CN117554362A - 在常温下高灵敏检测氰化物的方法及纳米比色分析试剂盒 - Google Patents
在常温下高灵敏检测氰化物的方法及纳米比色分析试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种在常温下高灵敏检测氰化物的方法及纳米比色分析试剂盒，属于化学检测技术领域。该方法包括以下步骤：（1）制备并纯化、浓缩AuNBPs胶体溶液；（2）向Tris‑NaOH缓冲液中添加TCEP、浓缩的AuNBPs胶体溶液、CTAB和实际样品，于25℃反应40min，检测溶液的紫外吸收光谱图；（3）根据金纳米双锥体的轴向LSPR峰位移与CN‑浓度对数形式的线性方程计算实际样品中CN‑的含量。本发明的有益之处在于：（1）通过引入TCEP，大幅度的提高了CN‑检测的灵敏度（大约提高了两个数量级）；（2）使用TCEP加速反应进行，避免了加热问题，扩宽了纳米比色传感器的使用范围。
Description
技术领域
本发明涉及一种检测氰化物的方法及试剂盒，具体涉及一种在常温下高灵敏检测氰化物的方法及纳米比色分析试剂盒，属于化学检测技术领域。
背景技术
在各种阴离子中，氰离子（CN-）是世界上毒性最大的物质之一，对人类和其他生物都有潜在危害。CN-可以与a3细胞色素中血红素辅因子的Fe3+强配位，这会导致a3细胞氧运输功能失活。长期暴露于少量的CN-中会影响中枢神经系统，过量的CN-（4300ppm）则会在几分钟内抑制中枢神经系统，导致人类死亡。此外，CN-在周围环境中的意外释放可能导致生态系统的严重污染。世界卫生组织（WHO）将饮用水中CN-浓度的限值设定为1.9μmol•L-1，氰化物在工业中的广泛使用以及CN-的固有毒性要求对环境样品中CN-杂质进行彻底的筛查。耗时费力的仪器检测法和共存阴离子的干扰使得CN-的检测非常困难。因此，有必要开发快速、简单、高灵敏的检测方法来检测环境样品中的痕量CN-。
贵金属纳米粒子已经广泛应用于各种比色方法，因为它们在可见光范围内表现出强烈的局域表面等离子体共振（LSPR）。基于局域表面等离子体共振光谱的比色传感器的制造变得越来越受到关注。从传感原理角度出发，基于贵金属纳米材料的LSPR 比色分析法可以分为两类，一类是基于贵金属纳米材料距离效应诱导的LSPR比色分析法，另一类是基于贵金属纳米材料形貌效应诱导的LSPR比色分析法。后者相较于前者优点更为明显，例如：无标签，避免了纳米颗粒的修饰；不会面临来自自动聚集的假阳性信号。目前，上述两类分析法已成功应用于重金属离子、阴离子、蛋白质、DNA等多种物质的比色分析检测中。
已经证明，表面蚀刻是改变金属纳米颗粒形状和随后调整光学性质的有效方法。因此，基于贵金属纳米颗粒蚀刻的光谱和比色传感器由于其与贵金属纳米颗粒形态变化相关的吸收光谱和颜色的变化明显而备受关注，各向异性金纳米棒（AuNRs）和金纳米双锥体（AuNBPs）由于二者的特征性LSPR和纵向LSPR带而被广泛研究。此外，通过改变纵横比，可以很容易地将横向和纵向LSPR带从可见光区域调整到近红外区域。理论研究和实验结果表明，与AuNRs相比，AuNBPs在化学上是稳定的。研究发现，AuNBPs表现出一些有利的特性，如：更高的折射率灵敏度、更大的品质因数值、两个尖端附近显著增强的局部场。所有这些因素使AuNBPs成为比色测定中探索的理想材料。但基于贵金属纳米材料形貌效应诱导的LSPR比色分析法仍存在以下问题：
（1）基于贵金属纳米材料形貌效应诱导的LSPR比色分析法存在检测灵敏度低的问题，与其他方法（例如：化学发光法、色谱法、流动注射法等）相比，体现不出简单、快速、高灵敏的优势；
（2）胶体纳米颗粒具有较高的比表面积和较大的表面自由能，溶剂和溶液的酸碱度、反应温度、盐类和带电分子等都会造成贵金属纳米材料不可逆聚集，对贵金属纳米材料比色分析检测造成较大的影响，易造成假阳性或假阴性结果的出现，影响检测的准确度；
（3）贵金属纳米材料胶体溶液的比色分析检测需要在加热的条件下进行，这在一定程度上限制了比色传感器的发展。
发明内容
