CN117259775A - 一种金纳米双锥的制备方法及其在光纤生物传感中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及纳米材料技术领域，尤其涉及一种金纳米双锥的制备方法及其在光纤生物传感中的应用。本发明制备的金纳米双锥产率高、均一性好，为在近红外Ⅱ区波段的光纤生物传感和治疗方向提供了更多的可能性，并且制备方法操作简便，流程较短，耗材价格低廉，总体制备成本低；当应用于光纤生物传感时，通过在锥形微纳光纤表面修饰WS2负载的金纳米双锥，相比无界面修饰的微纳光纤传感器，光纤传感灵敏度更高，可对不同浓度的前列腺癌细胞外泌体(甚至是在前列腺癌病人全血清中)实现检测，显著提高了前列腺癌细胞早期诊断和筛查的灵敏性和准确性，而且其制备方法简单，制备原料无毒性，生物应用安全性高。

Description

一种金纳米双锥的制备方法及其在光纤生物传感中的应用
技术领域
本发明涉及纳米材料技术领域，尤其涉及一种金纳米双锥的制备方法及其在光纤生物传感中的应用。
背景技术
贵金属纳米粒子具有丰富的局域表面等离子体共振(LSPR)特性。它们的表面等离子体共振峰通常随着周围环境折射率的增加而发生红移，它们的表面等离子体波长对周围折射率的依赖是高度敏感的，这构成了局域表面等离子体共振光谱的基础。因此，利用金纳米粒子可实现超灵敏等离子体传感。
近年来，各向异性纳米颗粒的合成因其在光谱学、光电、催化传感和药物传递等方面的独特性能而引起了生物医学领域的广泛关注。大量潜在的应用主要在于其有趣的局部表面等离子体共振(LSPR)特性，其中各向异性金属纳米颗粒(棒状、双锥体和十面体)具有两种对应于横向和纵向模式的表面等离子体共振，因此具有更突出的优势。金纳米双锥因其优越的光学性能、更大的消光截面以及比金纳米棒更显著的局部电场增强而受到广泛关注。与金纳米棒的圆形末端不同，金纳米双锥在交叉点上有两个更尖锐的顶点研究表明，由于其在近红外(NIR)窗口的高吸光度和在人体中的生物安全性，金纳米双锥已被用作癌症消融的一种光热转换剂。与金纳米棒的LSPR特性相比，金纳米双锥的锐边结构对介电环境的局部变化更敏感，局域电场增强更强。金纳米双锥体不仅具有与金纳米相似的水平SPR峰，可以吸收可见光(530nm)，而且在近红外光区(λ>700nm)具有更高的纵向SPR峰。此外，可以调节金纳米双锥的纵向等离子体共振波长(LPRWs)以匹配激发波长，从而提高光纤微纳生物传感器的灵敏度。但是，目前市面上现有的的金纳米双锥仅能匹配近红外I区(NIR-I，700-950nm)波段和可见光波段的激发波长，长径比约为100nm，相较而言，近红外II区(NIR-II，1000-1700nm)激光具有最小的组织散色和更深的组织穿透力(高达15nm)，与之波段相匹配的金纳米双锥可作为光热治疗的材料，因此如何制备出不同长径比的金纳米双锥以匹配更高波长段(尤其是近红外II区波段)的局域等离子体共振便显得极为重要。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供一种金纳米双锥溶液的制备方法，及结合二维材料对金纳米双锥进行修饰表征的方法应用于光纤生物传感领域。
为实现上述目的，本发明提供的一种技术方案是：
一种金纳米双锥的制备方法，包括以下步骤：
S101.将HAuCl4水溶液和柠檬酸钠溶液加入到去离子水中，搅拌下再加入NaBH4溶液，得到橙红色金种溶液；
S102.将橙红色金种溶液在室温下老化至少2小时，使未反应NaBH4完全水解，形成粉红色种子液；
S103.向CTAB溶液中依次加入HAuCl4水溶液、AgNO3溶液、HCl和抗坏血酸，并搅拌溶液直至变成无色，获得生长溶液；
