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

종래에 생체 시료의 검출 및 분석에 이용되는 대표적인 방법으로는 전기 영동법, 형광 분석법 등이 있다. 전기 영동법의 경우에는 재현성이 낮으며, 공장 자동화에 적합하지 않은 문제점이 있다. 또한, ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)법과 같은 형광 분석법의 경우, 형광 염료 가격 자체가 매우 비싼 편이며, 모든 생체 물질들을 균일하게 표지해야 한다는 단점이 있다. 이로 인하여 표면 플라즈몬 공명법이 대안으로 부각되고 있다.

금속 박막과 유전체의 경계면을 따라 진행하는 표면 전자기파를 표면 플라즈몬이라고 한다. 표면 플라즈몬 현상은 금속 박막 표면에 존재하는 전자들의 경우, 그 표면에 대하여 수직 방향으로 집단적인 진동을 양자화한 것이다. 이러한 표면 플라즈몬이 여기되는 현상을 표면 플라즈몬 공명 현상(Surface Plasmon Resonance, SPR)이라 한다. 표면 플라즈몬 공명 현상을 이용하는 SPR법은 광학적 원리를 이용하여 표지 물질 없이(non-labeling) 분자들 간의 상호작용을 측정할 수 있음과 동시에 반응의 진행상황을 실시간으로(real-time) 검출 및 분석할 수 있다.

최근에는 금속 박막이 아닌 금속으로 이루어진 ㎚ 크기를 가지는 나노입자(dot 또는 particle), 나노막대(rod) 등의 금속 나노 구조체의 경우, 외부에서 입사되는 특정한 파장 영역대의 빛에 의해 전도대에 있는 전자들이 집단적으로 진동하게 되어 전기 쌍극자 특성을 띄게 된다. 그 결과, 해당 주파수 영역대의 빛을 강하게 산란 및 흡수를 하게 되는데, 이를 국소 표면 플라즈몬 공명(Localized Surface Plasmon Resonance, LSPR)이라고 한다.

LSPR의 산란과 흡수는 금속 나노 구조체의 외부 입사광 대한 흡광도 특성, 즉 표면 플라즈몬 흡수 밴드의 세기나 주파수가, 금속의 종류에 따라 다르고, 나노 입자가 놓여진 위치, 나노 입자의 크기, 모양, 입자 크기 분포에 따라 표면 플라즈몬 주파수가 민감하게 반응하는 특성을 가지고 있다. 주변 물질의 굴절률 변화에 크게 영향을 받으므로 이러한 성질들을 이용하여 생체분자 및 화학성분을 검출하는 바이오 센서 응용에 이용되고 있다.

전립선암은 선진국에서 발병률이 증가하고 있는 남성의 전립성에서만 발생하는 악성 종양이다. 전립선암의 경우, 항남성 호르몬 용법이나 방사선 요법이 매우 주효하기 때문에 조기 발견이 중요한 과제이다. 전립선 상피 세포로부터 분비되어 전립선암 세포에 의해서 세린 프로테아제의 일종인 당단백질인 전립선 특이 항원(PSA)이 생산된다. PSA의 경우 2가지 형태로 존재한다. 혈중에 프로테아제 억제제와 결합하는 복합체형과 비결합의 유리형 전립선암의 형태로 존재하지만, 주로 복합체의 형태를 이루며, a1-항키모트립신 복합전립선 특이 항원(PSA-ACT)가 있다.

LSPR 현상을 이용한 대표적 생체물질인 전립선암을 검출하는 경우, 항원-항체 반응을 통해 최대 파장의 변화를 이용하여 단기간 내에 간편하게 진단할 수 있다. 다만, 생체지표로서의 PSA-ACT 복합체를 감지하는 방법에서 기존에 금 나노 입자 중 스피어(Sphere)형태를 가지고 실험하였으나, 공명 피크의 모양이 뚜렷하지 못한 단점이 있었다.

따라서, 본 발명이 해결하고자 하는 첫 번째 과제는 국지화된 표면 플라즈몬 공명 현상을 이용한 생체물질을 검출할 수 있는 금 나노로드 센서를 제공하고, 특히 금 나노로드의 종횡비 및 크기를 최적화하여 우수한 검출 감도를 가지는 금 나노로드의 국지화된 표면 플라즈몬 공명 센서를 제공하는 것이다.

본 발명이 해결하고자 하는 두 번째 과제는 상기 금 나노로드의 국지화된 표면 플라즈몬 공명 센서를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명이 해결하고자 하는 세 번째 과제는 상기 금 나노로드의 국지화된 표면 플라즈몬 공명 센서를 이용한 생체물질을 검출하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 상기 첫 번째 과제를 달성하기 위하여,

금 나노로드; 및 상기 금 나노로드 표면에 형성되는 자기조립단분자층;을 포함하고, 상기 자기조립단분자층은 유기 흡착제에 의해서 형성되고, 상기 유기 흡착제는 한 쪽 말단에는 티올기, 다른 쪽 말단에는 카르복실기 또는 하이드록실기가 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 국지화된 표면 플라즈몬 공명 센서를 제공한다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 금 나노로드의 종횡비(aspect ratio)는 3-5이고, 직경은 12-16 ㎚일 수 있다.

