KR20180069536A

KR20180069536A - 바이오센서, 이의 제조방법, 이를 포함하는 표적물질 검출용 키트 및 이를 이용한 표적물질 검출방법

Info

Publication number: KR20180069536A
Application number: KR1020160171813A
Authority: KR
Inventors: 김동환; 롱하구오
Original assignee: 성균관대학교산학협력단; 주식회사 티앤엘
Priority date: 2016-12-15
Filing date: 2016-12-15
Publication date: 2018-06-25
Also published as: KR101888769B1

Abstract

본 발명은 바이오센서에 관한 것으로, 보다 상세하게는 암시야 현미경에서 전혀 관찰되지 않는, 백그라운드 신호를 완전히 배제한 금 나노입자로 구성된 바이오센서, 이의 제조방법, 이를 이용한 DNA 검출용 키트, 이를 이용한 DNA 검출방법에 관한 것이다.

Description

바이오센서, 이의 제조방법, 이를 포함하는 표적물질 검출용 키트 및 이를 이용한 표적물질 검출방법{biosensor, method for manufacturing thereof, kit for target molecule sensing comprising thereof and method for detecting target molecule using thereof}

본 발명은 바이오센서에 관한 것으로, 보다 상세하게는 암시야 현미경에서 육안 또는 산란신호 세기가 전혀 관찰되지 않도록(백그라운드 신호 제로) 제조됨으로써 매우 우수한 검출한계를 갖는 바이오센서, 이의 제조방법, 이를 이용한 표적물질 검출용 키트, 이를 이용한 표적물질 검출방법에 관한 것이다.

금속 나노입자를 이용하여 생체 물질을 검출하는 방법에 대해 현재까지 많은 연구가 이루어져 왔고, 이러한 연구를 기반으로 하여 다양한 플랫폼의 바이오센서가 개발되어 왔다.

특히 금 나노입자는 대표적인 플라즈모닉 나노입자(plasmonic nanoparticles)로, 국소 표면 플라즈몬 공명(localized surface plasmon resonance; LSPR) 현상에 의해 물리적, 화학적 및 광학적 특성을 갖는다.

이러한 플라즈모닉 나노입자의 크기, 모양, 크기분포 등에 따라 달라지는 입자의 LSPR 세기 특성을 이용하여, 생체분자 또는 화학물질을 검출하는 다양한 바이오센서들이 고안되고 있다. 종래의 표면 플라즈몬 공명(SPR) 현상을 이용한 SPR 센서와 달리 LSPR 현상을 이용한 센서는 복잡한 광학적 장비 없이 단순 투과분광학적 방법에 의해 측정이 가능하다는 큰 장점을 갖고 있다.

상술한 LSPR 현상을 이용한 바이오센서로, 금 나노입자를 라벨(label)로 활용한 기술이 공지된 바 있다. 이는 상기 표적물질을 금 나노입자와 기판 사이를 연결하는 연결체(linker)로 응용하고 있다.

구체적으로 상기 표적물질의 존재로 인해, 상기 금 나노입자가 기판에 고정되고, 성장(enlargement)하게 되어, 상기 금 나노입자로부터의 신호를 증폭(amplification)시킨다. 이러한 표적물질에 따른 신호 변화를 통해, 표적물질을 정량적 혹은 정성적으로 검출할 수 있는 것이다. 이를 스캐노메트릭 DNA(scanometric DNA) 검출법이라고 하며, 형광 물질을 달아 어레이를 형성하는 기술들보다도 뛰어난 감도, 높은 재현성과 같은 장점을 갖는다.

스캐노메트릭 DNA의 검출과정은 기판 상에 특정 단일 DNA 시퀀스를 심은 후, 또 다른 단일 DNA 시퀀스로 개질된 금 나노입자와 상기 두 구성의 DNA 시퀀스들과 결합할 수 있는 표적물질을 반응시키면 하이브리디제이션(hybridization)이 일어나고, 이로 인해 표적물질을 검출하는 것으로, 검출과정이 빠르고, 특정 표식자(labeling)가 요구되지 않는 등의 다양한 장점들이 존재한다. 그러나 스캐노메트릭 DNA 검출법은 검출감도가 일정 범위로 제한된다는 큰 문제점이 존재한다.

이외에도 플라즈모닉 나노입자의 크기 변화에 따른 신호 증폭 효과를 이용하는 센서 기술들이 있지만, 종래 금속 나노입자의 성장을 기반으로 하는 모든 검출방법들은 금속 나노입자들의 거대한 앙상블(ensemble)을 사용하여 수행하고 있기 때문에, 입자 크기가 불균일할 뿐만 아니라, 크기 조절이 가능하지 않다. 따라서 백그라운드 신호(background signal; 잡음)가 발생하기 때문에, 바이오센서로서 기능하기 어렵다.

특허문헌 1. 대한민국 공개특허 제10-2009-0038251호

본 발명은 상기와 같은 문제점을 감안하여 안출된 것으로, 본 발명의 목적은 백그라운드 신호를 완전히 배제한 새로운 구조의 바이오센서 및 이의 제조방법을 제공하는 것이다.

또한 본 발명의 또 다른 목적은 상기 바이오센서를 포함하는 표적물질 검출용 키트를 제공하는 것이다.

또한 본 발명의 또 다른 목적은 상기 키트를 이용한 표적물질 검출을 위한 방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 상기 목적을 이루기 위하여, 암시야 현미경에서 산란신호 세기가 금 나노입자가 결합된 기판; 및 표적물질에 대해 상보적인 염기서열을 갖는 DNA, RNA 및 올리고뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 수용체;를 포함하고, 상기 수용체는 상기 금 나노입자 표면에 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 바이오센서를 제공한다.

상기 기판은 유리재질의 플로우셀(flow cell)일 수 있다.

상기 금 나노입자의 평균 직경은 10 내지 30 ㎚일 수 있다.

상기 금 나노입자 간 간격은 1.5 내지 20 ㎛일 수 있다.

상기 수용체의 말단 중 금 나노입자와 인접한 말단에 사이토민(C), 티민(T) 및 우라실(U) 중에서 선택되는 어느 하나의 염기가 연속으로 5 내지 15개 나열된 염기서열을 포함하는 것일 수 있다.

상기 기판은 표면활성기를 포함하는 것일 수 있다.

상기 표면활성기는 활성수소, 하이드록시기, 카르복실기, 술폰산기, 인산기, 아민기, 암모늄기 및 피리딘기로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 작용기일 수 있다.

상기 바이오센서를 암시야 현미경을 이용하여 산란신호 스펙트럼을 측정하고, 이로부터 수득된 500 내지 900 ㎚ 영역범위에서 산란신호 세기가 거의 제로에 가까운 것일 수 있다.

본 발명은 상기 다른 목적을 이루기 위하여, ｉ) 1 내지 20 ㎚ 평균직경을 갖는 금 나노입자 시드를 준비하는 단계; ⅱ) 상기 금 나노입자 시드를 금 전구체 용액과 혼합하여 10 내지 30 ㎚ 평균직경의 금 나노입자로 성장시키는 단계; ⅲ) 표면 처리된 기판 상에 상기 성장한 금 나노입자를 주입하여, 상기 기판 상에 상기 금 나노입자를 고정하는 단계; 및 ⅳ) 상기 고정된 금 나노입자의 표면에 수용체를 결합시키는 단계;를 포함하는 바이오센서의 제조방법을 제공한다.

ⅴ) 상기 ⅳ) 단계에서 제조된 바이오센서에 탈이온수 또는 포스페이트 완충 식염수를 적어도 1회 이상 주입하여 세척하는 단계;를 더 포함할 수 있다.

본 발명은 상기 또 다른 목적을 이루기 위하여, 기판; 상기 기판 표면에 증착된 금 나노입자; 상기 금 나노입자 표면에 결합된 수용체; 상기 수용체에 결합된 표적물질; 및 상기 표적물질과 결합된 반응물질;을 포함하고, 상기 반응물질은 글루코스 산화효소가 라벨링된 것을 특징으로 하는 샌드위치타입의 바이오센서를 제공한다.

상기 수용체는 상기 표적물질과 상보적인 염기서열을 갖고, 상기 반응물질은 상기 수용체와 상보적인 표적물질의 염기서열 외에 나머지 염기서열과 상보적인 염기서열을 갖는 것일 수 있다.

상기 표적물질은 하기 서열번호 1 내지 11 중에서 표시되는 어느 하나의 염기서열일 수 있다.

본 발명은 상기 또 다른 목적을 이루기 위하여, 기판, 상기 기판 표면에 증착된 금 나노입자, 및 상기 금 나노입자 표면에 결합된 수용체를 포함하는 바이오센서; 글루코스 산화효소로 라벨링된 반응물질을 포함하는 제1 용액; 및 은 전구체와 글루코오스를 포함하는 제2 용액;을 포함하는 표적물질 검출용 키트를 제공한다.

본 발명은 상기 또 다른 목적을 이루기 위하여, ⅰ) 제18항에 따른 바이오센서를 표적물질을 포함하는 시료와 접촉시키는 단계; ⅱ) 상기 ⅰ) 단계를 통해 표적물질이 결합된 바이오센서에 제18항에 따른 제1 용액을 주입하여 샌드위치타입의 바이오센서를 제조하는 단계; 및 ⅲ) 상기 ⅱ) 단계를 통해 제조된 샌드위치타입의 바이오센서에 제2 용액을 주입하고 일정 반응시간 후에 암시야 현미경으로 산란신호 세기를 측정하여 표적물질을 검출하는 단계;를 포함하는 표적물질의 검출방법을 제공한다.

상기 ⅲ) 단계에서 반응시간이 5 내지 20 분인 경우에는 표적물질 농도의 로그값에 산란 세기가 선형으로 증가하는 표적물질의 농도가 1.0 × 10^-16 M 내지 1.0 × 10^-13 M이고, 상기 반응시간이 50 내지 70 분인 경우에는 표적물질 농도의 로그값에 산란 세기가 선형으로 증가하는 표적물질의 농도가 1.0 × 10^-18 M 내지 1.0 × 10^-14 M이며, 상기 반응시간이 140 내지 160 분인 경우에는 표적물질 농도의 로그값에 산란 세기가 선형으로 증가하는 표적물질의 농도가 5.0 × 10^-21 M 내지 5.0 × 10^-17 M일 수 있다.

즉 다시 말해 상기 표적물질의 검출방법은 ⅲ) 단계에서 반응시간(cut-off time)이 5 내지 20분 경우 검출한계가 1.0 × 10^-16 M 내지 1.0 × 10^-13 M이고, 상기 반응시간(cut-off time)이 50 내지 70 분인 경우에는 검출한계가 1.0 × 10^-18 M 내지 1.0 × 10^-14 M이며, 상기 반응시간(cut-off time)이 140 내지 160 분인 경우에는 검출한계가 5.0 × 10^-21 M 내지 5.0 × 10^-17 M일 수 있다.

본 발명에 따른 바이오센서와 이를 포함하는 표적물질 검출용 키트는 LSPR 광특성의 변화를 관측하는데 있어, 기타 복잡한 광학계를 사용하지 않으며 표적물질에 특별한 처리를 요하지 않는다.

또한 본 발명에 따른 바이오센서와 이를 포함하는 표적물질 검출용 키트는 단순히 바이오센서에 시약들을 순차적으로 주입하는 단순한 방법을 통해 시료로부터 표적물질을 정밀하고, 정확하게 검출할 수 있다.

본 발명에 따른 바이오센서와 이를 포함하는 표적물질 검출용 키트는 뛰어난 검출한계를 가지면서, 빠르고 용이한 분석을 가능하게 하며, 높은 재현성을 갖는다.

본 발명에 따른 바이오센서와 이를 포함하는 표적물질 검출용 키트는 금 나노입자와 수용체 및 표적물질과 반응물질 간에 안정한 결합을 형성할 수 있을 뿐만 아니라, 상기 표적물질(DNA, RNA 및 올리고뉴클레오티드)의 구조적 안정성을 유지할 수 있는 높은 염 농도의 조건에서도 안정한 결합상태를 유지할 수 있다.

본 발명에 따른 바이오센서와 이를 포함하는 표적물질 검출용 키트는 표적물질 특히, 표적하는 DNA, RNA 및 올리고뉴클레오티드와 가역적 상보적 결합을 이용함으로써 검출을 효율적으로 수행할 수 있으며, 생체 물질의 검출이 중요한 의학 및 약학 등의 분야에 다양하게 이용될 수 있다.

또한 본 발명은 암시야 현미경으로 상기 금 나노입자의 single nanoparticle의 성장을 관찰할 수 있기 때문에, 종래의 나노입자들의 앙상블을 이용하는 방법보다 signal-to-noise를 현저히 높일 수 있는 것을 장점으로 한다.