S104.将步骤S102获得的粉红色种子溶液注入到生长溶液中，并在30℃水浴中静置20-24小时，直到溶液变为紫红色溶液；
S105.对紫红色溶液采用密度梯度离心法进行离心处理，去除杂质，获得提纯后的金纳米双锥溶液，即获得金纳米双锥。
上述方法中，通过调控步骤S104中粉红色种子溶液的加入量调控获得的金纳米双锥的长径比。
作为优选，所述步骤S101中：HAuCl4水溶液、柠檬酸钠溶液、去离子水、NaBH4溶液的体积比为0.125∶0.25∶9.625∶0.15；HAuCl4水溶液的浓度为0.01M，柠檬酸钠溶液的浓度为0.01M，NaBH4溶液的浓度为0.01M。在该浓度和比例条件下，能够产生形貌稳定的金纳米晶种。
作为优选，所述步骤S103中：CTAB溶液的浓度为0.1M，HAuCl4水溶液的浓度为0.01M，AgNO3溶液的浓度为0.01M，HCl的浓度为1M，抗坏血酸的浓度为0.1M；CTAB溶液、HAuCl4水溶液、AgNO3溶液、HCl、抗坏血酸的体积比为40∶2∶0.4∶0.5∶0.32。在该比例下，溶液生长环境使得金纳米双锥粒子尺寸差异小，具有高重现性和高产率的优点，通过改变配比不改变体积比的方式可以实现对金纳米双锥的精确调控。
作为优选，所述步骤S105具体包括：
S1051.将紫红色溶液加入去离子水中，紫红色溶液与去离子水的比例为1∶3，以9000rpm的转速离心10min，去除上清液，获得沉淀；
S1052.利用乙二醇与CTAB溶液分别配置5层密度梯度溶液，5层密度梯度溶液中乙二醇与CTAB溶液的体积比分别为50％、60％、70％、80％和90％；
S1053.将5层密度梯度溶液按照乙二醇浓度自上而下逐渐降低的方式逐层加入离心管中；
S1054.将S1051获得的沉淀重新分散在CTAB溶液中，然后将分散液滴加在离心管中的5个密度梯度溶液里，以8000rpm的转速离心20min，获得离心后分层溶液；
S1055.提取分层溶液中的金纳米双锥分离心，将其重新分散于去离子水中，即可得到提纯后的金纳米双锥溶液。
相比较未提纯的金纳米双锥溶液，提纯后的金纳米双锥溶液产率更高、杂质更少、分散性更好，金纳米双锥占比能达到70％以上。
作为优选，步骤S103中，通过调控溶液配比，将所述生长溶液的pH值控制在3～5。在该pH范围内，生长的金纳米双锥形貌均一规则、重复性和稳定性高。
从上述描述可以看出，该制备方法具备以下优点：
1、该方法采用种子介导生长法，利用NaBH4还原Au3+生成Au单晶，并通过控制熟化温度使所述Au单晶生长成为五重孪晶，制备出金种子溶液，然后加入AgNO3改变金种子的氧化还原电位，最后加入抗坏血酸促使金种子生长为金纳米双锥，之后通过改变HCl的量改变pH环境，经过调控种子液在生长溶液中的加入量使金纳米双锥生长成不同长径比。
2、该方法应用时，通过改变不同金钟子、盐酸的量可调控制备不同长径比的金纳米双锥，并且金纳米双锥产率高、均一性好，为在近红外Ⅱ区波段的光纤生物传感和治疗方向提供了更多的可能性，并且制备方法操作简便，流程较短，耗材价格低廉，总体制备成本低。
为实现上述技术目的，本发明提供的另一种技术方案是：
一种微纳光纤生物传感器，所述微纳光纤生物传感器具有前述金纳米双锥制备方法得到的金纳米双锥，通过修饰金纳米双锥并结合二维材料进行传感检测。
作为优选，所述二维材料为WS2。
从上述描述可以看出，该微纳光纤生物传感器具备以下优点：