본 발명의 다른 일 실시예에 의하면, 상기 유기 흡착제는 HS(CH₂)₁₁(OCH₂CH₂)₆OCH₂COOH와 HS(CH₂)₁₁(OCH₂CH₂)₃OH을 1:5-15의 부피비로 혼합한 용액일 수 있다.

본 발명은 상기 두 번째 과제를 달성하기 위하여,

(a) 금 핵(gold-seeds)를 수득하는 단계; (b) 상기 수득한 금 핵을 성장 용액에 담은 후, 성장시켜서 금 나노로드 용액을 수득하는 단계; (c) 상기 금 나노로드 용액을 세틸트리메틸암모늄 브로마이드(CTAB) 용액에 분산시켜서 CTAB 이중층이 형성된 금 나노로드 용액을 수득하는 단계; 및 (d) 상기 금 나노로드 표면에 유기 흡착제로 표면처리하여 자기조립 단분자층을 형성하여 표면을 개질하는 단계;를 포함하는 국지화된 표면 플라즈몬 공명 센서의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 (a) 단계는 염화금산 용액, 소듐시트레이트 용액, 소듐브로하이드라이드를 교반하여 염화금산 용액을 환원시켜서 금 핵을 수득할 수 있다.

본 발명의 다른 일 실시예에 의하면, 상기 (b) 단계는 염화금산 용액, 세틸트리메틸암모늄 브로마이드(CTAB) 용액 및 질산은 용액을 포함하는 성장용액에서 교반시켜 금 핵을 성장시켜 금 나노로드 용액을 수득할 수 있다.

본 발명의 다른 일 실시예에 의하면, 상기 질산은 용액의 농도는 3-5 mM일 수 있다.

본 발명의 다른 일 실시예에 의하면, 상기 (c) 단계는 상기 금 나노로드 용액을 원심분리한 후, 침전물에 10-50 % 농도의 글리세롤과 CTAB 용액을 넣고 다시 원심분리하여 CTAB 이중층이 형성된 금 나노로드 용액을 수득할 수 있다.

본 발명의 다른 일 실시예에 의하면, 상기 (d) 단계의 유기 흡착제는 말단이 티올기이고, 카르복실기와 하이드록실기가 결합되어 있는 올리고에틸렌글리콜 화합물일 수 있다.

본 발명은 상기 세 번째 과제를 달성하기 위하여,

(ⅰ) 표면을 유기 흡착제로 개질시켜서 자기조립단분자층을 형성한 금 나노로드를 포함하는 국지화된 표면 플라즈몬 공명 센서에 항체를 결합하여 고정화시키는 단계; (ⅱ) 상기 국지화된 표면 플라즈몬 공명 센서에 표적물질을 주입하여 흘려주는 단계; 및 (ⅲ) 암시야 현미경과 레일리-산란 스펙트로스코피을 이용하여 광산란 스펙트럼을 측정하고 최대파장 이동도를 측정하는 단계;를 포함하는 생체물질 검출방법을 제공한다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 금 나노로드의 종횡비(aspect ratio)비는 3-5이고, 직경은 12-16 ㎚일 수 있다.

본 발명의 다른 일 실시예에 의하면, 상기 (ⅰ) 단계에서 항체를 결합하여 고정화시키기 전에 N-하이드록시석신이미드(NHS)와 N-에틸-N'-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드(EDC) 혼합 용액으로 상기 금 나노로드 표면의 자기조립단분자층의 카르복실시기를 활성화시키는 단계;를 더 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 금 나노로드의 국지화된 표면 플라즈몬 공명 센서는 가장 최적화된 종횡비, 크기 등의 물성을 가지며, 표면을 유기흡착제로 개질한 금 나노로드를 이용한 것으로서, 센서 크기에 있어서 나노수준 규모로의 소형화가 가능하고, 검출 감도에 있어서는 입체장해를 감소시켜 검출한계의 현저한 향상을 유도할 수 있다. 따라서, 복잡한 혼합물의 검출, 암의 조기발견, 감염 및 신경질환 등의 조기 예방에 본 발명에 따른 금 나노로드 센서가 다양하게 활용될 수 있다.

