CN114660293A - 一种检测血浆或尿液中霉菌毒素暴露标志物的sers免疫分析试剂盒 - Google Patents

一种检测血浆或尿液中霉菌毒素暴露标志物的sers免疫分析试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种检测血浆或尿液中霉菌毒素暴露标志物的SERS免疫分析试剂盒，该试剂盒含有检测试纸条和检测试剂，所述检测试纸条有3条检测线，每条检测线上包被2种不同抗原，所述检测试剂为与六种霉菌毒素标志物的单抗结合形成的六种特异性SERS纳米探针，基于竞争免疫原理通过SERS侧流免疫传感分析方法，实现在一条检测线上同时与两种不同拉曼标记的SERS纳米探针发生反应，通过检测线上捕获的纳米探针产生的SERS信号强度对样品中的霉菌毒素标志物含量分析。本发明试剂盒测定血浆和尿液提取溶液中各霉菌毒素标志物的检测限在0.0022‑0.21ng/mL之间，准确度和精密度均高，可用于养殖场或基层实验室中血浆和尿液中霉菌毒素标志物的快速检测。

Description

一种检测血浆或尿液中霉菌毒素暴露标志物的SERS免疫分析 试剂盒
技术领域
本发明涉及拉曼光谱检测与竞争性免疫检测技术领域，尤其是涉及一种检测血浆或尿液中霉菌毒素暴露标志物的试剂盒。
背景技术
霉菌毒素是畜禽生产尤其是生猪养殖中常见危害因子，主要包括黄曲霉毒素、玉米赤霉烯酮、呕吐毒素、伏马毒素、赭曲霉毒素和T-2毒素等。霉菌毒素可对畜禽产生明显的中毒症状，如厌食、呕吐、黄疸、腹泻、繁殖障碍甚至急性死亡，因此，养殖生产中对霉菌毒素污染进行防控，对保障畜禽健康养殖具有重要意义。
目前养殖过程中霉菌毒素的防控主要通过监测其在饲料中的含量，同时根据实际情况添加脱毒剂来缓解其毒性效应。由于霉菌毒素在饲料和饲料原料中分布严重不均匀，极易产生取样和分析误差，同时由于隐蔽型霉菌毒素的存在，常规分析的结果往往低估样品中霉菌毒素的实际含量。其次，饲料和饲料原料在加工、运输、储藏以及在养殖场饲喂过程中都可能滋生霉菌污染产生霉菌毒素。因此，分析饲料中霉菌毒素的含量不能准确反映畜禽体内霉菌毒素的实际暴露水平。研究表明，畜禽体内主要霉菌毒素代谢标志物浓度与摄入的霉菌毒素呈高度相关，并且主要隐蔽型霉菌毒素在体内可转变成游离形态，因而分析血浆、尿和粪等生物样品中霉菌毒素标志物含量，可更直接、准确地反映猪体霉菌毒素暴露情况。
霉菌毒素脱毒剂有效性通常采用体外试验进行评价，不能真实反映其在体内的作用效果，亟需建立体内和体外相结合的评价手段，规范霉菌毒素脱毒剂产品的应用。研究建立血浆和尿液等生物样品中霉菌毒素暴露标志物的分析方法，可为畜禽体内霉菌毒素暴露评估和霉菌毒素脱毒剂的有效性评价提供技术手段。
畜禽体内霉菌毒素标志物种类多、含量低，常规分析方法难以满足其检测要求，目前主要采用液相色谱质谱分析法进行测定。该方法具有较高的灵敏度、准确度和精密度，但需要昂贵的仪器设备、专业的技术人员以及复杂的样品前处理，因而不适于基层实验室和现场环境霉菌毒素标志物的快速检测。有文献分别报道采用酶免疫分析法测定生物样品中黄曲霉毒素、呕吐毒素和伏马毒素等的暴露标志物，该法具有检测速度快、检测成本低等优点，但检测灵敏度不高且缺乏多组分分析能力，不能满足低水平霉菌毒素联合暴露的检测需求。因此，亟需研究开发灵敏度更高、多组分检测能力更强的快速分析方法，为养殖现场霉菌毒素污染监测提供更为经济、高效的技术手段。
基于表面增强拉曼散射(SERS)的免疫传感分析是一种结合SERS标记和抗原抗体免疫反应的新型快速检测技术，具有检测速度快、灵敏度高、多组分检测能力强等优点，可满足生物样品中霉菌毒素代谢标志物的检测需求。SERS标记具有如下几个优势：首先，拉曼光谱具有高度的分子特征性，谱峰窄，仅为荧光光谱的1/10-1/100，因而能减小不同分子间的谱峰重叠，适合于多元标记免疫分析；其次，在SERS多组分检测中，单波长激发光即可激发不同的拉曼活性分子，因而对光源配置要求较低；第三，SERS信号不易发生自淬灭现象，可通过增加拉曼活性分子数量来提高信号强度，从而提高免疫分析的灵敏度。基于SERS的侧流免疫传感分析近年来引起了广泛的关注与研究，但目前大部分研究均为单组分分析，未能充分发挥SERS的多元标记分析和侧流免疫分析的多检测线模式的优势，不能完全满足常见多种霉菌毒素标志物同步分析的检测需求。
