KR960016338B1 - 샌드위치식 면역분석용 키트 - Google Patents

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KR960016338B1 KR1019870006203A KR870006203A KR960016338B1 KR 960016338 B1 KR960016338 B1 KR 960016338B1 KR 1019870006203 A KR1019870006203 A KR 1019870006203A KR 870006203 A KR870006203 A KR 870006203A KR 960016338 B1 KR960016338 B1 KR 960016338B1
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Abstract

요약없음.

Description

샌드위치식 면역분석용 키트
제1도는 화학발광 강도와 hCG 양의 관계를 나타내는 그래프임.
제2도는 화학발광 강도와 AFP 양의 관계를 나타내는 그래프임.
제3도는 IgG 구조를 나타내는 모형도임.
제4도는 주어진 정상 기니아 피그 혈청 대 반응용액 A의 비율에 대해 비특이적 결합율을 도시한 그래프임.
제5도는 화학발광 강도와 hCG 양의 관계를 나타내는 그래프임.
제6도는 주어진 실시예에 대한 비특이적 결합율을 도시한 그래프임.
제7도는 화학발광 강도와 hCG 양의 관계를 나타내는 그래프임.
본 발명은 혈액 또는 기타 유기 시료중에 함유된 극소량의 성분을 측정하기 위하여 면역반응을 이용하는 샌드위치식 면역분석법에 관한 것이다. 더욱 구체적으로 본 발명은 이와 같은 샌드위치식 면역분석법에 사용하여 성분 측정의 정확도를 증가시키기 위한 개량된 시약 조합물, 즉 키트(kit)에 관한 것이다.
면역분석법은 면역반응 또는 항원-항체 반응을 이용함으로써 혈액 또는 기타 유기 시료중에 함유된 극소량의 성분을 측정하는데 널리 사용되어 왔다. 이와같은 면역분석법에는 일반적으로 "경쟁 면역분석법" 및 "비경쟁 면역분석법"의 두 종류가 있다. 경쟁 면역분석법은 표적 항원과 함께 경쟁적으로 예정된 양의 항체와 결합하는 예정된 양의 표지화 항원을 사용한다. 표적 항원이 항체에 결합된 표지화 항원의 양으로부터 측정하거나, 항체에 결합되지 않은 표지화 항원의 양으로부터 측정한다. 그러나, 경쟁 면역분석법의 경우 표지화 항원은 그것이 항체와 반응하기 위해서는 고농도이어야 한다. 또한, 경쟁 면역분석법은 표지화 항원 양의 거의 20분의 1 정도로 낮은 빈약한 측정 감도를 나타낸다.
비경쟁 면역분석법은, 측정하고자 하는 표적 항원을 포획하기 위하여 과량의 불용화 항체가 표면상에 도포된 고상물을 사용하는 샌드위치식 면역분석법이다. 고상물을 세척하고, 이어서 표지화 항체가 포획된 표적 항원과 반응할 수 있도록 과량의 표지화 항체와 함께 배양시킨다. 과량의 표지화 항체를 고상물로부터 세척하여 제거한다. 표적 항원의 양은 항원에 결합된 표지화 항체상의 표지의 양으로부터 측정한다. 샌드위치식 면역분석법은 높은 측정 감도를 제공할 수 있으나, 표지화 항체가 고상물에 비특이적으로 결합하는 경향이 있으므로, 샌드위치식 면역분석의 감도 및 측정가능 범위가 상당히 감소된다.
그러므로, 본 발명의 주목적은, 샌드위치식 면역분석의 정확도를 증가시킬 수 있도록, 표지화 항체가 고상물에 비특이적으로 결합하는 정도를 감소시키는 것이다.
본 발명의 다른 목적은, 샌드위치식 면역분석법에서 표지화 항체가 고상물에 비특이적으로 결합하는 정도를 상당한 정도까지 감소시키기 위한 용도의 개량된 시약 조합물 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 샌드위치식 면역분석법에서 샌드위치식 면역분석의 감도 및 측정가능 범위를 증가시키기 위한 용도의 개량된 시약 조합물 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 샌드위치식 면역분석법에서 샌드위치식 면역분석의 편차 정도를 감소시키기 위한 용도의 개량된 시약 조합물 키트를 제공하는 것이다.
본 발명에 의하면, 표지화 항체와 고상 항체 사이에 항원을 결합시키기 위한 반응용액 존재하에, 항원과 반응성인 표지화 항체 및 고상 항체를 사용하는 샌드위치식 면역분석법에 사용하기 위한 용도의 고상 항체, 표지화 항체 및 반응용액의 조합물이 제공된다. 표지화 항체와 고상 항체중 적어도 하나는 기니아 피그로부터 유래된 것이다.
이하 본 발명의 일실시 형태를 기술한다. 표적 항원은, 제1항체와 제2항체 사이에 표적 항원을 포획하는 반응용액의 존재하에, 표적 항원과 특이적으로 반응하는 제1항체와 제2항체를 사용하는 샌드위치식 효소 면역분석법(EIA)에 의해 분석된다. 항체는 표적 항원을 주사한 선택된 동물로부터 채취한 혈액 혈청으로부터 얻어진다. 제1항체는 폴리스티렌 보울과 같은 고상물에 도포된 고상 항체를 말한다. 제2항체는 그 위에 표지 효소가 결합된 표지화 항체를 말한다. 표지 효소는 글루코오스 옥시다제, 퍼옥시다제, 알칼리성 포스파타제, β-D-갈락토시다제 등일 수 있다. 표적 항원의 양에 대응하는 표지 효소의 양을 측정하기 위해서는 화학발광법이 사용된다. 표적 항원이 인체의 융모 고나도트로핀(hCG)이고, 선택된 동물이 기니아 피그이며, 표지 효소가 글루코오스 옥시다제(GOD)라는 가정하에 상기 방법을 좀더 상세히 기술한다. 사용된 반응용액은 0.1% 아지드화 나트륨, 0.2% 소 혈청 알부민(BSA) 및 0.337% NaCl을 함유하는 0.056몰/l 인산나트륨 완충액(pH 6.3)이다.
먼저, hCG(항원) 3000 IU(국제 단위)를 기니아 피그의 배면 피부에 1주 간격으로 6회 주사한다. 7주째에, 1000 IU를 기니아 피그에 추가로 주사한다. 5일후 기니아 프그로부터 혈액 적당량을 채혈한다.
채취한 혈청으로부터 다음과 같은 방법으로 기니아 피그 항-hCG 면역 글로불린 G(IgG)를 정제한다. 먼저, 포화 황산암모늄 2ml를 혈청 2ml중에 적가한다. 생성된 용액을 4℃의 온도에서 2 또는 3시간 동안 서서히 교반시킨다. 이어서 생성된 혼탁 용액을 원심분리관에 넣는다. 4℃의 온도에서 3000rpm의 속도로 회전하는 원심분리기를 사용하여 15분 동안 원심분리시킨다. 원심분리관으로부터 상청액을 제거하고, 5밀리몰/l 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)을 함유하는 0.1몰/l 인산나트륨 완충액(pH 6.0) 2ml로 침전물을 용해시킨다. 생성된 용액을, 5밀리몰/l 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)을 함유하는 0.1몰/l 인산나트륨 완충액(pH 6.0)으로 평형화한 Sephacryl S-300[스웨덴 소재의 파르마시아 파인 케미칼스(Pharmacia Fine Chemicals) 상표] 컬럼(1×90cm)상에서 6ml/시간의 유속으로 용출시킨다. 용출된 용액을 1ml 시료로 분할한다. 각 시료로부터 280nm에서 광선을 흡수하는 기니아 피그 항-hCG IgG 분획물을 모은다.