도 1의 A는 본 발명에 따른 금 나노로드의 제조 공정과 a1-항키모트립신 복합전립선 특이 항원(PSA-ACT)과의 결합으로 PSA를 검출하는 방법을 보여주는 개략도이다.
도 1의 B는 암시야 현미경을 이용하여 용액상에 침지된 금 나노로드의 LSPR 측정을 위한 장치의 개략도이다.
도 2의 A는 본 발명의 일 실시에에 따라 합성, 분리한 금 나노로드의 TEM 이미지이고, 이에 의해서 그 크기와 종횡비를 확인할 수 있다.
도 2의 B는 본 발명의 일 실시예에 따라 합성, 분리한 금 나노로드의 UV-Vis 흡광 스펙트럼이다.
도 3의 A는 종횡비가 각각 상이한 금 나노로드에 대한 RI 변화에 따른 LSPR λ_max를 나타내는 그래프이다.
도 3의 B는 종횡비가 각각 상이한 금 나노로드 센서의 LSPR 감응도를 나타낸 그래프이다.
도 4는 전립선 특이 항원-단일클론항체(PSA mAb)에 의해서 유도된 종횡비 3.51(제조예 3) 금 나노로드에 대한 LSPR 피크 이동 결과를 나타낸 그래프이다.
하기 도 5의 A는 본 발명의 일 실시예에 따라 합성한 3.51 종횡비(제조예 3)의 금 나노로드에 생화학 분자의 흡착 이후의 레일리-산란 스펙트럼으로서, 자기조립층 결합 금 나노로드 대비, PSA mAb 결합에 대한 LSPR 최대 이동과, PSA-ACT 복합체의 경우 LSPR λ_max이동을 나타내는 스펙트럼이다.
하기 도 5의 B는 PSA-ACT 복합체 농도와 LSPR λ_max이동 간의 관계를 나타낸 컬리브레이션 그래프이다.
도 6은 LSPR λ_max이동을 통한 금 나노로드 표면에 BSA와 피브리노겐의 비특이적 결합을 확인한 그래프이다.

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 발명은 LSPR 현상을 기반으로 하는 생체물질의 검출 센서 및 그 방법에 있어서, 종래 금 나노 스피어 대신에 금 나노 로드를 이용하였다. 금 나노 로드는 막대 형태의 금 나노입자로서, 가시광선 영역에서부터 근 적외선 영역에서까지의 광 흡수 특성이 우수하고, 나노 로드 직경에 대한 길이의 비율에 따라 흡수하는 파장이 달라져서 LSPR의 스펙트럼 이동을 분명하게 확인할 수 있는 것에 착안하여 본 발명을 완성하였다.

특히, LSPR에서 생체 분석 신호를 향상시킬 수 있도록, 금 나노로드의 표면을 개질하였고, 개질시 사용하는 유기 흡착제인 올리고에틸렌글리콜 화합물에서 OEG₆와 OEG₃의 혼합비를 달리하여 최적의 조건을 실험에 의해서 확인하였고, 금 나노 로드 입자들의 직경에 대한 길이 비율을 최적화함과 동시에 센서를 나노단위로 축소시켜 입체 장애를 감소시킴으로써 센서의 검출 한계를 크게 향상시킬 수 있는 것을 실험에 의해서 확인하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명에 따른 금 나노로드의 국지화된 표면 플라즈몬 공명 센서는 금 나노로드 및 상기 금 나노로드 표면에 형성되는 자기조립단분자층을 포함하는 것을 특징으로 하고, 금 나노로드의 합성시 합성 조건을 달리하여 플라즈몬 피크를 확인한 결과, 종횡비는 약 3.5인 것이 가장 바람직하고, 직경은 12-16 ㎚인 것이 바람직하다.

금 나노로드 표면의 자기조립단분자층(self-assembled monolayer, SAM)은 나노 센서의 감도를 향상시킬 수 있으며, 특히, 올리고(에틸렌글리콜)은 단백질의 비특이적 결합과 입체장해 효과를 줄일 뿐만 아니라, 금 나노로드 표면에 형성된 SAM의 카르복실 그룹과 단백질 간의 결합을 최적화할 수 있다. 이는 에틸렌글라이콜 화합물이 말단이 -SH기이고, 카르복실기(-COOH)와 하이드록실기(-OH)가 결합되어 있기 때문이다.

또한, HS(CH₂)₁₁(OCH₂CH₂)₆OCH₂COOH와 HS(CH₂)₁₁(OCH₂CH₂)₃OH을 1:5-15의 부피비로 혼합한 용액을 사용하여 SAM을 형성하는 것이 바람직하고, 가장 바람직한 부피비는 1 : 10이다.

이하, 바람직한 실시예를 들어 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 특히, 본 발명에 따른 금 나노로드의 국지화된 표면 플라즈몬 공명 센서의 제조방법과 이를 이용한 생체물질의 검출방법에 대해서 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이에 의하여 제한되지 않는다는 것은 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 자명할 것이다.

<실시예>

(1) 본 발명에서 사용한 하이드로젠 테트라클로로우레이트()트리하이드레이트(HAuCl₄×3H₂O), 트리소디움시트레이트, 아스코르브산, 소듐브로하드라이드(NaBH₄), 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드(EDC), N-하이드로숙신이미드(NHS), 세틸트리메틸암모늄 브로마이드(CTAB), 머캡토프로필에톡시실란(MPTES), PBS buffer(phosphate buffer saline, pH 7.4), bovine serum albumin (BSA)과 인간혈장에서 분리한 피브리노겐은 Sigma-Aldrich 사에서, HS(CH₂)₁₁(OCH₂CH₂)₆OCH₂COOH(OEG₆)과 HS(CH₂)₁₁(OCH₂CH₂)₃OH(OEG₃)은 Cos Biotech사에서, 에탄올아민, 에탄올, 글리세롤은 삼전화학에서, PSA-ACT, PSA-ACT complex는 Fitzgerald Industries International사에서 각 각 구입하여 사용하였다. 또한, 역삼투압필터 방식을 사용하여 불순물을 정제한 증류수를 사용하였다.