发明内容
本发明的目的在于提供一种检测血浆或尿液中霉菌毒素暴露标志物的SERS免疫分析试剂盒，用于现场快速、准确、灵敏地检测尿液或血浆中的黄曲霉毒素M1(AFM1)、赭曲霉毒素(OTA)、玉米赤霉烯酮(ZEA)、T-2毒素(T-2)、伏马毒素(FB1)和呕吐毒素(DON)。
本专利采用的免疫传感分析方法为基于表面增强拉曼散射(SERS)的侧流免疫传感分析方法。方法采用5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)和对巯基苯甲酸(MBA)分别作为拉曼标记物标记Au@Ag纳米粒子，然后分别与上述六种霉菌毒素标志物的单克隆抗体结合形成六种特异性SERS纳米探针。该方法的载体为侧流免疫层析试纸条，包括样品垫、硝酸纤维素膜和吸收垫。在硝酸纤维素膜上设置3条检测线，每条检测线上混合包被2种不同抗原，在一条检测线上可同时与两种不同SERS纳米探针发生反应，因此在一个试纸条上可同时检测六种不同霉菌毒素暴露标志物。
本发明首先提供一种检测血浆或尿液中霉菌毒素暴露标志物的试剂盒，含有检测试纸条和检测试剂；所述免疫试纸条为侧流免疫层析检测试纸条，含有3条检测线，每条检测线上混合包被2种不同抗原；所述抗原分别为黄曲霉毒素M1、赭曲霉毒素、玉米赤霉烯酮、T-2毒素、伏马毒素B1和呕吐毒素；所述检测试剂为SERS纳米探针，其为标记不同拉曼分子标记的Au@Ag核-壳纳米颗粒复合物分别与黄曲霉毒素M1单抗、赭曲霉毒素单抗、玉米赤霉烯酮单抗、T-2毒素单抗、伏马毒素B1单抗和呕吐毒素单抗偶联形成的SERS纳米探针。
本发明所述检测试纸条上设置有质控线，所述质控线喷涂有二抗-纳米金复合物。
优选地，所述检测试纸条上3条检测线中，每条检测线上混合包被2种不同抗原，组合方式为：
黄曲霉毒素M1抗原和赭曲霉毒素抗原；
玉米赤霉烯酮抗原和T-2毒素抗原；
伏马毒素B1抗原和呕吐毒素抗原。
优选地，黄曲霉毒素和赭曲霉毒素抗原包被在远离样品垫的检测线，玉米赤霉烯酮和T-2毒素抗原包被在中间的检测线位置，伏马毒素和呕吐毒素包被在靠近样品垫的检测线位置；即若样品垫在检测试纸条的左侧，则自左至右的3条检测线分别是伏马毒素和呕吐毒素包被的检测线、玉米赤霉烯酮和T-2毒素抗原包被的检测线、黄曲霉毒素和赭曲霉毒素抗原包被的检测线。
进一步优选地，所述检测试剂中，
与黄曲霉毒素M1单抗、赭曲霉毒素单抗偶联的SERS纳米探针的拉曼标记物不同；
与玉米赤霉烯酮单抗、T-2毒素单抗偶联的SERS纳米探针的拉曼标记物不同；
与伏马毒素B1单抗和呕吐毒素单抗偶联的SERS纳米探针的拉曼标记物不同。
所述拉曼标记物为5,5-二硫代双-2-硝基苯甲酸(DTNB)、对巯基苯胺(PATP)、对巯基苯甲酸(MBA)或2,2'-联吡啶(Bipy)。
更优选地，所述检测试剂中，与黄曲霉毒素M1单抗、赭曲霉毒素(OTA)单抗偶联的SERS纳米探针的拉曼标记物分别为DTNB、MBA；
与玉米赤霉烯酮单抗、T-2毒素单抗偶联的SERS纳米探针的拉曼标记物分别为DTNB、MBA；
与伏马毒素B1单抗和呕吐毒素单抗偶联的SERS纳米探针的拉曼标记物分别为DTNB、MBA。
本发明经过试验筛选发现，AFM1单抗和ZEA单抗与DTNB-Au@Ag NPs偶联制备的SERS纳米探针产生的灵敏度比与MBA-Au@Ag NPs复合物偶联制备的SERS纳米探针产生的灵敏度高。综合考虑检测线上包被原设置情况，最终确定将AFM1、ZEA、FB1单抗与DTNB-Au@AgNPs偶联制备SERS纳米探针，将OTA、T-2、DON单抗与MBA-Au@Ag NPs偶联制备SERS纳米探针，使得本发明试剂盒的检测灵敏度为最佳。
本发明提供的上述试剂盒中，所述Au@Ag核-壳纳米颗粒复合物的粒径为48-56nm，优选粒径为52nm。