为解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种在常温下即可简单、快速、高灵敏的检测氰化物的方法及纳米比色分析试剂盒。
为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：
一种在常温下高灵敏检测氰化物的方法，所述方法包括以下步骤：
步骤1：制备并纯化、浓缩AuNBPs胶体溶液，得到浓缩的AuNBPs胶体溶液；
步骤2：向100µL pH为8.6、浓度为0.25M的Tris-NaOH缓冲液中添加5µL浓度为10mM的TCEP水溶液、50µL浓缩的AuNBPs胶体溶液、5µL浓度为100mM的CTAB水溶液和350µL实际样品，将反应体系于室温下或放置于25℃水浴锅中反应40min，使用紫外可见分光光度计检测溶液的紫外吸收光谱图；
步骤3：根据金纳米双锥体的轴向LSPR峰位移与CN-浓度对数形式的线性方程计算实际样品中CN-的含量。
优选的，在步骤1中，制备并纯化和浓缩AuNBPs胶体溶液的方法具体如下：
（1）将HAuCl4•4H2O水溶液和柠檬酸钠水溶液混合均匀，然后加入冰镇的NaBH4水溶液，得到橘红色的种子液，避光老化5h备用；
（2）将HAuCl4•4H2O水溶液、AgNO3水溶液、HCl水溶液和丙烯酰胺水溶液依次加入到CTAB水溶液中混合均匀，然后加入种子液，于30℃水浴中静置过夜，得到紫红色的未纯化的AuNBPs胶体溶液；
（3）将未纯化的AuNBPs胶体溶液离心，沉淀分散在CTAC水溶液中，加入AgNO3水溶液和丙烯酰胺水溶液，油浴65℃反应4h，离心，沉淀分散在CTAB水溶液中，静置4h，沉淀分散在去离子水中，加入氨水和过氧化氢溶液，静置4h，上清液离心，将离心分离出来的沉淀分散在CTAB水溶液中，得到暗红色的纯化的AuNBPs胶体溶液；
（4）将纯化的AuNBPs胶体溶液离心，沉淀离心水洗一次，将水洗后的沉淀重新分散在CTAB水溶液中，得到浓缩的AuNBPs胶体溶液。
优选的，在步骤3中，金纳米双锥体的轴向LSPR峰位移与CN-浓度对数形式的线性方程的获取方法具体如下：
（1）向450µL pH为8.6、浓度为0.05M的Tris-NaOH缓冲液中添加5µL浓度为10mM的TCEP水溶液、50µL浓缩的AuNBPs胶体溶液、5µL浓度为100mM的CTAB水溶液和5µL不同浓度的CN-水溶液，CN-的终浓度在0µM～3.0µM范围内，将反应体系于室温下或放置于25℃水浴锅中反应40min；
（2）使用紫外可见分光光度计检测各溶液的紫外吸收光谱图；
（3）将CN-浓度取对数，以金纳米双锥体的轴向LSPR峰位移为纵坐标、以CN-浓度对数为横坐标做图，即得到金纳米双锥体的轴向LSPR峰位移与CN-浓度对数形式的线性方程。
优选的，在步骤（1）中，CN-的终浓度分别为0µM、0.01µM、0.02µM、0.03µM、0.05µM、0.07µM、0.1µM、0.3µM、0.5µM、0.7µM、1.0µM、2.0µM、3.0µM。
一种在常温下高灵敏检测氰化物的纳米比色分析试剂盒，所述纳米比色分析试剂盒的组成有：
（1）AuNBPs水凝胶试纸条；
（2）浓度为10mM的TCEP水溶液；
（3）浓度为100mM的CTAB水溶液；
（4）浓度分别为0.7μM、1μM、5μM的CN-水溶液；
其中，所述AuNBPs水凝胶试纸条是由浓缩的AuNBPs胶体溶液、琼脂糖和玻璃纤维膜制备得到的，所述浓缩的AuNBPs胶体溶液是由前述的方法制备得到的。
优选的，所述AuNBPs水凝胶试纸条的制备方法具体如下：
（1）将琼脂糖加到去离子水中，放置到96℃水浴锅中使琼脂糖完全溶解，得到浓度为1.5g/100mL的琼脂糖溶液；
（2）将玻璃纤维膜裁成合适大小；
（3）将浓缩的AuNBPs胶体溶液与琼脂糖溶液以体积比1:2混合，快速搅拌均匀得到水凝胶，将水凝胶均匀的涂抹在裁好的玻璃纤维膜上，静置放冷，即得到AuNBPs水凝胶试纸条。
本发明的有益之处在于：