도 1a는 본 발명에 따른 바이오센서의 구조를 나타낸 단면도이다.
도 1b는 본 발명에 따른 플로우셀의 구조를 나타낸 단면도이다.
도 1c는 본 발명에 따른 샌드위치타입의 바이오센서의 구조를 나타낸 단면도이다.
도 2는 본 발명에 따른 키트를 이용하여 표적물질을 검출하는 과정을 개략적으로 나타낸 도면이다.
도 3은 제조예 1로부터 제조된 25 ㎚ 평균직경의 금 나노입자의 SEM 이미지이다.
도 4는 1.0×10^-14 M 농도의 표적물질에 있어서, 반응시간에 따라 촬영한 실시예 3의 키트의 암시야 이미지이다.
도 5는 1.0×10^-14 M 농도의 표적물질에 있어서, 반응시간에 따라 촬영한 실시예 3의 키트의 대면적 암시야 이미지(large-area darkfield image)이다.
도 6은 1.0×10^-14 M 농도의 표적물질에 있어서, 반응시간에 따라 촬영한 실시예 3의 키트의 SEM 이미지이다.
도 7은 1.0×10^-14 M 농도의 표적물질에 있어서, 반응시간에 따라 촬영한 실시예 3의 키트의 산란신호 세기 스펙트럼이다.
도 8은 1.0×10^-14 M 농도의 표적물질에 있어서, 제2 용액을 첨가한 후 2 시간의 반응시간 후에 측정한 실시예 3의 키트의 산란신호 세기 스펙트럼이다.
도 9는 1.0×10^-14 M 농도의 표적물질에 있어서, 반응시간(0 min(a), 60 min(b), 150 min(c))에 따라 촬영한 실시예 3의 키트의 암시야 이미지이다.
도 10의 스펙트럼은 도 9의 삼각형 부분을 나타낸 것으로, 도 10의 흑색선은 나노입자가 1 개만 존재할 때의 커브이고, 도 10에서 청색선은 두 나노입자가 가까이 있지만 완전히 가까이 있는게 아니라 상대적으로 거리가 있는 경우에 대한 커브이며, 도 10에서 적색선은 두 나노입자가 매우 가까이 있을 때에 대한 커브이다. 상기 표적물질의 농도는 1.0 × 10^-14 M이고, 반응시간은 60 분이였다.
도 11은 동일한 반응시간에서 표적물질의 농도에 따른 실시예 3 키트 내에 금 나노입자의 산란신호 세기 스펙트럼이다.
도 12는 표적물질 농도에 따른 본 발명의 실시예 3으로부터 제조된 키트의 '가시화'되는 반응시간을 나타낸 그래프이다.
도 13은 10 분(a), 60 분(b) 및 150 분(c)으로 반응시간을 고정하였을 때, 표적물질 농도의 로그값에 따라 산란 세기가 선형으로 증가하는 농도에서의 산란신호 세기 스펙트럼이다. 구체적으로 1.0 × 10^-16 내지 1.0 × 10^-13 M(a), 1.0 × 10^-18 M 내지 1.0 × 10^-14 M(b) 및 5.0 × 10^-21 내지 5.0 × 10^-17 M(c)이다.
도 14는 돌연변이형 표적물질과 야생형 표적물질과 대조군 각각을 표적물질로 하였을 때, 실시예 3 키트에서의 산란신호 세기 스펙트럼이다.
도 15는 돌연변이형 표적물질과 야생형 표적물질과 대조군 각각을 표적물질로 하였을 때, 실시예 3 키트를 암시야 현미경으로 촬영한 사진이다.

이하에서, 본 발명의 여러 측면 및 다양한 구현예에 대해 더욱 구체적으로 살펴보도록 한다.

올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)의 특이적 시퀀스(sequences)를 고민감도로 검출하는 방법은 임상진단, 환경보호, 식품안전 및 반테러(anti-terrorism) 등 다양한 응용에 있어서 필수적이다. 이에 광학, 전기화학, 크로마토그래피 등의 기술을 기반으로 한 빠르고 민감한 DNA 검출법들이 개발되었는데, 이들은 출력 신호를 표적물질의 농도에 따라서 증가시키는데 취중하고 있을 뿐, 백그라운드 신호에 대해서는 전혀 고려하고 있지 않다.

여기서, 백그라운드 신호(background signal)란 백그라운드(background)라고 불리는 약한 신호로, 타겟이 존재하지 않는 상황에서도 관측되는 신호 즉, 잡음(noise)을 의미한다. 이러한 백그라운드 신호는 바이오센서에 있어서 검출감도 한계를 설정하는데 매우 주요한 요소이다.

상기 다양한 종래 DNA 검출방법에서는 전혀 인지하지 않던 문제점을 해결하기 위해, 백그라운드 신호가 없는 새로운 DNA 검출을 위한 바이오센서와 이를 포함하는 키트 등을 개발하고자 노력한 결과 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

본 발명의 일 측면은 암시야 현미경에서 비가시적인 금 나노입자가 결합된 기판; 및 표적물질에 대해 상보적인 염기서열을 갖는 DNA, RNA 및 올리고뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 수용체;를 포함하고, 상기 수용체는 상기 금 나노입자 표면에 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 바이오센서에 관한 것으로 이의 구조를 도 1a에 구체적으로 나타내었다.

도 1a는 본 발명의 일 구현예에 따른 바이오센서의 구조를 개략적으로 나타낸 도면으로, 이를 참조하면 본 발명의 일 측면은 기판(110); 상기 기판(110) 표면에 결합된, 암시야 현미경에서 비가시적인금 나노입자(120); 및 상기 금 나노입자(120) 표면에 결합되어 있는 수용체(130);를 포함하는 바이오센서(100)에 관한 것이다.

상기 기판(110)은 상기 바이오센서를 표적물질 검출에 이용할 경우, 산란신호 세기를 측정이 가장 용이한 유리 기판(110)인 것이 바람직하다.

상기 기판(110)은 표면에 금 나노입자(120)를 고정화하는데, 이들은 서로 정전기적 상호작용 또는 화학적 결합을 통해 더욱 안정적으로 결합하도록 할 수 있다. 이때 상기 정전기적 상호작용 또는 화학적 결합을 형성하도록 하는 수단은 특별히 제한되지 않으나, 바람직하게는 상기 기판(110) 표면에 표면활성기를 도입할 수 있다. 이를 위해 상기 기판(110)을 표면 처리할 수 있다.

상기 표면활성기는 활성을 갖는 작용기로, 상기 기판의 표면과 상기 금 나노입자를 결합할 수 있는 것이라면 특별히 제한되지 않으나, 바람직하게는 활성수소, 하이드록시기, 카르복실기, 술폰산기, 인산기, 아민기, 암모늄기 및 피리딘기로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 작용기일 수 있다.

또한, 상기 기판(110)은 흐르는 용액을 자주 사용하는 본 발명의 특성을 고려하여 주입과 세척을 용이하게 할 수 있으면서도, 측정에 번거로움이 있는 기판 형태를 대체하기 위해, 플로우셀(110a) 구조일 수 있다.

상기 플로우셀(110a)의 구조의 일예를 도 1b에 나타내었다. 상기 플로우셀(110a)은 흐름계 방식의 구조로, 측정이나 용액의 주입에 번거로움이 있는 기판(110) 형태보다 우수한 재현성을 가지며, 신속한 용액 주입이 가능하여 빠른 정량 분석을 수행할 수 있다.

도 1b를 참조하면 상기 플로우셀(110a)은 몸체(111)가 있고, 상기 플로우셀 몸체(111)의 일측으로부터 타측이 관통되게 형성된 하나의 유로(112)를 가지며, 상기 유로(112)는 유입구(113)와 유출구(114)가 구비된 것을 특징으로 한다. 상기 유로(112)의 평균 직경은 특별히 이에 제한되지 않는다.

상기 플로우셀(110a)을 기판(110)으로 이용할 경우, 상기 금 나노입자(120)는 상기 플로우셀(110a)의 안쪽 벽 표면에 고정화될 수 있다.

상기 금 나노입자(120)는 10 내지 30 ㎚ 평균직경을 갖는 것이 바람직하고, 가장 바람직하기로는 25 ㎚이다.

또한 상기 금 나노입자(120)의 평균 직경은 10 내지 30 ㎚인 것이 바람직하지만, 가장 바람직하기로는 25 ㎚일 수 있는데, 상기 금 나노입자(120)의 평균 직경이 상기 범위를 만족할 경우에만, 상기 금 나노입자(120)가 암시야 현미경에서 산란신호 세기 5 a.u 미만으로, 백그라운 신호를 배제할 수 있다. 만일 상기 금 나노입자(120)의 평균 직경이 10 ㎚ 미만일 경우에는 타겟에 의해 금 나노입자가 성장했을 때 바로 관측되기 어렵고, 30㎚를 초과할 경우에는 암시야 현미경에서 산란신호 세기 5 a.u를 초과해 버리므로 백그라운 신호가 발생하게 되어, 센서의 검출한계가 현저히 높아져버리는 문제가 발생한다.

상기 금 나노입자(120)는 구형인 것이 가장 바람직하다.

상기 금 나노입자(120)는 일정 간격으로 서로 이격되어 있고, 상기 금 나노입자(120) 간의 간격은 평균 1.5 내지 20 ㎛인 것이 바람직하다.

상기 수용체(130)는 표적물질에 대해 상보적인 염기서열을 갖는 DNA, RNA 및 올리고뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.

또한 상기 수용체(130)와 상기 금 나노입자(120)는 티올기에 의해 결합되어 있는데, 상기 티올기는 상기 수용체(130) 말단에 위치하고 있는 것일 수 있다. 이러한 상기 수용체(130)를 상기 금 나노입자(120)에 고정하는 방법에 관해서는 공지의 기술을 참조할 수 있다.

또한 상기 수용체(130)는 수용체(130)의 말단 중 금 나노입자와 인접한 말단에 사이토민(C), 티민(T) 및 우라실(U) 중에서 선택되는 어느 하나의 염기가 연속으로 5 내지 15개 나열된 염기서열을 포함하는 것을 사용하는 것이 바람직한데, 왜냐하면 상기 염기서열을 갖는 수용체(130)를 이용할 경우, 표적물질(DNA, RNA 및 올리고뉴클레오티드)의 구조를 안정적으로 유지할 수 있는 높은 염 농도 조건에, 상기 바이오센서(100)가 노출될 경우 다양한 이온으로부터 상기 금 나노입자(120)의 표면을 안정한 상태로 장기간 유지시킬 수 있기 때문이다.

상기 수용체(130)의 말단 중 금 나노입자와 인접한 말단에 사이토민(C), 티민(T) 및 우라실(U) 중에서 선택되는 어느 하나의 염기가 연속으로 5 내지 15개 나열된 염기서열을 포함하고 있어, 상기 염기서열의 구조적 안정성을 유지할 수 있는 높은 염 농도 조건에서도 금 나노입자의 상태를 안정적으로 유지할 수 있도록 한다.

상술한 과정을 통해 제조된 바이오센서(100)는 금 나노입자(120)의 크기를 제어하고, 기판(110)과 금 나노입자(120), 금 나노입자(120)와 수용체(130) 간에 강한 결합을 형성하고, 이를 안정적으로 유지할 수 있도록 상기 수용체(130)의 염기서열을 제어하였으며, 금 나노입자(120)와 금 나노입자(120)의 간격을 확보함으로써, 암시야 현미경에서 측정된 산란신호 세기의 백그라운드 신호(잡음; background signa)를 거의 제로에 가깝게 만들어, 표적물질 검출에 사용할 경우 백그라운드 신호를 완전히 배제시킬 수 있다는 장점을 갖는다.

상기와 같은 구조를 갖는 바이오센서는 특히, 암시야 현미경에서 육안으로 전혀 관찰되지 않을 뿐만 아니라, 이를 이용하여 측정된 산란신호 스펙트럼에서, 500 내지 900 ㎚ 파장영역에서 산란신호 세기가 거의 제로에 가깝게 측정되며, 백그라운드 신호가 전혀 발생하지 않는다.

본 발명의 다른 측면은 하기 단계를 포함하는 상기 바이오센서의 제조방법에 관한 것이다.

ｉ) 1 내지 20 ㎚ 평균직경을 갖는 금 나노입자 시드를 준비하는 단계;

ⅱ) 상기 금 나노입자 시드를 금 전구체 용액과 혼합하여 10 내지 30 ㎚ 평균직경의 금 나노입자로 성장시키는 단계;

ⅲ) 표면 처리된 기판 상에 상기 성장한 금 나노입자를 주입하여, 상기 기판 상에 상기 금 나노입자를 고정하는 단계; 및

ⅳ) 상기 고정된 금 나노입자의 표면에 수용체를 결합시키는 단계;를 포함한다.