通过二维材料WS2的加入，使得二维材料与金纳米双锥颗粒结合在光纤表面形成一种复合界面，进而提升光纤界面灵敏度。将二者结合后，二维材料WS2作为导体可以增强局部电场，相比较其它二维材料，WS2具有更丰富的亲水官能团(-O和-OH)、更好的电磁性能和更宽的等离子激元间隙，由于带间跃迁和边界效应之间的相互作用，从而提供了在近红外(NIR)到中红外(MIR)的大光谱范围内直接调节等离子体频率的可能性。因此将WS2与微纳光纤相结合，可以显著改善微纳光纤的倏逝场电磁性能，并且增强金纳米双锥粒子与生物分子之间的相互作用，提高光纤生物传感器的灵敏度，且复合界面具有更广泛的比表面积，为生物分子提供更多的结合位点和更大的有效接触区域，提高生物分子的吸附量和灵敏度。
为实现上述技术目的，本发明提供的另一种技术方案是：
一种微纳光纤生物传感器的制备方法，包括以下步骤：
S201.准备二氧化硅微纳光纤，用食人鱼溶液清洁裸露的二氧化硅微纳光纤，使得微纳光纤表面的羟基完全暴露出来；
S202.先将清洁后的二氧化硅微纳光纤依次浸泡于去离子水、无水乙醇溶液中；
S203.再将二氧化硅微纳光纤浸泡于APTES溶液中使光纤表面氨基化；
S204.接着将二氧化硅微纳光纤依次浸泡于无水乙醇溶液和WS2溶液；
S205.然后将二氧化硅微纳光纤再依次浸泡于去离子水和金纳米双锥溶液,氨基与金纳米双锥上的羧基发生共价反应，金纳米双锥逐渐结合到光纤表面，修饰完成；
S206.最后将修饰完的二氧化硅微纳光纤放于烘箱中烘干，即得到微纳光纤生物传感器。
从上述描述可以看出，该制备方案具备以下优点：
将微纳光纤表面通过浸泡食人鱼溶液、无水乙醇、APTES溶液，使得微纳光纤表面硅烷化，再通过Au-S键共价耦合金纳米双锥，制备方法简单，制备原料无毒性，生物应用安全性高。
为实现上述技术目的，本发明提供的另两种技术方案是：
所述微纳光纤生物传感器在制备诊断前列腺癌的产品中的应用。
使用所述微纳光纤生物传感器，体外检测前列腺癌细胞外泌体与适配体结合产生的光谱漂移。
从上述描述可以看出，上述两种微纳光纤生物传感检测方法均具备以下优点：
1、传感器通过修饰制备的金纳米双锥检测前列腺癌细胞外泌体与适配体结合产生的光谱漂移，检测灵敏度高，可直接实际应用于前列腺癌细胞外泌体的低检测限检测。
2、当采用微纳光纤进行传感时，能够对微纳光纤增敏，利用锥形微纳光纤侧面的倏逝波对外界环境变化敏感的特性，从而实现对前列腺癌外泌体与适配体的特异性结合所引起的适配体构象变化进行检测。
附图说明
图1为本发明制备的WS2支撑的金纳米双锥界面修饰的微纳光纤示意图；
图2为本发明制备的金纳米双锥结合WS2修饰在微纳光纤表面的扫描电镜(SEM)图；
图3为本发明制备的金纳米双锥界面修饰的微纳光纤检测前列腺癌外泌体原理图；
图4为本发明光纤生物传感系统结构示意图；
图5为本发明制备的金纳米双锥修饰后结合WS2用于微纳光纤生物传感器检测不同浓度10％牛血清前列腺癌外泌体的光谱漂移图；
图6为本发明制备的金纳米双锥修饰后结合WS2用于微纳光纤生物传感器检测前列腺癌病人血清的光谱漂移柱状图；
附图标记：1-前列腺癌细胞外泌体，2-特异性适配体，3-金纳米双锥，4-微纳光纤纤芯，5-微纳光纤包层，6-二硫化钨。
具体实施方式
结合图1至图5，详细说明本发明的实施例，但不对本发明的权利要求做任何限定。
实施例1
一种金纳米双锥溶液的制备方法，包括以下步骤：
1、金纳米双锥的制备：
1.1制备金纳米种子：将HAuCl4水溶液(0.01M，0.125mL)和柠檬酸钠溶液(0.01M，0.25mL)加入到去离子水(9.625ml)中，然后在剧烈搅拌下加入新鲜制备的放于3℃冷藏15分钟的NaBH4溶液(0.01M，0.15mL)，得到橙红色金种溶液；将橙红色金种溶液在室温下老化至少2小时，使未反应NaBH4完全水解，形成粉红色种子液；
1.2制备生长溶液：制备40ml的CTAB溶液，浓度为0.1M，使溶液冷却至室温后，先加入2ml浓度为0.01M的HAuCl4水溶液,再加入AgNO3(0.01M，0.4mL)，然后依次加入HCl(1.0M，0.5ml)和抗坏血酸(0.1M，0.32ml)，并剧烈搅拌溶液直到它变成无色(这是因为加入AA后，由于Au3+还原为Au+)，获得生长溶液；此过程中生长溶液的pH值控制在3～5；