（1）本发明针对贵金属纳米材料形貌效应诱导的LSPR比色分析法存在灵敏度低的问题，引入了三（2-羰基乙基）磷盐酸盐，该盐的引入大幅度的提高了CN-检测的灵敏度，灵敏度大约提高了两个数量级；
（2）本发明使用三（2-羰基乙基）磷盐酸盐加速反应进行，无需加热，避免了加热问题，扩宽了纳米比色传感器的使用范围；
（3）本发明基于AuNBPs水凝胶试纸条，成功构建出了集成式纳米比色分析试剂盒检测CN-，解决了胶体纳米颗粒存在的易聚集、难保存、检测结果不准确等问题，更重要的是，检测流程极其简单，操作极其方便。
附图说明
图1是未纯化的AuNBPs胶体溶液、纯化的AuNBPs胶体溶液、与CN-反应后的AuNBPs胶体溶液的TEM图，其中，（A）是未纯化的AuNBPs胶体溶液的TEM图，（B）是纯化的AuNBPs胶体溶液的TEM图，（C）是与0μM CN-反应后的AuNBPs胶体溶液的TEM图，（D）是与0.5μM CN-反应后的AuNBPs胶体溶液的TEM图，（E）是与1μM CN-反应后的AuNBPs胶体溶液的TEM图；
图2是未纯化的AuNBPs胶体溶液、纯化的AuNBPs胶体溶液、与不同浓度（0µM、0.5µM、1µM）CN-反应后的AuNBPs胶体溶液的紫外吸收光谱图；
图3是与不同浓度（0µM～3µM）CN-反应后的AuNBPs胶体溶液的紫外可见吸收光谱及与其对应的线性关系图，其中，（A）是与不同浓度（0µM～3µM）CN-反应后的AuNBPs胶体溶液的紫外可见吸收光谱图，（B）是与（A）对应的线性关系图；
图4是CN-检测的选择性探究紫外吸收光谱图；
图5是CN-检测的选择性探究波长移动柱状图。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例对本发明作具体的介绍。
一、制备金纳米双锥体胶体溶液
采用种子介导生长法合成金纳米双锥体（AuNBPs），合成过程具体如下：
（1）种子合成：将250μL浓度为0.01M的HAuCl4•4H2O水溶液和500μL浓度为0.01M的柠檬酸钠水溶液加入到19.25mL去离子水中，混合均匀后加入300μL浓度为0.01M的冰镇的NaBH4水溶液，得到橘红色的种子液，避光老化5h备用；
（2）AuNBPs的制备：将5mL浓度为0.01M的HAuCl4•4H2O水溶液、1mL浓度为0.01M的AgNO3水溶液、2mL浓度为1M的HCl水溶液和800μL浓度为0.1M的丙烯酰胺（AA）水溶液依次加入到100mL浓度为0.1M的十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）水溶液中混合均匀，然后再加入2.5mL种子液，搅拌2min，溶液颜色由无色变为紫红色，于30℃水浴中静置过夜，得到未纯化的AuNBPs胶体溶液（紫红色）；
（3）AuNBPs的纯化：取100mL未纯化的AuNBPs胶体溶液于10000rpm离心15min，将分离出来的沉淀重新分散在75mL浓度为0.08M的十六烷基三甲基氯化铵（CTAC）水溶液中，加入20mL浓度为0.01M的AgNO3水溶液和10mL浓度为0.1M的AA水溶液，油浴65℃反应4h以生成银包裹的金纳米双锥体，将生成的银包裹的金纳米双锥体于6000rpm离心15min，将分离出来的沉淀重新分散在75mL浓度为0.05M的CTAB水溶液中，静置4h，取沉淀并重新分散在50mL去离子水中，加入5mL浓度为25%（w/v）的氨水（NH3•H2O）溶液和500µL浓度为5%（w/v）的过氧化氢（H2O2）溶液，静置4h，取上清液于7000rpm离心15min，将分离出来的沉淀重新分散在50mL浓度为0.05M的CTAB水溶液中，得到纯化的AuNBPs胶体溶液（暗红色）；
（4）AuNBPs的浓缩：将纯化的AuNBPs胶体溶液于7500rpm离心15min，将分离出来的沉淀于6000rpm水洗一次，将水洗后的沉淀重新分散在1mL浓度为0.05M的CTAB水溶液中，得到浓缩的AuNBPs胶体溶液，备用。
二、探究金纳米双锥体胶体溶液检测CN-的原理