本发明提供的上述试剂盒中，所述检测试剂中，六种霉菌毒素的SERS纳米探针的浓度均为OD520nm＝1.0，分别以体积比1:2:1:3:1:2混合，总体积为200μL，置于酶标板孔中冻干备用。
所述Au@Ag核-壳纳米颗粒复合物的制备方法为：在室温下将60μL 200mM的抗坏血酸和15μL 200mM的AgNO3加入到10mL粒径约为30nm的Au NPs的容器中，搅拌条件下继续反应30min；继续加入60μL 200mM的抗坏血酸和15μL 200mM的AgNO3反应30min；依次通过4次循环制备获得粒径为48-56nm Au@Ag核-壳纳米颗粒复合物，并且将所得颗粒复合物分别离心20min并再复溶于10mL超纯水中。
所述SERS纳米探针的制备步骤如下：将10mLAu@Ag核-壳纳米颗粒复合物与500μL0.2M pH 8.5硼酸缓冲液混合，加入300μL 1mM DTNB或1mM MBA；将上述溶液分别在室温下轻微摇晃反应30min后，离心，去除上清中多余的拉曼分子，后使用10mL 2.0mM pH 8.5硼酸缓冲液复溶；分别将六种霉菌毒素抗体分别加入到DTNB-Au@Ag核-壳纳米颗粒复合物或MBA-Au@Ag核-壳纳米颗粒复合物溶液中，并在缓慢搅拌下反应1h；分别加入200μL溶于2.0mM、pH 8.5硼酸缓冲液1％PVP进行处理，掩蔽其纳米粒子表面上的裸露位点以终止反应；将此悬浮液以3,400rpm离心10min后去除上清液，复溶后离心，重复进行两次，将沉淀物重悬于含1％BSA的0.01M，pH 7.4磷酸盐缓冲液中。
本发明试剂盒依据的SERS侧流免疫传感分析原理如图1所示。首先将三组混合抗原分别喷涂在硝酸纤维素膜不同位置上作为检测线，羊抗鼠二抗喷涂在硝酸纤维素膜上作为质控线；微孔中为可识别六种霉菌毒素标志物的SERS纳米探针。如果样品中不含有任何一种霉菌毒素标志物，则特定的SERS纳米探针将与硝酸纤维素膜上的包被抗原结合，三条检测线上均出现可见颜色，并且在激光激发下产生强的SERS信号(DTNB标记的纳米探针特征性波段为1332cm-1，MBA标记的纳米探针特征性波段为1589cm-1)。但是，当样品中含有某种霉菌毒素标志物，样品中游离的待测物将与检测线上的包被抗原竞争特异性SERS纳米探针上的识别位点，硝酸纤维素膜上相应检测线的包被抗原会与较少的特异性SERS纳米探针发生反应，因而检测线上特定波段的SERS信号会相应降低。如果样品中含有某种含量较高的霉菌毒素标志物，则会完全阻断特异性SERS纳米探针与该包被抗原发生反应，因此，检测线上不会出现相应波段的SERS信号。同时，在硝酸纤维素膜上设置有质控线，当操作正常时，质控线上的二抗可与SERS纳米探针发生相互作用，因而不论样品为阴性或阳性，质控线可产生强的SERS信号。定量分析时，测定未知样品在检测线处特征性波段的SERS信号强度，代入相应的标准曲线，即可计算出样品中某种霉菌毒素标志物的含量。
本发明提供了一种检测血浆或尿液中霉菌毒素暴露标志物的SERS侧流免疫传感分析方法，所述霉菌毒素为黄曲霉毒素M1、赭曲霉毒素、玉米赤霉烯酮、T-2毒素、伏马毒素B1和呕吐毒素；其特征在于，包括以下步骤：
(1)待检样品前处理：
a)血浆样本前处理：取血浆样本0.3mL，加入乙腈0.7mL，充分涡动混匀，8000rpm离心10min，取上清0.5mL，与2mL含0.5％Triton-100和0.5％BSA的PBS溶液充分混匀，取200μL用于SERS侧流免疫传感分析；或
b)尿液样本前处理：将尿液样品在6,000rpm离心5分钟，取0.5mL上清液与0.5mL含1％Triton和1％BSA的PBS溶液混匀，取200μL用于SERS侧流免疫传感分析；
(2)利用本发明所述的试剂盒进行待测样品检测：取200μL样品溶液加至检测试剂中混合均匀，然后在室温下孵育3min后，将免疫试纸条浸入已孵育后的试剂中反应10min，取出试纸条干燥，用拉曼光谱仪对检测线处进行SERS信号进行采集；试验中光谱仪的参数设置如下：激发光源采用He-Ne激光器，激发波长为785nm，激光强度为20％，信号采集时间为5s；分别记录DTNB标记纳米探针1332cm-1和MBA标记纳米探针1589cm-1波段的信号强度。