일본 소재의 이찌꼬사(Ichiko Co.)로부터 구입한 폴리스티렌 보울(직경 6.5mm)을 4℃의 온도에서, 0.1mg/ml의 기니아 피그 항-hCG IgG를 함유하는 0.1몰/l 인산나트륨 완충액(pH 7.5)중에 철야 침지시킴으로써, 고상물상에 기니아 피그 항-hCG IgG를 물리적 흡수에 의해 도포시킨다. 항-hCG IgG 도포된 폴리스티렌 보울을 0.1몰/l 인산나트륨 완충액(pH 7.5)으로 3회 세척하고, 이어서 0.1몰/l NaCl, 0.1% 소 혈청 알부민(BSA) 및 0.1% NaN3을 함유하는 0.01몰/l 인산나트륨 완충액(pH 7.0)으로 3회 세척한다. 세척한 폴리스티렌 보울을, 4℃의 온도에서 0.1몰/l NaCl, 0.1% 소 혈청 알부민(BSA) 및 0.1% NaN3을 함유하는 0.01몰/l 인산나트륨 완충액(pH 7.0)중에 저장한다.
표지화 항체, 기니아 피그 항-hCG IgG-GOD는 다음과 같은 3단계의 방법으로 제조된다.
(1) 말레이미드 글루코오스 옥시다제(말레이미드 GOD)를 다음과 같은 방법으로 제조한다. 숙신이미딜-4-말레이미도부티레이트(GMBS)를, 0.1몰/l 인산나트륨 완충액(pH 7.0) 0.3ml를 함유하는 4개의 시험관에 각각 넣은 글루코오스 옥시다제(GOD) 약 3mg에 첨가하여 GOD/GMBS의 비율이 1/50인 용액을 제조한다. 이 용액을 30℃의 온도에서 1시간 동안 배양한다. 생성된 용액을, 0.1몰/l 인산나트륨 완충액(pH 6.0)으로 평형화한 Sephadex G-25(스웨덴 소재의 파르마시아 파인 케미칼스 상표) 컬럼(1×30cm)상에서 12ml/시간의 유속으로 탈염시킨다. 탈염된 용액을 1ml씩의 말레이미드 GOD 시료로 분할한다.
(2) 술프히드릴화 기니아 피그 항-hCG 면역 글로불린 G(SH-IgG)를 다음과 같은 방법으로 제조한다. 먼저, 기니아 피그 항-hCG IgG 10mg, 0.1몰/l 인산나트륨 완충액(pH 6.0) 및 5밀리몰/l 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)를 함유하는 IgG 용액 2ml를 제조한다. 이 IgG 용액을 N,N-디메틸포름아미드(DMF)중에 용해시킨 S-아세틸머캅토숙신산 무수물(ASMSa)을 함유하는 용액에 첨가하여 IgG/ASMSa 비율이 몰 농도로 1/300인 용액을 제조한다. 생성된 용액을 30℃의 온도에서 30분 동안 교반시킨다. 이어서 이 용액에 0.1몰/l 트리스-HCl 완충액(pH 7.0) 0.1ml, 0.1몰/l 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)(pH 7.0) 0.02ml 및 1몰/l 히드록실아민 염산염(pH 7.0) 0.1ml를 첨가한다. 생성된 용액을 30℃의 온도에서 4분 동안 배양시키고, 이어서 생성된 용액을 5밀리몰/l 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)을 함유하는 0.1몰/l 인산나트륨 완충액(pH 6.0)으로 평형화한 Sephadex G-25(스웨덴 소재의 파르마시아 파인 케미칼스 상표) 컬럼(1×30cm)상에서 12ml/시간의 유속으로 탈염시킨다. 탈염된 용액을 1ml씩의 SH-IgG 시료로 분할한다. 이 SH-IgG 시료들을 빙냉 콜로디온 백중에서 농축시킨다.
(3) 표지화 항체를 다음과 같은 방법으로 제조한다. 말레이미드 GOD를 말레이미드 GOD와 동일한 몰 농도를 갖는 SH-IgG 용액에 첨가한다. 생성된 용액을 30℃의 온도에서 1시간 및 이어서 4℃의 온도에서 철야 정치시킨 후, 5밀리몰/l 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)을 함유하는 0.1몰/l 인산나트륨 완충액(pH 6.5)으로 평형화한 Sephacryl S-300(스웨덴 소재의 파르마시아 파인 케미칼스 상표) 컬럼(1×90cm)상에서 6ml/시간의 유속으로 용출시킨다. 용출된 용액을 1ml 시료로 분할한다. 각 시료로부터 기니아 피그 항-hCG IgG-GOD(표지화 항체)를 모은 후, 4℃의 온도에서 0.1% NaN3및 0.1% 소 혈청 알부민(BSA)을 함유하는 용액중에 저장한다.
반응용액 A[0.1% 아지드화 나트륨, 0.2% 소 혈청 알부민(BSA) 및 0.337% NaCl을 함유하는 0.056몰/l 인산나트륨 완충액(pH 6.3)] 존재하에, 다음과 같은 방식으로 표지화 항체(기니아 피그 항-hCG IgG-GOD)를 항원(hCG)을 통하여 고상 항체(기니아 피그 항-hCG IgG)에 결합시킨다. 항-hCG IgG-도포된 폴리스티렌 보울을 반응용액 A로 희석한 hCG(항원)와 함께 실온에서 배양시킨다. 이어서 폴리스티렌 보울을 증류수로 3회 세척한다. 세척한 폴리스티렌 보울을 기니아 피그 혈청과 혼합한 반응용액 A중에서 항-hCG IgG-GOD(표지화 항체)와 함께 실온에서 배양시킨다. 이어서 폴리스티렌 보울을 증류수로 다시 세척하고, 또 다른 깨끗한 분석시험관으로 옮긴다.
표지 효소의 양, 즉 항원의 양을 측정하기 위해서는 화학발광법을 사용한다. 우선, 0.5몰/l 글루코오스를 함유하는 0.01몰/l 아세트산염 완충액(pH 5.1) 0.3ml를 분석 시험관에 가한다. 분석 시험관을 37℃의 온도에서 2시간 동안 정치시킨다. 생성된 용액을 취하여 0.1ml 시료를 만든다. 이 시료에 2×10-7몰/l 루미놀을 함유하는 0.2몰/l 탄산염 완충액(pH 9.8) 0.5ml를 첨가하고, 이어서 6×10-3몰/l 칼륨 페리시아나이드 0.5ml를 첨가한다. 생성되는 과산화수소의 농도는 루미놀과 칼륨 페리시아나이드 및 과산화수소의 화학발광 반응 후 방출되는 광선을 발광측정기(Luminometer) UPD-8000[일본 소재의 메이덴샤 일렉트릭 엠이프지. 코. (Meidensha Electric Mfg., Co.) 상표]으로 측정하는데, 발광측정기는, 루미놀과 칼륨 페리시아나이드를 분석관에 첨가한지 15초 후에 작동을 개시하고, 30초간 방출되는 광선의 수를 측정한다.