向450µL pH为8.6、浓度为0.05M的Tris-NaOH缓冲液中添加5µL浓度为10mM的三（2-羰基乙基）磷盐酸盐（TCEP）水溶液、50µL浓缩的AuNBPs胶体溶液、5µL浓度为100mM的CTAB水溶液和5µL 不同浓度的CN-水溶液，CN-的终浓度分别为0µM、0.5µM、1µM，将反应体系放置于25℃水浴锅中（或者室温下，下同）反应40min，观察溶液颜色。
使用高分辨的TEM对未纯化的AuNBPs胶体溶液、纯化的AuNBPs胶体溶液、与不同浓度CN-反应后的AuNBPs胶体溶液进行表征。表征结果见图1。
使用紫外可见分光光度计对未纯化的AuNBPs胶体溶液、纯化的AuNBPs胶体溶液、与不同浓度CN-反应后的AuNBPs胶体溶液进行表征。表征结果见图2。
由图1（A）可知，未纯化的AuNBPs胶体溶液里面含有大量的金纳米球，溶液不纯。由图2可知，未纯化的AuNBPs胶体溶液在520nm和720nm处表现出两个尖锐的特征峰（520nm是金纳米球的特征峰，720nm是金纳米双锥体的特征峰），说明金纳米双锥体和金纳米球在溶液中是单分散状态，与TEM的表征数据一致。
由图1（B）可知，纯化的AuNBPs胶体溶液里面含有极少量的金纳米球。由图2可知，纯化的AuNBPs胶体溶液在720nm处表现出一个尖锐的特征峰，而520nm处的特征峰已经不再明显，说明此刻溶液中只剩下金纳米双锥体，金纳米球大部分已经被清除掉，金纳米双锥体在溶液中是单分散状态，这一点与TEM的表征数据一致。
通过观察各溶液的颜色发现，不同浓度的CN-的加入，使AuNBPs胶体溶液呈现出不同的颜色。结合图1（C）、图1（D）和图1（E）以及图2的表征数据发现：被CTAB包裹的AuNBPs胶体溶液接触到CN-后，受金纳米双锥体形貌（两端尖锐）的影响，金原子非常活跃，容易发生氧化还原反应，从而使金纳米双锥体的形貌发生改变（长径比变小），由于贵金属纳米粒子的LSPR传感性质，溶液的颜色改变，紫外吸收光谱图曲线蓝移。
pH为8.6时，金纳米双锥体的轴向局域表面等离子体共振吸收峰出现在720nm附近，金纳米双锥体的颜色呈现出酒红色。随着CN-浓度的增加，金纳米双锥体逐渐氧化刻蚀，使得长径比也逐渐变小，导致了金纳米双锥体的LSPR吸收峰的蓝移，溶液颜色也因此由酒红色变成蓝色，最终变成红色。
为了证实这一原理，再次仔细观察与不同浓度CN-反应后的AuNBPs胶体溶液的透射电镜图像和紫外可见光谱，由图1（C）和图2可知，在没有CN-存在的情况下，金纳米双锥体呈现两头尖尖的锥形，此时，金纳米双锥体的轴向LSPR吸收峰在720nm处；由图1（D）和图2可知，当CN-浓度为0.5µM时，金纳米双锥体尖端明显变钝，金纳米双锥体逐渐变为棒状，此时，金纳米双锥体的轴向LSPR吸收峰蓝移到660nm附近；由图1（E）和图2可知，当CN-的浓度增加到1µM时，金纳米双锥体变得更像球形，此时，紫外吸收谱图只在620nm附近出现一个吸收峰。
为了探究金纳米双锥体的刻蚀机理，将CN-的终浓度提高至10µM，结果发现AuNBPs胶体溶液在10min内变成了无色。这个现象证明：金纳米双锥体被氧化成了Au(I)，而并非Au(Ⅲ)。据此推测：CN-与Au反应生成缔合物Au(CN-)2，生成的缔合物Au(CN-)2继而又与CTA+反应生成Au(CN-)2(CTA+)2，Au(CN-)2(CTA+)2的生成促使了CN-与Au反应的发生。由于反应体系中引入了TCEP，TCEP可以与Au(CN-)2(CTA+)2中的Au(I)反应生成Au(TCEP)2，反应体系中的CN-得以释放，释放后的CN-继续与Au反应生成缔合物Au(CN-)2，从而使反应进一步加强。反应体系中发生的化学反应如下所示：
Au+CTA++OH-+ O2+CN-→Au(CN-)2(CTA+)2+ H2O
Au(CN-)2(CTA+)2 +TCEP→Au(TCEP)2+ CN-+CTA+
三、测试金纳米双锥体胶体溶液检测CN-的灵敏度