이하, 본 발명의 바이오센서 제조방법에 대해 단계별로 자세히 설명하고자 한다.

우선, ｉ) 1 내지 20 ㎚ 평균직경을 갖는 금 나노입자 시드를 준비하는데, 상기 1 내지 20 ㎚ 평균직경을 갖는 금 나노입자 시드를 균일하게 제조할 수 있는 방법이면 특별히 이에 제한되지 않는다.

상기 금 나노입자 시드(seed)란 평균직경을 10 내지 30 ㎚의 균일한 금 나노입자를 만들기 위한 종자(seed)가 되는 금 입자를 의미하는 것이다. 만일 상기 금 나노입자 시드의 평균직경이 1 내지 20 ㎚를 초과할 경우 30 ㎚ 평균직경 이상의 금 나노입자가 제조되는 문제가 있다.

다음 ⅱ) 상기 금 나노입자 시드를 금 전구체 용액과 혼합하여 10 내지 30 ㎚ 평균직경의 금 나노입자로 성장시키는 것을 특징으로 한다.

상기 금 전구체 용액은 HAuCl₄, HAuBr₄, NaAuCl₄, AuCl₃ㅇ3H₂O 및 NaAuCl₄ㅇ2H₂O로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 금 전구체를 포함하는 것일 수 있다.

또한 상기 성장된 금 나노입자의 평균 직경은 10 내지 30 ㎚인 것이 바람직하지만, 가장 바람직하기로는 25 ㎚일 수 있는데, 상기 금 나노입자의 평균 직경이 상기 범위를 만족할 경우에만, 상기 금 나노입자가 암시야 현미경에서 산란신호 세기 5 a.u 미만으로, 백그라운 신호를 배제할 수 있다. 만일 상기 금 나노입자(120)의 평균 직경이 10 ㎚ 미만일 경우에는 타겟에 의해 금 나노입자가 성장했을 때 바로 관측되기 어렵고, 30㎚를 초과할 경우에는 암시야 현미경에서 산란신호 세기 가시화되어 버리므로 백그라운 신호가 발생하게 되어, 센서의 검출한계가 현저히 높아져버리는 문제가 발생한다.

다음 ⅲ) 기판 상에 상기 성장한 금 나노입자를 주입하여, 상기 기판 상에 상기 금 나노입자를 고정한다.

상기 기판은 이후 변화된 산란신호(scattering)를 용이하게 측정하기 위하여 유리 기판인 것이 가장 바람직하며, 상기 기판은 표면에 금 나노입자를 고정화하기 위해 표면활성기를 포함하도록 표면처리한 것일 수 있다.

상기 기판은 표면에 금 나노입자를 고정화하는데, 이는 정전기적 상호작용 또는 화학적 결합을 통해 더욱 안정적으로 결합하도록 할 수 있다. 이때 상기 정전기적 상호작용 또는 화학적 결합을 형성하도록 하는 수단을 특별히 제한되지 않으나, 바람직하게는 상기 기판 표면에 표면활성기를 도입할 수 있다. 이를 위해 상기 기판 표면을 표면처리할 수 있다.

상기 기판 표면에 상기 표면활성기를 도입하기 위한 표면처리는 일반적인 화학적ㅇ물리적 처리라면 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 플라즈마 처리, 오존 처리, 알칼리 또는 산 용액의 처리 또는 초음파 처리 등을 통해 상기 기판을 표면처리할 수 있다.

또한, 상기 기판은 흐르는 용액을 본 발명의 특성을 고려하여 주입과 세척을 용이하게 할 수 있으면서도, 측정에 번거로움이 있는 기판 형태를 대체하기 위해, 플로우셀 구조를 도입할 수 있다.

상기 플로우셀은 흐름계 방식의 구조로, 측정이나 용액의 주입에 번거로움이 있는 기판 형태보다 우수한 재현성을 가지며, 신속한 용액 주입이 가능하여 빠른 정량 분석을 수행할 수 있다.

상기 플로우셀은 몸체가 있고, 상기 플로우셀 몸체의 일측으로부터 타측이 관통되게 형성된 하나의 유로를 가지며, 상기 유로는 유입구와 유출구가 구비된 것을 특징으로 한다. 상기 유로의 평균 직경은 특별히 이에 제한되지 않는다.

상기 플로우셀을 기판으로 이용할 경우, 상기 금 나노입자는 상기 플로우셀의 안쪽 벽 표면에 고정화되는 것이 바람직하다.

상기 성장한 금 나노입자가 일정 간격으로 상기 기판 상에 고정화될 수 있도록 하기 위해서 상기 성장한 금 나노입자의 농도를 제어하여 상기 기판 상에 주입하는 것이 바람직한데, 구체적으로 상기 고정되는 금 나노입자 간에 1.5 내지 20 ㎛의 간격을 확보하는 것이 바람직하다.

최종적으로 ⅳ) 상기 고정된 금 나노입자의 표면에 수용체를 결합시키는데, 구체적으로 상기 수용체와 상기 금 나노입자는 티올기로 결합되는 것이 바람직하다.

따라서 상기 금 나노입자 표면에 직접 고정되기 위하여, 상기 수용체의 말단에는 티올기를 더 포함하는 것이 바람직하다. 즉 상기 수용체의 말단에 티올기를 더 포함할 경우, 상기 기판 표면에 고정된 금 나노입자와 상기 수용체는 상기 티올기를 통해 강한 결합을 형성할 수 있다.

또한 상기 수용체는 표적물질에 대해 상보적인 염기서열을 갖는 DNA, RNA 및 올리고뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.

상기 수용체는 수용체의 말단 중 금 나노입자와 인접한 말단에 사이토민(C), 티민(T) 및 우라실(U) 중에서 선택되는 어느 하나의 염기가 연속으로 5 내지 15개 나열된 염기서열을 포함하는 것을 사용하는 것이 바람직한데, 왜냐하면 상기 염기서열을 갖는 수용체를 이용할 경우, 표적물질(DNA, RNA 및 올리고뉴클레오티드)의 구조를 안정적으로 유지할 수 있는 높은 염 농도 조건에, 상기 바이오센서가 노출될 경우 다양한 이온으로부터 상기 금 나노입자의 표면을 안정한 상태로 장기간 유지시킬 수 있기 때문이다.

상술한 과정을 통해 제조된 바이오센서는 금 나노입자의 크기를 제어하고, 기판과 금 나노입자, 금 나노입자와 수용체 간에 강한 결합을 형성하고, 이를 안정적으로 유지할 수 있도록 상기 수용체의 염기서열을 제어하였으며, 금 나노입자와 금 나노입자의 간격을 확보함으로써, 암시야 현미경에서 측정된 산란신호 세기의 백그라운드 신호(잡음; background signa)를 거의 제로에 가깝게 만들어, 표적물질 검출에 사용할 경우 백그라운드 신호를 완전히 배제시킬 수 있다는 장점을 갖는다.

상기 과정을 통해 제조된 바이오센서는 특히, 암시야 현미경에서 육안으로 전혀 관찰되지 않을 뿐만 아니라, 이를 이용하여 측정된 산란신호 스펙트럼에서, 500 내지 900 ㎚ 파장영역에서 산란신호 세기가 거의 제로에 가깝게 측정되며, 백그라운드 신호가 전혀 발생하지 않는다.

상기 바이오센서의 기판 표면에 제대로 고정되지 못하고 남아있던 금 나노입자를 제거하기 위하여, ⅴ) 상기 ⅳ) 단계에서 제조된 바이오센서에 탈이온수 또는 포스페이트 완충 식염수를 적어도 1회 이상 주입하여 세척하는 단계를 더 포함할 수 있다.

만일 상기 고정되지 못하고 남아있던 금 나노입자를 제거하지 않고, 상기 바이오센서를 이용할 경우 고정되지 않았던 금 나노입자는 추후 순차적으로 주입되는 시료와 시약들에 의해 위치가 이동하게 되기 때문에, LSPR 현상에 따른 산란신호 세기 측정에 요구되는 상기 금 나노입자 간 간격을 유지하지 못하게 되어, 재현성이 낮아지는 문제가 발생하게 된다.

본 발명의 또 다른 측면은 기판; 상기 기판 표면에 증착된 금 나노입자; 상기 금 나노입자 표면에 결합된 수용체; 상기 수용체에 결합된 표적물질; 및 상기 표적물질과 결합된 반응물질;을 포함하는 샌드위치타입의 바이오센서에 관한 것이다.

본 발명자들은 백그라운드 신호에 의한 현상을 배제할 수 있는 바이오센서를 개발하고자 노력하였고, 그 결과 앞서 설명한 구조를 갖는 바이오센서를 개발하였다. 상술한 구조의 바이오센서에 표적물질을 고정하고, 이러한 결합에 따른 산란신호 세기 변화를 감지할 수 있도록 하기 위한 구조의 바이오센서를 완성하고자 노력한 바, 상술한 구조를 갖는 샌드위치타입의 바이오센서를 완성하기에 이르렀다.

즉, 앞서 설명한 바이오센서에 표적물질을 접촉시키면, 상기 수용체와 상기 표적물질이 결합하게 되고, 상기 표적물질에 글루코오스 산화효소가 라벨링된 반응물질을 결합시킴으로써 복합구조체가 형성됨으로써, 표적물질이 고정된 샌드위치타입의 바이오센서를 제작할 수 있다.

상기 샌드위치타입의 바이오센서로부터 산란신호 세기를 증폭하고, 육안으로 바이오센서에서 금 나노입자의 구조 변화를 검출하기 위하여, 은 전구체와 글루코오스를 포함하는 제2 용액을 첨가하여, 상기 바이오센서 내에 구비된 금 나노입자의 직경을 급격히 키워 색변화와 산란신호 세기 변화를 유도할 수 있다.

도 1c는 상기 샌드위치타입의 바이오센서의 구조를 개략적으로 나타낸 도면으로, 이를 참조하여 상기 샌드위치타입의 바이오센서(200)의 구조를 상세히 설명하고자 한다.

상기 샌드위치타입의 바이오센서(200)는 기판(210); 상기 기판(210) 표면에 증착된 금 나노입자(220); 상기 금 나노입자(220) 표면에 결합된 수용체(230); 상기 수용체(230)에 결합된 표적물질(240); 및 상기 표적물질(240)과 결합된 반응물질(250);을 포함한다.

상기 표적물질(240)은 본 발명의 바이오센서(200)가 측정하고자 하는 생체분자로, 특별히 이에 제한되는 것은 아니지만, 예로 DNA, RNA 및 올리고뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다. 특히 상기 표적물질(240)은 상기 수용체(230)와 상기 반응물질(250)을 연결하는 연결체 역할을 하기 때문에, 상기 수용체(230)의 염기서열 및 상기 반응물질(250)의 염기서열은 상기 표적물질(240)의 염기서열에 맞춰 설계되는 것을 특징으로 한다.

다시 말해 상기 표적물질(240)은 상기 수용체(230)의 염기서열과 상기 반응물질(250)의 염기서열에 상보적인 염기서열을 모두 포함하고 있다.

구체적으로 본 발명의 실시예에서는 상기 표적물질(240)은 다양한 질병과 관련된 하기 서열번호 1 내지 11 중에서 선택되는 어느 하나의 염기서열을 검출대상물질로 선정하여 사용하였고, 이에 따라 상기 수용체(230) 및 상기 반응물질(250)의 염기서열을 설계하였다. 결과적으로 상기 표적물질(240)은 상기 수용체(230)의 염기서열과 상기 반응물질(250)의 염기서열과 상보적인 염기서열을 모두 포함하고 있다.

[서열번호 1]

5'-GCTTTGTTCTGGATTTCACAGGTC-3'

[서열번호 2]

5'-GCTTTGTTCTGGATTTCGCAGGTC-3'

[서열번호 3]

5'-TCAGCTTCTCCGTGCGGTCCGTGTACAGCT-3'

[서열번호 4]

5'-TCAGCTTCTCCGTGTGGTCCGTGTACAGCT-3'

[서열번호 5]

5'-TCAGCTTCTCCGTGAGGTCCGTGTACAGCT-3'

[서열번호 6]

5'-TCAGCTTCTCCGTGCAGTCCGTGTACAGCT-3'

[서열번호 7]

5'-ATGTGAACATGGAATCATCAAGGAATGCACACTCACCAGCAACACCAAGTGCAAAGAGGAAGTGAAGAGAAAGGAAGTACAGAAAACATGCAGAAAGCACAGAAAGGAAAACCAAGGTTCTCATGAATCTCCAACTTTAAATCCT 3'

[서열번호 8]

5'-GTAGACAAGGAGATGCAGGTATTGGTGAGTCGGATCGCAGCTTGGATGGCCACTTACCTGAATGACCACCTAGAGCCTTGGATCCAGGAGAACGGCGGCTGGGATACTTTTGTGGAACTCTATGGGAACAATGCAGCAGCCGAGAGCCGAAAGGGCCAGGAACGCTTCAACCGCTGGTTCCTGACGGGCATGACTGTGGC-3'

[서열번호 9]

5'-GAGGCAGGCGACGAGTTTGAACTGCGGTACCGGCGGGCATTCAGTGACCTGACATCCCAGCTCCACATCACCCCAGGGACAGCATATCAGAGCTTTGAACAGGATACTTTTGTGGAACTCTATGGGAACAATGCAGCAGCCGAGAGCCGAAAGGGCCAGGAACGCTTCAACCGCTGGTTCCTGACGGGCATGACTGTGGC-3'

[서열번호 10]

5'-CGCGATCTCAGCAAAAGGATGGTCGATAGG-3'

[서열번호 11]

5'-GTGCGCCGGTCTCTCCCAGGACAGGCACAA-3'

다시 말해 본 발명에 따른 바이오센서는 검출하고자 하는 대상물질인 상기 표적물질(240)을 선정함에 따라, 상기 수용체(230)의 염기서열과 상기 반응물질(250)의 염기서열을 설계할 수 있다. 따라서 상기 표적물질(240)은 특별히 제한되지는 않는다.