제조예 1 내지 4. 본 발명에 따른 금 나노로드의 제조

(1) 금 핵(gold-seeds)의 제조

금 핵은 0.5 mM HAuCl₄ 2 ㎖을 0.2 M CTAB 2 ㎖에 넣은 후에 교반시켜서 합성하였고, 그 후 0.01 M NaBH₄ 240 ㎕을 넣었다. 약간 갈색을 띄는 노란색의 핵 용액이 생성되면 30 초간 섞어주었고, 이 용액을 15 분간 40-45 ℃로 교반시키면서 과량의 NaBH₄를 제거하여 금 핵(gold-seeds)을 제조하였다.

(2) 수용액에서 금 핵의 성장

1 mM HAuCl₄ 15 ㎖와 0.2 M CTAB 15 ㎖을 포함한 4 개의 삼각플라스크에 각각 30 ㎖의 성장용액을 담았다. 그 후, 4 개의 플라스크에 각기 다른 양의 4 mM AgNO₃를 첨가하였다. 질산은 농도가 금 나노로드의 가로 세로 비율을 제어한다.

상기 용액을 격렬하게 교반시킨 후 0.0788 M 아스코르브산 용액 220 ㎕을 각각의 플라스크 안에 서서히 넣었다. 아스코르브산은 성장용액의 색을 갈색-노랑에서 무색으로 서서히 줄이는 재료로 사용된다. 금 핵 용액 38 ㎕를 각각의 플라스크에 넣은 다음 20 초 동안 격렬하게 교반시켰다. 용액의 색은 점차적으로 바뀌어 15 분 이내에 최종적으로 안정화되었고, 나노로드 용액은 교반 없이 25 ℃에서 성장시켰다.

(3) 금 나노로드의 분리

금 나노로드 용액은 금 나노스피어 및 플레이트 같은 부산물을 포함하고 있어서, 품질을 향상시키기 위하여 농도의 차이를 두면서 글리세롤을 공급하였고, 금 나노로드 용액 10 ㎖을 12,000 rpm에서 15 분간 원심분리하였다. 다음 상층부를 버리고, 침전물에 50%에서 10%까지 단계적으로 10%씩 농도 차이를 둔 글리세롤 2 ㎖씩 넣어 rotary 튜브에 넣어 총 15 ㎖을 만든 후에 이 튜브를 5,000 rpm에서 15 분간 원심분리 한 다음 첫 번째 상층부의 용액을 다음 실험을 위하여 다른 튜브로 옮겼다.

그 후, 12,000 rpm에서 30 분간 원심분리 한 다음 0.1 M CTAB 용액에서 다시 분산시켰다. 분리한 다음 나노로드 용액을 12,000 rpm에서 15 분간 원심분리하여 과량의 CTAB를 제거하고, 상층액을 버렸다. 침전물에 증류수 4 ㎖을 첨가해 다시 분산시키고 9,000 rpm에서 15 분간 원심분리하여 CTAB 이중층이 결합된 금 나노로드를 분리, 제조하였다. 사용하기 전에 0.5 N NaOH로 pH를 7.0-7.2로 맞추었다.

금 나노로드 용액의 UV-vis absorption spectra는 life science UV/Vis spectrophotometer를 이용하여 얻었다. 크기 및 가로 세로 비율은 JEM3010 기기의 고해상도 전자 현미경(HR-TEM) 에 의해 얻었으며, 300 kV 전압에서 작동시켰다.

하기 도 1의 A에 나타난 바와 같이, 질산은 용액의 농도(은 이온의 농도)의 미세한 차이에 의해서 종횡비 2.18(제조예 1, NR1), 종횡비 2.57(제조예 2, NR2), 종횡비 3.51(제조예 3, NR3), 종횡비 3.90(제조예 4, NR4)를 가지는 금 나노로드를 합성, 분리하였다.

실시예 1. 올리고(에틸렌 글리콜)티올을 이용한 금 나노로드 표면의 개질

CTAB는 금 나노로드 표면에 결합하여 바이오-컨쥬게이션을 억제한다. 따라서, 금 나노로드 표면에서 CTAB 이중층을 제거하고, 금 나노로드 표면에서 단백질의 비특이적 결합을 방지하기 위하여 올리고(에틸렌 글리콜)티올을 사용하여 금 나노로드의 표면을 개질하였다.

상기 제조예 3(종횡비 3.51)에서 합성한 금 나노로드 용액 900 ㎕와 1:0 몰비 OEG₆와 OEG₃의 혼합물을 함유하는 5 mM 에탄올 용액 100 ㎕을 혼합하였다. 다음, 혼합 용액의 온도를 50 ℃로 서서히 승온시키면서 초음파처리하였고, 이후 50 ℃에서 30 분간 계속해서 초음파처리하였다. 그 후, 용액의 온도를 25 ℃로 감온시키고, 3 시간 동안 초음파처리하였다.

