CN113252631A - 双重检测丙溴磷农药的荧光比色核酸适配体传感器、其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种双重检测丙溴磷农药的荧光比色核酸适配体传感器、其制备方法与应用，属于农药残留检测技术领域。本发明的双重检测丙溴磷农药的荧光比色核酸适配体传感器，包括铂/金/铑纳米颗粒、金属网‑氧化石墨烯和荧光基团修饰的丙溴磷核酸适配体；其中，荧光基团修饰的丙溴磷核酸适配体非特异性吸附在铂/金/铑纳米颗粒上，然后与金属网‑氧化石墨烯非特异性吸附，形成组装体即为双重检测丙溴磷农药的荧光比色核酸适配体传感器。使用本发明的传感器检测丙溴磷的方法简单，无需对待测样本进行复杂的前处理；检测成本低，检测快速，检测灵敏度高，特异性强，对检测仪器的要求低。
Description
技术领域
本发明属于农药残留检测技术领域，具体涉及一种双重检测丙溴磷农药的荧光比色核酸适配体传感器、其制备方法与应用。
背景技术
随着农业产业的发展，病虫草害日益明显，农药被广泛用于防治。有机磷农药(Organophosphate pesticides OPPs)是一类含有磷元素的有机化合物农药，是农作物中常用的农药之一。它们主要保护农作物和植物免受病虫害、草害的侵害，提高农作物的产量。然而，过量的有机磷会残留在蔬菜和水果中，造成食品安全问题，并渗入土壤和水体，造成环境污染。因此，OPPs的检测和调控越来越受到人们的重视。
传统的检测方法主要集中在色谱技术上，包括气相色谱法(GC)、高效液相色谱法(HPLC)。但上述检测方法存在操作复杂、前处理繁琐、检测时间长、成本高等缺点。此外，其他检测方法如分子法、酶联免疫吸附试验(ELISA)等，由于灵敏度高，也被用于有机磷的检测，但也存在样品处理复杂、遥感能力不足等局限性。免疫学检测方法简单、快速、成本低且可进行大规模筛选，然而该类方法均建立在抗原和抗体特异性结合的基础之上，有机磷的全抗原及抗体均为蛋白质分子，在高温、强酸、强碱等极端检测环境下极易失活变性。因此，迫切需要在此领域开展深入的研究工作，建立快速、有效的方法分离和检测食品中的有机磷农药。
发明内容
本发明的目的在于提供一种双重检测丙溴磷农药的荧光比色核酸适配体传感器、其制备方法与应用。
为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种双重检测丙溴磷农药的荧光比色核酸适配体传感器，包括铂/金/铑纳米颗粒、金属网-氧化石墨烯和荧光基团修饰的丙溴磷核酸适配体；其中，荧光基团修饰的丙溴磷核酸适配体非特异性吸附在铂/金/铑纳米颗粒上，然后与金属网-氧化石墨烯非特异性吸附，形成组装体即为双重检测丙溴磷农药的荧光比色核酸适配体传感器。
在一个具体的实施例中，所述铂/金/铑纳米颗粒由以下方法制备而成：
将HAuCl4水溶液、K2PtCl4水溶液、RhCl3水溶液与HCl溶液混合，并加入PluronicF127；在超声下完全溶解Pluronic F127后，向混合物中加入抗坏血酸水溶液；然后，在室温下搅拌5小时；反应完成后，通过以8000r/min离心10min积累产物，随后用超纯水连续洗涤、离心三次，制得铂/金/铑纳米颗粒，即PtAuRh NPs。
在一个具体的实施例中，所述金属网-氧化石墨烯由以下方法制备而成：
①将0.3×0.3cm金属网置于稀盐酸中浸泡12小时，取出金属网并用超纯水反复清洗；
②将清洗完毕的金属网浸入0.1wt％氧化石墨烯溶液中0.5h；取出烘干后；浸入3-氨丙基三乙氧基硅烷中30min，然后捞出，烘干；