向450µL pH为8.6、浓度为0.05M的Tris-NaOH缓冲液中添加5µL 浓度为10mM的TCEP水溶液、50µL浓缩的AuNBPs胶体溶液、5µL 浓度为100mM的CTAB水溶液和5µL不同浓度的CN-水溶液，CN-的终浓度分别为0µM、0.01µM、0.02µM、0.03µM、0.05µM、0.07µM、0.1µM、0.3µM、0.5µM、0.7µM、1.0µM、2.0µM、3.0µM，将反应体系放置于25℃水浴锅中反应40min，观察溶液颜色。
使用紫外可见分光光度计对与不同浓度CN-反应后的AuNBPs胶体溶液进行表征。表征结果见图3。
由图3（A）可知，随着CN-浓度的增加，金纳米双锥体的轴向LSPR吸收光谱逐渐由长波方向向短波方向移动，因此将金纳米双锥体的轴向LSPR峰位移作为CN-响应信号，随着CN-浓度的上升，金纳米双锥体的轴向LSPR峰位移（Peak-Shift）不断上升，当CN-的浓度达到3.0μM时，金纳米双锥体的轴向LSPR峰位移到达平台，这是因为金纳米双锥体被刻蚀为球形，金纳米粒子只有一个峰位并且不再变化。金纳米双锥体的轴向LSPR峰位移与CN-浓度呈现幂函数的形式变化，将CN-浓度取对数，就可以得到金纳米双锥体的轴向LSPR峰位移与CN-浓度对数形式的线性方程，如图3（B）所示。根据3σ规则计算本方法的检出限为0.001μM（1nM）。
本方法的检出限比其他的一些纳米粒子或量子点相关的CN-传感器的灵敏度要低，同样也能和AAS、AES、ICP-MS以及阳极或阴极溶出伏安法相媲美。
值得提出的是，本方法的可视化检测灵敏度也非常高，通过观察溶液颜色发现，0.03μM（30nM）的CN-就能引起非常明显的颜色变化，而这个浓度低于WHO推荐的安全限度（1μM）近3个数量级。
四、测试金纳米双锥体胶体溶液检测CN-的选择性
通过检测在其他离子作用下的AuNBPs胶体溶液的紫外吸收光谱、颜色及轴向LSPR吸收峰位移的变化测试本方法的选择性。
向450µL pH为8.6、浓度为0.05M的Tris-NaOH缓冲液中添加5µL 浓度为10mM的TCEP水溶液、50µL浓缩的AuNBPs胶体溶液、5µL 浓度为100mM的CTAB水溶液和5µL浓度为50μM的待测离子（Na+、K+、Ca2+、Mg2+、Sn2+、Ni+、Fe2+、Hg2+、Cd2+、NO3 -、SO4 2-、PO4 3-、I-、Br-、Cl-、NO2 -、NH4 +、SO3 2-、CO3 2-、MoO4 -、S2O3 2-、SCN-、CN-）水溶液，将反应体系放置于25℃水浴锅中反应40min，观察溶液颜色。
使用紫外可见分光光度计对与不同待测离子反应后的AuNBPs胶体溶液进行表征。表征结果见图4。
由图4可知，只有在CN-作用下的金纳米双锥体的LSPR吸收峰发生了非常大的蓝移，而在其他离子作用下的金纳米双锥体的LSPR吸收峰和空白组（未添加任何待测离子）几乎一样。这说明AuNBPs胶体溶液只对CN-具有选择性。
将与不同待测离子反应后的AuNBPs的轴向LSPR峰位移以柱状图的形式呈现，可以更方便的观察出AuNBPs胶体溶液对CN-的选择性。
CN-检测的选择性探究波长移动柱状图见图5。由图5可知，只有在CN-作用下的金纳米双锥体的LSPR吸收峰发生了非常大的移动，波长差值在100nm左右，而在其他离子作用下的金纳米双锥体的LSPR吸收峰和空白组（未添加任何待测离子）几乎一样，基本没有移动。这说明AuNBPs胶体溶液只对CN-具有选择性。
通过观察各溶液的颜色发现，只有在CN-作用下的AuNBPs胶体溶液有明显的颜色变化（从酒红色变为蓝色），而在其他离子作用下的AuNBPs胶体溶液的颜色和空白组几乎一样（均呈酒红色）。
为了进一步考察本方法的抗干扰能力，将除CN-以外的待测离子混合后（记为混合1）或者将包括CN-在内的以上所有待测离子混合后（记为混合2）加入到反应体系中，具体的：
向450µL pH为8.6、浓度为0.05M的Tris-NaOH缓冲液中添加5µL浓度为10mM的TCEP水溶液、50µL浓缩的AuNBPs胶体溶液、5µL浓度为100mM的CTAB水溶液和5µL包括CN-在内的以上所有待测离子（或者除CN-以外的待测离子）水溶液，各待测离子的终浓度均为1.0μM，将反应体系放置于25℃水浴锅中反应40min。