그리고, CTAB와 결합되지 않은 올리고(에틸렌 글리콜)티올을 분리하기 위하여 혼합물을 5,000 rpm에서 5 분간 원심분리하였다.

실시예 2 내지 5는 상기 실시예 1과 동일하고, OEG₆와 OEG₃의 혼합물의 몰비를 각각 1:1(실시예 2), 1:5(실시예 3), 1:10(실시예 4), 1:15(실시예 5)로 하여 표면을 개질하였다.

실험예 1. 금 나노로드 센서의 LSPR 감응 측정

나노센서의 LSPR 감응 측정은 하기 도 1의 B와 같이, 암시야 현미경을 이용하여 레일리(Rayleigh)-산란 스펙트럼으로부터 측정하였다. (하기 도 1) 또한, 레일리-산란 스펨트럼을 얻기 위하여, 암시야 현미경은 분광기(Microspec 2300i, Roper Scientifics)와 고감도 CCD카메라(PIXIS:400B, Princeton Instruments)와 연결시켜서 사용하였다.

먼저, 티올기가 부착된 유리 슬라이드 위에 금 나노로드를 부착하였다. 다음, 이 유리 슬라이드를 입, 출구를 포함한 폐쇄 배쓰 영상 챔버(RC-30, Warner Instruments, USA)에 넣었다. 챔버는 암시야 현미경의 시료 홀더 위에 장착하였고, 주사기 펌프와 연결하였다.(Harvard Apparatus)

LSPR 시스템 조립 후 증류수와 글리세롤이 20, 40, 60, 그리고 80% 함유된 용액들을 흐르는 셀 위에 차례로 주입하였고, 금 나노로드로부터 레일리-산란 스펙트럼이 기록되었다. Lorentzian 알고리즘은 스펙트럼에 맞게 적용하였으며, 정확한 피크를 찾기 위하여 OriginPro 7.5 소프트웨어를 사용하여 노이즈을 제거하였다.

나노입자 매질의 굴절율(refractive index, RI)변경으로 인한 나노센서의 LSPR 감도는 굴절율(RI) 변화 대 LSPR 최대 이동에 의해서 확인하였다. (단위: ㎚/RIU, RIU: 굴절률).

실험예 2. 자기조립층 표면에 고정된 PSA-ACT mAb(a1-항키모트립신 복합전립선 특이 항원-항체 복합체)에 의해 유도된 금 나노로드 센서의 LSPR 감응 측정

OEG₆와 OEG₃의 몰비를 달리하여 결합한 금 나노로드를 MPTES로 처리한 유리 기판에 고정하였고, 이를 상기 LSPR 시스템에 적용하였고, 센서 표면의 오염물질과 OEG가 결합되지 않은 금 나노로드를 제거하기 위하여 증류수로 씻어 주었다.

전립선 특이 항원-단일클론항체(PSA mAb) 결합 전에 OEG₆의 카르복실기를 NHS ester로 변환하기 위하여 0.1 M N-hydroxysuccinimide (NHS), 0.1 M N-ethyl-N'-(3-diethylaminopropyl) carbodiimide (EDC)과 혼합하였다. PSA mAb 결합은 셀위로 10 ㎍/mL 농도의 PSA mAb 1 ㎖을 주입하여 수행하였다. 각각의 화학적 결합 단계에서 셀 위로 5 분 동안 증류수를 주입하여 센서 표면을 씻어 주었으며, 검출 대상 물질의 결합에 의해 유도된 LSPR 최대 이동은 금 나노로드의 산란된 스펙트럼을 측정하여 기록하였고, LSPR 최대 이동치 Δλ_max 는 다음과 같이 계산하였다.

Δλ_max = λ_max(결합 후) - λ_max(결합 전)

실험예 3. 금 나노로드 센서를 기반으로 한 PSA 검출

본 발명에 따른 금 나노로드 센서를 이용한 PSA 검출 방법은 하기 도 1의 B에 나타내었다.

MPTES로 처리한 유리 기판 위에 고정된 금 나노로드의 자기조립 층 표면은 PSA mAb로 결합시켰고, 금 나노로드 센서의 표면에 반응되지 않은 부분을 0.2 M 에탄올아민에서 30 분간 비활성화시켰다. PBS 버퍼(PH7.4)에서 1.11-1.11×10⁹aM(10^-7-10²ng/㎖)의 농도를 갖는 PSA-ACT 복합물을 용액 내에서 1 시간 동안 anti-PSA로 기능화된 금 나노로드 표면 위에 흘려주었다. 그리고, PSA mAb와 PSA-ACT 복합물 간의 상호작용으로 인한 LSPR Δλ_max와 검출한계를 확인하기 위하여, anti-PSA로 기능화된 금 나노로드 표면위에 10 ㎍/㎖ 알부민 1 ㎖와 피브리노겐을 주입하였다. 각 결합 단계에서의 스펙트럼을 측정한 후, LSPR 최대치 이동을 상술한 바와 같이 계산하였다.