따라서, 상기 표적물질(240)의 염기서열 중 하나라도 변화하면 본 발명에 따른 바이오센서는 상기 표적물질(240)을 고정하지 못하므로, 상기 바이오센서(200)로부터 전혀 감지될 수 없다. 다시 말해 본 발명에 따른 바이오센서(200)는 하나의 염기서열이 바뀐 돌연변이형을 야생형과 정확히 구별하여 검출할 수 있을 정도로 매우 우수한 감도, 선택성을 가지며, 재현성도 뛰어나다.

더군다나 본 발명에 따른 바이오센서(200)는 상기 금 나노입자(220) 간의 간격을 확보하고 있고, 백그라운드 신호의 발생을 거의 제로에 가깝게 배제하고 있으므로, 매우 작은 농도(약 5.0 × 10^-21 M 농도)의 표적물질(240)이라도 반응하여 상기 바이오센서(200)에 고정시킬 수 있다.

결론적으로 상기 샌드위치타입의 바이오센서(200)에서 상기 표적물질(240)은 상기 수용체(230)와 상기 반응물질(250)을 결합하는 연결체(linker) 역할을 수행한다.

상기 반응물질(250)은 글루코스 산화효소가 라벨링된 것으로, 상기 수용체(230)와 하이브리디제이션(hybridiztion)되지 않은 표적물질(240)의 나머지 염기서열과 상보적인 염기서열을 갖는 DNA, RNA 및 올리고뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.

상기 반응물질(250)에 라벨링된 상기 글루코스 산화효소로 인하여, 상기 바이오센서(200)는 은 전구체를 환원시킬 수 있는 과산화수소를 생성할 수 있고, 은 전구체의 환원을 통해 상기 금 나노입자(220)의 표면에 은을 증착시켜 금 나노입자(220)의 크기를 성장시킴으로써 암시야 현미경에서 비가시적이던 금 나노입자를 가시화함으로써, 이의 산란세기 신호를 검출하여 표적물질의 존재여부를 검출하거나 산란신호 세기를 증폭시켜 이를 통해 표적물질의 농도를 정량화할 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면은 본 발명에 따른 키트에 관한 것이다.

기판, 상기 기판 표면에 증착된 금 나노입자, 및 상기 금 나노입자 표면에 결합된 수용체를 포함하는 바이오센서;

글루코스 산화효소로 라벨링된 반응물질을 포함하는 제1 용액; 및

상기 금 나노입자를 성장시키는 제2 용액;을 포함한다.

본 발명에 따른 키트는 암시야 현미경을 이용하여 상기 키트 내에 고정되어 있는 금 나노입자의 성장을 실시간으로 관측할 수 있다. 게다가 제1 용액 및 제2 용액용액이 주입되지 않은 상기 바이오센서만 존재하는 상태에서는 상기 바이오센서 내에 금 나노입자의 입경과 입자간 거리를 제어함으로써 암시야 현미경과 산란신호 세기에서 전혀 관측되지 않는, 제로 백그라운드 신호(무잡음)를 갖는다.

이러한 바이오센서에 시료와 제1 용액 및 제2 용액이 순차적으로 주입됨으로써 상기 시료 내에 포함된 표적물질의 농도에 따라 상기 키트 내 금 나노입자의 성장이 증가하고, 이에 따라 산란신호 세기도 증가하는 특성을 가지고 있으므로 본 발명에 따른 키트는 이러한 특성을 이용하여 표적물질을 정성적·정량적으로 검출할 수 있다.

상기 바이오센서는 앞서 설명한 도 1a의 구조를 갖는 바이오센서(100)와 동일한 구성을 갖는 것이므로, 이하에서는 상기 바이오센서에 대해서는 간략하게 언급하기로 한다.

상기 기판은 상기 바이오센서를 표적물질 검출에 이용할 경우, 산란신호 세기를 측정이 가장 용이한 유리 기판인 것이 바람직하다.

상기 기판은 표면에 금 나노입자가 고정되는데, 이들은 서로 정전기적 상호작용 또는 화학적 결합을 통해 더욱 안정적으로 결합될 수 있다. 이때 상기 정전기적 상호작용 또는 화학적 결합을 형성하도록 하는 수단은 특별히 제한되지 않으나, 바람직하게는 상기 기판 표면에 표면활성기를 도입할 수 있다. 이를 위해 상기 기판 표면을 표면처리할 수 있다.

또한, 상기 기판은 흐르는 용액을 본 발명의 특성을 고려하여 주입과 세척을 용이하게 할 수 있으면서도, 측정에 번거로움이 있는 기판 형태를 대체하기 위해, 플로우셀 구조일 수 있다.

상기 플로우셀의 구조는 앞서 설명한 바와 같이 도 1b에 구체적으로 도시화 되어 있으므로 이를 참조하면, 상기 플로우셀은 몸체가 있고, 상기 플로우셀 몸체의 일측으로부터 타측이 관통되게 형성된 하나의 유로를 가지며, 상기 유로는 유입구와 유출구가 구비된 것을 특징으로 한다. 상기 유로의 평균 직경은 특별히 이에 제한되지 않는다.

상기 플로우셀을 기판으로 이용할 경우, 상기 금 나노입자는 상기 플로우셀의 안쪽 벽 표면에 고정화될 수 있다.

상기 금 나노입자는 10 내지 30 ㎚ 평균직경을 갖는 것이 바람직하다.

상기 금 나노입자는 구형인 것이 가장 바람직하다.

또한 상기 금 나노입자의 평균 직경은 10 내지 30 ㎚인 것이 바람직하지만, 가장 바람직하기로는 25 ㎚일 수 있는데, 상기 금 나노입자의 평균 직경이 상기 범위를 만족할 경우에만, 상기 금 나노입자가 암시야 현미경에서 비가시적으로, 백그라운 신호를 배제할 수 있다. 만일 상기 금 나노입자의 평균 직경이 10 ㎚ 미만일 경우에는 타겟에 의해 금 나노입자가 성장했을 때 바로 관측되기 어렵고, 30㎚를 초과할 경우에는 암시야 현미경에서 가시화되어 버리므로 백그라운드 신호가 발생하게 되어, 센서의 검출한계가 현저히 높아져버리는 문제가 발생한다.

상기 금 나노입자는 일정 간격으로 서로 이격되어 있는데, 이는 상기 금 나노입자의 LSPR 현상에 서로 영향을 미치지 않도록 하기 위하여 상기 금 나노입자 간의 간격은 평균 1.5 내지 20 ㎛으로 유지되는 것이 바람직하다.

상기 수용체는 표적물질에 대해 상보적인 염기서열을 갖는 DNA, RNA 및 올리고뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.

또한 상기 수용체와 상기 금 나노입자는 티올기에 의해 결합되어 있는데, 상기 티올기는 상기 수용체 말단에 위치하고 있는 것일 수 있다. 이러한 상기 수용체를 상기 금 나노입자에 고정하는 방법에 관해서는 공지의 기술을 참조할 수 있다.

또한 상기 수용체는 수용체의 말단 중 금 나노입자와 인접한 말단에 사이토민(C), 티민(T) 및 우라실(U) 중에서 선택되는 어느 하나의 염기가 연속으로 5 내지 15개 나열된 염기서열을 포함하는 것을 사용하는 것이 바람직한데, 왜냐하면 상기 염기서열을 갖는 수용체를 이용할 경우, 표적물질(DNA, RNA 및 올리고뉴클레오티드)의 구조를 안정적으로 유지할 수 있는 높은 염 농도 조건에, 상기 바이오센서가 노출될 경우 상기 금 나노입자(120)를 안정한 상태로 장기간 유지시킬 수 있기 때문이다.

상기 제1 용액은 글루코스 산화효소로 라벨링된 반응물질을 포함한다. 상기 제1 용액은 용매로 핵산 혼성화 용액을 포함할 수 있다. 상기 핵산 혼성화 용액은 핵산 혼성화 반응 필요한 다양한 화합물을 포함하는 것으로, 핵산 혼성화 반응시 핵산 혼성화 특이성이 증가되어 더욱 양호한 혼성화 결과를 수득하도록 하는 것이다. 상기 핵산 혼성화 용액은 당업계에서 핵산 혼성화 반응을 위해 사용되는 용액이라면 특별히 이에 제한되지 않는다.

상기 제1 용액에서 글루코스 산화효소로 라벨링된 반응물질의 농도는 0.5 내지 50 nM인 것이 바람직하다.

또한 상기 반응물질은 상기 글루코스 산화효소로 라벨링함으로써, 상기 글루코스 산화효소는 기질인 글루코오스와의 효소촉매반응을 통해 과산화수소를 생성하고, 이로 인해 은 이온을 환원시켜 금 나노입자의 직경을 성장시킬 수 있도록 유도할 수 있다.

또한 상기 제2 용액은 은 전구체와 글루코오스를 포함한다. 상기 은 전구체는 AgNO₃, AgBF₄, AgPF₆, Ag₂O, CH₃COOAg, AgCF₃SO₃, AgClO₄, AgCl, Ag₂SO₄ 및 CH₃COCH-COCH₃Ag로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.

상기 글루코오스는 제1 용액에 포함된 글루코스 산화효소의 기질로, 은 이온을 환원하여, 상기 금 나노입자를 성장시키도록 하기 위해, 과산화수소의 생성할 수 있도록 한다.

상술한 구성을 갖는 본 발명의 표적물질 검출용 키트는 상기 바이오센서 내에 고정되어 있는 금 나노입자의 성장에 따른 LSPR 현상에 기반하여, 암시야 현미경에서의 색변화와 산란신호 세기변화를 측정하는 방식이다.

게다가, 본 발명에 따른 표적물질 검출용 키트는 백그라운드 신호를 거의 제로에 가깝게 배제하고 있으므로, 매우 낮은 농도의 시료로부터 높은 민감도로 표적물질을 검출할 수 있다.

또한 수용체와 반응물질을 통한 샌드위치타입으로 제조되어야만 금 나노입자의 성장이 야기되기 때문에, 검출대상으로 하는 표적물질에서 어느 하나의 염기서열이 다른 것과 정확히 구별하여 검출가능하다는, 높은 선택성과 정확성을 갖는다. 구체적으로 상기 표적물질의 검출용 키트의 검출한계는 반응시간에 따라 다르며, 구체적으로 ⅲ) 단계에서 반응시간이 5 내지 20분 경우 검출한계가 1.0 × 10^-16 M 내지 1.0 × 10^-13 M이고, 상기 반응시간이 50 내지 70 분인 경우에는 검출한계가 1.0 × 10^-18 M 내지 1.0 × 10^-14 M이며, 상기 반응시간이 140 내지 160 분인 경우에는 검출한계가 5.0 × 10^-21 M 내지 5.0 × 10^-17 M일 수 있다. 즉, 종래 표적물질 검출 기술들보다 현저히 검출한계가 낮다.

또한 본 발명에 따른 표적물질 검출용 키트는 플로우셀 구조를 도입함으로써, 검출과정이 용이하고, 간단하게 측정할 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면은 아래 단계를 포함하는 상기 키트를 이용한 표적물질 검출방법에 관한 것으로, 도 2에 본 발명에 따른 키트를 이용하여 표적물질을 검출하는 방법을 구체적으로 나타내었다.

ⅰ) 상기 바이오센서를 표적물질을 포함하는 시료와 접촉시키는 단계;

ⅱ) 상기 ⅰ) 단계를 통해 표적물질이 결합된 바이오센서에 제18항에 따른 제1 용액을 주입하여 샌드위치타입의 바이오센서를 제조하는 단계; 및

ⅲ) 상기 ⅱ) 단계를 통해 제조된 샌드위치타입의 바이오센서에 제2 용액을 주입하고 일정 반응시간 후에 암시야 현미경으로 산란신호 세기를 측정하여 표적물질을 검출하는 단계;를 포함한다.