使用紫外可见分光光度计对与除CN-以外的混合待测离子反应后的AuNBPs胶体溶液以及与包括CN-在内的以上所有待测离子反应后的AuNBPs胶体溶液进行表征，表征结果见图4。
由图4可知，与空白相比，与除CN-以外的混合待测离子反应后的AuNBPs胶体溶液的紫外吸收光谱（混合1）没有发生明显的变化，这说明除CN-以外的各离子均不会对金纳米双锥体的形貌产生影响；与空白相比，与包括CN-在内的以上所有待测离子反应后的AuNBPs胶体溶液的紫外吸收光谱（混合2）发生了明显的变化，LSPR吸收峰移动了接近100nm，这说明包括CN-在内的待测离子中的某些离子与金纳米双锥体发生了反应，使金纳米双锥体的形貌产生了变化。
将与除CN-以外的混合待测离子反应后的AuNBPs的轴向LSPR峰位移以及与包括CN-在内的以上所有待测离子反应后的AuNBPs的轴向LSPR峰位移以柱状图的形式呈现，可以更方便的观察出AuNBPs胶体溶液对CN-的选择性。
CN-检测的选择性探究波长移动柱状图见图5。由图5可知，1.0μM的CN-产生的信号（混合2）和没加干扰离子时产生的信号（CN-）几乎相同，混合的其他离子对CN-的检测几乎不产生影响。
需要提出的是，较高浓度的Hg2+和I-会对本反应体系产生一些正干扰，这是由于：（1）Hg2+被TCEP还原成汞单质，汞单质与金形成汞齐，进而诱发金纳米棒发生形变；（2）I-被TCEP还原成碘单质，碘单质会刻蚀金纳米双锥体，导致金纳米双锥体的形貌发生改变。但是实际样品一般含汞和碘的浓度非常低或者不含有汞和碘，所以汞和碘的干扰可以忽略。
五、用金纳米双锥体胶体溶液检测实际样品中CN-的含量
为了测试本方法的实用性，通过检测一些实际样品中CN-的含量进行验证。
实际样品包括：海水（加拿大国家研究理事会确认浓度）、自来水、矿泉水和雨水。
检测实际样品中CN-含量的方法具体如下：向100µL pH为8.6、浓度为0.25M的Tris-NaOH缓冲液中添加5µL浓度为10mM的TCEP水溶液、50µL浓缩的AuNBPs胶体溶液、5µL浓度为100mM的CTAB水溶液和350µL实际样品，将反应体系放置于25℃水浴锅中反应40min，然后使用紫外可见分光光度计检测溶液的紫外吸收光谱图，根据图3（B）所示线性方程（Y=30.7097X+42.41751）计算实际样品中CN-的含量。
实际样品中CN-含量的检测结果见表1。
表1 实际样品中CN-含量的检测结果
通过将AuNBPs胶体溶液体系的检测结果和CN-浓度准确值（已知的，加标或 ICP-MS 测定浓度）进行比较可知，二者具有很好的一致性。这说明，AuNBPs胶体溶液体系的检测结果是可靠的。
目前，大部分纳米分析方法往往都会因为纳米粒子自发聚集而不能应用。但是考虑到AuNBPs胶体溶液对CN-的检测能够达到0.001µM（1nM），因此对实际样品稀释10倍也依旧能够高灵敏的检测出CN-的含量。
六、用于CN-检测的AuNBPs水凝胶试纸条的开发与应用
1、用于CN-检测的AuNBPs水凝胶试纸条的开发
为了解决金纳米粒子在高盐度海水中聚集的问题，进一步提高本方法的实用性，本发明还开发出了用于CN-检测的AuNBPs水凝胶试纸条。
该AuNBPs水凝胶试纸条的制备方法具体如下：
（1）将0.15g琼脂糖加到10mL去离子水中，放置到96℃水浴锅中使琼脂糖完全溶解，得到浓度为1.5g/100mL的琼脂糖溶液，于水浴锅中静置备用；
（2）取KB50型号玻璃纤维膜，裁切成50mm×50mm的方块，放置备用；
（3）取1mL 浓缩的AuNBPs胶体溶液，与2mL琼脂糖溶液混合，快速搅拌均匀，得到水凝胶，将水凝胶均匀的涂抹在50mm×50mm的玻璃纤维膜上，静置放冷，让水凝胶与玻璃纤维膜充分结合，得到AuNBPs水凝胶试纸条。
