KR960016337B1 - 샌드위치식 면역분석용 키트 - Google Patents

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노부오 오오시마
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가부시끼가이샤 메이덴샤
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Abstract

없음

Description

샌드위치식 면역분석용 키트
제 1 도는 화학발광 강도와 AFP 양의 관계를 나타내는 그래프임.
제 2 도는 IgG 구조를 나타내는 개략도임.
제 3 도는 주어진 실시예에 대한 비특이적 결합율을 도시한 그래프임.
제 4 도는 화학발광 강도와 AFP 양의 관계를 나타내는 그래프임.
본 발명은 혈액 또는 기타 유기 시료 중에 함유된 극소량의 성분을 측정하기 위해 면역반응을 이용하는 샌드위치식 면역분석법에 관한 것이다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 이와 같은 샌드위치식 면역분석법에 사용하여 성분 측정의 정확도를 향상시키기 위한 개선된 시약 조합물, 즉 키트(Kit)에 관한 것이다.
면역분석법은 면역반응 또는 항원-항체 반응을 이용함으로써 혈액 또는 기타 유기 시료 중에 함유된 극소량의 성분을 측정하는데 널리 사용되어 왔다. 이와 같은 면역분석법에는 일반적으로 "경쟁 면역분석법" 및 "비경쟁 면역분석법"의 두 종류가 있다. 경쟁 면역분석법은 표적 항원과 함께 경쟁적으로 예정된 양의 항체와 결합하는 예정된 양의 표지화 항원을 사용한다. 표적 항원의 양은 항체에 결합하는 표지화 항원의 양으로부터 측정하거나, 항체에 결합되지 않은 표지화 항원의 양으로 부터 측정한다. 그러나, 경쟁 면역분석법의 경우 표지화 항원은 그의 항체에 대한 반응을 위해 고농도이어야 한다. 또한, 경쟁 면역분석법은 표지화 항원양의 거의 20분의 1 정도로 낮은 측정 감도를 나타낸다.
비경쟁 면역분석법은 측정하고자 하는 표적 항원을 포획하기 위해 과량의 불용화 항체로 표면을 도포시킨 고상물을 사용하는 샌드위치식 면역분석법이다. 고상물을 세척하고 이어서 과량의 표지화 항체와 함께 배양시켜 표지화 항체가 포획된 표적 항원과 반응할 수 있도록 한다. 과량의 표지화 항체는 고상물로부터 세척하여 제거한다. 표적 항원의 양은 항원에 결합하는 표지화 항체 상에 제공된 표지의 양으로부터 측정한다. 샌드위치식 면역분석법은 높은 측정 감도를 제공할 수 있으나, 표지화 항체가 고상물에 비특이적으로 결합하는 경향이 있으므로, 샌드위치식 면역분석의 감도 및 측정 가능 범위가 상당히 감소된다.
그러므로, 본 발명의 주 목적은, 샌드위치식 면역분석의 정확도를 향상시키기 위하여, 표지화 항체가 고상물에 비특이적으로 결합하는 정도를 감소시키는 것이다.
본 발명의 다른 목적은, 샌드위치식 면역분석법에서 표지화 항체가 고상물에 비특이적으로 결합하는 정도를 상당한 정도까지 감소시키기 위한 용도의 개선된 시약 조합물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 샌드위치식 면역분석법에서 있어 감도 및 측정 가능 범위를 증가시키기 위한 용도의 개량된 시약 조합물을 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 목적은, 샌드위치식 면역분석법에 있어 편차 정도를 감소시키기 위한 용도의 개량된 시약 조합물을 제공하는 것이다.
본 발명에 의하면, 표지화 항체와 고상 항체 사이에 항원을 포획하기 위한 반응 용액 존재하에, 항원과 반응성인 표지화 항체 및 고상 항체를 사용하는 샌드위치식 면역분석법에 사용하기 위한 용도의 고상 항체, 표지화 항체 및 반응 용액으로 되는 조합물이 제공된다. 표지화 항체는 토끼로부터 유래되고, 고상 항체는 염소로부터 유래된 것이다.
이하, 본 발명의 일실시 태양을 기술한다. 표적 항원은, 제 1 항체와 제 2 항체 사이에 표적 항원을 포획하기 위하여, 반응 용액 존재하에 특이적으로 표적 항원과 반응하는 제 1 항체 및 제 2 항체를 사용하는 샌드위치식 효소 면역분석법(EIA)에 의해 분석한다. 항체는 표적 항원을 주사한 선택된 동물에서 재취한 혈청으로부터 얻는다. 제 1 항체는 폴리스티렌 볼과 같은 고상물에 도포된 고상 항체를 가리킨다. 제 2 항체는 그 위에 표지 효소가 결합된 표지화 항체를 가리킨다. 표지 효소는 글루코오스 옥시다제, 퍼옥시다제, 알칼리성 포스파타제, β-D-갈락토시다제 등일 수 있다. 표적 항원의 양에 대응하는 표지 효소의 양을 측정하기 위해서는 화학 발광법을 사용한다. 표적 항원이 α-페토프로테인(AFP)이고, 표지 효소가 글루코오스 옥시다제(GOD)라는 가정하에 이 방법을 상세히 서술하겠다. 사용된 반응 용액은 0.1% 아지드화 나트륨, 0.2% 소 혈청 알부민(BSA), 및 0.337% NaCl을 함유하는 0.056mol/l 인산나트륨 완충액(pH 6.3)이다. 이 반응 용액을 반응 용액 A라 한다.
먼저, AFP를 토끼, 염소 등에서 선택된 동물의 배면 피부에 1주 간격으로 6회 주사한다. 7주째에, 부스터를 선택된 동물에 주사한다. 5일 후 선택된 동물로 부터 혈액 적당량을 채혈한다.