항원은 인체의 융모 고나도트로핀(hCG)에 관련하여 기재하였으나, 이것은 인체의 융모 고나도트로핀 β(hCG β), α-페토프로테인(AFP), 항암 태아 항원(CEA) 등일 수도 있다. 항-AFP IgG는 AFP 300μg을 1주 간격으로 6회 주사하고, 7주째에 100μg을 추가 주사한, 기니아 피그, 토끼, 염소 등을 포함한 동물중에서 선택된 어느 하나의 동물로부터 채취한 혈청으로부터 정제된다. 항-CEA IgG는, CEA 300μg을 1주 간격으로 6회 주사하고, 7주째에 100μg을 추가 주사한, 기니아 피그, 토끼, 염소 등을 포함한 동물중에서 선택된 어느 하나의 동물로부터 채취한 혈청으로부터 정제된다.
이와 같은 샌드위치식 효소 면역분석법(EIA)에 있어서의 심각한 문제는 비교적 많은 양의 표지화 항체가 고상물에 비특이적으로 결합함으로써 샌드위치식 효소 면역분석의 정확도가 감소하는 경향이 있다는 점이다. 본 발명자들은 고상 항체와 표지화 항체중 적어도 하나를 기니아 피그로부터 유래된 혈액 혈청으로부터 제조하는 경우에, 표지화 항체가 고상물에 비특이적으로 결합하는 정도가 감소됨을 발견하였다. 효과적인 고상물 및 표지화 항체의 조합을 찾아내기 위하여 다수의 시험을 행하였다.
표지화 항체가 고상물에 비특이적으로 결합하는 정도를 측정하였다. 이 목적을 위해서, IgG-도포된 폴리스티렌 보울을 분석 시험관중에서, 기니아 피그 혈청과 혼합한 반응용액 A 0.3ml로 100배 희석한 IgG-GOD와 함께 실온에서 철야 배양시켰다. 폴리스티렌 보울을 반응용액 A로 3회 세척하고, 이어서 또다른 깨끗한 분석 시험관으로 옮겼다. 그후, 0.5몰/l 글루코오스를 함유하는 0.01몰/l 아세트산염 완충액(pH 5.1) 0.3ml를 분석 시험관에 첨가하였다. 분석 시험관을 37℃에서 2시간 동안 정치시켰다. 생성된 용액을 취하여 0.1ml 시료를 만들었다. 이 시료에 2×10-7몰/l 루미놀을 함유하는 0.2몰/l 탄산염 완충액(pH 9.8) 0.5ml를 첨가하고, 이어서 6×10-3몰/l 칼륨 페리시아나이드 0.5ml를 첨가하였다. 루미놀과 칼륨 페리시아나이드 및 생성되는 과산화수소의 화학발광 반응후 방출된 광선을 발광측정기 USD-8000로 측정하는데, 발광측정기는 루미놀과 칼륨 페리시아나이드를 분석관에 첨가한지 15초 후에 작동을 개시하고, 30초 동안 방출된 광선의 수를 측정한다. 표지화 항체가 고상물에 비특이적으로 결합하는 정도는 C1/C2×100(%)로 주어지는 비특이적 결합 비율로서 나타내는데, 여기에서 C1은 폴리스티렌 보울에 결합된 표지화 항체를 측정한 집계이고, C2는 분석 시험관내에 사용된 표지화 항체의 총량에 해당하는 집계이다.
이들 시험의 한 계열에 있어서, 사용된 고상 항체는 기니아 피그로부터 유래된 것이고 사용된 표지화 항체는 기니아 피그로부터 유래된 것이다.
실시예 1
표지화 항체로는 정상 기니아 피그 IgG-GOD를 사용하였고, 고상 항체로는 정상 기니아 피그 IgG를 사용하였다. 정상 기니아 피그 IgG는 마일즈사(Miles Co.) 품목 제29호였다. 정상 기니아 피그 IgG-도포된 폴리스티렌 보울을 기니아 피그 혈청과 혼합된 반응용액 A의 존재하에 정상 기니아 피그 IgG-GOD와 함께 배양시켰다.
실시예 2
표지화 항체로는 기니아 피그 항-hCG IgG-GOD를 사용하였고, 고상 항체로는 기니아 피그 항-hCG IgG를 사용하였다. 기니아 피그 항-hCG IgG-도포된 폴리스티렌 보울을 기니아 피그 혈청과 혼합된 반응용액 A의 존재하에 기니아 피그 항-hCG IgG-GOD와 함께 배양시켰다.
실시예 3
표지화 항체로는 기니아 피그 항-AFP IgG-GOD를 사용하였고, 고상 항체로는 기니아 피그 항-AFP IgG를 사용하였다. 기니아 피그 항-AFP IgG-도포된 폴리스티렌 보울을 기니아 피그 혈청과 혼합된 반응용액 A의 존재하에 기니아 피그 항-AFP IgG-GOD와 함께 배양시켰다.
실시예 4
표지화 항체로는 기니아 피그 항-CEA IgG-GOD를 사용하였고, 고상 항체로는 기니아 피그 항-CEA IgG를 사용하였다. 기니아 피그 항-CEA IgG-도포된 폴리스티렌 보울을 기니아 피그 혈청과 혼합된 반응용액 A의 존재하에 기니아 피그 항-CEA IgG-GOD와 함께 배양시켰다.
실시예 5
표지화 항체로는 기니아 피그 항-인슐린 IgG-GOD를 사용하였고, 고상 항체로는 기니아 피그 항-인슐린 IgG를 사용하였다. 기니아 피그 항-인슐린 IgG는 마일즈사의 품목 제23호였다. 기니아 피그 항-인슐린 IgG-도포된 폴리스티렌 보울을 기니아 피그 혈청과 혼합된 반응용액 A의 존재하에 기니아 피그 항-인슐린 IgG-GOD와 함께 배양시켰다.
본 발명에 의해 얻을 수 있는 비특이적 결합의 감소 효과를 비교하기 위하여, 고상 항체 및 표지화 항체가 모두 기니아 피그로부터 유래되지 않은 다음과 같은 비교예에 대하여 시험을 행하였다.
비교예 1
표지화 항체로는 정상 토끼 IgG-GOD를 사용하였고, 고상 항체로는 정상 토끼 IgG를 사용하였다. 정상 토끼 IgG는 마일즈사의 품목 제0019호였다. 정상 토끼 IgG-도포된 폴리스티렌 보울을 기니아 피그 혈청과 혼합된 반응용액 A의 존재하에 정상 토끼 IgG-GOD와 함께 배양시켰다.
비교예 2
표지화 항체로는 토끼 항-hCG IgG-GOD를 사용하였고, 고상 항체로는 토끼 항-hCG IgG를 사용하였다. 토끼 항-hCG IgG는 이와이샤(EY Co.)의 품목 제021304호였다. 토끼 항-hCG IgG-도포된 폴리스티렌 보울을 기니아 피그 혈청과 혼합된 반응용액 A의 존재하에 토끼 항-hCG IgG-GOD와 함께 배양시켰다.
비교예 3
표지화 항체로는 토끼 항-AFP IgG-GOD를 사용하였고, 고상 항체로는 토끼 항-AFP IgG를 사용하였다. 토끼 항-AFP IgG는 노르딕사(Nordic Co.)의 품목 제16-184호였다. 토끼 항-AFP IgG-도포된 폴리스티렌 보울을 기니아 피그 혈청과 혼합된 반응용액 A의 존재하에 토끼 항-AFP IgG-GOD와 함께 배양시켰다.
비교예 4
표지화 항체로는 토끼 항-CEA IgG-GOD를 사용하였고, 고상 항체로는 토끼 항-CEA IgG를 사용하였다. 토끼 항-CEA IgG는 지메드사(Zymed Co.)의 품목 제40925호였다. 토끼 항-CEA IgG-도포된 폴리스티렌 보울을 기니아 피그 혈청과 혼합된 반응용액 A의 존재하에 토끼 항-CEA IgG-GOD와 함께 배양시켰다.