1.3制备金纳米双锥溶液：将粉红色种子溶液注入到生长溶液中，并在30℃水浴中静置过夜(大约为20-24小时)，直到溶液由无色变为紫红色，证明生成了金纳米双锥。
2、提纯处理
由于上述方法制得的金纳米双锥溶液是包含了金纳米双锥和金纳米球的混合溶液，含有杂质，为了进一步提高金纳米双锥溶液的纯度，采用密度梯度离心法对制得的紫红色金纳米双锥溶液进行提纯处理，具体步骤包括：
2.1将制备好的金纳米双锥溶液按照1∶3的比例加入到去离子水中，进行离心处理(转速9000rpm，时间10min)，然后用胶头滴管将上清液吸出，留下Au NBP沉淀；
2.2按照密度梯度法的原理，使用乙二醇(纯度≥98.5％)和CTAB(10mM)分别配置五层密度梯度溶液，5层密度梯度溶液中乙二醇与CTAB溶液的体积比分别为50％、60％、70％、80％和90％。
2.3将制备的5层密度梯度溶液以密度逐渐降低(较低的乙二醇浓度)的方式沿离心管的纵向逐层添加到离心管中，以形成5层密度梯度；
2.4将Au NBP沉淀重新分散在CTAB(10mM 0.5mL)溶液中，取0.25mL的再分散AuNBP溶液添加到离心管中的5层密度梯度上，然后进行离心(转速8000rpm，时间20分钟)，获得离心后分层溶液；
2.5使用微量移液器手动提取分层溶液，然后将提取的金纳米双锥分离心重新分散于去离子水即可得到分散均匀、杂质少的金纳米双锥溶液。
按照上述方法制备的金纳米双锥溶液中，金纳米双锥长径比较长，均一性良好。
上述方法实施时，可以做以下改良：
1、在一些实施例中，还可以利用聚乙二醇PEG对金纳米双锥进行封端处理，每毫升金纳米双锥溶液加入20毫克聚乙二醇PEG，然后通过超声震荡分散均匀后即可得到不再生长的金纳米双锥溶液，便于后续应用。
2、在一些实施例中，可以改变制备金纳米双锥溶液步骤中，生长溶液中加入粉红色种子溶液的量(即改变金种子量)，来有效调控最终获得的金纳米双锥的长径比。
3、在一些实施例中，可以改变制备生长溶液步骤中HCl的加入量来控制溶液的pH值稳定在3左右，以影响最终获得的金纳米双锥的形貌，使其形貌规则均一，产量可观。
4、在一些实施例中，可以改变制备生长溶液步骤中AgNO3的加入量来调控金种子的生长环境，以影响最终获得的金纳米双锥的形貌，使其均一性良好。
实施例2
下面将按照上述方法制得的金纳米双锥溶液应用于光纤生物传感器领域，具体为微纳光纤生物传感器。
由于金纳米双锥具有特殊的各向异性结构。这使得它具有对应于沿纵向和横向的电子振荡的两个表面等离子体共振。纵向表面等离子体共振(LSPR)表现出强的光学消光，并且通过改变它们的长宽比可以容易地从可见光到近红外区域进行调谐。因此，利用可调谐LSPR耦合策略能够提高微纳光纤生物传感器的界面灵敏度。
具体方法为：通过对金纳米双锥进行修饰表征，并结合二维材料二硫化钨(WS2)制备微纳光纤生物传感器。制备的光纤生物传感器可以通过扫描电子显微镜(SEM)观测。
由于SEM要求样品的背景基底必须干净，不能有灰尘、有机溶剂或是其他不需要检测的试剂残留物，并且必须保证被测样品必须导电，若不导电，则必须对样品进行喷金处理。因此需对按照实施例1方法获得的金纳米双锥溶液进行前期处理。
由于本发明制备的金纳米双锥表面包裹了一层CTAB，会影响样品的SEM表征，因此需要对制备的金纳米双锥进行处理，具体处理步骤如下：
1、将金纳米双锥溶液取出放入离心机进行离心处理(转速8000rpm，时间10min)，用胶头滴管去除上清液，得到沉淀，然后在沉淀中加入无水乙醇，然后放入超声清洗中进行超声清洗，清洗至溶液完全混合，获得混合溶液；