채취한 혈액 혈청으로 부터 다음과 같은 방법으로 항-AFP 면역글로블린 G(IgG)를 정제한다. 먼저, 포화 황산암모늄 2ml를 혈청 2ml중에 적가한다. 생성된 용액을 4℃의 온도에서 2 또는 3시간 동안 서서히 진탕시킨다. 이어서 생성된 혼탁 용액을 원심분리관 중에 넣는다. 4℃의 온도에서 3000rpm의 속도로 회전하는 원심분리기를 사용하여 15분 동안 원심분리시킨다. 원심분리관으로 부터 상징액을 제거하고, 침전물은 5mmol/l 에틸렌디아민테트라 아세트산(EDTA)을 함유하는 0.1mol/l 인산나트륨 완충액(pH 6.0) 2ml중에 용해시킨다. 생성된 용액을 5mmol/l 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)을 함유하는 0.1mol/l 인산 나트륨 완충액(pH 6.0)으로 평형시킨 Sephacryl S-300[스웨덴 소재의 파마시아 파인 케미칼스(Pharmacia Fine Chemicals) 상표] 컬럼(1×90cm)상에서 6ml/시간의 유속으로 용출시킨다. 용출된 용액을 1ml 시료로 분할한다. 280nm 광을 흡수하는 항-AFP IgG 분획물을 각 시료로 부터 모은다.
일본 소재의 이찌꼬사(Ichiko Co.)로 부터 구입한 폴리스티렌 볼(직경 6.5mm)을 온도 4℃, 0.1mg/ml의 항-AFP IgG를 함유하는 0.1mol/l의 인산나트륨 완충액(pH 7.5)중에서 철야 침지시킴으로써 물리적인 흡수에 의해 고상물 상에 생성된 항-AFP IgG를 도포시킨다. IgG로 도포된 폴리스티렌 볼을 0.1mol/l 인산나트륨 완충액(pH 7.0)으로 3회 세척하고, 이어서 0.1mol/l NaCl, 0.1% 소 혈청 알부민(BSA)가 0.1% NaN3을 함유하는 0.01mol/l 인산나트륨 완충액(pH 7.0)으로 3회 세척한다. 세척한 폴리스티렌 볼은, 4℃의 온도에서 0.1mol/l NaCl, 0.1% 소 혈청 알부민(BSA)과 0.1% NaN3을 함유하는 0.01mol/l 인산나트륨 완충액(pH 7.0)중에 저장한다.
표지화 항체, 항-AFP IgG-GOD는 다음과 같은 3단계의 방법으로 제조한다.
(1) 말레이미드 글루코오스 옥시다제(말레이미드 GOD)를 다음과 같은 방법으로 제조한다. 숙신이미딜-4-말레이미도부티레이트(GMBS)를 0.1mol/l 인산나트륨 완충액(pH 7.0) 0.3ml를 함유하는 4개의 시험관에 각각 넣은 글루코오스 옥시다제(GOD) 약 3mg를 함유하는 4개의 시험관에 각각 넣은 글루코오스 옥시다제(GOD) 약 3mg에 첨가하여 GOD/GMBS의 비율이 1/50인 용액을 제조한다. 이 용액을 30℃의 온도에서 1시간 동안 배양시켰다. 생성된 용액을, 0.1mol/l 인산나트륨 완충액(pH 6.0)으로 평형시킨 Sephadex G-25(스웨덴 소재의 파르마시아파인 케미칼스 상표) 컬럼(1×30cm)상에서 12ml/시간의 유속으로 탈염시킨다. 탈염된 용액을 1ml씩의 말레이미드 GOD 시료로 분할한다.
(2) 술프히드릴화 항-AFP 면역글로불린 G(SH-IgG)를 다음과 같은 방법으로 제조한다. 먼저, 항-AFP IgG 10mg, 0.1mol/l 인산나트륨 완충액(pH 6.0)과 5mmol/l 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)을 함유하는 IgG 용액 2ml를 제조한다. 이 IgG 용액을 N,N-디메틸포름아미드(DMF)중에 용해시킨 S-아세틸머캅토숙신산 무수물(ASMSa)을 함유하는 용액에 첨가하여 IgG /ASMSa 비율이 몰 농도로서 1/300인 용액을 제조한다. 생성된 용액을 30℃의 온도에서 30분 동안 진탕시킨다. 이어서 이 용액에 0.1mol/l 트리스-HC1 완충액(pH 7.0) 0.1ml, 0.1mol/l 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)(pH 7.0) 0.02ml와 1mol/l 히드록실아민 염산염(pH 7.0) 0.1ml를 첨가한다. 생성된 용액을 30℃의 온도에서 4분 동안 배양시키고, 이어서 생성된 용액을 5mmol/l 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)을 함유하는 0.1mol/l 인산나트륨 완충액(pH 6.0)으로 평형시킨 Sephadex G-25(스웨덴 소재의 파르마시아 파인 케미칼스 상표) 컬럼(1×30cm)상에서 12ml/시간의 유속으로 탈염시킨다. 탈염된 용액을 1ml씩의 SH-IgG 시료로 분할한다. 이 SH-IgG 시료들을 빙냉 콜로디온 백 중에서 농축시킨다.
3) 표지화 항체를 다음과 같은 방법으로 제조한다. 말레이미드 GOD를 말레이미드 GOD와 동일한 몰 농도를 갖는 SH-IgG 용액에 첨가한다. 생성된 용액을 30℃의온도에서 1시간 및 이어서 4℃의 온도에서 철야 정치시킨 후, 5mmol/l 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)을 함유하는 0.1mol/l 인산나트륨 완충액(pH 6.5)으로 평형시킨 Sephacryl S-300(스웨덴 소재의 파르마시아 파인 케미칼스 상표) 컬럼(1×90cm)상에서 6ml/시간의 유속으로 용출시킨다. 용출된 용액을 1ml 시료로 분할한다. 각 시료로 부터 항-AFP IgG-GOD(표지화 항체)를 모은 후, 4℃의 온도에서 0.1% NaN3와 0.1% 소 혈청 알부민(BSA)을 함유하는 용액 중에 저장한다.