또 다른 계열의 시험에서는, 고상 항체로서 기니아 피그로부터 유래된 것을 사용하였고, 표지화 항체로서 토끼 또는 염소로부터 유래된 것을 사용하였다.
실시예 6
표지화 항체로는 토끼 항-hCG IgG-GOD를 사용하였고, 고상 항체로는 기니아 피그 항-hCG IgG를 사용하였다. 토기 항-hCG IgG는 이와이사의 품목 제021304호였다. 기니아 피그 항-hCG IgG-도포된 폴리스티렌 보울을 기니아 피그 혈청과 혼합된 반응용액 A의 존재하에 토끼 항-hCG IgG-GOD와 함께 배양시켰다.
실시예 7
표지화 항체로는 토끼 항-AFP IgG-GOD를 사용하였고, 고상 항체로는 기니아 피그 항-AFP IgG를 사용하였다. 토끼 항-AFP IgG는 노르딕사의 품목 제16-184호였다. 기니아 피그 항-AFP IgG-도포된 폴리스티렌 보울을 기니아 피그 혈청과 혼합된 반응용액 A의 존재하에 토끼 항-AFP IgG-GOD와 함께 배양시켰다.
실시예 8
표지화 항체로는 염소 항-AFP IgG-GOD를 사용하였고, 고상 항체로는 기니아 피그 항-AFP IgG를 사용하였다. 염소 항-AFP IgG는 카펠사(Cappel Co.)의 품목 제20176호였다. 기니아 피그 항-AFP IgG-도포된 폴리스티렌 보울을 기니아 피그 혈청과 혼합된 반응용액 A의 존재하에 염소 항-AFP IgG-GOD와 함께 배양시켰다.
실시예 9
표지화 항체로는 염소 항-hCG IgG-GOD를 사용하였고, 고상 항체로는 기니아 피그 항-hCG IgG를 사용하였다. 기니아 피그 항-hCG IgG-도포된 폴리스티렌 보울을 기니아 피그 혈청과 반응용액 A의 존재하에 염소 항-hCG IgG-GOD와 함께 배양시켰다.
추가의 시험에서는, 고상 항체로서 토끼 또는 염소로부터 유래된 것을 사용하였고, 표지화 항체로서 기니아 피그로부터 유래된 것을 사용하였다.
실시예 10
표지화 항체로는 기니아 피그 항-hCG IgG-GOD를 사용하였고, 고상 항체로는 토끼 항-hCG IgG를 사용하였다. 토끼 항-hCG IgG는 이와이사의 품목 제021304호였다. 토끼 항-hCG IgG-도포된 폴리스티렌 보울을 기니아 피그 혈청과 혼합된 반응용액 A의 존재하에 기니아 피그 항-hCG IgG-GOD와 함께 배양시켰다.
실시예 11
표지화 항체로는 기니아 피그 항-AFP IgG-GOD를 사용하였고, 고상 항체로는 토끼 항-AFP IgG를 사용하였다. 토끼 항-AFP IgG는 노르딕사의 품목 제16-184호였다. 토끼 항-AFP IgG-도포된 폴리스티렌 보울을 기니아 피그 혈청과 혼합된 반응용액 A의 존재하에 토끼 항-AFP IgG-GOD와 함께 배양시켰다.
실시예 12
표지화 항체로는 기니아 피그 항-AFP IgG-GOD를 사용하였고, 고상 항체로는 염소 항-AFP IgG를 사용하였다. 염소 항-AFP IgG는 카펠사의 품목 제20176호였다. 염소 항-AFP IgG-도포된 폴리스티렌 보울을 기니아 피그 혈청과 혼합된 반응용액 A의 존재하에 기니아 피그 항-AFP IgG-GOD와 함께 배양시켰다.
본 발명에 의해 얻을 수 있는 비특이적 결합의 감소 효과를 비교하기 위하여, 고상 항체 및 표지화 항체가 모두 기니아 피그로부터 유래되지 않은 다음과 같은 비교예에 대하여 시험을 행하였다.
비교예 5
표지화 항체로는 토끼 항-hCG IgG-GOD를 사용하였고, 고상 항체로는 토끼 항-hCG IgG를 사용하였다. 토끼 항-hCG IgG-도포된 폴리스티렌 보울을 기니아 피그 혈청과 혼합된 반응용액 A의 존재하에 토끼 항-hCG IgG-GOD와 함께 배양시켰다.
비교예 6
표지화 항체로는 토끼 항-AFP IgG-GOD를 사용하였고, 고상 항체로는 토끼 항-AFP IgG를 사용하였다. 토끼 항-AFP IgG-도포된 폴리스티렌 보울을 기니아 피그 혈청과 혼합된 반응용액 A의 존재하에 토끼 항-AFP IgG-GOD와 함께 배양시켰다.
비교예 7
표지화 항체로는 염소 항-AFP IgG-GOD를 사용하였고, 고상 항체로는 염소 항-AFP IgG를 사용하였다. 염소 항-AFP IgG-도포된 폴리스티렌 보울을 기니아 피그 혈청과 혼합된 반응용액 A의 존재하에 염소 항-AFP IgG-GOD와 함께 배양시켰다.
이들 비특이적 결합 시험의 결과를 하기 표 1에 나타내었다.
[표 1]
Figure kpo00001
고상 항체 및 표지화 항체가 모두 기니아 피그로부터 유래되지 않은 조합물의 경우 비특이적 결합율은 0.78% 내지 0.190%이다. 고상 항체와 표지화 항체중 적어도 하나가 기니아 피그로부터 유래된 조합물의 경우 비특이적 결합율은 0.0089% 내지 0.023%이다. 상기 시험 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, 표지화 항체가 고상물에 비특이적으로 결합하는 정도는 고상 항체와 표지화 항체중 적어도 하나가 기니아 피그로부터 유래된 것인 경우에 현저한 정도까지 감소될 수 있다.
이와 같은 샌드위치식 효소 면역분석의 감도 및 측정가능 범위를 측정하였다. 이 목적을 위해서, 항-hCG IgG-도포된 폴리스티렌 보울을 분석 시험관중에서 반응용액 A 0.2ml로 희석한 hCG 표준 용액 0.1ml와 함께 6시간 동안 실온에서 배양시켰다. 폴리스티렌 보울을 반응용액 A로 3회 세척하였다. 세척한 폴리스티렌 보울을, 기니아 피그 혈청과 혼합된 반응용액 A로 적당비로 희석한 hCG IgG-GOD 표지화 항체 0.1ml와 함께 배양시켰다. 분석 시험관을 실온에서 철야 정치시켰다. 이어서 폴리스티렌 보울을 반응용액 A로 3회 세척한 후, 또 다른 깨끗한 분석 시험관으로 옮겼다. 그후, 이 분석 시험관에 글루코오스 0.5몰/l를 함유하는 0.01몰/l 아세트산염 완충액(pH 5.1) 0.3ml를 첨가하였다. 분석 시험관을 37℃에서 2시간 동안 정치시켰다. 생성된 용액을 취하여 0.1ml 시료를 만들었다. 이 시료에 2×10-7몰/l 루미놀을 함유하는 탄산염 완충액(pH 9.8) 0.5ml를 첨가하고, 이어서 6×10-3몰/l 칼륨 페리시아나이드 0.5ml를 첨가하였다. 루미놀과 칼륨 페리시아나이드 및 생성된 과산화수소의 화학발광 반응후 방출된 광선을 발광측정기 UPD-8000을 사용하여 측정하였는데, 발광측정기는 루미놀과 칼륨 페리시아나이드를 분석관에 첨가한지 15초 후에 작동을 개시하였고, 30초간 방출된 광선의 수를 측정하였다. 항-AFP IgG 항체 및 항-CEA IgG 항체에 대해서도 유사한 처리를 반복한다.