이하에서 도 2를 참고하여 상기 검출과정을 구체적으로 설명하기로 한다.

우선 ⅰ) 상기 바이오센서를 표적물질을 포함하는 시료와 접촉시켜, 상기 바이오센서에 표적물질을 결합시키고, 여기에 제1 용액을 주입하여 상기 바이오센서에 표적물질을 고정한 샌드위치타입의 바이오센서를 제조한 후, 제2 용액을 주입하여 상기 바이오센서 내에 금 나노입자의 성장을 유도함으로써 일정 반응시간 후에 이를 암시야 현미경으로 산란신호 세기를 측정하여 상기 시료 내에 존재하는 표적물질의 존재여부 검출한다.

이를 위해 표준시료를 이용하여 먼저 검량선을 제조하는데, 통상적으로 검량선을 제조하는 방법이면 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 표적물질의 표준시료를 이용하여 각각 다른 농도의 표준용액을 제조하고, 상기 검출방법과 동일한 조건에서 모든 과정을 수행한 후에 암시야 현미경으로 산란신호 세기를 측정하여, 상기 표준시료의 농도에 따른 산란신호 세기 그래프(검량선)을 작성한다.

이후, 상기 검출방법을 통해 분석하고자 하는 표적물질이 미지의 농도로 포함된 시료를 이용하여 얻은 산란신호 세기와 상기 검량선을 사용하여 미지시료 내에 존재하는 표적물질의 농도를 정량화할 수 있다.

본 발명은 앞서 설명한 바와 같이, 상기 표적물질이 상기 바이오센서 내에 금 나노입자의 표면에 결합되어 있는 수용체와 상기 제1 용액의 반응물질을 연결시켜주는 연결체 역할을 하기 때문에, 상기 표적물질의 농도에 따라 상기 금 나노입자의 성장 범위가 조절되고, 이로 인해 상기 금 나노입자의 산란신호 세기가 증가하는 현상을 이용하여, 상기 표적물질을 검출하는 원리를 기반으로 한다.

따라서, 본 발명은 상기 금 나노입자의 성장에 따른 LSPR 현상을 이용하여 연결체 역할을 하는 표적물질을 정량적ㅇ정성적으로 검출하는 것을 특징으로 한다.

상기 바이오센서, 제1 용액 및 제2 용액은 앞서 설명한 바와 같으므로, 이하에서 중복되는 내용은 생략하기로 한다.

상기 제1 용액은 글루코오스 산화효소로 라벨링된 반응물질을 포함하고, 이를 상기 바이오센서에 주입하면, 상기 주입된 글루코오스 산화효소로 라벨링된 반응물질이 상기 표적물질과 혼성화하여 샌드위치타입의 바이오센서를 형성한다.

상기 샌드위치타입의 바이오센서에 은 전구체와 글루코오스 산화효소의 기질인 글루코오스를 포함하는 제2 용액을 주입하면, 상기 주입된 글루코오스가 상기 글루코오스 산화효소와 반응하여 은 전구체를 환원시키는 과산화수로를 생성하고, 환원된 은 전구체가 금 나노입자 표면에 증착되어, 상기 바이오센서 내에 금 나노입자의 성장을 유도한다.

이렇게 성장이 유도된 금 나노입자로 인하여, LSPR 세기가 증가되어 육안으로 확인가능한 색변화와 산란신호 세기가 증폭되므로 이를 통해 상기 시료 내에 존재하는 표적물질의 존재여부와 농도를 정확히 검출할 수 있다.

또한 상기 검출방법은 ⅲ) 단계에서 반응시간이 5 내지 20분 경우 표적물질의 농도에 따른 산란세기가 1.0 × 10^-16 M 내지 1.0 × 10^-13 M에서 선형으로 증가하고, 상기 반응시간이 50 내지 70 분인 경우에는 표적물질의 농도에 따른 산란세기가 1.0 × 10^-18 M 내지 1.0 × 10^-14 M에서 선형으로 증가하며, 상기 반응시간이 140 내지 160 분인 경우에는 표적물질의 농도에 따른 산란세기가 5.0 × 10^-21 M 내지 5.0 × 10^-17 M에서 선형으로 증가한다.

또한 상기 표적물질의 검출방법은 검출한계가 반응시간이 5 내지 20분인 경우 검출한계가 1.0 × 10^-16 M, 반응시간이 50 내지 70분인 경우에는 검출한계가 1.0 × 10^-18 M, 반응시간이 140 내지 160분인 경우에는 검출한계가 5.0 × 10^-21 M로 종래 표적물질 검출방법보다 현저히 검출한계가 낮다는 장점을 갖는다.

이하에서 실시예 등을 통해 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 하며, 다만 이하에 실시예 등에 의해 본 발명의 범위와 내용이 축소되거나 제한되어 해석될 수 없다. 또한, 이하의 실시예를 포함한 본 발명의 개시 내용에 기초한다면, 구체적으로 실험 결과가 제시되지 않은 본 발명을 통상의 기술자가 용이하게 실시할 수 있음은 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속하는 것도 당연하다.

또한 이하에서 제시되는 실험 결과는 상기 실시예 및 비교예의 대표적인 실험 결과만을 기재한 것이며, 아래에서 명시적으로 제시하지 않은 본 발명의 여러 구현예의 각각의 효과는 해당 부분에서 구체적으로 기재하도록 한다.

시약

모든 올리고뉴클레오티드(oligonucleotides)는 Sigma-Aldrich(Singapore)에서 구매하였다. 본 발명에 사용한 올리고뉴클레오티드의 시퀀스는 아래 표 1에 나타내었다.

서열번호	명칭	시퀀스
티올기가 결합된 서열번호 12	티올기가 결합된 수용체(capture DNA)	5'-CCAGAACAAAGCTTTTTTTTTT-3'-(CH₂)₆-SH
Biotin으로 라벨링된 서열번호 13	Biotin으로 라벨링된 반응물질(probe DNA)	Biotin-(CH₂)₆-5'-TTTTTTTTGACCTGTGAAAT-3'
서열번호 1	표적물질(targets) -돌연변이형(mutant phenotype)	5'-GCTTTGTTCTGGATTTCACAGGTC-3'
서열번호 2	표적물질(targets) -야생형(wild-type phenotype)	5'-GCTTTGTTCTGGATTTCGCAGGTC-3'
-	대조군(control)	5'-TACACGAAGCTTCATGACTTAAGT-3'

염화금산 수화물(Hydrogen tetrachloroaurate(Ⅲ) hydrate, HAuCl₄ㅇxH₂O), 소듐 시트레이트(sodium citrate), 염산(HCl), 은 나이트레이트(Ag nitrate, AgNO₃), 황산(H₂SO₄), 과산화수소(hydrogen peroxide, H₂O₂(30%)), 에틸렌디아민 테트라아세트산(EDTA), 소듐 클로라이드(sodium chloride, NaCl) 및 2-머캅토숙신산(2-mercaptosuccinic acide, MSA(150.15))은 Merck Pte, Ltd(Singapore)에서 구매하였다.

글루코오스 산화효소(GO_x), 글루코오스(glucose), 소혈청알부민(bovine serum albumin, BSA), 포름아미드(formamide), 덱스트란 설페이트(dextran sulfate) 및 트리(히드록시메틸)아미노메탄(tris(hydroxymethyl)aminomethane(Tris))은 Sigma-Aldrich(Singapore)에서 구매하였다.

글루코오스 산화효소가 라벨링된 스트렙타아비딘(GOx-labeled strptavidin)은 Interchim(Montluㅷon, France)에서 구매하였다. 모든 화합물은 추가 정제하지 않고, 받은 것을 그대로 사용하였다.

용액

1) Tris - EDTA 완충액 ( TE buffer)

10 mM Tris-HCl(pH 8.0)과 1 mM EDTA를 혼합하여 제조한 것을 사용하였다.

2) 상기 DNA 혼성화 완충액 (hybridization buffer)

15% 포름아미드, 10% 덱스트란 설페이트, 0.3 M NaCl, 3.75 mM MgCl₂ 및 0.1% BSA를 포함하는 20 mM Tris-HCl 완충액(pH 7.4)을 제조하여 사용하였다.

제조예 1. 25 ㎚ 평균직경의 금 나노입자 합성

우선 13 ㎚ 평균직경의 금 나노입자 시드를 제조하고, 여기에 금 전구체 용액을 첨가하여, 25 ㎚ 평균직경의 균일한 금 나노입자로 성장시켜 제조하였다.

구체적으로 5 × 10^-3 M HAuCl₄ 0.80 ㎖와 13 ㎚ 평균직경의 금 나노입자 시드 용액 5.0 ㎖를 100 ㎖ 플라스크에 넣고, 이를 섞어준 후, 탈이온수로 희석하여 50㎖을 맞춘 다음 여기에 0.01 M 2-머캅토숙신산(MSA) 0.24ml을 첨가하여 혼합액을 제조하였다.

상기 혼합액을 2 시간동안 저어준 후, 이러한 방법을 통해 평균직경이 25 ㎚로 매우 균일한 금 나노입자를 제조하였다. 제조된 금 나노입자의 평균 직경이 매우 균일하다는 것을 도 3의 SEM 결과를 통해 확인할 수 있다.

제조예 2. 글루코오스 산화효소로 라벨링된 반응물질(GOx-labeled probe DNA)

표 1에서의 반응물질인 Biotin으로 라벨링된 probe DNA(5'Biotin-labeled probe DNA)를 최종농도가 1.0 μM이 되도록 TE buffer로 희석하였다. 상기 희석한 1.0 μM Biotin으로 라벨링된 probe DNA(5'Biotin-labeled probe DNA) 900 ㎕에 1.0 ㎎/㎖ 글루코오스 산화효소로 라벨링된 스트렙타아비딘(GOx-labeled strptavidin)을 100 ㎕ 첨가하여 혼합액을 제조하고, 이를 상온에서 최소 30 분 동안 반응시킨 후 사용하였다. 상기 과정을 통해 제조된 GOx-labeled probe DNA 10 ㎕를 10 ㎖ DNA 혼성화 완충액(hybridization buffer)에 첨가하였고, 이때 probe DNA의 최종농도는 상기 전체 용액을 기준으로 1 nM이였다.

제조예 3. 성장용액

20 mM 인산 완충액(phosphate buffer, pH 8.0), 0.1 mM AgNO₃, 1.0 mM 글루코오스 및 10 mM EDTA를 혼합하여 제조하였다.

실시예 1. 수용체/금 나노입자- 플로우셀(바이오센서)의 제조

1) 플로우 셀에 금 나노입자 고정.

상기 금 나노입자를 유리 재질의 플로우셀(flow cell)의 안쪽 벽(inner-wall)에 고정하기 위해서, 1.0 M NaOH 용액을 플로우셀에 주입하고, 유리 표면에 존재하는 실리콘 하이드록실기(silicon hydroxyl)를 활성화시키기 위해 적어도 2시간동안 반응시켰다. 이후 제조예 1로부터 제조한 금 나노입자 용액을 100 배 희석하고, 이 용액을 상기 플로우셀에 주입하여 10 초간 반응시켜, 플로우셀 안쪽벽에 금 나노입자를 고정하였다.

최종적으로 다량의 탈이온수와 0.1 M pH 7.0 포스페이트 완충 식염수(phosphate-buffered saline)을 상기 플로우셀에 주입하여 고정되지 않은 금 나노입자를 제거하였다.

2) 상기 금 나노입자에 수용체 결합

Thiol기를 deprotected 하기 위해, 0.1mM tris(2-carboxyethyl)phosphine, 20mM Tris-HCl buffer (pH7.4) 용액에 1시간 동안 넣어둔다. deprotected oligonucleotides(100 uM)을 AuNP-immobilized flow cell에 주입하고, 24시간 incubate 한다. flow cell을 20mM Tris-HCl buffer (pH 7.4)로 5분 동안 세척한 뒤, TE buffer를 flow cell에 주입한 뒤, 사용할 때까지 incubate 한다.

실시예 2. GOx -labeled DNA/표적물질/수용체/금 나노입자- 플로우셀(샌드위치 타입의 바이오센서)의 제조

실시예 1로부터 제조된 수용체/금 나노입자-플로우셀(샌드위치타입의 바이오센서)에 표적물질을 포함하는 시료를 흘려주었다. 이때, 상기 표적물질은 유방암 유전자 BRCA1의 돌연변이형의 올리고뉴클레오티드(서열번호 1; 5'-GCTTTGTTCTGGATTTCACAGGTC-3', 표 1 참조)를 사용하였고, 상기 시료에서 상기 올리고뉴클레오티드의 농도는 1.0 × 10^-14M였다.