표지화 항체(항-AFP IgG-GOD)를 반응 용액 A[0.1% 아지드화 나트륨, 0.2% 소 혈청 알부민(BSA)과 0.337% NaCl을 함유하는 0.056mol/l 인산나트륨 완충액(pH 6.3)] 존재하에 다음과 같은 방식으로 항원(AFP)을 통하여 고상 항체(항-AFP IgG)에 결합시킨다. 분석 시험관 중에서, 항-AFP IgG-도포된 폴리스티렌 볼을 반응 용액 A로 희석한 AFP(항원)과 함께 실온에서 6시간 동안 배양시켰다. 이어서 폴리스티렌 볼을 증류수로 3회 세척한다. 세척한 폴리스티렌 볼을 기니아피그 혈청을 혼합한 반응 용액 A중에서 항-AFP IgG-GOD(표지화 항체)와 함께 실온에서 철야 배양시킨다. 이어서, 폴리스티렌 볼을 증류수로 다시 세척하고, 또 다른 깨끗한 분석 시험관으로 옮긴다.
표지 효소의 양, 즉 항원의 양을 측정하기 위하여 화학발광법을 사용한다. 우선, 0.5mol/l 글루코오스를 함유하는 0.01mol/l 아세트산염 완충액(pH 5.1) 0.3ml를 분석시험관에 첨가시킨다. 분석시험관을 37℃의 온도에서 2시간 동안 정치시킨다. 생성된 용액을 취하여 0.1ml 시료를 만든다. 이 시료에 2×10-7mol/l 루미놀을 함유하는 0.2mol/l 탄산염 완충액(pH 9.8) 0.5ml를 첨가하고, 이어서 6×10-3mol/l 칼륨 페리시아나이드 0.5ml를 첨가한다. 생성되는 과산화수소의 농도는 루미놀과 칼륨 페리시아나이드와 과산화수소의 화학발광 반응시 방출되는 광선을 발광측정기(Luminometer) UPD-8000[일본 소재의 메이덴샤 일렉트릭 엠에프지사(Meidensha Electric Mfg., Co.) 상표]으로 측정하는데, 발광 측정기는 루미놀 및 칼륨 페리시아나이드를 분석시험관에 첨가한 후 15초 후에 작동을 개시하여 30초간 방출되는 광의 수를 측정한다.
항원은 α-페토프로테인(AFP)에 관련하여 기재하였으나, 이것은 항암 태아 항원(CEA)등일 수도 있다. 항-CEA IgG는, CEA를 1주 간격으로 6회 주사하고, 7주째에 부스터를 주사한, 토끼, 염소등을 포함한 동물 중에서 선택된 동물 중 어느 하나의 동물로 부터 채취한 혈청으로부터 정제한다.
이와 같은 샌드위치식 효소 면역분석법(EIA)에 있어서의 심각한 문제는 비교적 많은 양의 표지화 항체가 고상물에 비특이적으로 결합함으로써 샌드위치식 효소 면역분석의 정확도가 감소하는 경향이 있다는 점이다. 본 발명자들은 표지화 항체를 토끼로부터 얻은 혈청으로부터 제조하고, 고상 항체는 염소로부터 유래된 혈액 혈청으로 부터 제조하는 경우에, 표지화 항체가 고상물에 비특이적으로 결합하는 정도가 감소됨을 발견하였다. 효과적인 고상물과 표지화 항체의 조합을 찾아내기 위하여 다수의 시험을 행하였다.
표지화 항체가 고상물에 비특이적으로 결합하는 정도를 측정하였다. 이 목적을 위해서, IgG-도포된 폴리스티렌 볼을 분석시험관 중에서, 기니아피그 혈청을 혼합시킨 반응 용액 A 0.3ml로 100배 희석한 IgG-GOD와 함께 실온에서 철야 배양하였다. 폴리스티렌 볼을 반응 용액 A로 3회 세척하고, 이어서 또 다른 깨끗한 분석시험관에 옮겼다. 그후, 0.5mol/l 글루코오스를 함유하는 0.01mol/l 아세트산염 완충액(pH 5.1) 0.3ml 분석시험관에 첨가하였다. 분석시험관을 37℃에서 2시간 동안 정치시켰다. 생성된 용액을 취하여 0.1ml 시료를 만들었다. 이 시료에 2×10-7mol/l 루미놀을 함유하는 0.2mol/l 탄산염 완충액(pH 9.8) 0.5ml를 첨가하고, 이어서 6×10-3mol/l 칼륨 페리시아나이드 0.5ml를 첨가하였다. 루미놀과 칼륨 페리시아나이드 및 생성되는 과산화수소의 화학발광 반응시 방출되는 광선을 발광측정기 UPD-8000로 측정하는데, 발광측정기는 루미놀 및 칼륨 페리시아나이드를 분석시험관에 첨가한지 15초 후에 작동을 개시하여 30초 동안 방출된 광선의 수를 측정하였다. 표지화 항체가 고상물에 비특이적으로 결합하는 정도는 C1/C2×100(%)로 주어지는 비특이적 결합비율로서 나타내는데, 여기에서 C1은 폴리스티렌 볼에 결합하는 표지화 항체를 측정한 집계이고, C2는 분석시험관 중에 사용된 표지화 항체의 총량에 해당하는 집계이다.
실시예 1
표지화 항체로는 토끼 항-AFP IgG-GOD를 사용하였고, 고상 항체로는 염소 항-AFP IgG를 사용하였다. 토끼 항-AFP IgG는 노르딕사(Nordic Co.) 품목 제16-184호였다. 염소 항-AFP IgG-도포된 폴리스티렌 볼을 기니아피그 혈청과 혼합된 반응 용액 A의 존재하에 토끼 항-AFP IgG-GOD와 함께 배양시켰다.
