CN206832820U - 一种检测包含黄曲霉毒素的真菌毒素用免疫层析试纸条 - Google Patents

Abstract

本实用新型公开了一种检测包含黄曲霉毒素的真菌毒素用免疫层析试纸条，包括底板以及底板上依次粘接的样品垫、结合垫、NC膜和吸收垫，所述NC膜上设置有真菌毒素的检测线和质控线，所述结合垫表面具有抗真菌毒素的单克隆抗体标记胶体金探针溶液层；所述检测线至少包括2条，分别对应不同的真菌毒素；所述具有抗真菌毒素的单克隆抗体至少具有2种。本实用新型的主要目的在于提供一种检测真菌毒素的免疫层析试纸条，能同时检测多种真菌毒素，且灵敏高、特异性良好。

Description

一种检测包含黄曲霉毒素的真菌毒素用免疫层析试纸条

技术领域

本实用新型属于免疫分析技术领域，特别涉及一种检测包含黄曲霉毒素的真菌毒素用免疫层析试纸条。

背景技术

真菌毒素(Mycotin)是真菌产生的次级代谢物，目前已知有300多种，这些真菌毒素通过对农作物的污染，而给人类和家畜健康带来巨大威胁。我国根据保障粮食卫生安全的需要，有针对性地中部分真菌毒素制定了限量标准。食物中常见的真菌毒素有黄曲霉、赭曲霉毒素、呕吐毒素，玉米赤烯酮，伏马毒素和T2毒素这六种，这些主要存在于谷物、干果水及蔬菜等作物中，另外在牛奶、咖啡酒类及中药材等也有报道。受污染的食品通过食物链最终进入人和动物体内，严重危害与类的健康。世界各国针对食品饲料中真菌毒素已经制定了最大残留限量的标准。如欧盟规定玉米中真菌毒素黄曲霉B1的最大限量为2μg/kg呕吐霉素为1.0mg/kg、赭曲霉毒素为5μg/kg、玉米赤霉烯酮为2000μg/kg。GB2761GB2761-2011《食品中真菌毒素限量》明确规定玉米、小麦及其制品中玉米赤霉烯酮的限量标准为20-100ug/kg，T-2毒素的最高限量为80μg/kg，黄曲霉毒素B1的限量标准涵盖食品范围较多，包括玉米及其制品、花生及其制品(20μg/kg)、大米及其制品(10μg/kg)、小麦及其制品、豆类熟制坚果以及调味品(5μg/kg)等。

现有技术中常用的真菌毒素检测技术主要有薄层层析法、精密仪器分析法、免疫学分析法。免疫学分析法克服了前两者的缺点，具有特异性强、灵敏度高、样品前处理简单、成本低、对实验人员和环境的污染危害小、适于现场批量检测等优点。其中基于纳米金的免疫层析快速检测技术具有简便、快速、灵敏、适于现场检测的优点，具有极大的应用价值和应用前景。目前已有针对黄曲霉毒素单一组分的快速检测试纸条问世，但是因为绝大多数被污染的样品都不止含有一种真菌毒素，从而易对检测结果造成干扰或交叉污染，不能够很好地满足当前更加严格的真菌毒素限量标准的检测需求。因此，研究建立一种针对多种生物毒素的高灵敏度免疫层析试纸条对于监控食品和农产品中的真菌毒素具有很重要的意义和应用价值。

实用新型内容

针对背景技术中的上述问题，本实用新型的主要目的在于提供一种检测包含黄曲霉毒素的真菌毒素用免疫层析试纸条，能同时检测多种真菌毒素，且灵敏高、特异性良好。

为了达到上述目的，本实用新型采用如下技术方案：一种检测包含黄曲霉毒素的真菌毒素用免疫层析试纸条，包括底板以及底板上依次粘接的样品垫、结合垫、NC膜(硝酸纤维素膜)和吸收垫，所述NC膜上设置有真菌毒素的检测线和质控线，所述结合垫表面具有抗真菌毒素的单克隆抗体标记胶体金探针溶液层；所述检测线至少包括2条，分别对应不同的真菌毒素；所述具有抗真菌毒素的单克隆抗体至少具有2种。