本发明建立的检测血浆或尿液中霉菌毒素暴露标志物的试剂盒采用的为竞争性免疫分析原理，最终可通过检测线上捕获的SERS纳米探针产生的SERS信号强度，对样品中的霉菌毒素暴露标志物的含量进行分析。经验证，该方法测定血浆和尿液提取溶液中各霉菌毒素暴露标志物的检测限在0.0022-0.21ng/mL之间，远低于大多数报道的仪器分析和免疫分析，同时方法的准确度和精密度满足定量或半定量分析的要求。本发明的方法可用于现场环境霉菌毒素的暴露评估，检测动物血浆或尿液中霉菌毒素的含量准确度高、灵敏度高，省时省力，可用于养殖场或基层实验室中血浆和尿液中霉菌毒素暴露标志物的检测，因而具有广阔的应用价值和应用前景。
附图说明
图1为SERS侧流免疫传感分析霉菌毒素标志物的原理图。
图2为Au@Ag纳米粒子粒径对DTNB特征信号(左图)和MBA特征信号(右图)强度的影响。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员熟知的常规手段和常规检测方法。若未特别说明，实施例中所有试剂耗材均为市售可得。
以下实施例均采用重复实验5次的方法，结果显示重复实验各个批次平行实验结果的数据间差异不显著，最终取平均值列于实施例中。
六种霉菌毒素单克隆抗体均为本实验室通过常规方法经过小鼠免疫、细胞融合、杂交瘤筛选、腹水制备和抗体纯化等步骤获得。实施例中述及的六种霉菌毒素抗原(AFM1、ZEA、FB1、OTA、T-2、DON)抗原，是参照现有技术公开的方法制备得到的。
AFM1抗原合成方法参考文献：Chu,F.S,Ueno,I.,1977.Production of antibodyagainst aflatoxin B1.Appl.Environ.Microbiol.33,1125–1128.
ZEA抗原合成方法参考文献：Thouvenot,D.,Morfin,R.F.,1983.Radioimmunoassay for zearalenone and zearalanol in human serum:production,properties,and use of porcine antibodies.Appl.Environ.Microbiol.45,16–23.
FB1抗原合成方法参考文献：Yu,F.Y.,Chu,F.S.,1996.Production andcharacterization of antibodies against fumonisin B1,J.Food Prot.59,992–997.
DON抗原合成方法参考文献：Maragos,C.M.,Mccormick,S.P.,2000.MonoclonalAntibodies for the Mycotoxins Deoxynivalenol and 3-Acetyl-Deoxynivalenol.FoodAgr.Immunol.12,181–192.
T-2抗原合成方法参考文献：Chu,F.S.,Grossman,S.,Wei,R.,Mirocha,C.J.,1979.Production of Antibody Against T-2Toxin.Appl.Environ.Microbiol.37,104–108.
OTA抗原合成方法参考文献：Liu,B.H.,Tsao,Z.J.,Wang,J.J.,Yu,F.Y.,2008.Development of a monoclonal antibody against ochratoxin A and itsapplication in enzyme-linked immunosorbent assay and gold nanoparticleimmunochromatographic strip.Anal.Chem.80,7029–7035.