③将上步获得的金属网重复步骤②1次后，再次将金属网浸入氧化石墨烯溶液中，30min；后取出烘干，即得金属网-氧化石墨烯。
在一个具体的实施例中，所述的丙溴磷核酸适配体的序列如下：
5’-AAGCTTGCTTTATAGCCTGCAGCGATTCTTGATCGGAAAAGGCTGAGAGCTACGC-3’(SEQ IDNO:1)；
所述的荧光基团采用不会与丙溴磷农药发射光谱有重叠的荧光基团；例如FAM、Cy3、Cy5中的一种。
在一个具体的实施例中，所述双重检测丙溴磷农药的荧光比色核酸适配体传感器的制备方法，步骤如下：
(1)取PtAuRh NPs溶液以8000rpm离心10分钟，丢弃上清液，沉淀用PBS再悬浮；然后加入荧光基团修饰的丙溴磷核酸适配体，37℃摇动过夜；
(2)将上述混合液在8000rpm的转速下离心3次10分钟，然后用酒精清洗沉淀，获得PtAuRh NPs-Aptamer，将其重新分散于PBS中；
(3)将金属网-氧化石墨烯浸没入PtAuRh NPs-Aptamer的PBS溶液中15分钟，反应完成后PtAuRh NPs-Aptamer与金属网-GO相连接，得到双重检测丙溴磷农药的荧光比色核酸适配体传感器。
上述方法制备的双重检测丙溴磷农药的荧光比色核酸适配体传感器在制备丙溴磷检测试剂中的应用。
使用上述方法制备的传感器检测丙溴磷的方法，步骤如下：
将双重检测丙溴磷农药的荧光比色核酸适配体传感器加入待检测溶液中，混合常温孵育15分钟，取出金属网-氧化石墨烯；向剩余溶液中依次加入H2O2、TMB、NaAc-HAc缓冲液；室温反应3分钟后，快速通过紫外-可见光谱记录所得溶液在652nm的吸光度信号或者检测荧光基团的荧光强度；对照标准曲线获得丙溴磷浓度。
在一个具体的实施例中，所述标准曲线由以下方法构建而成：
将双重检测丙溴磷农药的荧光比色核酸适配体传感器加入不同浓度的丙溴磷溶液中，混合常温孵育15分钟，取出金属网-氧化石墨烯；向剩余溶液中依次加入H2O2、TMB、NaAc-HAc缓冲液；室温反应3分钟后，快速通过紫外-可见光谱记录所得溶液在652nm的吸光度信号或者检测荧光基团的荧光强度；以丙溴磷浓度为横坐标，紫外吸光度为纵坐标，构建丙溴磷浓度-紫外吸光度标准曲线；或以丙溴磷浓度为横坐标，荧光强度为纵坐标，构建丙溴磷浓度-荧光强度标准曲线。
本发明技术方案的优点
本发明双重检测丙溴磷农药的荧光比色核酸适配体传感器中的丙溴磷农药核酸适配体Apt用于吸附到金属网-氧化石墨烯和特异性识别结合丙溴磷农药。相比之下，荧光检测的灵敏度更高，而比色检测更加直观，两者结合能够直观灵敏检测。
本发明方法具有操作简便，无需对待测样本进行复杂的前处理；检测成本低，检测快速，对检测仪器的要求低。
其中，金属网可以被直接取出，不会影响到后续实验结果的测定。荧光比色适配体应用于有机磷农药的检测，可以进行双重检测，提高了适配体传感器的灵敏度，同时为快速筛查食品中的有机磷农药污染提供新的技术手段。
附图说明
图1是本发明传感器制备方法示意图；
图2是本发明传感器检测原理示意图；
图3是不同浓度丙溴磷农药的检测结果；
图4丙溴磷浓度-紫外吸光度标准曲线；
图5丙溴磷浓度-荧光强度标准曲线；
图6是不同有机磷农药的检测结果图。
具体实施方式
在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。
下面结合具体实施例，并参照数据进一步详细的描述本发明。以下实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