2、将完全混合的溶液再次放入离心机进行离心处理(转速8000rpm，时间10min)，用胶头滴管去除上清液，得到沉淀，然后在沉淀中加入无水乙醇，然后放入超声清洗中进行超声清洗，清洗至溶液完全混合，获得二次混合溶液，
3、将二次混合溶液加入去离子水后再次放入离心机进行离心处理(转速8000rpm，时间10min)，用胶头滴管去除上清液，得到最终沉淀产物，即修饰表征用金纳米双锥溶液。
如图1所示，结合二维材料，对修饰表征用金纳米双锥溶液进行修饰表征，制备微纳光纤生物传感器，方法如下：
1、准备二氧化硅微纳光纤(最好采用锥形微纳光纤，因为锥形微纳光纤相较于普通的直型微纳光纤灵敏度更高)，用食人鱼溶液清洁裸露的二氧化硅微纳光纤，使得微纳光纤表面的羟基完全暴露出来；
2、先将清洁后的二氧化硅微纳光纤依次浸泡于去离子水、无水乙醇溶液中，各2分钟，然后浸泡于浓度为99％的APTES溶液中30分钟以及再次浸泡无水乙醇2分钟，之后浸泡WS2溶液20分钟，最后浸泡去离子水2分钟后浸泡于金纳米双锥溶液30分钟，修饰完成。
3、将修饰完的微纳光纤放于烘箱(烘干温度57℃，时间8h)中烘干，得到微纳光纤生物传感器。
如图2所示，通过SEM对其进行观测，可以看出片状WS2以及长度250nm左右的金纳米双锥粒子均匀分散并且层层自组装于微纳光纤表面。
上述技术方案中：
1、将微纳光纤表面通过浸泡食人鱼溶液、无水乙醇、APTES溶液，使得微纳光纤表面硅烷化，再通过Au-S键共价耦合金纳米双锥，制备方法简单，制备原料无毒性，生物应用安全性高。
2、首先先利用光纤倏逝波与表面物质的相互作用感知目标分子的结合引起的折射率变化，通过共振峰落在光源区域的金纳米双锥的局域表面等离子激元效应，增强倏逝场能量，即利用锥形微纳光纤侧面的倏逝波对外界环境变化敏感的特性对微纳光纤增敏；再通过二维材料WS2的加入，使得二维材料与金纳米双锥颗粒结合在光纤表面形成一种复合界面，进而提升光纤界面灵敏度。将二者结合后，二维材料WS2作为导体可以增强局部电场，从而增强金纳米双锥粒子与生物分子之间的相互作用，提高光纤生物传感器的灵敏度，且复合界面具有更广泛的比表面积，为生物分子提供更多的结合位点和更大的有效接触区域，提高生物分子的吸附量和灵敏度。因此，二维材料WS2的修饰，进一步优化了等离子共振效应对倏逝场的增强能力，同时增大光纤表面结合特异性适配体的能力，相比无界面修饰的微纳光纤传感器，灵敏度更高。
实施例3
下面结合实施例1的金纳米双锥溶液制备方法和实施例2的微纳光纤生物传感器，将金纳米双锥应用于牛血清中前列腺癌外泌体的检测。如图3所示，通过调控高长径比金纳米双锥的LSPR峰与微纳光纤生物传感器在通讯波段的工作波长一致，微纳米光纤表面结合的前列腺癌细胞适配体识别并捕获解离的前列腺癌外泌体，随后靶成分进入微纳光纤的消逝场，随着前列腺癌外泌体-适配体复合体在微纳光纤表面的形成，折射率RI增加。微纳光纤生物传感器作为折射率传感器，折射率的增加反映了微纳光纤传输光谱的红移，因此能够实现对前列腺癌细胞的高灵敏度定量检测。
具体实施方案如下：
1、试剂准备
1.1准备金纳米双锥溶液：根据实施例1的方法制备高长径比金纳米双锥溶液，并根据实施例2中提到的方法对金纳米双锥溶液进行表征前处理，使其达到表征要求；
1.2配制WS2溶液：将浓度为1mg/mL的WS2·NH2分散液按1∶2的比例加入无水乙醇；
1.3配制前列腺癌适配体溶液：使用TE缓冲液稀释质量为100μg且浓度为1mg/mL的初始前列腺癌细胞适配体溶液，将其稀释为浓度为10μM的适配体溶液；