샌드위치식 효소 면역분석 감도 및 측정가능 범위에 대한 시험 결과를 첨부도면 제1도 및 제2도에 나타내었다. 제1도는 항원으로서 hCG를 사용한 실시예 2, 6, 9 및 10 및 비교예 2 및 5에 관한 것이다. 제2도는 항원으로서 AFP를 사용한 실시예 3, 7, 8, 11 및 12 및 비교예 3, 6 및 7에 관한 것이다. 이들 시험 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, 샌드위치식 효소 면역분석의 감도 및 측정가능 범위는 고상 항체와 표지화 항체중 적어도 하나가 기니아 피그로부터 유래된 경우가, 고상 항체 및 표지화 항체가 모두 기니아 피그로부터 유래되지 않은 경우에 얻은 결과보다 우수하다.
실시예 2, 6, 9 및 10 및 비교예 2 및 5에서의 항체를 사용하여, 1일 이내에 샌드위치식 효소 면역분석을 10회 분석하였다(일괄 분석 : within assay). 이 결과를 하기 표 2 및 3에 나타내었다. 마찬가지로, 실시예 2, 6, 9 및 10 및 비교예 2 및 5에서의 항체를 사용하여, 상이한 매 6일에 샌드위치식 효소 면역분석을 6회 반복하였다(기간 분석 : between assay). 그 결과를 하기 표 4 및 5에 나타내었다.
[표 2]
Figure kpo00002
Figure kpo00003
[표 3]
Figure kpo00004
[표 4]
Figure kpo00005
[표 5]
Figure kpo00006
이들 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, 고상 항체 및 표지화 항체중 적어도 하나가 기니아 피그로부터 유래된 경우에는, 고상 항체 및 표지화 항체가 모두 기니아 피그로부터 유래되지 않은 경우보다 적은 샌드위치식 효소 면역분석 결과 변화를 얻을 수 있다.
첨부도면 제3도에는 면역 글로불린 G(IgG)의 구조를 개략적으로 나타내었다. IgG 구조는 펩신 존재하에 37℃에서 18시간 동안 정치시킬 경우, 항원-결합 F(ab')2단편과 1개의 결정화(Fc) 단편으로 분리될 수 있다. Fc 단편은 세포에 흡착되는 P4부분을 갖는다. Fc 단편은 항원에 결합할 능력이 없고 저온에서 결정화된다. F(ab')2단편은 환원 공정하에서, 예를 들면 머캅토에틸아민 존재하에 항원에 결합할 수 있는 P1 부분을 갖는 2개의 Fab' 단편으로 분리될 수 있다. 본 발명자들은, 표지화 항체가 고상물에 비특이적으로 결합하는 정도는 Fc 단편의 존재여부에 의존하며, 이것은 고상 항체와 표지화 항체중 적어도 하나가 기니아 피그로부터 유래된 경우에, IgG-GOD 표지화 항체를 Fab'-GOD 표지화 항체로 대체시킴으로써 감소시킬 수 있음을 발견하였다. Fab' 단편은 다음과 같은 방법으로 IgG로부터 Fc 단편을 분리시킴으로써 제조된다.
우선, 상기한 선택된 동물로부터 채취한 혈청 2ml중에 포화 황산암모늄 2ml를 적가한다. 생성된 용액을 4℃의 온도에서 2시간 또는 3시간 동안 서서히 교반시킨다. 이어서 생성된 용액을 원심분리관에 넣는다. 3000rpm의 속도로 회전하는 원심분리기를 사용하여 4℃에서 15분 동안 원심분리시킨다. 원심분리관으로부터 상청액을 제거하고, 침전물을 5밀리몰/l 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)을 함유하는 0.1몰/l 인산나트륨 완충액(pH 6.0) 2ml로 용해시킨다. 생성된 용액을, 0.1밀리몰/l NaCl을 함유하는 0.1몰/l 아세트산염 완충액(pH 4.5)으로 평형화한 Sephacryl S-300(스웨덴 소재의 파르마시아 파인 케미칼스 상표) 컬럼(1×90cm)상에서 6ml/시간의 유속으로 용출시킨다. 용출된 용액을 1ml 시료로 분할한다. 각 시료로부터 280nm에서 광선을 흡수하는 IgG 분획물을 모은다. 그후, 3mg/ml 펩신 용액 0.1ml를 모은 IgG에 첨가한다. 생성된 용액을 37℃의 온도에서 18시간 동안 배양시킨다. 생성된 용액을 0.1몰/l 인산나트륨 완충액(pH 7.5)으로 평형화한 Sephacryl S-200(스웨덴 소재의 파르마시아 파인 케미칼스 상표) 컬럼(1×90cm)상에서 6ml/시간의 유속으로 용출시킨다. 용출된 용액을 1ml 시료로 분할한다. 각 시료로부터 280nm에서 광선을 흡수하는 F(ab')2분획불을 모은다. 모은 F(ab')2에 0.1몰/l 머캅토에틸아민 0.05ml를 첨가하고, 37℃의 온도에서 90분 동안 배양시킨다. 생성된 용액을, 5밀리몰/l EDTA를 함유하는 0.1몰/l 인산나트륨 완충액(pH 6.0)으로 평형화한 Sephadex G-25(스웨덴 소재의 파르마시아 파인 케미칼스 상표) 컬럼(1×30cm)상에서 6ml/시간의 유속으로 탈염시킨다. 탈염된 용액을 1ml의 Fab' 시료로 분할한다.
Fab'-GOD 표지화 항체가 고상물에 비특이적으로 결하하는데에 대한 유리한 효과를 입증하기 위하여, 앞에 기술한 바와 저의 동일한 방법으로 다수의 시험을 행하였다.
실시예 13
표지화 항체로는 기니아 피그 항-AFP Fab'-GOD를 사용하였고, 고상 항체로는 기니아 피그 항-AFP IgG를 사용하였다. 기니아 피그 항-AFP IgG-도포된 폴리스티렌 보울을 기니아 피그 혈청과 혼합된 반응용액 A의 존재하에 기니아 피그 항-AFP Fab'-GOD와 함께 배양시켰다.
실시예 14
표지화 항체로는 기니아 피그 항-AFP Fab'-GOD를 사용하였고, 고상 항체로는 토끼 항-AFP IgG를 사용하였다. 토끼 항-AFP IgG-도포된 폴리스티렌 보울을 기니아 피그 혈청과 혼합된 반응용액 A의 존재하에 기니아 피그 항-AFP Fab'-GOD와 함께 배양시켰다.
실시예 15
표지화 항체로는 기니아 피그 항-AFP Fab'-GOD를 사용하였고, 고상 항체로는 염소 항-AFP IgG를 사용하였다. 염소 항-AFP IgG-도포된 폴리스티렌 보울을 기니아 피그 혈청과 혼합된 반응용액 A의 존재하에 기니아 피그 항-AFP Fab'-GOD와 함께 배양시켰다.
실시예 16
표지화 항체로는 토끼 항-AFP Fab'-GOD를 사용하였고, 고상 항체로는 기니아 피그 항-AFP IgG를 사용하였다. 기니아 피그 항-AFP IgG-도포된 폴리스티렌 보울을 기니아 피그 혈청과 혼합된 반응용액 A의 존재하에 토끼 항-AFP Fab'-GOD와 함께 배양시켰다.