作为进一步的优选，所述质控线为将包被有兔抗鼠多克隆抗体喷涂在所述NC膜表面形成的膜层。

作为进一步的优选，所述检测线为将真菌毒素的BSA牛血清白蛋白偶联物喷涂在所述NC膜表面形成的膜层。

作为进一步的优选，所述检测线为2-6条，所述具有抗真菌毒素的单克隆抗体具有2-6种。

作为进一步的优选，所述检测线为6条，所述具有抗真菌毒素的单克隆抗体具有6种。

作为进一步的优选，所述真菌毒素选自黄曲霉毒素，赭曲霉毒素，玉米赤霉烯酮，呕吐毒素、伏马毒素和T2毒素。

作为进一步的优选，所述底板为硝酸纤维素膜。

作为进一步的优选，所述依次粘接的样品垫、结合垫、NC膜和吸收垫，在粘接处的两者之间交叠连接。

作为进一步的优选，所述试纸条还设置有外壳，所述外壳将试纸条包裹在内，并在检测线上方对应的外壳处设置有标记真菌毒素种类的检测线窗口，所述检测线窗口至少包括2个，分别与不同的检测线一一对应。

作为进一步的优选，所述样品垫上方对应的外壳处还设置有样品加入孔。

本实用新型的有益效果是：应用本实用新型的试纸条可以同时检测包括黄曲霉毒素，赭曲霉毒素，玉米赤霉烯酮，呕吐毒素、伏马毒素和T2毒素等的多种真菌毒素，从而大大提高了检测的速度和效率，相对于单项检测降低了判断误差，具有灵敏度高和特异性强的特点，避免了不同种真菌毒素之间干扰或交叉污染，能够很好地满足当前更加严格的真菌毒素限量标准的检测需求。

附图说明

图1为本实用新型实施例1试纸条的结构示意图。

图2为图1中检测线和质控线在试纸条上的平面分布示意图。

图3为本实用新型实施例2试纸条的结构示意图。

图4为图3中检测线和质控线在试纸条上的平面分布示意图。

图5为本实用新型实施例3试纸条的结构示意图。

图6为图5中外壳的俯视图。

附图中标记的说明如下：1-底板、2-NC膜、3-样品垫、4-结合垫、5-黄曲霉毒素(DON)检测线、6-赭曲霉毒素(OTA)检测线、7-玉米赤霉烯酮(FB1)检测线、8-呕吐毒素(AFB1)检测线、9-伏马毒素(ZEN)检测线、10-T2毒素(T2)检测线、11-质控线、12-吸收垫、13-外壳、14(14.1、14.2、14.3、14.4、14.5、14.6)-检测线窗口、15-质控线窗口，16-样品孔。

具体实施方式

本实用新型通过提供一种检测包含黄曲霉毒素的真菌毒素用免疫层析试纸条，可以同时检测包括黄曲霉毒素，赭曲霉毒素，玉米赤霉烯酮，呕吐毒素、伏马毒素和T2毒素等的多种真菌毒素，从而大大提高了检测的速度和效率，相对于单项检测降低了判断误差，具有灵敏度高和特异性强的特点，

为了解决上述问题，本实用新型实施例的主要思路是：

本实用新型实施例检测包含黄曲霉毒素的真菌毒素用免疫层析试纸条，包括底板以及底板上依次粘接的样品垫、结合垫、NC膜和吸收垫，所述NC膜上设置有真菌毒素的检测线和质控线，所述结合垫表面具有抗真菌毒素的单克隆抗体标记胶体金探针溶液层；所述检测线至少包括2条，分别对应不同的真菌毒素；所述具有抗真菌毒素的单克隆抗体至少具有2种。

为了让本实用新型之上述和其它目的、特征、和优点能更明显易懂，下文特举数实施例，来说明本实用新型所述之检测真菌毒素的免疫层析试纸条。

实施例1

如图1和2所示，本实用新型实施例1试纸条包括：底板1以及底板1上依次粘接的样品垫3、结合垫4、NC膜2和吸收垫12，所述NC膜2上设置有真菌毒素的检测线5、6，以及质控线11，所述结合垫4表面具有抗真菌毒素的单克隆抗体标记胶体金探针溶液层；所述检测线5、6分别为黄曲霉毒素(DON)检测线和赭曲霉毒素(OTA)检测线；所述具有抗真菌毒素的单克隆抗体具有2种。