이와 같이 항체를 고정시킨 센서에 표적물질을 반응시킨 후에, 변화된 광산란을 측정한다. 금 나노로드에 다른 물질들이 결합하였을 때, 최대파장이 점점 이동하는데, 이러한 최대파장의 이동도를 측정하여 생체물질을 검출하는 것이 가능하다.

평가예 1.

본 발명에 따라 합성된 금 나노로드는 seeds-mediated 방법에 의해서 합성하였고, 금 나노로드의 비율뿐 아니라 분산성은 질산은 농도, 금 핵의 농도, 핵의 안정성, 계면활성제 농도, 계면 활성제의 종류 및 성장용액의 이온세기 등의 요인에 의해 영향을 받는다.

질산은 농도는 가로세로 비율을 제어하였고, 성장용액에 4 mM AgNO₃의 양을 조절하여 직경이 거의 일정히 유지되면서, 입자길이의 구형 말단 캡 변화를 준 금 나노로드를 합성하였다.(하기 도 2)

또한, 광학 속성과 분산성을 개선하기 위하여 농도를 달리한 글리세롤을 사용하여 정제하였다. 본 발명의 일 실시예에 따라 합성한 금 나노로드의 종횡비(aspect ratio)는 2.18, 2.57, 3.51 그리고 3.90이고, 직경은 약 12-16 ㎚임을 확인할 수 있다.(하기 도 2의 A)

또한, 하기 도 2의 B를 보면 증가된 성장용액의 은 이온의 양에 따라 플라스몬 밴드가 이동하였고, 플라스몬 피크는 794 ㎚ 정도로 상승하였으며(종횡비 3.90), 이에 따라, 계면활성제로 CTAB를 사용하고, 성장용액의 질산은 농도를 조절하여 종횡비와 플라스몬 피크를 조절할 수 있음을 알 수 있다.

평가예 2.

금 나노로드 합성과 분리 후, 금 나노로드의 광학반응을 관찰하기 위하여 말단에 티올이 부착된 유리 슬라이드에 고정하였다. 금속 나노입자의 LSPR은 사이즈, 모양, 나노입자의 상태, 금속 나노입자 유전체 매질의 굴절률에 따라 특성이 좌우되므로, 금 나노로드의 종횡비율에 따른 특성을 실험하였다. 말단부가 티올화 되어있는 유리 기판에 금 나노로드를 고정시켜 다양한 굴절지수에 따른 레일리-산란 스펙트럼을 측정하였다.

하기 도 3에 나타난 바와 같이 나노입자를 둘러싼 국부적인 매질의 굴절율(RI) 변경으로 인한 금 나노로드 LSPR 감응도는 금 나노로드의 종횡비가 3.5일 때, 최대치를 보여줬다(약 298 ㎚/RIU).

따라서, 종횡비 3-4 사이의 금 나노로드가 LSPR 센서에 최적인 것을 알 수 있으며, 이는 금 나노로드 내부 전자의 분극률과 나노입자를 둘러싼 유전체 매체의 굴절률에 따라 달라짐을 알 수 있다.

평가예 3.

나노입자 표면에 특정의 분자가 결합될 때 나노환경의 RI의 변화가 발생하고, LSPR 스펙트럼의 피크이동과 LSPR 응답이 감지된다. 더 많은 리간드 혹은 수용체가 나노입자 표면에 고정될수록, 더 많은 표적물질의 분자들이 결합하고, 그에 따라 보다 큰 LSPR 피크 이동이 있었다. 따라서, LSPR 감도는 나노입자 표면의 리간드의 밀도에 따라 좌우된다. 나노입자 표면의 많은 양의 리간드를 고정화하려면, 입체장해효과를 줄이고, 금 나노로드 표면과 단백질 상의 자기조립단분자층(SAM)의 카르복실기 사이에서 결합을 최적화하는 것이 필요하다.

하기 도 4는 전립선 특이 항원-단일클론항체(PSA mAb)에 의해서 유도된 종횡비 3.51(제조예 3) 금 나노로드에 대한 LSPR 피크 이동 결과를 나타낸 그래프이다.

하기 도 4에 나타난 바와 같이, OEG₆와 OEG₃ 사이의 몰 비율이 1:10인 경우에 최대 23.6 ㎚ 이동을 확인할 수 있었다. 이는 입체방해의 감소와 PSA mAb 결합에 대한 금 나노로드 표면 SAM층의 활성 부분이 보다 많이 노출된 것에 기인함을 알 수 있다. 1:15 몰비인 경우에는 LSPR 최대치 이동이 오히려 감소하였다. 따라서, 특정물질의 검출을 위한 금 나노로드의 표면의 개질시 최적의 조건은 1:10의 몰비로 OEG₆와 OEG₃를 혼합하여 개질하는 것임을 알 수 있다.

평가예 4.

PSA 검출을 위하여, 1.11-1.11×10⁹ aM (10^-7-10² ng/㎖)에 이르는 다양한 농도의 PSA-ACT 복합체를 센서 표면위로 흘렸다. 하기 도 5의 A에 3.51 종횡비(제조예 3)의 금 나노로드에 생화학 분자의 흡착 이후의 레일리-산란 스텍트럼을 나타내었다.