1.4配制10％牛血清(BSA)溶液：用PBS缓冲液将经过细胞培养并超速离心后的前列腺癌外泌体浓度为109cells/mL的原始牛血清溶液先稀释至10％体积浓度，再进一步基于10％牛血清溶液逐一配制前列腺癌外泌体浓度分别为100-108cells/mL的牛血清溶液。
2、微纳光纤生物传感器界面功能化
2.1先使用食人鱼溶液清洗裸露的二氧化硅微纳光纤，使得微纳光纤表面的羟基完全暴露出来；
2.2再将清洁后的二氧化硅微纳光纤依次浸泡于去离子水、无水乙醇溶液中各2分钟，然后浸泡于浓度为99％的APTES溶液中30分钟使得光纤表面氨基化，再次浸泡无水乙醇2分钟以及WS2溶液20分钟，最后浸泡去离子水2分钟以及高长径比金纳米双锥溶液30分钟，由于氨基与金纳米双锥上的羧基发生共价反应，金纳米双锥逐渐结合到光纤表面；
2.3最后，通过浸泡前列腺癌细胞适配体溶液45分钟将带有羧基的前列腺癌细胞适配体固定在微纳光纤表面，微纳光纤修饰完成，得到微纳光纤生物传感器。
3、牛血清前列腺癌外泌体的检测
将修饰完成的微纳光纤作为传感器集成于光纤生物传感系统中。如图4所示，整个传感系统至少包括传感器、超宽带光源、光谱分析仪，超宽带光源通过单模光纤与传感器相连接，再通过单模光纤连接光谱分析仪，将传感器(即微纳光纤)分别浸入在浓度从100-108cells/mL的牛血清溶液中进行前列腺癌外泌体的检测，能够实现对前列腺癌外泌体的超灵敏分析。传感系统的工作原理为：超宽带光源发出1250-1650nm的激光，经过单模光纤在微纳传感区域激发LSPR效应以检测到光纤表面折射率的变化，并将光信号传输到光谱分析仪，光谱分析仪将光信号转化为电信号，从而显示为透射光谱图，通过光谱图的变化进一步对待测目标物溶液进行折射率分析或液体生物样品分析。
上述方案中，基于可调谐LSPR耦合策略，首先制备散布在微纳光纤表面的WS2负载的金纳米双锥，并将其用作一个超灵敏的光纤生物传感平台，然后在修饰的金纳米双锥及WS2结构上附着前列腺癌外泌体的特异性适配体分子，金纳米双锥上的LSPR起到近红外吸收的作用，激发电子-空穴对并将它们转化为热载流子，然后将热载流子注入WS2二维纳米片，因此，微光纤界面上的瞬变电磁场度得到了加强，由于适配体和外泌体的特异性结合，靶成分进入微纳光纤的消逝场，随着适配体-外泌体复合体在微纳光纤表面形成，折射率增加，从而得到不同的光谱漂移图。
观察光谱图的变化可以看出，不同的外泌体溶液浓度条件下，传感器的透射谱不同，并且随着外泌体溶液浓度的增加观察到规则明显的红移，如图5所示，灵敏度高达1.506nm/log10(particles/mL)。
实施例4
下面结合实施例1的金纳米双锥溶液制备方法和实施例2的微纳光纤生物传感器，将金纳米双锥应用于人血清中前列腺癌外泌体的检测，原理与实施例3类似。
具体实施方案如下：
1、试剂准备
1.1准备金纳米双锥溶液：根据实施例1的方法制备高长径比金纳米双锥溶液，并根据实施例2中提到的方法对金纳米双锥溶液进行表征前处理，使其达到表征要求；
1.2配制WS2溶液：将浓度为1mg/mL的WS2·NH2分散液按1∶2的比例加入无水乙醇；
1.3配制前列腺癌适配体溶液：使用TE缓冲液稀释质量为100μg且浓度为1mg/mL的初始适配体溶液(特异性的识别分子)，将其稀释为浓度为10μM的适配体溶液；
1.4准备前列腺癌病人的人血清溶液，通常从医院取得前列腺癌病人的全血清溶液。
2、微纳光纤生物传感器界面功能化
2.1先使用食人鱼溶液清洗裸露的二氧化硅微纳光纤，使得微纳光纤表面的羟基完全暴露出来；
2.2再将清洁后的二氧化硅微纳光纤依次浸泡于去离子水、无水乙醇溶液中各2分钟，然后然后浸泡于浓度为99％的APTES溶液中30分钟使得光纤表面氨基化，再次浸泡无水乙醇2分钟以及WS2溶液20分钟，最后浸泡去离子水2分钟以及高长径比金纳米双锥溶液30分钟，由于氨基与金纳米双锥上的羧基发生共价反应，金纳米双锥逐渐结合到光纤表面；