실시예 17
표지화 항체로는 염소 항-AFP Fab'-GOD를 사용하였고, 고상 항체로는 기니아 피그 항-AFP IgG를 사용하였다. 기니아 피그 항-AFP IgG-도포된 폴리스티렌 보울을 기니아 피그 혈청과 혼합된 반응용액 A의 존재하에 염소 항-AFP Fab'-GOD와 함께 배양시켰다.
실시예 18
표지화 항체로는 기니아 피그 항-CEA Fab'-GOD를 사용하였고, 고상 항체로는 기니아 피그 항-CEA IgG를 사용하였다. 기니아 피그 항-CEA IgG-도포된 폴리스티렌 보울을 기니아 피그 혈청과 혼합된 반응용액 A의 존재하에 기니아 피그 항-CEA Fab'-GOD와 함께 배양시켰다.
실시예 19
표지화 항체로는 기니아 피그 항-CEA Fab'-GOD를 사용하였고, 고상 항체로는 토끼 항-CEA IgG를 사용하였다. 토끼 항-CEA IgG-도포된 폴리스티렌 보울을 기니아 피그 혈청과 혼합된 반응용액 A의 존재하에 기니아 피그 항-CEA Fab'-GOD와 함께 배양시켰다.
실시예 20
표지화 항체로는 기니아 피그 항-CEA Fab'-GOD를 사용하였고, 고상 항체로는 염소 항-CEA IgG를 사용하였다. 염소 항-CEA IgG-도포된 폴리스티렌 보울을 기니아 피그 혈청과 혼합된 반응용액 A의 존재하에 기니아 피그 항-CEA Fab'-GOD와 함께 배양시켰다.
실시예 21
표지화 항체로는 토끼 항-CEA Fab'-GOD를 사용하였고, 고상 항체로는 기니아 피그 항-CEA IgG를 사용하였다. 기니아 피그 항-CEA IgG-도포된 폴리스티렌 보울을 기니아 피그 혈청과 혼합된 반응용액 A의 존재하에 토끼 항-CEA Fab'-GOD와 함께 배양시켰다.
실시예 22
표지화 항체로는 염소 항-CEA Fab'-GOD를 사용하였고, 고상 항체로는 기니아 피그 항-CEA IgG를 사용하였다. 기니아 피그 항-CEA IgG-도포된 폴리스티렌 보울을 기니아 피그 혈청과 혼합된 반응용액 A의 존재하에 염소 항-CEA Fab'-GOD와 함께 배양시켰다.
본 발명에 의해 얻을 수 있는 비특이적 결합 감소의 효과를 비교하기 위하여, 다음과 같은 비교예에 대하여 시험을 행하였다.
비교예 8
표지화 항체로는 기니아 피그 항-AFP IgG-GOD를 사용하였고, 고상 항체로는 기니아 피그 항-AFP IgG를 사용하였다. 기니아 피그 항-AFP IgG-도포된 폴리스티렌 보울을 기니아 피그 혈청과 혼합된 반응용액 A의 존재하에 기니아 피그 항-AFP IgG-GOD와 함께 배양시켰다.
비교예 9
표지화 항체로는 토끼 항-AFP Fab'-GOD를 사용하였고, 고상 항체로는 토끼 항-AFP IgG를 사용하였다. 토끼 항-AFP IgG-도포된 폴리스티렌 보울을 기니아 피그 혈청과 혼합된 반응용액 A의 존재하에 토끼 항-AFP Fab'-GOD와 함께 배양시켰다.
비교예 10
표지화 항체로는 염소 항-AFP Fab'-GOD를 사용하였고, 고상 항체로는 염소 항-AFP IgG를 사용하였다. 염소 항-AFP IgG-도포된 폴리스티렌 보울을 기니아 피그 혈청과 혼합된 반응용액 A의 존재하에 염소 항-AFP Fab'-GOD와 함께 배양시켰다.
비교예 11
표지화 항체로는 기니아 피그 항-CEA IgG-GOD를 사용하였고, 고상 항체로는 기니아 피그 항-CEA IgG를 사용하였다. 기니아 피그 항-CEA IgG-도프된 폴리스티렌 보울을 기니아 피그 혈청과 혼합된 반응용액 A의 존재하에 기니아 피그 항-CEA IgG-GOD와 함께 배양시켰다.
비교예 12
표지화 항체로는 토끼 항-CEA Fab'-GOD를 사용하였고, 고상 항체로는 토끼 항-CEA IgG를 사용하였다. 토끼 항-CEA IgG-도포된 폴리스티렌 보울을 기니아 피그 혈청과 혼합된 반응용액 A의 존재하에 토끼 항-CEA Fab'-GOD와 함께 배양시켰다.
비교예 13
표지화 항체로는 염소 항-CEA Fab'-GOD를 사용하였고, 고상 항체로는 염소 항-CEA IgG를 사용하였다. 염소 항-CEA IgG-도포된 폴리스티렌 보울을 기니아 피그 혈청과 혼합된 반응용액 A의 존재하에 염소 항-CEA Fab'-GOD와 함께 배양시켰다.
상기 비특이적 결합 시험의 결과를 하기 표 6에 나타내었다.
[표 6]
Figure kpo00007
표지화 항체로는 Fab'-GOD를 사용한 비교에 9, 10, 12 및 13의 비특이적 결합율은 IgG 고상 항체와 IgG-GOD 표지화 항체가 모두 기니아 피그로부터 유래된 비교예 8 및 11의 결합율과 실질적으로 동일하다. 실시예 13-22의 관련된 시험 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, 표지화 항체가 고상물에 비특이적으로 결합하는 정도는 Fab'-GOD 표지화 항체와 IgG 고상 항체중 적어도 하나가 기니아 피그로부터 유래된 경우에 현저한 정도까지 감소시킬 수 있다.
샌드위치식 효소 면역분석의 측정가능 범위 및 검출 한계를 상기한 방법과 실질적으로 동일한 방법으로 측정하였다. 샌드위치식 효소 면역분석 측정가능 범위 및 검출 한계의 측정 결과를 하기 표 7-10에 나타내었다.
[표 7]
Figure kpo00008
Figure kpo00009
[표 8]
Figure kpo00010
[표 9]
Figure kpo00011
[표 10]
Figure kpo00012
이들 시험 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, 샌드위치식 효소 면역분석의 측정가능 범위 및 검출 한계는 표지화 항체로서 Fab'-GOD를 사용하는 경우가 표지화 항체로서 IgG-GOD를 사용하는 경우보다 우수하다. 또한, 샌드위치식 효소 면역분석의 측정가능 범위 및 검출 한계는, 표지화 항체(Fab'-GOD)와 고상 항체(IgG)중 적어도 하나가 기니아 피그로부터 유래된 경우에, 표지화 항체가 토끼로부터 유래된 Fab'-GOD이고 고상 항체(IgG)가 토끼로부터 유래된 경우나, 표지화 항체(Fab'-GOD)가 염소로부터 유래되고 고상 항체(IgG)가 염소로부터 유래된 경우보다 우수하다.
상기 실시예 13-22 및 비교예 8-13에서의 항체를 사용하여, 1일 이내에 샌드위치식 효소 면역분석을 10회 반복하였다(일괄 분석). 마찬가지로, 실시예 13-22 및 비교예 8-13의 항체를 사용하여, 상이한 매 6일에 샌드위치식 효소 면역분석을 6회 반복하였다(기간 분석). 그 결과를 하기 표 15-18에 나타내었다.