실시예 2
표지화 항체로는 정상 토기 IgG-GOD를 사용하였고, 고상 항체로는 정상 염소 IgG를 사용하였다. 정상 토끼 IgG는 마일즈사(Miles Co) 품목 제0019호였다. 정상 토끼 IgG-도포된 폴리스티렌 볼을 기니아피그 혈청과 혼합된 반응 용액 A의 존재하에 정상 토끼 IgG-GOD와 함께 배양시켰다.
본 발명에 의해 얻을수 있는 비특이적 결합의 감소 효과를 비교하기 위하여, 다음과 같은 비교예에 대해 시험을 행하였다.
비교예 1
표지화 항체로는 염소 항-AFP IgG-GOD를 사용하였고, 고상 항체로는 염소 항-AFP IgG를 사용하였다. 염소 항-AFP IgG-도포된 폴리스티린렌 볼을 기니아피그 혈청과 혼합된 반응 용액 A의 존재하에 염소 항-AFP IgG-GOD와 함께 배양시켰다.
비교예 2
표지화 항체로는 토끼 항-AFP IgG-GOD를 사용하였고, 고상 항체로는 토끼 항-AFP IgG를 사용하였다. 토끼 항-AFP IgG-도포된 폴리스티렌 볼을 기니아피그 혈청과 혼합된 반응 용액 A의 존재하에 토끼 항-AFP IgG-GOD와 함께 배양시켰다.
비교예 3
표지화 항체로는 정상 염소 IgG-GOD를 사용하였고, 고상 항체로는 정상 염소 IgG를 사용하였다. 정상 염소 IgG-도포된 폴리스티렌 볼을 기니아피그 혈청과 혼합된 반응 용액 A의 존재하에 정상 염소 IgG-GOD와 함께 배양시켰다.
비교예 4
표지화 항체로는 정상 토끼 IgG-GOD를 사용하였고, 고상 항체로는 정상 토끼 IgG를 사용하였다, 정상 토끼 IgG-도포된 포리스티렌 볼을 기니아피그 혈청과 혼합된 반응 용액 A의 존재하에 정상 토끼 IgG-GOD와 함께 배양시켰다.
이들 비특이적으로 결합 시험 결과를 하기 표 1에 나타내었다.
[표 1]
Figure kpo00001
표지화 항체 및 고상 항체는 모두 토끼로부터 유래되거나 또는 표지화 항체 및 고상 항체가 염소로부터 유래된 조합물인 경우, 비특이적 결합율은 0.078% 내지 0.190%이다.
표지화 항체는 토끼로부터 유래되고, 고상 항체는 염소로부터 유래된 조합물인 경우, 비특이적 결합율은 0.015% 내지 0.017%이다. 상기 시험 결과로부터, 표지화 항체가 고상물에 비특이적으로 결합하는 정도는 표지화 항체가 토끼로부터 유래되고, 고상 항체는 염소로부터 유래된 것인 경우에 현저하게 감소될 수 있음을 알 수 있다.
이와 같은 샌드위치식 효소 면역분석의 감도 및 측정 가능 범위를 측정하였다. 이 목적을 위해서, 항-AFP IgG-도포된 폴리스티렌 볼을 분석시험관 중에서 반응 용액 A 0.2ml로 희석한 AFP 표준 용액 0.1ml와 함께 6시간 동안 실온에서 배양시켰다. 폴리스티렌 볼을 반응 용액 A로 3회 세척하였다. 세척한 폴리스티렌 볼을, 기니아피그 혈청과 혼합된 반응 용액 A에 의해 적당비로 희석한 항-AFP IgG-GOD 표지화 항체 0.1ml와 함께 배양시켰다. 분석시험관을 실온에서 철야 정치시켰다. 이어서, 폴리스티렌 볼을 반응 용액 A로 3회 세척한 후, 또 다른 깨끗한 분석시험관으로 옮겼다. 그후, 이 분석시험관에 글루코오스 0.5mol/l를 함유하는 0.01mol/l 아세트산염 완충액(pH 5.1) 0.3ml를 첨가하였다. 분석시험관을 37℃에서 2시간 동안 정치시켰다. 생성된 용액을 취하여 0.1ml 시료를 만들었다. 이 시료에 2×10-7mol/l 루미놀을 함유하는 0.2mol/l 탄산염 완충액(pH 9.8) 0.5ml를 첨가하고, 이어서 6×10-3mol/l 칼륨 페리시아나이드 0.5ml를 첨가하였다. 루미놀과 칼륨 페리시아나이드 및 생성된 과산화수소의 화학발광 반응시 방출되는 광선을 발광 측정기 UPD-8000을 사용하여 측정하였는데, 발광 측정기는 루미놀 및 칼륨 페리시아나이드를 분석시험관에 첨가한 후 15초 후에 작동을 개시하여, 30초 간 방출된 광선의 수를 측정하였다. 정상 토끼 IgG 항체 및 정상 염소 IgG 항체에 대해서도 유사한 처리를 반복한다.
샌드위치식 효소 면역분석 감도 및 특정 가능 범위에 대한 시험 결과를 첨부 도면 제 1 도에 나타내었다. 제 1 도는 실시예 1 및 비교예 1 및 2에 관한 것이다. 이들 시험 결과로 부터, 샌드위치식 효소 면역분석의 감도 및 측정 가능 범위는 표지화 항체가 토끼로부터 유래되고, 고상 항체는 염소로부터 유래된 경우가, 고상 항체 및 표지화 항체가 모두 토끼로부터 유래되거나 또는 표지화 항체 및 고상 항체가 모두 염소로부터 유래된 경우에서 얻은 결과보다 우수함을 알 수 있다.