实施例1 Au@Ag纳米颗粒的制备、鉴定和粒径选择
Au@Ag NPs的制备过程参照Blanco-Covián等的方法：首先，在室温下将60μL的抗坏血酸(Ascorbic acid，AA)(200mM)和15μL的AgNO3(200mM)加入到10mL粒径约为30nm的AuNPs溶液中，在搅拌条件下反应30min。然后继续加入60μL的AA(200mM)和15μL的AgNO3(200mM)反应30min(第二次循环)。随着加入次数的增多，其Au@Ag NPs的银壳厚度不断增加。根据不同循环次数，分别制备循环次数为1、2、4、的Au@Ag NPs，并且将所得颗粒分别离心20min，将颗粒再次复溶于10mL超纯水中。最后，将制得的48-56nm粒径纳米粒子进行鉴定可发现包含明显的核-壳结构，表明Au@Ag NPs合成成功。
Au@Ag纳米颗粒的粒径对SERS信号强度可以产生显著影响，由图2可见，纳米颗粒粒径由32nm提高到40nm时，DTNB和MBA的特征信号强度均上升，继续提高至52nm，相应SERS信号继续提高。但实验过程中发现，当纳米颗粒粒径大于52nm时，在制备SERS纳米探针的过程中，纳米探针容易出现凝聚现象，或者制备的SERS纳米探针在长期保存过程中易出现凝聚现象，52nm左右粒径的纳米颗粒可产生足够强的拉曼信号，同时在制备SERS纳米探针和长期保存过程中均可以保持稳定，因此，最终选择52nm Au@Ag纳米颗粒制备SERS纳米探针。
实施例2 SERS纳米探针的制备和优化
SERS纳米探针的制备具体步骤如下：首先，将制备的10mLAu@Ag NPs与500μL硼酸缓冲液(0.2M，pH 8.5)混合，加入300μL 1mM 5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)或1mM对巯基苯甲酸(MBA)。将上述溶液分别在室温下轻微摇晃反应30min后，离心，去除上清中多余的拉曼分子，后使用10mL硼酸缓冲液(2.0mM，pH 8.5)复溶。然后，分别将六种霉菌毒素抗体分别加入到DTNB-Au@Ag NPs或MBA-Au@Ag NPs溶液中，并在缓慢搅拌下反应1h。最后，分别加入200μL溶于硼酸缓冲液(2.0mM，pH 8.5)1％PVP进行处理，掩蔽其纳米粒子表面上的裸露位点以终止反应。将此悬浮液以3,400rpm离心10min后去除上清液，复溶后离心，重复进行两次，将沉淀物重悬于含1％BSA的磷酸盐缓冲液(0.01M，pH 7.4)中。最后，将六种霉菌毒素的SERS纳米探针按照最优比例混合，转移至酶标板孔中冷冻干燥，备用。
在SERS纳米探针的制备过程中，分别将六种霉菌毒素单克隆抗体与DTNB-Au@AgNPs或MBA-Au@Ag NPs复合物进行偶联，然后采用制备的SERS纳米探针进行免疫分析，测定灵敏度，结果(表1)表明，AFM1单抗和ZEA单抗与DTNB-Au@Ag NPs偶联制备的SERS纳米探针产生的灵敏度比与MBA-Au@Ag NPs复合物偶联制备的SERS纳米探针产生的灵敏度高，其它抗体与两种复合物制备的SERS纳米探针灵敏度相当。综合考虑检测线上包被原设置情况，最终确定将AFM1、ZEA、FB1单抗与DTNB-Au@Ag NPs偶联制备SERS纳米探针，将OTA、T-2、DON单抗与MBA-Au@Ag NPs偶联制备SERS纳米探针。
表1各单抗与DTNB、MBA标记纳米探针组合产生的检测限对比结果
DTNB标记纳米探针 MBA标记纳米探针
AFM<sub>1</sub>单抗 0.0021ng/mL 0.0032ng/mL
ZEA单抗 0.0091ng/mL 0.013ng/mL
FB<sub>1</sub>单抗 0.183ng/mL 0.188ng/mL
OTA单抗 0.0171ng/mL 0.0174ng/mL
T-2单抗 0.0142ng/mL 0.0144ng/mL
DON单抗 0.093ng/mL 0.091ng/mL
实施例3霉菌毒素抗原组合的优化和位置设置
本实施例对比了六种霉菌毒素抗原(AFB1-BSA、OTA-BSA、T2-OVA、ZEA-BSA、DON-BSA和FB1-OVA)分别固定在硝酸纤维素3条检测线位置的灵敏度，结果(表2)表明，除伏马毒素抗原外，其它霉菌毒素抗原固定在远离样品垫位置的检测线(检测线1)获得的灵敏度相比靠近样品垫位置的检测线(检测线3)获得灵敏度更高。同时考虑到血浆和尿液中黄曲霉毒素和赭曲霉毒素一般最低，玉米赤霉烯酮和T-2毒素稍高，伏马毒素和呕吐毒素一般浓度相对较高，因此本发明将黄曲霉毒素和赭曲霉毒素抗原固定在远离样品垫的检测线(检测线1)，玉米赤霉烯酮和T-2毒素抗原固定在中间的检测线(检测线2)位置，伏马毒素和呕吐毒素固定在靠近样品垫的检测线(检测线3)位置。