이후, 제조예 2로부터 제조된 1.0 nM GOx-labeled probe DNA 용액을 주입한 후, 상온(25 ℃)에서 30분 동안 반응시킨 후, 상기 바이오센서를 DNA 혼성화 용액으로 린스함으로써, 결합되지 않은 GOx-labeled probe DNA를 제거하여 GOx-labeled DNA/표적물질/수용체/금 나노입자-플로우셀(샌드위치타입의 바이오센서)를 제조하였다.

실시예 3. 표적물질 검출용 키트 (이하, ' 키트 '라고도 한다).

실시예 1로부터 제조된 플로우셀형태의 바이오센서;와

제조예 2로부터 제조된 글루코오스 산화효소로 라벨링된 반응물질을 포함하는 제1 용액; 및

제조예 3으로부터 제조된 성장용액을 포함하는 제2 용액;으로 구성된다.

상기 바이오센서에서의 수용체는 하기 서열번호 12로 표시되는 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 사용하였다.

[서열번호 12]

5'-CCAGAACAAAGCTTTTTTTTTT-3'

이때 상기 서열번호 12로 표시되는 염기서열의 3' 말단에는 -(CH₂)₆-SH가 결합되어 있어, 상기 티올기로 인해 상기 수용체와 금 나노입자가 결합될 수 있다.

상기 반응물질은 하기 서열번호 13로 표시되는 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 사용하였다.

[서열번호 13]

5'-TTTTTTTTGACCTGTGAAAT-3'

본 발명에 따른 키트를 이용하면, 시료 내에 존재하는 하기 서열번호 1로 표시되는 표적물질만(유방암 관련 BRCA1에서 18번째 염기서열이 A로 치환된 돌연변이형)을 정성적·정량적으로 검출할 수 있다.

[서열번호 1]

5'-GCTTTGTTCTGGATTTCACAGGTC-3'

실험예 1. 표적물질의 검출 과정.

실시예 1로부터 제조된 바이오센서에 검출하고자하는 시료를 주입한 다음, 제조예 2로부터 제조된 1 nM GOx-labeled probe DNA 용액을 주입한 후, 상온(25 ℃)에서 30분 동안 반응시킨 후, 상기 바이오센서를 DNA 혼성화 용액으로 린스하여, 결합되지 않은 GOx-labeled probe DNA를 제거한다.

만일 상기 시료 내에 검출하고자하는 표적물질이 존재한다면 상술한 과정을 통하여 제조예 2와 같은 샌드위치타입의 바이오센서가 제조되는데, 상기 시료 내에 검출하고자하는 표적물질이 존재하지 않는다면 실시예 1의 바이오센서와 같은 구조를 그대로 유지하게 된다(도 2 참조).

이후, 샌드위치타입의 바이오센서로 형성된 정도를 확인하기 위하여, 이를 가시화하고, 산란신호 세기를 측정할 수 있도록 제조예 3으로부터 제조된 제2 용액을 주입한다. 상기 제2 용액의 주입으로 인해 상기 바이오센서 내에 존재하는 GOx에 의해 발생하는 과산화수소 때문에, 제2 용액 내에 포함된 은 이온이 금 나노입자 표면에서 환원되어 상기 금 나노입자의 성장을 유도하게 됨으로써, 상기 금 나노입자의 크기가 커지게 되어, 가시화됨과 동시에 산란신호 세기가 급격히 증가하게 된다.

상기 과정에 있어서, 시료 내 존재하는 표적물질 농도에 따라 결합하는 GOx-labeled probe DNA의 양이 달라지고, 상기 GOx의 양에 따라 발생하는 과산화수소의 함량이 달라지며, 이로 인해 환원되는 은 함량이 달라지어, 금 나노입자의 성장속도 및 크기에 차이를 가지게 된다. 이러한 금 나노입자의 성장속도 및 크기에 따라 산란 세기와 암시야 현미경에서 가시화정도를 나타내기 때문에, 이를 통해 표적물질의 농도를 정량·정성적으로 측정할 수 있다.

실험예 2. 반응시간에 따른 산란신호 세기.

성장용액을 첨가하고 난 후, 유지되는 반응시간에 따른 산란신호 세기를 측정하기 위하여, 우선 표적물질을 포함하는 시료를 제조하였다. 시료는 상기 표적물질을 핵산 혼성화 용액으로 희석한 것으로, 이때 표적물질은 하기 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 사용하였다.

[서열번호 1]

5'-GCTTTGTTCTGGATTTCACAGGTC-3'

본 실험을 위하여, 상기 시료는 시료 내에 올리고뉴클레오티드의 농도가 1.0 × 10^-14 M를 갖도록 희석한 것을 사용하였다.

구체적인 실험방법은 상기 실시예 3의 표적물질 검출용 키트를 사용하여 상기 실험예 1의 방법으로 상기 시료 내에 존재하는 표적물질을 검출하였다.

여기서 상기 실시예 3에서의 키트 내 바이오센서가 비가시적(invisible)에서 가시적(visible)으로 변화되어가는 것을 확인하기 위하여, 실시간으로 상기 플로우셀 형태의 바이오센서를 암시야 현미경으로 관측하고, 500-900 ㎚ 영역범위에서 산란신호 세기를 측정하여 그 결과를 그래프로 도시하였다. 본 발명에서 사용된 암시야 현미경의 설정은 Guo, L., Ferhan, A.R., LEE, K., Kim, D.H., 2011a. Anal. Chem. 83(7), 2605-2612를 참고하였다.

도 4는 1.0×10^-14 M 농도의 표적물질에 있어서, 반응시간에 따라 촬영한 실시예 3의 키트의 암시야 이미지이고, 도 5는 1.0×10^-14 M 농도의 표적물질에 있어서, 반응시간에 따라 촬영한 실시예 3의 키트의 대면적 암시야 이미지(large-area darkfield image)이며, 도 6은 1.0×10^-14 M 농도의 표적물질에 있어서, 반응시간에 따라 촬영한 실시예 3의 키트의 SEM 이미지이며, 도 7은 1.0×10^-14 M 농도의 표적물질에 있어서, 반응시간에 따라 촬영한 실시예 3의 키트의 산란신호 세기 스펙트럼이다.

본 발명의 실시예 3으로부터 제조된 키트는 구체적으로 플로우셀의 안쪽 벽에 증착된 금 나노입자와 상기 금 나노입자의 표면에 결합되어 있는 수용체를 포함하는 바이오센서와 GOx로 라벨링된 반응물질을 포함하는 제1 용액 및 금 나노입자의 성장을 위한 제2 용액을 포함한다.

이러한 구성을 갖는 실시예 3의 키트는, 시료 내에 표적물질의 존재여부 및 농도를 파악하기 위하여 상기 플로우셀 형태의 바이오센서에 시료를 주입하고, 그 다음 제1 용액과 제2 용액을 차례대로 주입함으로써, 표적물질이 시료 내에 존재할 경우 정밀하게는 암시야 현미경을 통해 육안으로 색변화 확인할 수 있고, 보다 정밀하게는 산란신호 세기(scattering intensity)를 통해 정량화할 수 있다.

다시 말해 상기 표적물질이 상기 바이오센서 중 하나의 구성요소인 수용체에 글루코오스 산화효소로 라벨링된 반응물질이 고정화될 수 있도록 하는 연결체역할을 수행하고 있다고 할 수 있다. 이렇게 상기 수용체에 고정된 글루코오스 산화효소로 라벨링된 반응물질은 은이온(Ag⁺)의 환원을 유도하는 과산화수소를 생성하기 위한 촉매로 작용한다. 이때 상기 글루코오스 산화효소는 촉매이기 때문에 반응이 진행되는 동안에는 소모되지 않는다. 이러한 일련의 과정은 도 4 내지 7을 통해서 확인이 가능하다.

우선, 도 4와 도 5에 나타난 바와 같이, 실시예 3의 키트 중 제2 용액이 첨가되기 전(0 min)에는, 키트 중 바이오센서에 존재하는 금 나노입자의 성장이 전혀 관측되지 않았다.(여기서 도 4와 5의 상단 좌측에 있는 숫자는 반응시간을 의미한다.)

그러나 상기 실시예 3의 키트 중 제2 용액이 첨가되고 나서 1 min 의 반응시간이 지난 후, 키트 중 바이오센서에 존재하는 금 나노입자의 성장이 관측됨과 동시에 가시화되었음을 확인할 수 있고, 반응시간이 증가함에 따라 상기 금 나노입자의 평균직경도 커지고 있기 때문에, 암시야 현미경으로 촬영한 사진에서 산란지점(scattering spot)의 밝기(brightness)가 점차 밝아지고 있다는 것을 확인할 수 있다. 게다가 반응시간이 120 min일 때, CCD 카메라에서 산란신호가 포화상태에 도달한 것을 확인할 수 있었다.

도 6에 나타난 바와 같이, 반응시간이 증가할수록 실질적으로 실시예 3의 키트 내에 존재하는 금 나노입자의 평균 직경이 커지고 있음을 알 수 있는데, 구체적으로 제2 용액이 첨가되기 전의 상기 금 나노입자의 평균직경은 24 ㎚이였고, 제2 용액이 첨가되고 1 min 뒤 상기 금 나노입자의 평균직경이 28 ㎚로 커졌음을 확인하였다. 이는 상기 금 나노입자 표면에 은(Ag)의 증착이 이루어졌음을 의미하는 것이다. 즉 상기 금 나노입자 표면에 은 층이 2 ㎚ 두께 이상 형성되고, 이로 인해 암시야 현미경에서 비가시적(invisible)이던 상기 금 나노입자가 LSPR 현상에 따른 광학신호가 발생하여 가시화(visible)되었다 할 수 있다.

또한, 120 min의 반응시간 후에는 상기 실시예 3의 키트 내 상기 금 나노입자의 평균직경이 약 90 ㎚ 크기로 증가하였음을 확인할 수 있었다.

또한, 실시예 3의 키트 내 상기 금 나노입자는 반응시간이 지남에 따라, 표면 형태가 비규칙적이고 비균일하게 성장하였음을 알 수 있다. 이러한 비규칙적인 성장은 상기 금 나노입자의 표면에 과산화수소가 불균일하게 분배되었기 때문에 야기된 결과라 할 수 있다.

도 7에 나타난 바와 같이, 0 min에서 120 min의 반응시간 동안, 실시예 3의 키트의 산란신호는 560 ㎚에서 670 ㎚로 피크의 위치가 이동하는 것이 관찰되었고, 이는 실시예 3의 키트 내 상기 금 나노입자의 크기가 커지고, 모양이 변화하였기 때문에 이의 LSPR 피크가 크게 이동하고 있음을 확인하였다.

일반적으로 적색편이한 피크의 위치변화는 코어(Au)-쉘(Ag)로 이루어진 구형 나노입자에서 관측되는 현상인데 반해, 본 발명에서는 청색편이(blue-shift)한 피크의 위치변화가 관찰되었고, 이는 실시예 3의 키트에서 상기 금 나노입자의 불균일한 성장으로 인해 기인한 것이라 여겨진다.

또한, 상기 도 7내에 삽입된 그래프는 실시예 3의 키트에서 제2 용액을 첨가하지 않은 0 min에서의 산란신호 세기 스펙트럼과 제2 용액을 첨가하고 1 min 후의 산란신호 세기 스펙트럼을 확대한 것으로, 이에 따르면 제2 용액이 첨가되지 않은 0 min에서는 전혀 피크가 관찰되지 않았으며 오직 baseline만이 존재함을 확인하였다, 이는 본 발명에 따른 키트가 제로 백그라운드 신호를 가진다는 것을 의미한다.

도 8은 1.0×10^-14 M 농도의 표적물질에 있어서, 제2 용액을 첨가한 후 2 시간의 반응시간 후에 측정한 실시예 3의 키트의 산란신호 세기 스펙트럼이다. 이때, 상기 실시예 3의 키트 내에 존재하는 서로 다른 금 나노입자(산란지점) 네 개의 산란신호 세기를 각각 측정하여 도 8 그래프에 나타내었다.

도 8에 나타난 바와 같이, 동일한 반응시간을 거친 실시예 3의 키트 내에 존재하는 서로 다른 네 개의 금 나노입자의 피크 위치가 모두 다르다는 것을 확인하였다. 구체적으로 630 ㎚부터 693 ㎚까지 다양하게 측정되었는데, 이는 도 6, 7에서 언급한 바와 같이 상기 금 나노입자의 불균일한 성장으로 인해 상기 금 나노입자의 표면 형태(morphology)가 서로 다르게 형성되기 때문이다.