실시예 1 및 비교예 1 및 2에서의 항체를 사용하여, 1일 이내에 샌드위치식 효소 면역 분석을 10회 반복하였다(일괄 분석 : within assay). 그 결과를 하기 표 2 및 3에 나타내었다. 마찬가지로, 실시예 1 및 비교예 1 및 2에서의 항체를 사용하여, 상이한 매 6일에 샌드위치식 효소 면역분석을 6회 반복하였다(기간 분석 :between assay).
그 결과를 하기 표 4 및 5에 나타내었다.
[표 2]
Figure kpo00002
[표 3]
Figure kpo00003
[표 4]
Figure kpo00004
[표 5]
Figure kpo00005
이들 결과로 부터, 표지화 항체는 토끼로부터 유래되고, 고상 항체가 염소로부터 유래된 경우가 표지화 항체 및 고상 항체가 모두 토끼로부터 유래되거나 또는 표지화 항체 및 고상 항체가 모두 염소로부터 유래된 경우보다 보다 작은 샌드위치식 효소 면역분석 결과 변화를 얻을 수 있음을 알 수 있다.
첨부 도면 제 2 도에는 면역글로불린 G(IgG)의 구조를 개략적으로 나타내었다. IgG 구조는 펩신 존재하에 37℃에서 18시간 동안 정치시킬 경우, 항원-결합 F(ab')2단편과 결정화 (Fc)단편으로 분리될 수 있다. Fc 단편은 세포에 흡착되는 P4 부분을 갖는다. Fc 단편은 항원에 결합할 능력이 없고, 저온에서 결정화된다. F(ab')2단편은 환원 공정하에서, 예를 들면 머캅토에틸아민 존재하에 항원에 결합할 수 있는 P1 부분을 갖는 2개의 Fab' 단편으로 분리될 수 있다. 본 발명자들은, 표지화 항체가 고상물에 비특이적으로 결합하는 정도는 Fc단편의 존재 여부에 의존하며, 이것은 고상 항체는 염소로부터 유래되고, 표지화 항체는 토끼로부터 유래된 경우에, IgG-GOD를 Fab'-GOD로 대체시킴으로써 감소시킬 수 있음을 발견하였다. Fab' 단편은 다음과 같은 방법으로 IgG로부터 Fc 단편을 분히시킴으로써 제조한다.
우선 상기한 바와 같은 선택된 동물로 부터 채취한 혈청 2ml중에 포화 황산암모늄 2ml를 적가한다. 생성된 용액을 4℃에서 2시간 또는 3시간 동안 서서히 진탕시킨다. 이어서 생성된 혼탁 용액을 원심분리관에 넣는다. 3000rpm의 속도로 회전하는 원심분리기를 사용하여 4℃에서 15분 동안 원심분리시킨다. 원심분리관으로부터 상징액을 제거하고, 침전물을 5mmol/l 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)을 함유하는 0.1mol/l 인산나트륨 완충액(pH 6.0) 2ml로 용해시킨다. 생성된 용액을, 0.1mmol/l NaCl을 함유하는 0.1mol/l 아세트산염 완충액(pH 4.5)으로 평형시킨 Sephacryl S-300(스웨덴 소재의 파르마시아 파인 케미칼스 상표) 컬럼(1×90cm) 상에서 6ml/시간의 유속으로 용출시킨다. 용출된 용액을 1ml 시료로 분할한다. 각 시료로부터 280nm에서 광선을 흡수하는 IgG 분획물을 모은다. 그후, 3mg/ml 펩신 용액 0.1ml를 모은 IgG에 첨가한다. 생성된 용액을 37℃의 온도에서 18시간 동안 배양시킨다. 생성된 용액을 0.1mol/l 인산나트륨 완충액(pH 7.5)으로 평형시킨 Sephacryl S-200(스웨덴 소재의 파르마시아 파인 케미칼스 상표) 컬럼(1×90cm) 상에서 6ml/시간의 유속으로 용출시킨다. 용출된 용액을 1ml 시료로 분할한다. 각 시료로부터 280nm에서 광선을 흡수하는 F(ab')2분획물을 모은다. 모은 F(ab')2에 0.1mol/l 머캅토에틸아민 0.05ml를 첨가하고, 37℃의 온도에서 90분 동안 배양시킨다. 생성된 용액을 5mmol/l EDTA를 함유하는 0.1mol/l 인산나트륨 완충액(pH 6.0)으로 평형시킨 Sephadex G-25(스웨덴 소재의 파르마시아 파인 케미칼스 상표) 컬럼(1×30cm) 상에서 6ml/시간의 유속으로 탈염시킨다. 탈염된 용액을 1ml의 Fab' 시료로 분할한다.
Fab'-GOD 표지화 항체가 고상물에 비특이적으로 결합하는 데에 대한 유리한 효과를 입증하기 위하여, 앞서 기술한 바와 실제로 동일한 방법으로 다회의 시험을 행하였다.
실시예 3
표지화 항체로는 토끼 항-AFP Fab'-GOD를 사용하였고, 고상 항체로는 염소 항-AFP IgG를 사용하였다. 염소 항-AFP IgG-도포된 폴리스티렌 볼을 기니아피그 혈청과 혼합된 반응 용액 A의 존재하에 토끼 항-AFP Fab'-GOD와 함께 배양시켰다.
실시예 4
표지화 항체로는 토끼 항-CEA Fab'-GOD를 사용하였고, 고상 항체로는 염소 항-CEA IgG를 사용하였다. 염소 항-CEA IgG-도포된 포리스티렌 볼을 기니아피그 혈청과 혼합된 반응 용액 A의 존재하에 토끼 항-CEA Fab'-GOD와 함께 배양시켰다.
본 발명에 의해 얻을 수 있는 비특이적 결합 감소의 효과를 비교하기 위하여, 다음과 같은 비교예에 대해 시험을 행하였다.