表2各霉菌毒素抗原包被不同检测线位置产生的检测限对比结果
检测线1 检测线2 检测线3
AFB<sub>1</sub>-BSA 0.0022ng/mL 0.0026ng/mL 0.0031ng/mL
OTA-BSA 0.0173ng/mL 0.0181ng/mL 0.0189ng/mL
T2-OVA 0.0134ng/mL 0.0143ng/mL 0.0155ng/mL
ZEA-BSA 0.0083ng/mL 0.0090ng/mL 0.0098ng/mL
DON-BSA 0.078ng/mL 0.085ng/mL 0.094ng/mL
FB<sub>1</sub>-OVA 0.181ng/mL 0.184ng/mL 0.183ng/mL
实施例4免疫侧流试纸条的制备
(1)硝酸纤维素膜的准备
将黄曲霉毒素M1(AFM1)和赭曲霉毒素(OTA)的混合抗原、玉米赤霉烯酮(ZEA)和T-2毒素(T-2)的混合抗原、伏马毒素(FB1)和呕吐毒素(DON)的混合抗原、羊抗鼠二抗(0.5mg/mL)分别溶于碳酸缓冲液(0.05M，pH 9.5)，然后使用划膜仪以1μL/cm的速度及间距3.0mm在硝酸纤维素膜上分别喷涂3条检测线和1条质控线。最后，将硝酸纤维素膜在37℃下干燥6h，并在室温下进行干燥密封以备使用。
(2)试纸条的组装
将上述涂有混合包被抗原和羊抗鼠二抗的硝酸纤维素膜固定在底板的中央，将样品垫固定于一端，与中央硝酸纤维素膜重叠2～4mm，后将吸收垫固定于另一端，与硝酸纤维素膜重叠2～4mm。最后，将组装好的的底板切割成宽度为4mm的试纸条，密封备用。
实施例5检测尿液或血浆中六种霉菌毒素暴露标志物的SERS侧流免疫传感分析方法的建立
(1)血浆样本前处理：取血浆样本0.3mL，加入乙腈0.7mL，充分涡动混匀，8000rpm离心10min，取上清0.5mL，与2mL含0.5％Triton-100和0.5％BSA的PBS溶液充分混匀，取200μL用于SERS侧流免疫传感分析。
(2)尿液样本前处理：将尿液样品在6,000rpm离心5分钟，取0.5mL上清液与0.5mL含1％Triton和1％BSA的PBS溶液混匀，取200μL用于SERS侧流免疫传感分析。
(3)测定过程：取200μL样品溶液加至微孔板中，与孔中冻干的纳米探针混合均匀，然后在室温下孵育3min后，将试纸条浸入到样品孔反应10min，溶液向吸收垫方向移动并在检测线及质控线处发生特异性结合。待反应结束后，取出试纸条干燥，用拉曼光谱仪对检测线处进行SERS信号进行采集。试验中光谱仪的参数设置如下：激发光源采用He-Ne激光器，激发波长为785nm，激光强度为20％，信号采集时间为5s。分别记录1332cm-1(DTNB标记纳米探针)和1589cm-1(MBA标记纳米探针)波段的信号强度。
(4)标准曲线的制备
取阴性血浆和尿液样本，按上述样品前处理方式进行处理。分别往阴性样品提取液中加入适量霉菌毒素标准溶液，制成系列混合标准工作溶液。其中，AFM1的浓度分别为0、0.0027、0.0082、0.025、0.074、0.22、0.67和2.0ng/mL，OTA的浓度分别为0、0.027、0.082、0.25、0.74、2.22、6.67和20ng/mL，ZEA的浓度分别为0、0.017、0.049、0.15、0.44、1.33、4.0和12ng/mL，T-2的浓度分别为0、0.017、0.049、0.15、0.44、1.33、4.0和12ng/mL，FB1的浓度分别为0、0.27、0.82、2.5、7.4、22.2、66.7和200ng/mL，DON的浓度分别为0、0.14、0.41、1.23、3.70、11.1、33.3和100ng/mL。每个混合标准溶液做3个平行，按上述检测步骤进行测定。计算各浓度下产生相应拉曼信号强度与阴性样品产生的拉曼信号强度的比值(B/B0)作为纵坐标，以标准溶液浓度的自然对数值(lnC)作为横坐标，绘制标准曲线。以相比阴性样品的信号强度下降10％的浓度作为检测限。经测定，各霉菌毒素标准曲线公式和检测限如表3和表4所示。
表3血浆样本中霉菌毒素标准曲线公式和检测限
标准曲线公式 R<sup>2</sup> 检测限；ng/mL