도 9는 1.0×10^-14 M 농도의 표적물질에 있어서, 반응시간(0 min(a), 60 min(b), 150 min(c))에 따라 촬영한 실시예 3의 키트의 암시야 이미지이다.

도 9에 나타난 바와 같이, 실시예 3의 키트에서 제2 용액을 주입하기 전인 0 min(a)의 암시야 이미지는 산란지점(scattering spots)이 관찰되지 않았으나, 제2 용액을 주입하고 반응시간이 60 min(b)이 지난 후의 암시야 이미지에서는 밝게 빛나는 다수 개의 산란지점을 관찰할 수 있었다. 아울러 제2 용액을 주입하고 반응시간이 120 min(c) 지난 후의 암시야 이미지에서는 상기 산란지점의 밝기가 더욱 밝아져있었다.

본 발명은 단일 나노입자의 관찰을 기반으로 하고 있기 때문에, 상기 이웃하는 입자간의 분광학적 상호작용을 방지하기 위해 상기 입자사이 간격을 제어하는 것이 매우 중요하다.

실시예 3의 키트 내에 존재하는 금 나노입자끼리 서로 밀접하게 위치되어 있는 것들을 도 9에서 삼각형으로 표기하였다, 이는 하기 도 10을 통해 보다 명확하게 확인하였다. 일반적으로 암시하여 현미경에서 광학적 신호가 상호작용에 의해 방해받지 않도록 하기 위해서는 적정 거리를 유지해야한다고 알려져 있다. 그런데 본 발명에서는 유리 플로우셀의 안쪽 벽 표면과 금 나노입자는 모두 전기적 음성을 띄기 때문에, 상기 금 나노입자와 플로우셀 표면 사이에 정전기적 반발이 발생하게 된다. 이를 해결하기 위해 상기 플로우셀 안쪽 벽 표면을 히드록시기를 갖는 NaOH로 처리함으로써, 상기 플로우셀 안쪽 벽 표면에 금 나노입자가 고정되도록 하였다. 또한 고정되는 금 나노입자의 밀도는 주입되는 금 나노입자 용액의 농도와 배양시간을 조절하여 제어하였다(100 배 희석한 제조예 1의 금 나노입자를 주입하고 10 초 동안 배양하였다). 이러한 과정을 통해 본 발명에 따른 바이오센서는 금 나노입자 간에 평균 간격이 ~ 3.5 ㎛가 되도록 제어할 수 있었다.

도 9b에 나타난 바와 같이, dotted circle 부분은 60분까지 보이지 않았지만 150 분에서 보인 것으로 봤을 때, 금 나노입자가 25 nm 보다 작았을 것이라 예상할 수 있다.

상술한 결과를 통해, 플로우셀의 표면에 은 핵(Ag nuclei)이 형성되는 가설을 세워볼 수 있었는데, 구체적으로 실시예 3의 키트 중 플로우셀에 고정된 금 나노입자의 표면에 결합되있던 글루코오스 산화효소에 의해 발생된 과산화수소로 인해 은 이온(Ag⁺)의 대부분이 환원되고, 환원된 은 이온(Ag⁰)은 상기 금 나노입자의 표면에 증착되었을 것이라 여겨진다. 그러나 일부의 은 (Ag⁰ ₎은 상기 플로우셀의 표면에 존재하는 결함에 부착되었을 수 있다.

이러한 현상은 150min로 반응시간을 연장했을 때, 형성된 은 핵(Ag nuclei)이 더 명확히 관찰되고 있음을 확인할 수 있는데, 이러한 은 핵(Ag nuclei)의 산란신호 세기는 금 나노입자의 종자로부터 성장한 산란신호 세기보다 상당히 약하다는 것을 확인할 수 있고, 이러한 영향을 검출 시에 제외하는 것이 이론상으로 바람직하다.

그러나 상기 금 나노입자가 다양한 형태로 성장하기 때문에, 다양한 LSPR 피크를 가지고 있어 상기 은 핵(Ag nuclei)의 LSPR 피크와 구별하기에 다소 어려움이 있다. 따라서 이러한 LSPR 피크의 위치를 이용해서 새롭게 형성된 은 핵(Ag nuclei)을 분류하는 것은 실험적으로 바람직하지 않다는 것을 확인할 수 있다.

또한 도 10의 dotted rectangle에서 볼 수 있듯이, 제2 용액의 첨가로 인한 상기 금 나노입자의 성장과정 동안 고정된 금 나노입자의 일부의 위치가 변화하고 있다는 것을 확인할 수 있는데, 이는 대부분의 금 나노입자가 플로우셀 안쪽 벽 표면에 고정되어 있지만 일부 금 나노입자가 상기 플로우셀 표면과 약하게 결합되어 있기 때문으로, 상기 약한 결합을 갖는 금 나노입자는 제2 용액이 주입되는 과정에서 위치가 이동하게 된다. 이렇게 불안정하게 고정되어 있는 금 나노입자의 위치이동에 의해 상기 금 나노입자 간에 평균 간격에 변동이 생기게 되고, 입자간의 분광학적 상호작용이 형성되어 서로 간섭하게 되는 문제가 발생하게 된다.

따라서 이렇게 플로우셀에 불안정하게 고정되어 있는 금 나노입자는 플로우셀에 금 나노입자를 고정하고 난 후 즉시 완충액 또는 탈이온수를 이용하여 반복 세척하여, 최대한 제거하는 것이 바람직하다.

도 10의 스펙트럼은 도 9의 삼각형 부분을 나타낸 것으로, 도 10의 흑색선은 나노입자가 1 개만 존재할 때의 커브이고, 도 10에서 청색선은 두 나노입자가 가까이 있지만 완전히 가까이 있는게 아니라 상대적으로 거리가 있는 경우에 대한 커브이며, 도 10에서 적색선은 두 나노입자가 매우 가까이 있을 때에 대한 커브이다. 상기 표적물질의 농도는 1.0 × 10^-14 M이고, 반응시간은 60 분이였다.

도 10에 나타난 바와 같이, 상기 청색선과 적샌석의 산란신호 세기와 피크의 파장이 흑색선과 비교하였을 때 상당히 이동하였음을 알 수 있다. 즉, 도 10의 청색선을 통해 상기 두 나노입자가 상대적으로 거리가 가까울 때의 커브에서, 두 나노입자는 실질적으로 완전히 가까이 있는게 아니라, 어느 정도의 간격을 가지고 위치하고 있다는 것을 알 수 있고, 도 10의 적샌선을 통해 두 나노입자가 매우 가까운 거리에 있을 때, 실질적으로 서로 짧은 간격을 가지고 위치하고 있음을 확인할 수 있다.

실험예 3. '가시화'되는 시점의 정의

본 발명에 따른 표적물질 검출용 키트를 개발함에 있어서, 정확성에 영향을 미치는 모든 주관적인 요소들을 정확히 정의할 필요가 있다.

우선, 본 발명에서 성장시간(growth time)(이하, 반응시간이라고도 한다.)이란, 본 발명에서의 키트 중 바이오센서 내에 고정되어 있는 금 나노입자에, 제2 용액의 첨가에 의해 은이 증착되어 암시야 현미경 하에서 '가시화'되어가는 시간을 의미하는 것이다.

다음으로, '가시화(visible)'란 암시야 현미경에서 육안으로 상기 금 나노입자를 쉽게 분별될 수 있을 때의 산란신호 세기를 나타내는 것을 말한다.

이 중에서도 본 발명에서의 키트 중 금 나노입자가 '가시화'되는 기준은 오롯이 육안에 의지하고 있기 때문에, 매우 주관적일 수 밖에 없고, 이러한 주관적인 요소를 최대한 배제하기 위해, 다양한 관찰자들을 통해 '가시화'의 기준을 산란신호 세기의 범주로 정확히 정의하기로 한다.

이를 위해, 다양한 농도의 표적물질에서, 세 관찰자(operator)가 각각 상기 금 나노입자의 가시화를 판단한 시점의 산란신호 세기를 측정하고, 이로부터 오차를 분석하고, '가시화'에 대한 산란신호 세기를 분석하였다.

도 11은 동일한 반응시간에서 표적물질의 농도에 따른 실시예 3 키트 내에 금 나노입자의 산란신호 세기 스펙트럼이다.

상기 도 11에서 각기 서로 다른 세 가지 도형으로 표기된 수치는 동일한 시료에 대해 세 관찰자(operator)가 각각 서로 다른 가시적 기준으로 분류한 시점에서의 산란신호 세기 스펙트럼이다.

도 11에 나타난 바와 같이 다른 관찰자들 사이에서의 RSD(relative standard deviation; 상대표준편차)는 7.8 내지 15.4%인데 반해, 한 관찰자(operator)에서의 RSD(relative standard deviation)는 10.5 내지 13.6%였다.

또한, 세 관찰자에 의해 가시화된 것으로 분류한 시점에서 최저 산란신호 세기는 50 a.u이였고, 최대 산란신호 세기는 85 a.u이였다. 따라서 암시야 현미경에서 상기 금 나노입자의 '가시화'란, 산란신호 세기가 50 내지 85 a.u로 측정되는 것이라 정의할 수 있다.

실험예 4. target-concentration-dependent growth time of AuNP

다양한 표적물질 농도에 따른 반응시간을 측정하였다. 이때, 표적물질의 농도는 5.0 × 10^-21 M 내지 5.0 × 10^-14 M이였다.

실시예 3의 키트를 이용하여 실험예 1의 과정을 통해, 상기 키트 내에 존재하는 금 나노입자의 '가시화' 변화를 암시야 현미경으로 실시간 관찰하였다. 금 나노입자가 '가시화'되었을 때의 반응시간을 기록하고, 상기 반응과정은 탈이온수(D.W)를 주입하여 종료시켰다.

도 12는 표적물질 농도에 따른 본 발명의 실시예 3으로부터 제조된 키트의 '가시화'되는 반응시간을 나타낸 그래프이다.

도 12에 나타난 바와 같이, 표적물질의 농도가 증가함에 따라서 반응시간이 감소하고 있음을 확인할 수 있다.

높은 농도의 표적물질 조건에서는 실시예 3 키트 내의 금 나노입자의 성장 즉 '가시화'가 빠르게 일어나는 것을 확인할 수 있는데, 구체적으로 5.0 × 10^-14 M의 표적물질 농도의 시료를 주입한 경우, 실시예 3 키트 내의 금 나노입자가 가시화되기까지 반응시간이 37 초 소모되었다.

한편 낮은 농도의 표적물질 조건에서는 실시예 3 키트 내의 금 나노입자의 성장 즉 '가시화'가 느리게 일어나는 것을 확인할 수 있었다. 구체적으로 5.0 × 10^-21 M의 표적물질 농도의 시료를 주입한 경우 상기 실시예 3 키트 내의 금 나노입자가 가시화되기까지 반응시간이 136 분 소모되었다.

도 12에 나타난 바와 같이 본 발명에 따른 키트(구체적으로 실시예 3)는 광범위한 농도의 표적물을 정확하고 면밀하게 검출할 수 있음을 확인하였다. 게다가 본 발명에 따른 키트를 사용하여 측정된 반응시간에 따라 표적물질의 농도를 정량화할 수 있다는 것도 확인하였다.

본 발명에 따른 표적물질을 검출하는 방법은, 암시야 현미경에서 육안으로 상기 실시예 3 키트의 '가시화'를 구별하여 반응시간을 측정할 수 있기 때문에, 이를 통해 본 발명에 실시예 3 키트를 사용하여 육안을 통해 표적물질 여부를 확인할 수 있으므로 별도의 기술자와 검출장치가 요구되지 않는다는 장점이 있다.

실험예 5. 표적물질의 농도에 따른 검량선(calibration curve)

실험예 4에서 언급한 바와 같이, 반응시간을 이용하여 시료( unknown sample)에 포함되어 있는 표적물질을 정량할 수 있으나, 상기 실시예 3의 키트 내에서 실시간으로 반응시간을 기록할 수 있는 장치가 필요하다.

따라서, 시료 내 포함되어 있는 표적물질을 정량화할 수 있는 다른 방법으로, 표적물질 농도에 따른 산란신호 세기를 측정하여 검량선을 제조하고, 실시예 3의 키트로부터 얻은 산란신호 세기를 상기 검량선에 대입하여 미지시료 내에 존재하는 표적물질의 농도를 산출할 수 있다.

먼저 검량선을 제조하기 위하여, 고정된 반응시간(이하 'cut-off time'이라고도 한다)에서, 다양한 표적물질 농도에 따른 산란신호 세기를 측정하여 그래프로 나타내었다. 상기 cut-off time은 10 분, 60 분, 150 분으로 하여 측정하였다.