2.3最后，通过浸泡前列腺癌细胞适配体溶液45分钟将带有羧基的前列腺癌细胞适配体固定在微纳光纤表面，微纳光纤修饰完成，得到微纳光纤生物传感器。
3、人血清前列腺癌外泌体的检测
将修饰完成的微纳光纤作为传感器集成于光纤生物传感系统中，整个传感系统至少包括传感器、超宽带光源、光谱分析仪等，传感系统的架构和工作原理与实施例3相同，将微纳光纤浸入在人血清溶液中进行检测，能够实现对前列腺癌外泌体的超灵敏分析。
上述方案中，首先制备散布在微纳光纤表面的WS2负载的金纳米双锥，并将其用作一个超灵敏的光纤生物传感平台，然后在修饰的金纳米双锥及WS2结构上附着前列腺癌外泌体的特异性适配体分子，金纳米双锥上的LSPR起到近红外吸收的作用，激发电子-空穴对并将它们转化为热载流子，然后将热载流子注入WS2二维纳米片，因此，微光纤界面上的瞬变电磁场度得到了加强，由于适配体和外泌体的特异性结合，靶成分进入微纳光纤的消逝场，随着适配体-外泌体复合体在微纳光纤表面形成，折射率增加，从而得到不同的光谱漂移图，从而区别正常人血清与前列腺癌病人的血清。
观察光谱图的变化可以看出，传感器的透射谱发生改变，并随着血清溶液中外泌体与光纤上的适配体逐渐结合，观察到规则明显的红移光谱，能够灵敏测出人全血清中的前列腺癌外泌体，最终测得10组前列腺癌病人血清光谱漂移量数据，统计后如图6所示。
综上所述，本发明制备的高长径比的金纳米双锥对于光纤生物传感具有以下有益效果：
1、本发明采用种子介导生长法，利用NaBH4还原Au3+生成Au单晶，并通过控制熟化温度使所述Au单晶生长成为五重孪晶，制备出金种子溶液，然后加入AgNO3改变金种子的氧化还原电位，最后加入抗坏血酸促使金种子生长为金纳米双锥，之后通过改变HCl的量改变pH环境，经过调控种子液在生长溶液中的加入量使金纳米双锥生长成不同长径比；并且通过改变不同金种子、盐酸的量可调控制备不同长径比的金纳米双锥，并且金纳米双锥产率高、均一性好，为在近红外Ⅱ区波段的光纤生物传感和治疗方向提供了更多的可能性，并且制备方法操作简便，流程较短，耗材价格低廉，总体制备成本低。
2、本发明制备的高长径比的金纳米双锥应用于光纤生物传感时，通过在锥形微纳光纤表面修饰WS2负载的金纳米双锥，利用光纤倏逝波与表面物质的相互作用感知目标分子的结合引起的折射率变化；通过共振峰落在光源区域的金纳米双锥的局域表面等离子激元效应，增强倏逝场能量；通过二维材料WS2的修饰，从而优化等离子共振效应对倏逝场的增强能力，同时增大光纤表面结合特异性适配体的能力，相比无界面修饰的微纳光纤传感器，本发明所提出的技术实现了对光纤传感灵敏度的增强作用。
3、本发明制备的微纳光纤生物传感器表面通过浸泡食人鱼溶液、无水乙醇、APTES溶液，使得微纳光纤表面硅烷化，再通过Au-S键共价耦合金纳米双锥，修饰特异性结合的适配体后，可对不同浓度的前列腺癌细胞外泌体(甚至是在30％浓度的病人血清中)实现检测，显著提高了前列腺癌细胞早期诊断和筛查的灵敏性和准确性；而且其制备方法简单，制备原料无毒性，生物应用安全性高。
可以理解的是，以上关于本发明的具体描述，仅用于说明本发明而并非受限于本发明实施例所描述的技术方案。本领域的普通技术人员应当理解，仍然可以对本发明进行修改或等同替换，以达到相同的技术效果；只要满足使用需要，都在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种金纳米双锥的制备方法，包括以下步骤：
S101.将HAuCl4水溶液和柠檬酸钠溶液加入到去离子水中，搅拌下再加入NaBH4溶液，得到橙红色金种溶液；
S102.将橙红色金种溶液在室温下老化至少2小时，使未反应NaBH4完全水解，形成粉红色种子液；