비교예 5
표지화 항체로는 토끼 항-AFP IgG-GOD를 사용하였고, 고상 항체로는 염소 항-AFP IgG를 사용하였다. 염소 항-AFP IgG-도포된 폴리스티렌 볼을 기니아피그 혈청과 혼합된 반응 용액 A의 존재하에 토끼 항-AFP IgG-GOD와 함께 배양시켰다.
비교예 6
표지화 항체로는 토끼 항-AFP Fab'-GOD를 사용하였고, 고상 항체로는 토끼 항-AFP IgG를 사용하였다. 토끼 항-AFP IgG-도포된 폴리스티렌 볼을 기니아피그 혈청과 혼합된 반응 용액 A의 존재하에 토끼 항-AFP Fab'-GOD와 함께 배양시켰다.
비교예 7
표지화 항체로는 염소 항-AFP Fab'-GOD를 사용하였고, 고상 항체로는 염소 항-AFP IgG를 사용하였다. 염소 항-AFP IgG-도포된 폴리스티렌 볼을 기니아피그 혈청과 혼합된 반응 용액 A의 존재하에 염소 항-AFP Fab'-GOD와 함께 배양시켰다.
비교예 8
표지화 항체로는 토끼 항-CEA IgG-GOD를 사용하였고, 고상 항체로는 염소 항-CEA IgG를 사용하였다. 염소 항-CEA IgG-도포된 폴리스티렌 볼을 기니아피그 혈청과 혼합된 반응 용액 A의 존재하에 염소 항-CEA IgG-GOD와 함께 배양시켰다.
비교예 9
표지화 항체로는 토끼 항-CEA Fab'-GOD를 사용하였고, 고상 항체로는 토끼 항-CEA IgG를 사용하였다. 토끼 항-CEA IgG-도포된 폴리스티렌 볼을 기니아피그 혈청과 혼합된 반응 용액 A의 존재하에 토끼 항-CEA Fab'-GOD와 함께 배양시켰다.
비교예 10
표지화 항체로는 염소 항-CEA Fab'-GOD를 사용하였고, 고상 항체로는 염소 항-CEA IgG를 사용하였다. 염소 항-CEA IgG-도포된 폴리스티렌 볼을 기니아피그 혈청과 혼합된 반응 용액 A의 존재하에 염소 항-CEA Fab'-GOD와 함께 배양시켰다.
상기 비특이적 결합 시험 결과를 하기 표 6에 나타내었다.
[표 6]
Figure kpo00006
Figure kpo00007
상기 시험 결과로부터, 표지화 항체가 고상물에 비특이적으로 결합하는 정도는 표지화 항체가 토끼 Fab'이고, 고상 항체가 염소 IgG인 경우가 표지화 항체가 토끼 Fab'이고 고상 항체가 토끼 IgG이거나 또는 표지화 항체가 염소 Fab'이고, 고상 항체가 염소 IgG인 경우보다 현저히 감소될 수 있음을 알 수 있다.
샌드위치식 효소 면역분석의 측정 가능 범위 및 검출 한계를 상기한 방법과 실질적으로 동일한 방법으로 측정하였다. 샌드위치식 효소 면역분석 측정 가능 범위 및 검출 한계 결과를 하기 표 7-10에 나타내었다.
[표 7]
Figure kpo00008
[표 8]
Figure kpo00009
[표 9]
Figure kpo00010
[표 10]
Figure kpo00011
이들 시험 결과로 부터 알 수 있는 바와 같이, 샌드위치식 효소 면역분석의 측정 가능 범위 및 검출 한계는 표지화 항체로서 Fab'-GOD를 사용하는 경우가 표지화 항체로서 IgG-GOD를 사용하는 경우보다 우수하다. 또한, 샌드위치식 효소 면역분석의 측정 가능 범위 및 검출 한계는 표지화 항체가 토끼 Fab'이고 고상 항체가 염소 IgG인 경우가 표지화 항체가 토끼 Fab'이고 고상 항체가 토끼 IgG이거나 또는 표지화 항체가 염소 Fab'이고 고상 항체가 염소 IgG인 경우보다 우수하다.
상기 실시예 3-4 및 비교예 8-10에서의 항체를 사용하여, 1일 이내에 샌드위치식 효소 면역분석을 10회 반복하였다(일괄 분석). 그 결과를 하기 표 11-14에 나타내었다. 마찬가지로, 실시예 3-4 및 비교예 5-10의 항체를 사용하여, 상이한 매 6일에 샌드위치식 효소 면역분석을 6회 반복하였다(기간 분석). 그 결과를 하기 표 15-18에 나타내었다.
[표 11]
Figure kpo00012
[표 12]
Figure kpo00013
[표 13]
Figure kpo00014
[표 14]
Figure kpo00015
[표 15]
Figure kpo00016
[표 16]
Figure kpo00017
[표 17]
Figure kpo00018
[표 18]
Figure kpo00019
이들 결과로 부터 표지화 항체가 토끼 Fab'이고, 고상 항체가 염소 IgG인 경우, 샌드위치식 효소 면역분석 결과에 있어서 보다 작은 편차를 얻을 수 있음을 알 수 있다.
본 발명자들은 또한 표지화 항체를 항원을 통하여 고상 항체에 결합시키는 반응 용액 A에 정상 기니아피그 혈청을 첨가함으로써 표지화 항체가 고상물에 비특이적으로 결합하는 정도를 감소시킬 수 있음을 발견하였다. 표지화 항체가 고상물에 비특이적으로 결합하는 정도에 대한 유효한 효과를 증명하기 위해서 수회의 시험을 행하였다.
실시예 5
표지화 항체로는 토끼 항-AFP IgG-GOD를 사용하였고, 고상 항체로는 염소 항-AFP IgG를 사용하였다. 반응 용액은 반응 용액 A와 정상 기니아피그 혈청의 혼합물이었다.