下面结合附图1和图2，进一步说明本发明的检测原理。
首先，将氧化石墨烯修饰在金属网上，提高金属网的吸附能力，为非特异性吸附丙溴磷核酸适配体提供条件。金属网-氧化石墨烯除了能够非特异性吸附丙溴磷核酸适配体外，当丙溴磷适配体与丙溴磷靶标结合时，金属网方便取出，可防止干扰后续实验检测。将制备好的金属网-氧化石墨烯/PtAuRh NPs-Apt加入待检测溶液中，丙溴磷核酸适配体(Apt)特异性结合丙溴磷农药，此时PtAuRh NPs-Apt与丙溴磷的结合能力远远大于PtAuRhNPs-Apt与金属网的吸附能力，因此PtAuRh NPs-Apt从金属网-氧化石墨烯脱离下来，将金属网-氧化石墨烯溶液中取出。PtAuRh NPs-Apt的脱离能力与丙溴磷含量成正比。因此，脱离下来的PtAuRh NPs-Apt催化TMB/H2O2体系，溶液变蓝，通过紫外分光光度计检测吸光度值。相同的原理，将脱离下来的PtAuRh NPs-Apt修饰了FAM荧光基团，根据相同的原理，用激发波长492nm来激发FAM荧光基团，检测其在发射波长518nm处的荧光强度，对照标准曲线获得待测溶液中丙溴磷浓度。
实施例1
一种双重检测丙溴磷农药的荧光比色核酸适配体传感器，包括铂/金/铑纳米颗粒、金属网-氧化石墨烯和荧光基团修饰的丙溴磷核酸适配体；其中，荧光基团修饰的丙溴磷核酸适配体非特异性吸附在铂/金/铑纳米颗粒上，然后与金属网-氧化石墨烯非特异性吸附，形成组装体即为双重检测丙溴磷农药的荧光比色核酸适配体传感器，具体制备方法如下：
(1)取1mL浓度为0.5M的铂/金/铑纳米颗粒(PtAuRh NPs)溶液以8000rpm离心10分钟，丢弃上清液，沉淀用10mL PBS(0.01M，pH 7.4)再悬浮；然后加入10μL浓度为10μM的荧光基团修饰的丙溴磷核酸适配体，37℃摇动过夜；
(2)将上述混合液在8000rpm的转速下离心3次10分钟，然后用酒精清洗沉淀，获得PtAuRh NPs-Aptamer，将其重新分散于1mL PBS中；
(3)取1.5mL离心管将金属网-氧化石墨烯浸没入PtAuRh NPs-Aptamer的PBS溶液中15分钟，反应完成后PtAuRh NPs-Aptamer与金属网-氧化石墨烯相连接，得到双重检测丙溴磷农药的荧光比色核酸适配体传感器。
所述铂/金/铑纳米颗粒(PtAuRh NPs)由以下方法制备而成：
将0.6mL HAuCl4水溶液(浓度0.02M)、3.0mL K2PtCl4水溶液(浓度0.02M)、2.0mLRhCl3水溶液(浓度0.02M)与120μL HCl溶液(浓度6.0M)混合，并加入100.8mg PluronicF127；在超声下完全溶解Pluronic F127后，向混合物中加入4.0mL抗坏血酸水溶液(浓度0.1M)；然后，在室温下搅拌5小时；反应完成后，通过以8000r/min离心10min积累产物，随后用超纯水连续洗涤、离心三次，制得铂/金/铑纳米颗粒，收集的产品保存在4℃以备进一步使用。
所述金属网-氧化石墨烯由以下方法制备而成：
①将0.3×0.3cm不锈钢金属网置于稀盐酸(浓度1.2M)中浸泡12小时，取出金属网并用超纯水反复清洗；
②将清洗完毕的金属网浸入0.1wt％氧化石墨烯溶液中0.5h；取出烘干(80℃，30min)后；浸入3-氨丙基三乙氧基硅烷中30min，然后捞出，烘干(120℃，30min)；
③将上步获得的金属网重复步骤②1次后，再次将金属网浸入氧化石墨烯溶液中，30min；后取出烘干(80℃，30min)，即得金属网-氧化石墨烯。