산란 스펙트럼은 두 개의 대칭 피크(봉우리)를 나타내고 있으며, 약 800 ㎚에서 강한 피크 한 개와, 약 550 ㎚에서 약한 피크 한 개이다. 첫 번째 550 ㎚ 부근의 대칭 피크는 횡파 플라스몬 공명을 나타낸 것이고, 두 번째 대칭 피크는 종파 플라스몬 공명을 나타낸 것이다. 세로 방향의 플라스몬 공명 밴드가 가로 밴드에 비하여, RI의 변화뿐만 아니라 나노입자 표면의 화학적 결합에도 더 민감하다.

하기 도 5의 A에 나타난 바와 같이, 자기조립층으로 결합한 본 발명에 따른 금 나노로드 대비, PSA mAb 10 ㎍/㎖ 결합에 대해서는 LSPR 최대 이동은 22.63 ㎚였고, 1.11×10⁸aM PSA-ACT 복합체의 경우에는 LSPR λ_max shift가 44.27 ㎚이었다.

또한, PSA-ACT 응답 곡선은 11 aM < [PSA-ACT] < 1.11×10⁹aM 농도 범위에서 측정하였다. 하기 도 5의 B는 LSPR λ_max이동 및 PSA-ACT 복합체 농도 사이의 관계를 보여주는 그래프이다.

하기 도 5의 B에서, 금 나노로드 센서의 포화 응답의 PSA-ACT 복합체 농도는 1.11×10⁸aM이고, 고정된 PSA mAb 와 PSA-ACT 복합체의 상호작용에 대한 열역학적 결합친화력 상수는 약 10¹⁴M^-1이다. 이는 종래 알려진 PSA-mAb의 결합친화상수보다 약 10 배 정도 높아진 것이다.

이는 입체 방해 효과가 감소되어 금 나노로드 표면에 고정된 항체 분자의 수가 증가되었기 때문이고, 그 결과 항원에 대한 결합친화력이 향상되었다. 또한, 이는 센서의 검출한계 때문에 검출 한계의 향상에 매우 중요한 것이다. 이에 의해서 센서의 소형화를 나노규모로 낮추고, 입체 장해를 줄이며, 크기를 최적화하고, 모양뿐 아니라 나노입자의 비율에 의해서 센서의 검출한계를 상당히 향상시킬 수 있다.

하기 도 5의 B에서, PSA-ACT 복합체 1 aM에 대하여 약 4.2 ㎚ LSPR λ_max이동을 확인할 수 있으며, 이는 금 나노로드 센서가 감지될 수 있는 최소의 농도이다.

평가예 5.

검출 한계뿐만 아니라 PSA mAb와 PAS-ACT사이의 특정 상호작용으로부터의 LSPR λ_max이동을 확인하기 위하여, 금 나노로드 센서 포화감응 농도보다 큰 농도에서의 BSA, 피브리노겐과 같은 혈청 내의 일반적인 단백질을 포함하는 용액을 센서 표면의 리간드에 결합시켜서 비특이적 단백질의 흡광도 실험을 수행하였다.

anti-PSA로 기능화된 금 나노로드 센서의 표면은 BSA, 피브리노겐 10⁴ng/㎖에서 1.9-2.4 ㎚의 작은 LSPR λ_max이동을 나타내었다. 결합된 PSA mAb와 PSA-ACT간의 결합에 의한 LSPR λ_max이동은 비교시 10^-7-10²ng/㎖ 농도 범위에서 측정되었다.

따라서, 본 발명에 따른 금 나노로드 센서의 검출 한계는 1 aM 이하임을 알 수 있다.(약 4.2 ㎚의 LSPR λ_max이동) 이는 1 ㎖을 사용할 경우에 약 600 분자에 해당하는 것이므로, 검출 플랫폼의 감도가 매우 우수함을 알 수 있다.

이와 같이, 본 발명에 따른 금 나노로드 센서를 이용한 검출방법은 저렴한 비용, 그리고, 항원-항체 인식 및 LSPR λ_max이동을 기반으로 하고, 레일리-산란 분광법을 사용하여 아토몰(attomolar) 수준에서도 검출이 가능하다. 특히, 3.5 종횡비의 금 나노로드와 1:10 몰 비율의 SAM 표면은 단일 나노분자 단계에서 LSPR 감지를 위한 최적의 조건임을 실험을 통하여 확인하였다. 또한, 1 aM (약 6×10⁵분자수)에서, 약 4.2 ㎚의 LSPR λ_max이동을 확인하였다.

본 발명에 따른 금 나노로드 및 이를 이용한 센서에 의해서, 나노규모 수준으로의 센서 소형화를 이룰 수 있고, 입체 방해의 감소, 크기 최적화 및 검출한계의 향상을 유도하여 복잡한 혼합물의 검출, 암의 조기발견, 감염 및 신경질환 등의 조기 예방에 본 발명에 따른 금 나노로드 센서가 다양하게 활용될 수 있다는 것을 보여준다.