具体地，在底板1中部粘贴NC膜2，在底板1图示的左侧粘贴样品垫3，样品垫3之下放置结合垫4，结合垫4上固化胶体金和抗真菌毒素单抗偶联物，结合垫4一端与NC膜2紧密相连，在底板1右侧粘贴吸收垫12，吸收垫12左侧与NC膜2相连。NC膜2上有3条分开的显示印记带，分别喷上黄曲霉毒素(DON)的BSA偶联物以及赭曲霉毒素(OTA)的BSA偶联物作为检测线(T线)和羊抗鼠IgG作为质控线(C线)，置于37℃干燥箱烘干15min，利用点膜仪将2种抗真菌毒素的单克隆抗体标记胶体金探针溶液均匀喷到结合垫4上，真空冷冻干燥。最后将喷好T线和C线的NC膜2、结合垫4、样品垫3和吸收垫12按图1所示组装，以用于样品检测，所述依次粘接的样品垫3、结合垫4、NC膜2和吸收垫12，在各粘接处的两者之间交叠连接，例如图1所示的样品垫3、结合垫4之间粘接处的端部重叠在一起。

实施例2

如图3和4所示，本实用新型实施例2试纸条包括：底板1以及底板1上依次粘接的样品垫3、结合垫4、NC膜2和吸收垫12，所述NC膜2上设置有真菌毒素的检测线5-10，以及质控线11，所述结合垫4表面具有抗真菌毒素的单克隆抗体标记胶体金探针溶液层；所述检测线5-10分别为黄曲霉毒素(DON)，赭曲霉毒素(OTA)，玉米赤霉烯酮(FB1)，呕吐毒素(AFB1)、伏马毒素(ZEN)和T2毒素(T2)检测线；所述具有抗真菌毒素的单克隆抗体为黄曲霉毒素(DON)，赭曲霉毒素(OTA)，玉米赤霉烯酮(FB1)，呕吐毒素(AFB1)、伏马毒素(ZEN)和T2毒素(T2)这6种。

具体地，本实用新型实施例2试纸条是在底板1上粘接NC膜2，结合垫4，样品垫3和吸收垫12而成的。在底板1中部粘贴NC膜2，底板1图示左侧粘贴样品垫3，样品垫3之下放置结合垫4，结合垫4上固化胶体金和抗OTA单抗偶联物，结合垫4一端与NC膜2紧密相连，在底板1右侧粘贴吸收垫12，吸收垫12左侧与NC膜2相连。NC膜2上有7条分开的显示印记带，分别喷上6种真菌毒素的BSA偶联物作为检测线(T线)和羊抗鼠IgG作为质控线(C线),置于37℃干燥箱烘干15min，利用点膜仪将6种抗真菌毒素的单克隆抗体标记胶体金探针溶液均匀喷到结合垫上，真空冷冻干燥。最后将喷好T线和C线的NC膜2，结合垫4，样品垫3和吸收垫12按图3所示组装，以用于样品检测。

本实用新型实施例2试纸条的制备方法包括如下步骤：

胶体金制备：采用柠檬酸三钠法，取100mL质量分数为0.01％的氯金酸溶液到300mL锥形瓶中，将锥形瓶置于恒温磁力搅拌器上，搅拌加热至沸腾，持续搅拌加入质量分数为1％的柠檬酸三钠溶液2mL，继续搅拌加热10min，当溶液颜色逐渐变至透亮红色并不再改变后，停止加热。适当速度搅拌至室温，用去离子水定容至100mL，保存备用。分别取黄曲霉毒素(DON)，赭曲霉毒素(OTA)，玉米赤霉烯酮(FB1)，呕吐毒素(AFB1)、伏马毒素(ZEN)和T2毒素(T2)的单克隆抗体，进行胶体金标记。

胶体金标记抗体过程：(1)标记前先将单克隆抗体溶液在转速15000rpm，温度4℃条件下离心30min，取上清液用于标记。(2)量取制备好的胶体金溶液50mL，用0.1M的碳酸钾调节胶体金溶液pH8.0，(3)用磁力搅拌器充分搅拌，并逐滴加入200μL单克隆抗体溶液，达终质量浓度56mg/L混匀搅拌45min，(4)取质量分数为10％BSA溶液逐滴加入至胶体金中至终质量分数为1％，继续搅拌15min，(5)4℃，8500rpm离心15min，(6)小心弃去上清液，沉淀利用胶体金储存液悬浮至4℃冰箱备用。