AFM1 y＝-0.114ln(x)+0.2033 0.9925 0.0022
OTA y＝-0.107ln(x)+0.4638 0.9912 0.0169
ZEA y＝-0.1091n(x)+0.3885 0.9916 0.0092
T-2 y＝-0.117ln(x)+0.4033 0.9947 0.014
FB1 y＝-0.114n(x)+0.7039 0.9938 0.18
DON y＝-0.132ln(x)+0.5821 0.9908 0.090
表4尿液样本中霉菌毒素标准曲线公式和检测限
标准曲线公式 R<sup>2</sup> 检测限；ng/mL
AFM<sub>1</sub> y＝-0.113ln(x)+0.2073 0.9925 0.0022
OTA y＝-0.108ln(x)+0.4762 0.9912 0.0198
ZEA y＝-0.11ln(x)+0.3969 0.9916 0.0103
T-2 y＝-0.118ln(x)+0.3974 0.9947 0.014
FB<sub>1</sub> y＝-0.113ln(x)+0.7249 0.9938 0.21
DON y＝-0.131ln(x)+0.592 0.9908 0.095
(5)方法准确度和精密度的测定(添加回收试验)
将不同浓度的霉菌毒素标准溶液添加到空白血浆和尿液样品中，进行加标回收测定，每个浓度做4个平行，评价该免疫传感分析方法的准确度和精密度。测定时采用拉曼光谱仪对检测线的拉曼信号强度进行采集，代入相应标准曲线计算样品中各霉菌毒素标志物浓度并计算回收率和变异系数。结果如表5所示，在各添加浓度，霉菌毒素标志物的回收率在82.4％～118.6％之间，变异系数小于20％，表明该SERS侧流免疫传感分析的准确度和精密度基本满足定量和半定量分析的要求。
表5SERS侧流免疫传感分析霉菌毒素暴露标志物的添加回收率和变异系数(n＝4)
Figure BDA0002852011960000131
Figure BDA0002852011960000141
实施例6实际样本检测
从不同猪场采集猪血浆和尿液样本各3份，与阴性样品一起采用上述方法进行前处理和测定后，获得各检测线相应的拉曼信号强度，除以阴性样品相应信号强度获得信号相对比值(B/B0)，代入标准曲线，计算获得提取溶液中的浓度，乘以相应稀释倍数，即为样品中相应霉菌毒素暴露代谢标志物的浓度。实际样本的测定结果如表6所示。
表6 SERS免疫传感分析实际样本的结果(ng/mL)
样品类型和编号 AFM<sub>1</sub> OTA ZEA T-2 FB1 DON
血浆1 -- -- 2.96 -- -- 3.18
血浆2 -- 0.71 3.33 -- -- 2.74
血浆3 0.63 0.92 7.83 1.24 3.21 12.9
尿液1 -- -- 0.74 -- -- 1.25
尿液2 -- 0.08 0.64 -- -- 0.46
尿液3 0.11 0.17 1.11 0.13 0.52 5.2
虽然，上文已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做出一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种检测血浆或尿液中霉菌毒素暴露标志物的SERS免疫分析试剂盒，其特征在于，含有检测试纸条和检测试剂；所述免疫试纸条为侧流免疫层析检测试纸条，含有3条检测线，每条检测线上混合包被2种不同抗原；所述抗原分别为黄曲霉毒素M1、赭曲霉毒素、玉米赤霉烯酮、T-2毒素、伏马毒素B1和呕吐毒素；所述检测试剂为SERS纳米探针，其为标记不同拉曼分子标记的Au@Ag核-壳纳米颗粒复合物分别与黄曲霉毒素M1单抗、赭曲霉毒素单抗、玉米赤霉烯酮单抗、T-2毒素单抗、伏马毒素B1单抗和呕吐毒素单抗偶联形成的SERS纳米探针。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述检测试纸条上设置有质控线，所述质控线喷涂有羊抗鼠二抗。
3.如权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述检测试纸条上分布的3条检测线中，每条检测线上混合包被2种不同抗原，组合方式为：
黄曲霉毒素M1抗原和赭曲霉毒素抗原；
玉米赤霉烯酮抗原和T-2毒素抗原；
伏马毒素B1抗原和呕吐毒素抗原；
优选地，黄曲霉毒素和赭曲霉毒素抗原包被在远离样品垫的检测线，玉米赤霉烯酮和T-2毒素抗原包被在中间的检测线位置，伏马毒素和呕吐毒素包被在靠近样品垫的检测线位置。