[표 11]
Figure kpo00013
Figure kpo00014
[표 12]
Figure kpo00015
[표 13]
Figure kpo00016
[표 14]
Figure kpo00017
[표 15]
Figure kpo00018
[표 16]
Figure kpo00019
[표 17]
Figure kpo00020
Figure kpo00021
[표 18]
Figure kpo00022
이들 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, 표지화 항체(Fab'-GOD)와 고상 항체(IgG)중 적어도 하나가 기니아 피그로부터 유도된 경우에는 보다 적은 샌드위치식 효소 면역분석 결과 변화율을 얻을 수 있다.
본 발명자들은 또한 표지화 항체를 항원을 통하여 고상 항체에 결합시키는 반응용액 A에 정상 기니아 피그 혈청을 첨가함으로써 표지화 항체가 고상물에 비특이적으로 결합하는 정도를 감소시킬 수 있음을 발견하였다. 표지화 항체가 고상물에 비특이적으로 결합하는 정도에 대한 유리한 효과를 증명하기 위해서 수회의 시험을 행하였다.
실시예 23
표지화 항체로는 기니아 피그 항-hCG IgG-GOD를 사용하였고, 고상 항체로는 기니아 피그 항-hCG IgG를 사용하였다. 반응용액은 반응용액 A와 정상 기니아 피그 혈청의 혼합물이었다.
표지화 항체가 고상물에 비특이적으로 결합하는 정도를 측정하였다. 이 목적을 위해서 기니아 피그 항-hCG IgG-도포된 폴리스티렌 보울을, 정상 기니아 피그 혈청과 용적비로 혼합된 반응용액 A[0.1% 아지드화 나트륨, 0.2% 소 혈청 알부민(BSA) 및 0.337% NaCl을 함유하는 0.056몰/l 인산나트륨 완충액(pH 6.3)]를 함유하는 반응용액 혼합물 X 0.3ml로 희석한 기니아 피그 항-hCG IgG와 함께 분석 시험관내에서 실온으로 철야 배양시켰다. 폴리스티렌 보울을 반응용액 혼합물 X로 3회 세척하고, 이어서 또 다른 깨끗한 분석 시험관으로 옮겼다. 그후, 0.5몰/l 글루코오스를 함유하는 0.01몰/l 아세트산염 완충액(pH 5.1) 0.3ml를 분석 시험관에 첨가하였다. 분석 시험관을 37℃에서 2시간 동안 정치시켰다. 생성된 용액을 취하여 0.1ml 시료를 만들었다. 이 시료에 2×10-7몰/l 루미놀을 함유하는 0.2몰/l 탄산염 완충액(pH 9.8) 0.5ml를 첨가하고, 이어서 6×10-3몰/l 칼륨 페리시아나이드 0.5ml를 첨가하였다. 루미놀과 포태슘 페리시아나이드 및 생성된 과산화수소의 화학발광 반응후 방출된 광선을 발광측정기 UPD-8000(일본 소재의 메이덴샤 일렉트릭 엠에프지., 회사. 상표)을 사용하여 측정하였는데, 발광측정기는 루미놀과 칼륨 페리시아나이드를 분석 시험관에 첨가한지 15초 후에 가동을 시작하여, 30초 동안 방출된 광선의 수를 측정하였다. 표지화 항체가 고상물에 비특이적으로 결합하는 정도는 C1/C2×100(%)로 주어지는 비특이적 결합비로써 나타내는데, 여기에서 C1은 폴리스티렌 보울에 결합된 표지화 항체의 측정 집계이고, C2는 분석 시험관내에 사용된 표지화 항체의 총수에 해당하는 집계이다. 정상 기니아 피그 혈청 대 반응용액 A의 용적비를 1 : 0 내지 1 : 20으로 변화시키면서 이들 처리를 반복하였다.
첨부도면 제4도는 상이한 용적비로 행한 일련의 비특이적 결합 시험결과를 나타낸다. 이들 시험결과로부터 알 수 있는 바와 같이, 비특이적 결합율은 정상 기니아 피그 혈청 대 반응용액 A의 용적비가 1 : 0에서 1 : 20로 증가함에 따라 0.005%에서 0.5%로 증가한다.
본 발명에 의해 얻을 수 있는 비특이적 결합 감소를 비교하기 위하여, 다음과 같은 비교예에 대하여 실질적으로 동일한 방법으로 시험을 행하였다.
비교예 14
표지화 항체로는 기니아 피그 항-hCG IgG-GOD를 사용하였고, 고상 항체로는 기니아 피그 항-hCG IgG를 사용하였다. 반응용액으로는 정상 기니아 피그 혈청이 혼합되지 않은 반응용액 A를 사용하였다. 이 비교예에서 비특이적 결합비는 0.4%였다.
따라서, 표지화 항체가 고상물에 비특이적으로 결합하는 정도는, 표지화 항체를 고상 항체에 결합시키는데 사용되는 반응용액에 정상 기니아 피그 혈청을 첨가하는 경우에 상당한 정도까지 감소시킬 수 있음이 명백하다.
하기 실시예에서 샌드위치식 효소 면역분석의 감도 및 측정가능 범위를 측정하였다.
실시예 24
표지화 항체로는 기니아 피그 항-hCG IgG-GOD를 사용하였고, 고상 항체로는 기니아 피그 항-hCG IgG를 사용하였다. 반응용액으로는 반응용액 A와 정상 기니아 피그 혈청의 혼합물을 사용하였다. 정상 기니아 피그 혈청 대 반응용액 A의 용적비는 1 : 5였다.
항-hCG IgG-도포된 폴리스티렌 보울을, 반응용액 A 0.3ml로 희석한 hCG 표준 용액과 함께, 분석 시험관중에서 실온으로 6시간 동안 배양시켰다. 폴리스티렌 보울을 반응용액 A로 3회 세척하였다. 세척한 폴리스티렌 보울을, 정상 기니아 피그 혈청과 혼합한 반응용액 A의 혼합물로 적당비로 희석한 항-hCG IgG-GOD 표지화 항체 0.1ml와 함께 배양시켰다. 정상 기니아 피그 혈청 대 반응용액 A의 용적비는 1 : 5였다. 분석 시험관을 실온에서 철야 정치시켰다. 이어서 폴리스티렌 보울을 반응용액 A로 3회 세척한 후, 또 다른 깨끗한 분석 시험관으로 옮겼다. 그후, 이 분석 시험관에 0.5몰/l 글루코오스를 함유하는 0.01몰/l 아세트산염 완충액(pH 5.1) 0.3ml를 첨가하였다. 이 분석 시험관을 37℃의 온도에서 2시간 동안 정치시켰다. 생성된 용액을 취하여 0.1ml 시료를 만들었다. 이 시료에 2×10-7몰/l 루미놀을 함유하는 탄산염 완충액(pH 9.8) 0.5ml를 첨가하고, 이어서 6×10-3몰/l 칼륨 페리시아나이드 0.5ml를 첨가하였다. 루미놀과 칼륨 페리시아나이드 및 생성된 과산화수소의 화학발광 반응후 방출된 광선을 발광측정기 UPD-8000를 사용하여 측정하였는데, 발광측정기는 루미놀과 칼륨 페리시아나이드를 분석 시험관에 첨가한지 15초 후에 작동을 개시하여 30초 동안 방출된 광선의 수를 측정하였다.
샌드위치식 효소 면역분석법에 대한 유리한 효과를 입증하기 위하여, 하기 비교예에 대하여 유사한 처리를 반복하였다.