표지화 항체가 고상물에 비특이적으로 결합하는 정도를 측정하였다. 이 목적을 위해서, 토끼 항-AFP IgG-GOD-도포된 폴리스티렌 볼을 분석시험관 중에서, 반응 용액 A[0.1% 이지드화 나트륨, 0.2% 소 혈청 알부민(BSA)과 0.337% NaCl을 함유하는 0.056mol/l 인산나트륨 완충액(pH 6.3)] 및 정상 기니아피그 혈청을 함유하는 반응 용액의 혼합물 X 0.3ml로 희석한 염소 항-AFP IgG와 함께 실온에서 철야 배양시켰다. 정상 기니아피그 혈청대 반응 용액 A의 용적비는 1 : 5였다. 폴리스티렌 볼을 반응 용액 혼합물 X로 3회 세척하고, 이어서 다른 깨끗한 분석시험관으로 옮겼다. 그후 0.5mol/l 글루코오스를 함유하는 0.01mol/l 아세트산염 완충액(pH 5.1) 0.3ml를 분석시험관에 첨가하였다. 분석시험관을 37℃에서 2시간 동안 정치시켰다. 생성된 용액을 취하여 0.1ml 시료를 만들었다. 이 시료에 2×10-7mol/l 루미놀을 함유하는 0.2mol/l 탄산염 완충액(pH 9.8) 0.5ml를 첨가하고, 이어서 6×10-3mol/l 칼륨 페리시아나이드 0.5ml를 첨가하였다. 루미놀과 칼륨 페리시아나이드 및 생성된 과산화수소의 화학발광 반응시 방출되는 광선을 발광측정기 UPD-8000(일본 소재의 메이덴샤 일렉트릭 엠에프지사. 상표)을 사용하여 측정하였는데, 발광측정기는 칼륨 페리시아나이드를 분석시험관에 첨가한지 15초 후에 가동을 시작하여, 30초 동안 방출된 광선의 수를 측정하였다. 표지화 항체가 고상물에 비특이적으로 결합하는 정도는 C1/C2×100(%)로 주어지는 비특이적 결합비율로써 나타내는데, 여기에서 C1은 폴리스티렌 볼에 결합된 표지화 항체의 측정 집계이고, C2는 분석시험관 중에 사용된 표지화 항체의 총량에 해당하는 집계이다. 본 발명에 의해 얻을 수 있는 비특이적 결합 감소를 비교하기 위하여, 다음과 같은 비교예에 대하여 실질적으로 동일한 방법으로 시험을 행하였다.
비교예 11
표지화 항체로는 토끼 항-AFP IgG-GOD를 사용하였고, 고상 항체로는 염소 항-AFP IgG를 사용하였다. 반응 용액으로는 정상 토끼 혈청과 혼합된 반응 용액 A를 사용하였다. 정상 토끼 혈청 대 반응 용액 A의 용적비는 1 : 5였다.
비교예 12
표지화 항체로는 토끼 항-AFP IgG-GOD를 사용하였고, 고상 항체로는 염소 항-AFP IgG를 사용하였다. 반응 용액으로는 정상 염소 혈청과 혼합된 반응 용액 A를 사용하였다. 정상 염소 혈청 대 반응 용액 A의 용적비는 1 : 5였다.
비교예 13
표지화 항체로는 토끼 항-AFP IgG-GOD를 사용하였고, 고상 항체로는 염소 항-AFP IgG를 사용하였다. 반응 용액으로는 정상 말 혈청을 혼합시킨 반응 용액 A를 사용하였다. 정상 말 혈청 대 반응 용액 A의 용적비는 1 : 5였다.
비교예 14
표지화 항체로는 토끼 항-AFP IgG-GOD를 사용하였고, 고상 항체로는 염소 항-AFP IgG를 사용하였다. 반응 용액으로서는 반응 용액 A를 사용하였다.
비특이적 결합 시험 결과를 첨부 도면 제 3 도에 나타내었다. 비특이적 결합율을 실시예 5의 경우 0.006% 정도로 낮았다. 한편, 비교예 11-14에서의 비특이적 결합율은 0.016% 내지 0.25%였다. 따라서, 표지화 항체가 고상물에 비특이적으로 결합하는 정도는 정상 기니아피그 혈청을 반응 용액에 첨가함으로써 현저한 정도까지 감소시킬 수 있음이 명백하다.
상기한 방법과 실질적으로 동일한 방법으로 행한 샌드위치식 효소 면역분석의 감도 및 측정 가능 범위를 다음 실시예에 대해 측정하였다.
실시예 6
표지화 항체로는 토끼 항-AFP IgG-GOD를 사용하였고, 고상 항체로는 염소 항-AFP IgG를 사용하였다. 반응 용액으로는 반응 용액 A와 정상 기니아피그 혈청의 혼합물을 사용하였다. 정상 기니아피그 혈청 대 반응 용액 A의 용적비는 1 : 5였다.
염소 항-AFP IgG-도포된 폴리스티렌 볼을 분석시험관 중에서, 반응 용액 A 0.3ml로 희석한 AFP 표준 용액과 함께 실온에서 6시간 동안 배양시켰다. 폴리스티렌 볼을 반응 용액 A로 3회 세척하였다. 세척한 폴리스티렌 볼을 정상 기니아피그 혈청과 혼합한 반응 용액 A의 혼합물로 적당비로 희석한 토끼 항-AFP IgG-GOD 표지화 항체 0.1ml와 함께 배양시켰다. 정상 기니아피그 혈청 대 반응 용액 A의 용적비는 1 : 5였다. 분석시험관을 실온에서 철야 정치시켰다. 이어서 폴리스티렌 볼을 반응 용액 A로 3회 세척한 후, 또 다른 깨끗한 분석시험관으로 옮겼다. 그후, 이 분석시험관에 0.5mol/l 글루코오스를 함유하는 0.01mol/l 아세트산염 완충액(pH 5.1)0.3ml를 첨가하였다. 이 분석시험관을 37℃에서 2시간 동안 정치시켰다. 생성된 용액을 취하여 0.1ml 시료를 만들었다. 이 시료에 2×10-7mol/l 루미놀을 함유하는 0.2mol/l 탄산염 완충액(pH 9.8) 0.5ml를 첨가하고, 이어서 6×10-3mol/l 칼륨 페리시아나이드 0.5ml를 첨가하였다. 루미놀과 칼륨 페리시아나이드 및 생성된 과산화수소의 화학발광 반응시 방출되는 광선을 발광측정기 UPD-8000을 사용하여 측정하였는데, 발광측정기는 루미놀과 칼륨 페리시아나이드를 분석시험관에 첨가한지 15초 후에 작동을 개시하여, 30초 동안 방출된 광선의 수를 측정하였다.