도 13은 10 분(a), 60 분(b) 및 150 분(c)으로 반응시간을 고정하였을 때, 표적물질 농도의 로그값에 따라 산란 세기가 선형으로 증가하는 농도에서의 산란신호 세기 스펙트럼이다. 구체적으로 1.0 × 10^-16 내지 1.0 × 10^-13 M(a), 1.0 × 10^-18 M 내지 1.0 × 10^-14 M(b) 및 5.0 × 10^-21 내지 5.0 × 10^-17 M(c)이다.

도 13에 나타난 바와 같이, cut-off time이 10분일 때, 표적물질의 농도가 1.0 × 10^-16 M 내지 1.0 × 10^-13 M 범위에서 표적물질 농도의 로그값에 대해 산란신호 세기가 선형적으로 증가하고 있음을 관찰하였고, cut-off time이 60분일 때는 표적물질의 농도가 1.0 × 10^-18 M 내지 1.0 × 10^-14 M 범위에서, cut-off time이 150분일 때는 표적물질의 농도가 5.0 × 10^-21 M 내지 5.0 × 10^-17 M 범위에서 표적물질 농도의 로그값에 대해 산란신호 세기가 선형적으로 증가하고 있음을 관찰되었다.

이러한 각 고정된 반응시간에서의 검량선의 조합은 약 7 orders of magnitude에 걸친 광범위한 표적물질 농도를 커버할 수 있는데 구체적으로 1.0 × 10^-13 M 내지 5.0 × 10^-21 M 범위를 커버할 수 있다. 이러한 수치는 실사용(field applications)에서 매우 유용하다.

본 발명에 따른 키트를 사용할 경우 cut-off time이 150 분일 때의 검출한계(LOD)는 5.0 × 10^-21 M로, 이는 현재까지 공지된 뉴클레오티드 검출용 센서들 중에서 가장 낮은 검출한계(LOD)이다. 이 수치는 1mL 샘플 용액에 ~3 copies of target oligonucleotides 가 들어있다는 의미이다.

게다가 짧은 검출 시간이 필요한 경우에는 10 분을 cut-off time으로 하여 표적물질을 검출할 수 있고, 다만 이때 검출한계는 1.0 × 10^-16 M 이다.

실험예 6. 유방암 DNA 돌연변이 검출

본 발명에 따른 키트의 병을 진단하는 등의 용도로 사용이 가능한지 여부를 확인하기로 하였다.

이를 위해 유방암 DNA인 BRCA1에서 단일 염기가 돌연변이된 것을 표적물질로 선택하였고, 구체적으로 아래 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드이며, 이하 R1443X라고도 한다.

BRCA1은 24-mer 유전자 서열(서열번호 2)로 이루어져있고, 돌이변이형인 R1443X는 야생 표현형 BRCA1로부터 단일 뉴클레오티드가 돌연변이 된 것으로 아래 서열번호 1로 표시된다.

도 14는 돌연변이형 표적물질과 야생형 표적물질과 대조군 각각을 표적물질로 하였을 때, 실시예 3 키트에서의 산란신호 세기 스펙트럼이다.

도 15는 돌연변이형 표적물질과 야생형 표적물질과 대조군 각각을 표적물질로 하였을 때, 실시예 3 키트를 암시야 현미경으로 촬영한 사진이다.

도 14에 나타난 바와 같이, 실시예 3으로부터 제조된 키트는 오직 돌연변이형 표적물질이 포함된 시료를 이용할 경우에만 '가시화'범위의 산란신호가 관찰되는 것을 확인할 수 있었다. 또한 도 14의 우측에 내삽된 암시야 현미경에서 촬영한 사진에 나타난 바와 같이, 실시예 3으로부터 제조된 키트는 오직 돌연변이형 표적물질이 포함된 시료를 이용할 경우에만 '가시화'되는 것을 확인할 수 있었다.

그런데 야생형과 대조군 올리고뉴클리오티드에서는 모두 실시예 3의 키트 내에 존재하는 금 나노입자를 성장시키지 못했기 때문에 LSPR 피크가 관측되지 않았다.

이는 본 발명에 따른 키트를 이용할 경우, 표적물질의 염기 서열 중에서 어느 하나의 염기서열이 다를 경우에도 정확히 이를 구별할 수 있음을 의미한다.

즉, 본 발명에 따른 키트는, 표적물질의 염기서열에 따라 수용체와 제1 용액에 포함되는 글루코오스 산화효소로 라벨링된 반응물질을 설계한다면 매우 낮은 농도의 표적물질도 매우 정확하게 검출할 수 있음을 알 수 있다.

게다가 본 발명에 따른 키트는 표적물질이 포함되어 있는 시료에 특별한 처리를 하지 않아도, 단순히 바이오센서에 측정하고자 하는 시료와 제1 용액 및 제2 용액을 순서대로 주입하는 간단한 작동방법을 통해, 시료로부터 표적물질의 존재여부와 농도를 검출할 수 있다는 데 큰 의미를 가진다.

<110> Research Business Foundation SUNGKYUNKWAN UNIVERSITY T&L CO., LTD. <120> biosensor, method for manufacturing thereof, kit for target molecule sensing comprising thereof and method for detecting target molecule using thereof <130> HPC6568 <160> 13 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R1443X <400> 1 gctttgttct ggatttcaca ggtc 24 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BRCA1 <400> 2 gctttgttct ggatttcgca ggtc 24 <210> 3 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> spliced mRNA <400> 3 tcagcttctc cgtgcggtcc gtgtacagct 30 <210> 4 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> spliced mRNA <400> 4 tcagcttctc cgtgtggtcc gtgtacagct 30 <210> 5 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> spliced mRNA <400> 5 tcagcttctc cgtgaggtcc gtgtacagct 30 <210> 6 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BIGH3 Gene <400> 6 tcagcttctc cgtgcagtcc gtgtacagct 30 <210> 7 <211> 145 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fas 57 gene <400> 7 atgtgaacat ggaatcatca aggaatgcac actcaccagc aacaccaagt gcaaagagga 60 agtgaagaga aaggaagtac agaaaacatg cagaaagcac agaaaggaaa accaaggttc 120 tcatgaatct ccaactttaa atcct 145 <210> 8 <211> 200 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BCL-XL gene <400> 8 gtagacaagg agatgcaggt attggtgagt cggatcgcag cttggatggc cacttacctg 60 aatgaccacc tagagccttg gatccaggag aacggcggct gggatacttt tgtggaactc 120 tatgggaaca atgcagcagc cgagagccga aagggccagg aacgcttcaa ccgctggttc 180 ctgacgggca tgactgtggc 200 <210> 9 <211> 200 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BCL-XS gene <400> 9 gaggcaggcg acgagtttga actgcggtac cggcgggcat tcagtgacct gacatcccag 60 ctccacatca ccccagggac agcatatcag agctttgaac aggatacttt tgtggaactc 120 tatgggaaca atgcagcagc cgagagccga aagggccagg aacgcttcaa ccgctggttc 180 ctgacgggca tgactgtggc 200 <210> 10 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 30-mer single-stranded oligonucleotide <400> 10 cgcgatctca gcaaaaggat ggtcgatagg 30 <210> 11 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> human p53 gene <400> 11 gtgcgccggt ctctcccagg acaggcacaa 30 <210> 12 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> capture DNA <400> 12 ccagaacaaa gctttttttt tt 22 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe DNA <400> 13 ttttttttga cctgtgaaat 20

Claims

암시야 현미경에서 금 나노입자가 결합된 기판; 및
표적물질에 대해 상보적인 염기서열을 갖는 DNA, RNA 및 올리고뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 수용체;를 포함하고,
상기 수용체는 상기 금 나노입자 표면에 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 바이오센서.
제1항에 있어서,
상기 기판은 유리재질의 플로우셀(flow cell)인 것을 특징으로 하는 바이오센서.
제1항에 있어서,
상기 금 나노입자의 평균 직경은 10 내지 30 ㎚인 것을 특징으로 하는 바이오센서.
제1항에 있어서,
상기 금 나노입자 간 간격은 1.5 내지 20 ㎛인 것을 특징으로 하는 바이오센서.
제4항에 있어서,
상기 수용체의 말단 중 금 나노입자와 인접한 말단에 사이토민(C), 티민(T) 및 우라실(U) 중에서 선택되는 어느 하나의 염기가 연속으로 5 내지 15개 나열된 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 바이오센서.
제5항에 있어서,
상기 표적물질은 서열번호 1 내지 11 중에서 선택되는 어느 하나의 염기서열인 것 특징으로 하는 바이오센서.
제1항에 있어서,
상기 기판은 표면활성기를 포함하는 것을 특징으로 하는 바이오센서.
제8항에 있어서,
상기 표면활성기는 활성수소, 하이드록시기, 카르복실기, 술폰산기, 인산기, 아민기, 암모늄기 및 피리딘기로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 작용기인 것을 특징으로 하는 바이오센서.
제1항에 있어서,
상기 바이오센서를 암시야 현미경을 이용하여 산란신호 스펙트럼을 측정하고, 이로부터 수득된 500 내지 900 ㎚ 영역범위에서 산란신호 세기가 거의 제로에 가까운 것을 특징으로 하는 바이오센서
ｉ) 1 내지 20 ㎚ 평균직경을 갖는 금 나노입자 시드를 준비하는 단계;
ⅱ) 상기 금 나노입자 시드를 금 전구체 용액과 혼합하여 10 내지 30 ㎚ 평균직경의 금 나노입자로 성장시키는 단계;
ⅲ) 표면 처리된 기판 상에 상기 성장한 금 나노입자를 주입하여, 상기 기판 상에 상기 금 나노입자를 고정하는 단계; 및
ⅳ) 상기 고정된 금 나노입자의 표면에 수용체를 결합시키는 단계;를 포함하는 바이오센서의 제조방법.
제10항에 있어서,
ⅴ) 상기 ⅳ) 단계에서 제조된 바이오센서에 탈이온수 또는 포스페이트 완충 식염수를 적어도 1회 이상 주입하여 세척하는 단계;를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 바이오센서의 제조방법.
제10항에 있어서,
상기 바이오센서를 암시야 현미경을 이용하여 산란신호 스펙트럼을 측정하고, 이로부터 수득된 500 내지 900 ㎚ 영역범위에서 산란신호 세기가 거의 제로에 가까운 것을 특징으로 하는 바이오센서의 제조방법.
기판;
상기 기판 표면에 증착된 금 나노입자;
상기 금 나노입자 표면에 결합된 수용체;
상기 수용체에 결합된 표적물질; 및
상기 표적물질과 결합된 반응물질;을 포함하고,
상기 반응물질은 글루코스 산화효소가 라벨링된 것을 특징으로 하는 샌드위치타입의 바이오센서.
제13항에 있어서,
상기 수용체는 상기 표적물질과 상보적인 염기서열을 갖고,
상기 반응물질은 상기 수용체와 상보적인 표적물질의 염기서열 외에 나머지 염기서열과 상보적인 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 샌드위치타입의 바이오센서.
제13항에 있어서,
상기 표적물질은 하기 서열번호 1 내지 11 중에서 표시되는 어느 하나의 염기서열인 것을 특징으로 하는 샌드위치타입의 바이오센서.
기판, 상기 기판 표면에 증착된 금 나노입자, 및 상기 금 나노입자 표면에 결합된 수용체를 포함하는 바이오센서;
글루코스 산화효소로 라벨링된 반응물질을 포함하는 제1 용액; 및
은 전구체와 글루코오스를 포함하는 제2 용액;을 포함하는 표적물질 검출용 키트.
ⅰ) 제16항에 따른 바이오센서를 표적물질을 포함하는 시료와 접촉시키는 단계;
ⅱ) 상기 ⅰ) 단계를 통해 표적물질이 결합된 바이오센서에 제17항에 따른 제1 용액을 주입하여 샌드위치타입의 바이오센서를 제조하는 단계; 및
ⅲ) 상기 ⅱ) 단계를 통해 제조된 샌드위치타입의 바이오센서에 제2 용액을 주입하고 일정 반응시간 후에 암시야 현미경으로 산란신호 세기를 측정하여 표적물질을 정량화하는 단계;를 포함하는 표적물질의 검출방법.
제17항에 있어서,
상기 ⅲ) 단계에서 반응시간이 5 내지 20 분인 경우에는 표적물질 농도의 로그값에 산란 세기가 선형으로 증가하는 표적물질의 농도가 1.0 × 10^-16 M 내지 1.0 × 10^-13 M이고,
상기 반응시간이 50 내지 70 분인 경우에는 표적물질 농도의 로그값에 산란 세기가 선형으로 증가하는 표적물질의 농도가 1.0 × 10^-18 M 내지 1.0 × 10^-14 M이며,
상기 반응시간이 140 내지 160 분인 경우에는 표적물질 농도의 로그값에 산란 세기가 선형으로 증가하는 표적물질의 농도가 5.0 × 10^-21 M 내지 5.0 × 10^-17 M인 것을 특징으로 하는 표적물질의 검출방법.