NC膜包被：NC膜的包被质量浓度影响试纸条的敏感度，利用抗原稀释液稀释DON-BSA，OTA-BSA，FB1-BSA，AFB1-BSA，ZEN-BSA，T2-BSA配制终质量浓度3.5g/L、4.8g/L、6.4g/L、5.0g/L、4.2g/L、5.5g/L。质控线利用抗原稀释液稀释羊抗鼠IgG配制成终质量浓度为1.5g/L。利用划膜喷金一体机以1μL/cm和2μL/cm的量分别包被到NC膜上。6种真菌毒素的BSA偶联物按照前后顺序分别自下往上包被到NC膜上作为检测线。

本实用新型实施例2试纸条的使用方法包括如下步骤：

将试纸条检测卡平放，用加样管吸取制备好的检测样品，加入至样品垫，样品在毛细管的扩散作用下沿着NC膜泳动至C线和T线，5min内观察检测结果，如果试纸条失效，C线不呈现红色条带，需重新检测，样品中没有这6种毒素，试纸条的6条C线和T线均呈现红色条带，结合垫上的胶体金-单抗在毛细管的扩散作用下泳动至T线，与T线的真菌毒素相结合，呈现红色条带，多余的胶体金-单抗泳动至C线，与羊抗鼠IgG相结合，呈现红色条带。如果样品中含有6种真菌毒素中的一种或者几种，则样品中的真菌毒素会和T线包被的同种真菌毒素竞争胶体金标记的真菌毒素抗体，检测的时候，会造成相应条带的T线结合的胶体金含量下降，结果是对应条带会比标准条带变浅，通过对比变浅的程度，可以得知对应毒素的含量。

本实用新型实施例2试纸条灵敏度测定如下：

将黄曲霉毒素标准品利用pH7.4，0.01M的PBS液配制成质量浓度为0，1.0，5.0，10.0μg/L的标准液，分别取70μL加入到试纸条检测孔中，每个质量浓度重复检测3次，5min后观察检测结果。检测结果通过试纸条呈现的红色条带颜色的深浅判断。样品中含有真菌毒素，即可与结合垫上的胶体金-DON单抗结合,并在毛细管的扩散作用下泳动至T线。形成胶体金-单抗-DON毒素复合物，因此，T线的黄曲霉毒素-BSA无法与胶体金-单抗相结合，不呈现红色条带或呈现微弱的红色条带，多余的胶体金单抗泳动至C线，与羊抗鼠IgG相结合，呈现红色条带，通过颜色的深浅即可判定肉眼可视检测限和肉眼可视的消线质量浓度。

当用PBS检测试纸条时，检测线与质控线均出现红色条带，随着加入的6种真菌毒素样品质量浓度的增加，检测线的红色条带颜色逐渐变浅，当6种真菌毒素标准品质量浓度达到1μg/L的时候，检测线的红色条带与对照组相比显著变浅，质量浓度达到10μg/L，检测线未出现红色条带，其中质控线出现红色条带，因此判断该DON毒素试纸条的肉眼可视检测限为1μg/L。

同样方法检测其他几种真菌毒素的灵敏度，发现灵敏度均可以达到国家标准。

本实用新型实施例2试纸条特异性测定如下：

将除黄曲霉毒素以外的5种真菌毒素标准品利用pH7.4，0.01M的PBS溶液配制成质量浓度为1，10，100μg/L的标准液，分别取70μL加入到试纸条检测孔中，每个质量浓度重复检测3次，5min后观察检测结果，检测结果通过试纸条呈现的红色条带颜色的深浅判断。伏马毒素、玉米赤霉烯酮等5种毒素如果发生非特异性反应，形成胶体金-单抗-毒素(伏马毒素/玉米赤霉烯酮等)复合物，因此T线的DON-BSA无法与胶体金-DON单抗相结合，不呈现红色条带或呈现微弱的红色条带，多余的胶体金-DON抗泳动至C线，与羊抗鼠IgG相结合，C线呈现红色条带。伏马毒素、玉米赤霉烯酮等如果不发生非特异性反应，结合垫上的胶体金-DON单抗在毛细管的扩散作用下泳动至T线，与T线的DON-BSA相结合，呈现红色条带，多余的胶体金-DON单抗泳动至C线，与羊抗鼠IgG相结合，呈现红色条带。

由于伏马毒素、玉米赤霉烯酮等与胶体金DON单抗不发生非特异性反应,因此结合垫上的胶体金DON单抗在毛细管的扩散作用下泳动至T线，与T线的DON-BSA相结合，试纸条均呈现2条红色条带。本实用新型所制备的试纸条与伏马毒素、玉米赤霉烯酮等均无交叉反应，特异性良好。