샌드위치식 효소 면역분석법에 대한 유리한 효과를 입증하기 위하여, 하기 비교예에 대하여 유사한 과정을 반복하였다.
비교예 15
표지화 항체로는 토끼 항-AFP IgG-GOD를 사용하였고, 고상 항체로는 염소 항-AFP IgG를 사용하였다. 반응 용액으로는 정상 기니아피그 혈청과 혼합되지 않은 반응 용액 A를 사용하였다.
첨부 도면 제 4 도에 그 결과를 나타내었다. 실시예 6에서 얻은 샌드위치식 면역분석 측정 가능 범위 및 감도는 각각 1.0-1000ng/ml 및 1.0ng/ml였다. 한편, 비교예 15에서 얻은 샌드위치식 효소 면역분석 측정 가능 범위 및 감도는 각각 50-1000ng/ml 및 50ng/ml였다. 따라서, 샌드위치식 효소 면역분석 감도 및 측정 가능 범위는 정상 기니아피그 혈청을 반응 용액 A에 첨가하는 경우에 향상됨이 명백하다.
상기 실시예 6 및 비교예 15에 대하여 1일 이내에 샌드위치식 효소 면역분석법을 10회 반복하였다(일괄 분석). 그 결과를 하기 표 19 및 20에 나타내었다. 마찬가지로, 실시예 6 및 비교예 15에 대하여 상이한 날들에 샌드위치식 효소 면역분석을 반복하였다(기간 분석). 이 결과를 하기 표 21 및 22에 나타내었다.
[표 19]
Figure kpo00020
[표 20]
Figure kpo00021
[표 21]
Figure kpo00022
[표 22]
Figure kpo00023
이들 결과로 부터, 정상 기니아피그 혈청을 반응 용액에 첨가하는 경우에, 샌드위치식 효소 면역분석 결과에 있어서 보다 적은 변화를 얻을 수 있음을 알 수 있다.
반응 용액은 인산나트륨 완충액(pH 6.3)을 함유하는 경우를 기재하였으나, 인산나트륨 완충액(pH 6.0-7.5), 붕산염 완충액(pH 8.0-8.5) 등으로 대체할 수도 있다. 표지화 항체는 글루코오스 옥시다제(GOD) 표지 효소를 함유하는 경우를 기재하였으나, 표지 효소는 퍼옥시다제, 알칼리성 포스파타제, β-D-갈락토시다제 등일 수도 있다. 또한, 본 발명에서는 샌드위치식 효소 면역분석과 관련하여 기재하였으나, 표지는 형광 물질(플루오레세인, 이소티오시아네이트, 테트라메틸로다민, 이소티오시아테이트 등), 화학 발광 물질(아미노에틸에틸 이소루미놀, 아미노부틸 에틸 이소루미놀, 아미노펜틸에틸 이소루미놀, 아미노헥실에틸 이소루미놀 등), 또는 방사선 동위원소(3H,14C,32P,125I,131I등)일 수 있다.

Claims (7)

  1. 표지화 항체 및 고상 항체 사이에 항원을 결합시키기 위하여, 반응 용액 존재하에서 항원과 반응성인 표지화 항체 및 고상 항체를 사용하고, 고상물에 결합되어 있는 고상 항체, 표지 효소가 항체에 결합되어 있는 표지화 항체 및 반응 용액을 포함하는 샌드위치식 면역분석법에 사용하기 위한 키트에 있어서, 표지화 항체의 고상 항체에 대한 비특이적 결합도를 감소시키기 위하여 표지화 항체는 토끼로부터 유래되고 고상 항체는 염소로부터 유래된 것을 특징으로 하는 키트.
  2. 제 1 항에 있어서, 표지화 항체는 표지 효소가 결합된 면역글로불린 G인 것인 키트.
  3. 제 1 항에 있어서, 표지화 항체는 표지 효소가 결합된 Fab' 단편이고, 이 Fab' 단편은 면역글로불린 G로부터 생성된 것인 키트.
  4. 제 1 항에 있어서, 반응 용액은 정상 기니아피그 혈청을 포함하는 것인 키트.
  5. 제 4 항에 있어서, 표지화 항체는 표지 효소가 결합된 면역글로불린 G인 것인 키트.
  6. 제 5 항에 있어서, 표지화 항체는 표지 효소가 결합된 Fab' 단편이고, 이 Fab' 단편은 면역글로불린 G로부터 생성된 것인 키트.
  7. 제 1 항에 있어서, 표지화 항체가 글루코오스 옥시다제인 것인 키트.
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KR20180069536A (ko) * 2016-12-15 2018-06-25 성균관대학교산학협력단 바이오센서, 이의 제조방법, 이를 포함하는 표적물질 검출용 키트 및 이를 이용한 표적물질 검출방법

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KR20180069536A (ko) * 2016-12-15 2018-06-25 성균관대학교산학협력단 바이오센서, 이의 제조방법, 이를 포함하는 표적물질 검출용 키트 및 이를 이용한 표적물질 검출방법

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