将AuNBPs水凝胶试纸条浸没在100µL pH为8.6、浓度为0.05M的Tris-NaOH缓冲液中，然后向Tris-NaOH缓冲液中添加5µL浓度为10mM的TCEP水溶液、5µL浓度为100mM的CTAB水溶液和5µL不同浓度的CN-水溶液，CN-的终浓度分别为0μM、0.3μM、0.5μM、0.7μM、1μM、2μM、4μM、5μM、10μM，于25℃水浴锅中反应40min，反应结束后将各AuNBPs水凝胶试纸条拿出观察比对颜色变化。
通过观察比对颜色发现，随着CN-浓度的增加，AuNBPs水凝胶试纸条的颜色逐渐由酒红色向蓝色再到粉红色变化，当CN-的浓度为0.5μM时，AuNBPs水凝胶试纸条可以产生明显的颜色变化（由酒红色色变成蓝色色）。
通过不同非专业自愿者实验，确认本发明开发出的AuNBPs水凝胶试纸条的CN-检出限为0.1μM。
与以往报道的检测CN-的方法相比，使用本发明开发的AuNBPs水凝胶试纸条检测CN-更加简单，并且经济实用。
2、用于CN-检测的集成式纳米比色分析试剂盒的开发
用于CN-检测的集成式纳米比色分析试剂盒的组成有：
（1）AuNBPs水凝胶试纸条；
（2）浓度为10mM的TCEP水溶液；
（3）浓度为100mM的CTAB水溶液；
（4）浓度分别为0.7μM、1μM、5μM的CN-水溶液。
3、对AuNBPs水凝胶试纸条进行高盐度测试
取6个AuNBPs水凝胶试纸条分别放置在6个1.5mL离心管中，每个离心管中各加入100μL pH为8.6、浓度为0.25M的Tris-NaOH缓冲液，然后向第1个和第2个离心管中加入400μL水（记为第一组实验），向第3个和第4个离心管中加入400μL浓度为0.625M的NaCl水溶液（记为第二组实验），向第5个和第6个离心管中加入400μL浓度为1.25M的NaCl水溶液（记为第三组实验），之后向6个离心管中同时加入5μL浓度为1mM的TCEP水溶液、5μL浓度为100mM的CTAB水溶液和5μL浓度为50μM的CN-水溶液，在25℃水浴锅中反应40min，观察各离心管中溶液的颜色。
通过对比发现，6个离心管中溶液的颜色完全相同，也就是说，三组实验的结果完全相同，NaCl溶液不会对实验结果造成影响。
4、AuNBPs水凝胶试纸条的应用
将AuNBPs水凝胶试纸条分别浸没在100µL湖水（烟台大学三元湖）、100µL海水（加拿大国家研究理事会确认浓度）、100µL水库水（烟台凤凰山水库）、100µL矿泉水、100µL雨水、100µL河水（逛荡河水）中。然后分别将5µL浓度为0.7μM、1μM、5μM的CN-水溶液加标到上述各实际样品中，与此同时，向实际样品中添加5µL浓度为10mM的TCEP水溶液和5µL浓度为100mM的CTAB水溶液，于25℃水浴锅中反应40min，反应结束后将各AuNBPs水凝胶试纸条拿出观察比对颜色变化。
AuNBPs水凝胶试纸条对海水、逛荡河水、凤凰山水库水、三元湖水、矿泉水和雨水的检测结果具体如下：
所有水样的实验现象一致，即加标的CN-初始浓度为0.7μM时，各AuNBPs水凝胶试纸条均呈现出蓝色；加标的CN-初始浓度为1μM时，各AuNBPs水凝胶试纸条均呈现出紫色；加标的CN-初始浓度为5μM时，各AuNBPs水凝胶试纸条均呈现出粉红色
通过将AuNBPs水凝胶试纸条的检测结果和CN-浓度准确值（已知的，加标或 ICP-MS 测定浓度）进行比较可知，二者具有很好的一致性。这说明，AuNBPs水凝胶试纸条的检测结果是可靠的。
与AuNBPs胶体溶液体系相比，用AuNBPs水凝胶试纸条检测CN-流程极其简单，操作极其方便，同时还解决了胶体纳米颗粒存在的易聚集、难保存、检测结果不准确等问题，AuNBPs水凝胶试纸条在实际样品检测中具有较好的使用价值。
需要说明的是，上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无法对所有的实施方式予以穷举。凡是属于本发明技术方案所引申出的显而易见变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。
Claims (6)