同样方法检测其他几种真菌毒素的特异性，发现非特异性反应基本上可以忽略。

实施例3

如图5所示，将本实用新型实施例2试纸条设置在一外壳13内，所述外壳13将试纸条包裹在内，并在对应检测线上方的外壳处设置有标记不同真菌毒素种类的检测线窗口14(或开口)，所述检测线窗口包括6个(分别为14.1、14.2、14.3、14.4、14.5、14.6)，分别与黄曲霉毒素、赭曲霉毒素、玉米赤霉烯酮、呕吐毒素、伏马毒素、和T2毒素的检测线一一对应。另外可在外壳上分别标记各检测线窗口的对应的真菌毒素名称，方便判断出现变化的是哪一个真菌。同样也可在质控线上方对应的外壳上设置质控线窗口15，方便观察。

所述样品垫上方对应的外壳处还设置有样品孔16(样品加入孔)，方便定位加样的方向。

上述本申请实施例中的技术方案，至少具有如下的技术效果或优点：

应用本实用新型的试纸条可以同时检测包括黄曲霉毒素，赭曲霉毒素，玉米赤霉烯酮，呕吐毒素、伏马毒素和T2毒素等的多种真菌毒素，从而大大提高了检测的速度和效率，相对于单项检测降低了判断误差，具有灵敏度高和特异性强的特点，避免了不同种真菌毒素之间干扰或交叉污染，能够很好地满足当前更加严格的真菌毒素限量标准的检测需求。

尽管已描述了本实用新型的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本实用新型范围的所有变更和修改。显然，本领域的技术人员可以对本实用新型进行各种改动和变型而不脱离本实用新型的精神和范围。这样，倘若本实用新型的这些修改和变型属于本实用新型权利要求及其等同技术的范围之内，则本实用新型也意图包含这些改动和变型在内。

Claims (10)

1.一种检测包含黄曲霉毒素的真菌毒素用免疫层析试纸条，其特征在于：包括底板以及底板上依次粘接的样品垫、结合垫、NC膜和吸收垫，所述NC膜上设置有真菌毒素的检测线和质控线，所述结合垫表面具有抗真菌毒素的单克隆抗体标记胶体金探针溶液层；所述检测线至少包括2条，分别对应不同的真菌毒素；所述具有抗真菌毒素的单克隆抗体至少具有2种。

2.根据权利要求1所述的检测包含黄曲霉毒素的真菌毒素用免疫层析试纸条，其特征在于：所述质控线为将包被有兔抗鼠多克隆抗体喷涂在所述NC膜表面形成的膜层。

3.根据权利要求1所述的检测包含黄曲霉毒素的真菌毒素用免疫层析试纸条，其特征在于：所述检测线为将真菌毒素的BSA牛血清白蛋白偶联物喷涂在所述NC膜表面形成的膜层。

4.根据权利要求1所述的检测包含黄曲霉毒素的真菌毒素用免疫层析试纸条，其特征在于：所述检测线为2-6条，所述具有抗真菌毒素的单克隆抗体具有2-6种。

5.根据权利要求4所述的检测包含黄曲霉毒素的真菌毒素用免疫层析试纸条，其特征在于：所述检测线为6条，所述具有抗真菌毒素的单克隆抗体具有6种。

6.根据权利要求1或4所述的检测包含黄曲霉毒素的真菌毒素用免疫层析试纸条，其特征在于：所述真菌毒素选自黄曲霉毒素，赭曲霉毒素，玉米赤霉烯酮，呕吐毒素、伏马毒素和T2毒素。

7.根据权利要求1所述的检测包含黄曲霉毒素的真菌毒素用免疫层析试纸条，其特征在于：所述底板为硝酸纤维素膜。

8.根据权利要求1所述的检测包含黄曲霉毒素的真菌毒素用免疫层析试纸条，其特征在于：所述依次粘接的样品垫、结合垫、NC膜和吸收垫，在粘接处的两者之间交叠连接。

9.根据权利要求1所述的检测包含黄曲霉毒素的真菌毒素用免疫层析试纸条，其特征在于：所述试纸条还设置有外壳，所述外壳将试纸条包裹在内，并在检测线上方对应的外壳处设置有标记真菌毒素种类的检测线窗口，所述检测线窗口至少包括2个，分别与不同的检测线一一对应。

10.根据权利要求1所述的检测包含黄曲霉毒素的真菌毒素用免疫层析试纸条，其特征在于：所述样品垫上方对应的外壳处还设置有样品加入孔。