S103.向CTAB溶液中依次加入HAuCl4水溶液、AgNO3溶液、HCl和抗坏血酸，并搅拌溶液直至变成无色，获得生长溶液；
S104.将步骤S102获得的粉红色种子溶液注入到生长溶液中，并在30℃水浴中静置20-24小时，直到溶液变为紫红色溶液；
S105.对紫红色溶液采用密度梯度离心法进行离心处理，去除杂质，获得提纯后的金纳米双锥溶液，即获得金纳米双锥；
上述方法中，通过调控步骤S104中的粉红色种子溶液的加入量调控获得的金纳米双锥的长径比。
2.根据权利要求1所述的金纳米双锥的制备方法，其特征在于，所述步骤S101中：
HAuCl4水溶液、柠檬酸钠溶液、去离子水、NaBH4溶液的体积比为0.125∶0.25∶9.625∶0.15；
HAuCl4水溶液的浓度为0.01M，柠檬酸钠溶液的浓度为0.01M，NaBH4溶液的浓度为0.01M。
3.根据权利要求2所述的金纳米双锥的制备方法，其特征在于，所述步骤S103中：
CTAB溶液、HAuCl4水溶液、AgNO3溶液、HCl、抗坏血酸的体积比为40∶2∶0.4∶0.5∶0.32；
CTAB溶液的浓度为0.1M，HAuCl4水溶液的浓度为0.01M，AgNO3溶液的浓度为0.01M，HCl的浓度为1M，抗坏血酸的浓度为0.1M。
4.根据权利要求3所述的金纳米双锥的制备方法，其特征在于，所述步骤S105具体包括：
S1051.将紫红色溶液加入去离子水中，紫红色溶液与去离子水的比例为1∶3，以9000rpm的转速离心10min，去除上清液，获得沉淀；
S1052.利用乙二醇与CTAB溶液分别配置5层密度梯度溶液，5层密度梯度溶液中乙二醇与CTAB溶液的体积比分别为50％、60％、70％、80％和90％；
S1053.将5层密度梯度溶液按照乙二醇浓度自上而下逐渐降低的方式逐层加入离心管中；
S1054.将S1051获得的沉淀重新分散在CTAB溶液中，然后将分散液滴加在离心管中的5个密度梯度溶液里，以8000rpm的转速离心20min，获得离心后分层溶液；
S1055.提取分层溶液中的金纳米双锥分离心，将其重新分散于去离子水中，即可得到提纯后的金纳米双锥溶液。
5.根据权利要求1所述的金纳米双锥的制备方法，其特征在于，步骤S103中，通过调控溶液配比，将所述生长溶液的pH值控制在3～5。
6.一种微纳光纤生物传感器，其特征在于，所述微纳光纤生物传感器具有权利要求1至5任意一项所述的金纳米双锥，通过修饰金纳米双锥并结合二维材料进行传感检测。
7.根据权利要求7所述的微纳光纤生物传感器，其特征在于，所述二维材料为WS2。
8.一种如权利要求7所述的微纳光纤生物传感器的制备方法，包括以下步骤：
S201.准备二氧化硅微纳光纤，用食人鱼溶液清洁裸露的二氧化硅微纳光纤，使得微纳光纤表面的羟基完全暴露出来；
S202.先将清洁后的二氧化硅微纳光纤依次浸泡于去离子水、无水乙醇溶液中；
S203.再将二氧化硅微纳光纤浸泡于APTES溶液中使光纤表面氨基化；
S204.接着将二氧化硅微纳光纤依次浸泡于无水乙醇溶液和WS2溶液；
S205.然后将二氧化硅微纳光纤再依次浸泡于去离子水和金纳米双锥溶液,氨基与金纳米双锥上的羧基发生共价反应，金纳米双锥逐渐结合到光纤表面，修饰完成；
S206.最后将修饰完的二氧化硅微纳光纤放于烘箱中烘干，即得到微纳光纤生物传感器。
9.根据权利要求7所述的微纳光纤生物传感器在制备诊断前列腺癌的产品中的应用。
10.一种微纳光纤生物传感检测方法，其特征在于，使用权利要求7所述的微纳光纤生物传感器，体外检测前列腺癌细胞外泌体与适配体结合产生的光谱漂移。
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