비교예 15
표지화 항체로는 기니아 피그 항-hCG IgG-GOD를 사용하였고, 고상 항체로는 기니아 피그 항-hCG IgG를 사용하였다. 반응용액으로는 정상 기니아 피그 혈청이 혼합되지 않은 반응용액 A를 사용하였다.
첨부도면 제5도에 이 결과를 나타내었다. 실시예 24에서 얻은 샌드위치식 면역분석 측정가능 범위 및 감도는 각각 2.5-1000mIU/ml 및 2.5mIU/ml였다. 한편, 비교예 15에서 얻은 샌드위치식 효소 면역분석 측정가능 범위 및 감도는 각각 50-500mIU/ml 및 50mIU/ml였다. 따라서, 샌드위치식 효소 면역분석 감도 및 측정가능 범위는 정상 기니아 피그 혈청을 반응용액 A에 첨가하는 경우에 향상됨이 명백하다.
상기 실시예 24 및 비교예 15에 대하여 1일 이내에 샌드위치식 효소 면역분석법을 10회 반복하였다(일괄 분석). 이 결과를 하기 표 19 및 20에 나타내었다. 마찬가지로, 실시예 24 및 비교예 15에 대하여 상이한 날들에 샌드위치식 효소 면역분석을 반복하였다(기간 분석). 이 결과를 하기 표 21 및 22에 나타내었다.
[표 19]
Figure kpo00023
[표 20]
Figure kpo00024
[표 21]
Figure kpo00025
[표 22]
Figure kpo00026
이들 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, 정상 기니아 피그 혈청을 반응용액에 첨가하는 경우에, 보다 적은 샌드위치식 효소 면역분석 결과 변화를 얻을 수 있다.
반응용액에 첨가하기에 유효한 혈청을 제공하기 위하여, 하기 비교예에서 수회의 시험을 행하였다.
비교예 16
표지화 항체로는 기니아 피그 항-hCG IgG-GOD를 사용하였고, 고상 항체로는 기니아 피그 항-hCG IgG를 사용하였다. 정상 토끼 혈청을 반응용액 A에 첨가하였다. 정상 토끼 혈청 대 반응용액 A의 용적비는 1 : 5였다.
비교예 17
표지화 항체로는 기니아 피그 항-hCG IgG-GOD를 사용하였고, 고상 항체로는 기니아 피그 항-hCG IgG를 사용하였다. 정상 염소 혈청을 반응용액 A에 첨가하였다. 정상 염소 혈청 대 반응용액 A의 용적비는 1 : 5였다.
비교예 18
표지화 항체로는 기니아 피그 항-hCG IgG-GOD를 사용하였고, 고상 항체로는 기니아 피그 항-hCG IgG를 사용하였다. 정상 말 혈청을 반응용액 A에 첨가하였다. 정상 말 혈청 대 반응용액 A의 용적비는 1 : 5였다.
비교예 19
표지화 항체로는 기니아 피그 항-hCG IgG-GOD를 사용하였고, 고상 항체로는 기니아 항-hCG IgG를 사용하였다. 반응용액 A에 혈청을 첨가하지 않았다.
상기한 방법과 실질적으로 동일한 방법으로 행한 비특이적 결합 시험결과를 첨부도면 제6도에 나타내었다. 비특이적 결합율은 실시예 24의 경우 0.022% 정도로 낮았다. 한편, 비교예 16-19에서의 비특이적 결합율은 0.07% 내지 0.3%였다. 따라서 표지화 항체가 고상물에 비특이적으로 결합하는 정도는 정상 기니아 피그 혈청을 반응용액에 첨가함으로써 현저한 정도까지 감소시킬 수 있음이 명백하다.
상기한 방법과 실질적으로 동일한 방법으로 행한 샌드위치식 효소 면역분석 감도 및 측정가능 범위 시험 결과를 첨부도면 제7도에 나타내었다. 실시예 24의 경우 샌드위치식 효소 면역분석 측정가능 범위 및 감도는 1-1000mIU/ml 및 1mIU/ml였다. 한편, 비교예 19에서의 샌드위치식 효소 면역분석 측정가능 범위 및 감도는 50-1000mIU/mL 및 50mIU/ml였다. 따라서, 샌드위치식 효소 면역분석 측정가능 범위 및 감도는 정상 기니아 피그 혈청을 반응용액에 첨가함으로써 개선할 수 있음이 명백하다.
실시예 24 및 비교예 19에 대하여 1일 이내에 샌드위치식 효소 면역분석을 10회 반복하였다(일괄 분석). 이 결과를 하기 표 23 및 24에 나타내었다. 마찬가지로, 실시예 24 및 비교예 19에 대하여 상이한 날들에 샌드위치식 효소 면역분석을 반복하였다(기간 분석). 이 결과를 하기 표 25 및 26에 나타내었다.
[표 23]
Figure kpo00027
[표 24]
Figure kpo00028
[표 25]
Figure kpo00029
[표 26]
Figure kpo00030
이들 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, 정상 기니아 피그 혈청을 반응용액 A에 첨가하는 경우에, 보다 적은 샌드위치식 효소 면역분석 결과 변화를 얻을 수 있다.
반응용액은 인산나트륨 완충액(pH 6.3)을 함유하는 경우를 기재하였으나, 인산나트륨 완충액(pH 6.0-7.5), 붕산염 완충액(pH 8.0-8.5) 등으로 대체할 수도 있다. 표지화 항체는 글루코오스 옥시다제(GOD) 표지 효소를 함유하는 경우를 기재하였으나, 표지 효소는 퍼옥시다제, 알칼리성 포스파타제, β-D-갈락토시다제 등일 수도 있다. 또한, 본 발명에서는 샌드위치식 효소 면역분석과 관력하여 기재하였으나, 표지는 형광물질(플루오레세인 이소티오시아네이트, 테트라메틸로다민 이소티오시아네이트 등), 화학발광 물질(아미노에틸에틸 이소루미놀, 아미노부틸에틸 이소루미놀, 아미노펜틸에틸 이소루미놀, 아미노헥실에틸 이소루미놀 등) 또는 방사선 동위원소(3H,14C,32P,125I,131I 등)일 수 있다.

Claims (6)

  1. 표지화 항체 및 고상 항체 사이에 항원을 결합시키기 위하여 반응용액 존재하에서 항원과 반응성인 표지화 항체 및 고상 항체를 사용하고, 고상물에 결합되어 있는 고상 항체, 표지 효소가 항체에 결합되어 있는 표지화 항체 및 반응용액을 포함하는, 샌드위치식 면역분석법에 사용하기 위한 키트에 있어서, 표지화 항체 및 고상 항체중 적어도 하나가 기니아 피그로부터 유래된 것이고, 표지화 항체의 고상 항체에 대한 비특이적 결합도를 감소시키기 위하여 반응용액이 정상 기니아 피그 혈청을 함유하는 것을 특징으로 하는 키트.
  2. 제1항에 있어서, 표지화 항체가 면역 글로불린 G를 포함하는 것인 키트.
  3. 제2항에 있어서, 표지화 항체가 면역 글로불린 G로부터 생성된 Fab' 단편을 포함하는 것인 키트.
  4. 제1항에 있어서, 표지화 항체가 기니아 피그로부터 유래된 것인 키트.
  5. 제1항에 있어서, 고상 항체가 기니아 피그로부터 유래된 것인 키트.
  6. 제1항에 있어서, 표지화 항체가 기니아 피그로부터 유래된 것이고, 고상 항체가 기니아 피그로부터 유래된 것인 키트.
KR1019870006203A 1986-06-19 1987-06-19 샌드위치식 면역분석용 키트 KR960016338B1 (ko)

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