1.一种在常温下高灵敏检测氰化物的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：制备并纯化、浓缩AuNBPs胶体溶液，得到浓缩的AuNBPs胶体溶液；
步骤2：向100µL pH为8.6、浓度为0.25M的Tris-NaOH缓冲液中添加5µL浓度为10mM的TCEP水溶液、50µL浓缩的AuNBPs胶体溶液、5µL浓度为100mM的CTAB水溶液和350µL实际样品，将反应体系于室温下或放置于25℃水浴锅中反应40min，使用紫外可见分光光度计检测溶液的紫外吸收光谱图；
步骤3：根据金纳米双锥体的轴向LSPR峰位移与CN-浓度对数形式的线性方程计算实际样品中CN-的含量。
2.根据权利要求1所述的在常温下高灵敏检测氰化物的方法，其特征在于，在步骤1中，制备并纯化和浓缩AuNBPs胶体溶液的方法具体如下：
（1）将HAuCl4•4H2O水溶液和柠檬酸钠水溶液混合均匀，然后加入冰镇的NaBH4水溶液，得到橘红色的种子液，避光老化5h备用；
（2）将HAuCl4•4H2O水溶液、AgNO3水溶液、HCl水溶液和丙烯酰胺水溶液依次加入到CTAB水溶液中混合均匀，然后加入种子液，于30℃水浴中静置过夜，得到紫红色的未纯化的AuNBPs胶体溶液；
（3）将未纯化的AuNBPs胶体溶液离心，沉淀分散在CTAC水溶液中，加入AgNO3水溶液和丙烯酰胺水溶液，油浴65℃反应4h，离心，沉淀分散在CTAB水溶液中，静置4h，沉淀分散在去离子水中，加入氨水和过氧化氢溶液，静置4h，上清液离心，将离心分离出来的沉淀分散在CTAB水溶液中，得到暗红色的纯化的AuNBPs胶体溶液；
（4）将纯化的AuNBPs胶体溶液离心，沉淀离心水洗一次，将水洗后的沉淀重新分散在CTAB水溶液中，得到浓缩的AuNBPs胶体溶液。
3.根据权利要求1所述的在常温下高灵敏检测氰化物的方法，其特征在于，在步骤3中，金纳米双锥体的轴向LSPR峰位移与CN-浓度对数形式的线性方程的获取方法具体如下：
（1）向450µL pH为8.6、浓度为0.05M的Tris-NaOH缓冲液中添加5µL浓度为10mM的TCEP水溶液、50µL浓缩的AuNBPs胶体溶液、5µL浓度为100mM的CTAB水溶液和5µL不同浓度的CN-水溶液，CN-的终浓度在0µM～3.0µM范围内，将反应体系于室温下或放置于25℃水浴锅中反应40min；
（2）使用紫外可见分光光度计检测各溶液的紫外吸收光谱图；
（3）将CN-浓度取对数，以金纳米双锥体的轴向LSPR峰位移为纵坐标、以CN-浓度对数为横坐标做图，即得到金纳米双锥体的轴向LSPR峰位移与CN-浓度对数形式的线性方程。
4.根据权利要求3所述的在常温下高灵敏检测氰化物的方法，其特征在于，在步骤（1）中，CN-的终浓度分别为0µM、0.01µM、0.02µM、0.03µM、0.05µM、0.07µM、0.1µM、0.3µM、0.5µM、0.7µM、1.0µM、2.0µM、3.0µM。
5.一种在常温下高灵敏检测氰化物的纳米比色分析试剂盒，其特征在于，所述纳米比色分析试剂盒的组成有：
（1）AuNBPs水凝胶试纸条；
（2）浓度为10mM的TCEP水溶液；
（3）浓度为100mM的CTAB水溶液；
（4）浓度分别为0.7μM、1μM、5μM的CN-水溶液；
其中，所述AuNBPs水凝胶试纸条是由浓缩的AuNBPs胶体溶液、琼脂糖和玻璃纤维膜制备得到的，所述浓缩的AuNBPs胶体溶液是由权利要求2所述的方法制备得到的。
6.根据权利要求5所述的在常温下高灵敏检测氰化物的纳米比色分析试剂盒，其特征在于，所述AuNBPs水凝胶试纸条的制备方法具体如下：
（1）将琼脂糖加到去离子水中，放置到96℃水浴锅中使琼脂糖完全溶解，得到浓度为1.5g/100mL的琼脂糖溶液；
（2）将玻璃纤维膜裁成合适大小；
（3）将浓缩的AuNBPs胶体溶液与琼脂糖溶液以体积比1:2混合，快速搅拌均匀得到水凝胶，将水凝胶均匀的涂抹在裁好的玻璃纤维膜上，静置放冷，即得到AuNBPs水凝胶试纸条。
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