所述荧光基团修饰的丙溴磷核酸适配体为：
5’-FAM-AAGCTTGCTTTATAGCCTGCAGCGATTCTTGATCGGAAAAGGCTGAGAGCTACGC-SH-3’；
实施例2
使用实施例1传感器检测丙溴磷的方法，步骤如下：
将双重检测丙溴磷农药的荧光比色核酸适配体传感器加入50μL待检测溶液中，混合常温孵育15分钟，取出金属网-氧化石墨烯；向剩余溶液中依次加入12μL H2O2(浓度0.1μM)、12μL TMB(浓度2.5μM)、24μL NaAc-HAc缓冲液(0.2μM，pH4)；室温反应3分钟后，快速通过紫外-可见光谱记录所得溶液在652nm(A652 nm)的吸光度信号或者用激发波长492nm来激发FAM荧光基团，检测其在发射波长518nm处的荧光强度；对照标准曲线获得丙溴磷浓度。
所述标准曲线由以下方法构建而成：
将双重检测丙溴磷农药的荧光比色核酸适配体传感器加入不同浓度的丙溴磷溶液中，混合常温孵育15分钟，取出金属网-氧化石墨烯；向剩余溶液中依次加入H2O2、TMB、NaAc-HAc缓冲液；室温反应3分钟后，快速通过紫外-可见光谱记录所得溶液在652nm的吸光度信号或者检测荧光基团的荧光强度；以丙溴磷浓度为横坐标，紫外吸光度为纵坐标，构建丙溴磷浓度-紫外吸光度标准曲线；或以丙溴磷浓度为横坐标，荧光强度为纵坐标，构建丙溴磷浓度-荧光强度标准曲线。
不同浓度丙溴磷农药的检测结果如图3所示，随着丙溴磷浓度的增加，各管中液体的颜色由浅蓝向深蓝转变。
其中，构建的丙溴磷浓度-紫外吸光度标准曲线如图4所示，丙溴磷浓度-荧光强度标准曲线如图5所示；由图4和图5可知，比色适配体传感器的检测范围在10-12mol/mL-10- 2mol/mL，该荧光适配体传感器的检测范围在10-12mol/mL-10-2mol/mL之间，检测下限达到0.5×10-12mol/mL。
实施例3
实施例1双重检测丙溴磷农药的荧光比色核酸适配体传感器特异性检测：
采用倍硫磷、二嗪农、毒死蜱、辛硫磷、双硫磷对实施例1双重检测丙溴磷农药的荧光比色核酸适配体传感器特异性检测，具体是将双重检测丙溴磷农药的荧光比色核酸适配体传感器分别加入浓度均为500pg/mL的6种农药溶液中，混合常温孵育15分钟，取出金属网-氧化石墨烯；向剩余溶液中依次加入12μL H2O2(浓度0.1μM)、12μL TMB(浓度2.5μM)、24μL NaAc-HAc缓冲液(0.2μM，pH4)；室温反应3分钟后，快速通过紫外-可见光谱记录所得溶液在652nm(A652 nm)的吸光度信号。结果如图6所示，由吸光度可以看出丙溴磷的数值明显高于其他有机磷农药，因此，该适配体传感器对丙溴磷具有很高的特异性。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。
序列表
<110> 青岛农业大学
<120> 双重检测丙溴磷农药的荧光比色核酸适配体传感器、其制备方法与应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
aagcttgctt tatagcctgc agcgattctt gatcggaaaa ggctgagagc tacgc 55
Claims (8)
1.一种双重检测丙溴磷农药的荧光比色核酸适配体传感器，其特征在于，包括铂/金/铑纳米颗粒、金属网-氧化石墨烯和荧光基团修饰的丙溴磷核酸适配体；其中，荧光基团修饰的丙溴磷核酸适配体非特异性吸附在铂/金/铑纳米颗粒上，然后与金属网-氧化石墨烯非特异性吸附，形成组装体即为双重检测丙溴磷农药的荧光比色核酸适配体传感器。