4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述检测试剂中，
与黄曲霉毒素M1单抗、赭曲霉毒素单抗偶联的SERS纳米探针的拉曼标记物不同；
与玉米赤霉烯酮单抗、T-2毒素单抗偶联的SERS纳米探针的拉曼标记物不同；
与伏马毒素B1单抗和呕吐毒素单抗偶联的SERS纳米探针的拉曼标记物不同。
5.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述检测试剂中，与黄曲霉毒素M1单抗、赭曲霉毒素单抗偶联的SERS纳米探针的拉曼标记物分别为DTNB、MBA；
与玉米赤霉烯酮单抗、T-2毒素单抗偶联的SERS纳米探针的拉曼标记物分别为DTNB、MBA；
与伏马毒素B1单抗和呕吐毒素单抗偶联的SERS纳米探针的拉曼标记物分别为DTNB、MBA。
6.如权利要求1-5任一所述的试剂盒，其特征在于，所述Au@Ag核-壳纳米颗粒复合物的粒径为40-80nm，优选粒径为52nm。
7.如权利要求1-6任一所述的试剂盒，其特征在于，所述检测试剂中，六种霉菌毒素的SERS纳米探针的OD520均为1.0，分别以体积比1:2:1:3:1:2混合，总体积为200μL，置于酶标板孔中冻干备用。
8.如权利要求1-7任一所述的试剂盒，其特征在于，所述Au@Ag核-壳纳米颗粒复合物的制备方法为：在室温下将60μL 200mM的抗坏血酸和15μL 200mM的AgNO3加入到10mL粒径约为30nm的Au NPs的容器中，搅拌条件下继续反应30min；继续加入60μL 200mM的抗坏血酸和15μL200mM的AgNO3反应30min；依次通过4次循环制备获得粒径为48-56nm Au@Ag核-壳纳米颗粒复合物，并且将所得颗粒复合物分别离心20min并再复溶于10mL超纯水中。
9.如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述SERS纳米探针的制备步骤如下：将10mLAu@Ag核-壳纳米颗粒复合物与500μL 0.2M pH 8.5硼酸缓冲液混合，加入300μL 1mMDTNB或1mM MBA；将上述溶液分别在室温下轻微摇晃反应30min后，离心，去除上清中多余的拉曼分子，后使用10mL 2.0mM pH 8.5硼酸缓冲液复溶；分别将六种霉菌毒素抗体分别加入到DTNB-Au@Ag核-壳纳米颗粒复合物或MBA-Au@Ag核-壳纳米颗粒复合物溶液中，并在缓慢搅拌下反应1h；分别加入200μL溶于2.0mM、pH 8.5硼酸缓冲液1％PVP进行处理，掩蔽其纳米粒子表面上的裸露位点以终止反应；将此悬浮液以3,400rpm离心10min后去除上清液，复溶后离心，重复进行两次，将沉淀物重悬于含1％BSA的0.01M，pH 7.4磷酸盐缓冲液中，调节各SERS纳米探针的OD520值为1.0，分别以体积比1:2:1:3:1:2混合，总体积为200μL，置于酶标板孔中冻干备用。
10.一种检测血浆或尿液中霉菌毒素暴露标志物的SERS侧流免疫传感分析方法，所述霉菌毒素为黄曲霉毒素M1、赭曲霉毒素、玉米赤霉烯酮、T-2毒素、伏马毒素B1和呕吐毒素；其特征在于，包括以下步骤：
(1)待检样品前处理：
a)血浆样本前处理：取血浆样本0.3mL，加入乙腈0.7mL，充分涡动混匀，8000rpm离心10min，取上清0.5mL，与2mL含0.5％Triton-100和0.5％BSA的PBS溶液充分混匀，取200μL用于SERS侧流免疫传感分析；或
b)尿液样本前处理：将尿液样品在6,000rpm离心5分钟，取0.5mL上清液与0.5mL含1％Triton和1％BSA的PBS溶液混匀，取200μL用于SERS侧流免疫传感分析；
(2)利用权利要求1-9任一所述的试剂盒进行待测样品检测：取200μL样品溶液加至检测试剂中混合均匀，然后在室温下孵育3min后，将免疫试纸条浸入已孵育后的试剂中反应10min，取出试纸条干燥，用拉曼光谱仪对检测线处进行SERS信号进行采集；试验中光谱仪的参数设置如下：激发光源采用He-Ne激光器，激发波长为785nm，激光强度为20％，信号采集时间为5s；分别记录DTNB标记纳米探针1332cm-1和MBA标记纳米探针1589cm-1波段的信号强度。
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