Claims

금 나노로드; 및 상기 금 나노로드 표면에 형성되는 자기조립단분자층;을 포함하고,
상기 자기조립단분자층은 유기 흡착제에 의해서 형성되고, 상기 유기 흡착제는 한 쪽 말단에는 티올기, 다른 쪽 말단에는 카르복실기 또는 하이드록실기가 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 국지화된 표면 플라즈몬 공명 센서.
제 1 항에 있어서,
상기 금 나노로드의 종횡비(aspect ratio)는 3-5이고, 직경은 12-16 ㎚인 것을 특징으로 하는 국지화된 표면 플라즈몬 공명 센서.
제 1 항에 있어서,
상기 유기 흡착제는 HS(CH₂)₁₁(OCH₂CH₂)₆OCH₂COOH와 HS(CH₂)₁₁(OCH₂CH₂)₃OH을 1:5-15의 부피비로 혼합한 용액인 것을 특징으로 하는 국지화된 표면 플라즈몬 공명 센서.
(a) 금 핵(gold-seeds)를 수득하는 단계;
(b) 상기 수득한 금 핵을 성장 용액에 담은 후, 성장시켜서 금 나노로드 용액을 수득하는 단계;
(c) 상기 금 나노로드 용액을 세틸트리메틸암모늄 브로마이드(CTAB) 용액에 분산시켜서 CTAB 이중층이 형성된 금 나노로드 용액을 수득하는 단계; 및
(d) 상기 금 나노로드 표면에 유기 흡착제로 표면처리하여 자기조립 단분자층을 형성하여 표면을 개질하는 단계;를 포함하는 국지화된 표면 플라즈몬 공명 센서의 제조방법.
제 4 항에 있어서,
상기 (a) 단계는 염화금산 용액, 소듐시트레이트 용액, 소듐브로하이드라이드를 교반하여 염화금산 용액을 환원시켜서 금 핵을 수득하는 것을 특징으로 하는 국지화된 표면 플라즈몬 공명 센서의 제조방법.
제 4 항에 있어서,
상기 (b) 단계는 염화금산 용액, 세틸트리메틸암모늄 브로마이드(CTAB) 용액 및 질산은 용액을 포함하는 성장용액에서 교반시켜 금 핵을 성장시켜 금 나노로드 용액을 수득하는 것을 특징으로 하는 국지화된 표면 플라즈몬 공명 센서의 제조방법.
제 6 항에 있어서,
상기 질산은 용액의 농도는 3-5 mM인 것을 특징으로 하는 국지화된 표면 플라즈몬 공명 센서의 제조방법.
제 4 항에 있어서,
상기 (c) 단계는 상기 금 나노로드 용액을 원심분리한 후, 침전물에 10-50 % 농도의 글리세롤과 CTAB 용액을 넣고 다시 원심분리하여 CTAB 이중층이 형성된 금 나노로드 용액을 수득하는 것을 특징으로 하는 국지화된 표면 플라즈몬 공명 센서의 제조방법.
제 4 항에 있어서,
상기 (d) 단계의 유기 흡착제는 말단이 티올기이고, 카르복실기와 하이드록실기가 결합되어 있는 올리고에틸렌글리콜 화합물인 것을 특징으로 하는 국지화된 표면 플라즈몬 공명 센서의 제조방법.
제 9 항에 있어서,
상기 유기 흡착제는 HS(CH₂)₁₁(OCH₂CH₂)₆OCH₂COOH와 HS(CH₂)₁₁(OCH₂CH₂)₃OH을 1:5-15의 부피비로 혼합한 용액인 것을 특징으로 하는 국지화된 표면 플라즈몬 공명 센서의 제조방법.
(ⅰ) 표면을 유기 흡착제로 개질시켜서 자기조립단분자층을 형성한 금 나노로드를 포함하는 국지화된 표면 플라즈몬 공명 센서에 항체를 결합하여 고정화시키는 단계;
(ⅱ) 상기 국지화된 표면 플라즈몬 공명 센서에 표적물질을 주입하여 흘려주는 단계; 및
(ⅲ) 암시야 현미경과 레일리-산란 스펙트로스코피을 이용하여 광산란 스펙트럼을 측정하고 최대파장 이동도를 측정하는 단계;를 포함하는 생체물질 검출방법.
제 11 항에 있어서,
상기 금 나노로드의 종횡비(aspect ratio)비는 3-5이고, 직경은 12-16 ㎚인 것을 특징으로 하는 생체물질 검출방법.
제 11 항에 있어서,
상기 (ⅰ) 단계에서 항체를 결합하여 고정화시키기 전에 N-하이드록시석신이미드(NHS)와 N-에틸-N'-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드(EDC) 혼합 용액으로 상기 금 나노로드 표면의 자기조립단분자층의 카르복실시기를 활성화시키는 단계;를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 생체물질 검출방법.
제 11 항에 있어서,
상기 유기 흡착제는 HS(CH₂)₁₁(OCH₂CH₂)₆OCH₂COOH와 HS(CH₂)₁₁(OCH₂CH₂)₃OH을 1:5-15의 부피비로 혼합한 용액인 것을 특징으로 하는 생체물질 검출방법.