2.根据权利要求1所述双重检测丙溴磷农药的荧光比色核酸适配体传感器，其特征在于，所述铂/金/铑纳米颗粒由以下方法制备而成：
将HAuCl4水溶液、K2PtCl4水溶液、RhCl3水溶液与HCl溶液混合，并加入Pluronic F127；在超声下完全溶解Pluronic F127后，向混合物中加入抗坏血酸水溶液；然后，在室温下搅拌5小时；反应完成后，通过以8000r/min离心10min积累产物，随后用超纯水连续洗涤、离心三次，制得铂/金/铑纳米颗粒，即PtAuRh NPs。
3.根据权利要求1所述双重检测丙溴磷农药的荧光比色核酸适配体传感器，其特征在于，所述金属网-氧化石墨烯由以下方法制备而成：
①将0.3×0.3cm金属网置于稀盐酸中浸泡12小时，取出金属网并用超纯水反复清洗；
②将清洗完毕的金属网浸入0.1wt％氧化石墨烯溶液中0.5h；取出烘干后；浸入3-氨丙基三乙氧基硅烷中30min，然后捞出，烘干；
③将上步获得的金属网重复步骤②1次后，再次将金属网浸入氧化石墨烯中，30min；后取出烘干，即得金属网-氧化石墨烯。
4.根据权利要求1所述双重检测丙溴磷农药的荧光比色核酸适配体传感器，其特征在于，所述的丙溴磷核酸适配体的序列如下：
5’-AAGCTTGCTTTATAGCCTGCAGCGATTCTTGATCGGAAAAGGCTGAGAGCTACGC-3’；
所述的荧光基团为FAM、Cy3、Cy5中的一种。
5.权利要求1-4任一项所述双重检测丙溴磷农药的荧光比色核酸适配体传感器的制备方法，其特征在于，步骤如下：
(1)取PtAuRh NPs溶液以8000rpm离心10分钟，丢弃上清液，沉淀用PBS再悬浮；然后加入荧光基团修饰的丙溴磷核酸适配体，37℃摇动过夜；
(2)将上述混合液在8000rpm的转速下离心3次10分钟，然后用酒精清洗沉淀，获得PtAuRh NPs-Aptamer，将其重新分散于PBS中；
(3)将金属网-氧化石墨烯浸没入PtAuRh NPs-Aptamer的PBS溶液中15分钟，反应完成后PtAuRh NPs-Aptamer与金属网-GO相连接，得到双重检测丙溴磷农药的荧光比色核酸适配体传感器。
6.权利要求5所述方法制备的双重检测丙溴磷农药的荧光比色核酸适配体传感器在制备丙溴磷检测试剂中的应用。
7.使用权利要求5所述方法制备的传感器检测丙溴磷的方法，其特征在于，步骤如下：
将双重检测丙溴磷农药的荧光比色核酸适配体传感器加入待检测溶液中，混合常温孵育15分钟，取出金属网-氧化石墨烯；向剩余溶液中依次加入H2O2、TMB、NaAc-HAc缓冲液；室温反应3分钟后，快速通过紫外-可见光谱记录所得溶液在652nm的吸光度信号或者检测荧光基团的荧光强度；对照标准曲线获得丙溴磷浓度。
8.根据权利要求7所述检测丙溴磷的方法，其特征在于，所述标准曲线由以下方法构建而成：
将双重检测丙溴磷农药的荧光比色核酸适配体传感器加入不同浓度的丙溴磷溶液中，混合常温孵育15分钟，取出金属网-氧化石墨烯；向剩余溶液中依次加入H2O2、TMB、NaAc-HAc缓冲液；室温反应3分钟后，快速通过紫外-可见光谱记录所得溶液在652nm的吸光度信号或者检测荧光基团的荧光强度；以丙溴磷浓度为横坐标，紫外吸光度为纵坐标，构建丙溴磷浓度-紫外吸光度标准曲线；或以丙溴磷浓度为横坐标，荧光强度为纵坐标，构建丙溴磷浓度-荧光强度标准曲线。
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