CN102183646A - 一种检测梅毒血清抗体的rTpN15-17-47-ELISA的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种梅毒血清学筛查或诊断方法。目的是该方法应具有廉价、快速、敏感和特异的特点。本发明提供的技术方案是：一种检测梅毒血清抗体的rTpN15-17-47-ELISA的制备方法，依次包括以下步骤：采用基因工程技术构建tpN15、tpN17和tpN47的人工融合基因tpN15-17-47及其原核表达系统E.coliBL21DE3pET42a-tpN15-17-47，提纯重组表达产物rTpN15-17-47为包被抗原，建立用于检测梅毒血清抗体的rTpN15-17-47-ELISA。所述的人工融合基因tpN15-17-47具有序列表5所示的核苷酸序列和氨基酸序列。
Description
技术领域
本发明涉及一种快速、敏感和特异的梅毒血清学筛查或诊断方法，具体是用连接引物构建融合基因并进行原核表达，提纯重组表达产物rTpN15-17-47为包被抗原，建立用于检测梅毒血清抗体的rTpN15-17-47-ELISA。
背景技术
梅毒螺旋体(Treponema pallidum)感染引起的梅毒(syphilis)是最为重要的人类性传播性疾病(sexual transmission diseases，STD)之一。梅毒潜伏期较长、病情进展相对缓慢、加之病灶中分离梅毒螺旋体的阳性率较低，因而检测梅毒螺旋体特异性抗体的血清学试验成为临床上梅毒病的实验室诊断方法。例如，TRUST(梅毒甲苯胺红不加热血清试验)和TPHA(梅毒螺旋体抗体血凝试验)分别是目前普遍应用于临床的梅毒病初筛和确诊试验。
有文献报道，早期梅毒患者血清中存在梅毒螺旋体TpN30、TpN33和TpN37等抗体，但在中、晚期梅毒或治疗后患者血清中，此等抗体水平往往明显下降甚至消失；在早、中期梅毒患者血清中，可检测出TpN15、TpN17、TpN34和TpN47等抗体。由于TpN15、TpN17和TpN47抗体水平较高且稳定、维持时间较长，故被认为是最有临床应用前景的梅毒螺旋体TpNs抗原。
由于至今尚不能用无生命的人工培养基培养梅毒螺旋体，因而建立基于重组TpNs(recombinant TpNs，rTpNs)抗原的梅毒血清学检测方法倍受人们重视。目前以单一rTpNs为抗原所建立血清抗体检测方法已有不少研究报道，但单一重组抗原的灵敏度和特异性较低。为了提高基于rTpNs抗原的梅毒血清学检测方法的敏感性和特异性，我们构建了梅毒螺旋体tpN15、tpN17和tpN47融合基因tpN15-17-47原核表达系统，建立了基于rTpN15-17-47重组蛋白为包被抗原的ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay；酶联免疫吸附试验)，为临床梅毒病提供了一种快速、敏感和特异的梅毒血清学筛查或诊断新方法。
发明内容
本发明的目的是克服非梅毒抗原试验敏感性和特异性较低，梅毒血清学试验中梅毒抗原试验虽有较高敏感性和特异性，但是需制备大量梅毒抗原导致成本较高的缺点；提供一种廉价、快速、敏感和特异的梅毒血清学筛查或诊断新方法。
本发明提供的技术方案是：一种检测梅毒血清抗体的rTpN15-17-47-ELISA的制备方法，依次包括以下步骤：采用基因工程技术构建tpN15、tpN17和tpN47的人工融合基因tpN15-17-47及其原核表达系统E.coliBL21DE3pET42a-tpN15-17-47，提纯重组表达产物rTpN15-17-47为包被抗原，建立用于检测梅毒血清抗体的rTpN15-17-47-ELISA。
所述的人工融合基因tpN15-17-47具有序列表5所示的核苷酸序列和氨基酸序列。
所述的一种检测梅毒血清抗体的rTpN15-17-47-ELISA的制备方法，具体包含以下步骤：
1)梅毒螺旋体tpN15、tpN17和tpN47基因的克隆和测序；
2)人工融合基因tpN15-17-47及其原核表达系统构建和测序；
3)含IPTG的LB培养基中诱导重组蛋白抗原分子rTpN15-17-47表达，SDS-PAGE和BioRad凝胶图象分析系统确定重组表达产物rTpN15-17-47的表达情况和产量；
4)Ni-NTA亲和层析法提纯重组表达产物rTpN15-17-47；
5)rTpN15-17-47作为包被抗原的ELISA的建立。
所述梅毒螺旋体tpN15、tpN17和tpN47基因的克隆方法分别是：
1)取离心沉淀的梅毒病人硬性下疳分泌物，用苯酚-氯仿提取、乙酸钠和无水乙醇沉淀获得基因组DNA；2)以梅毒螺旋体基因组DNA为模板，采用PCR分别扩增tpN15、tpN17和tpN47基因，各上下游引物序列中均分别设置限制性核酸内切酶位点NdeI和XhoI；3)PCR产物经电泳后，在紫外线下观察目的DNA扩增条带；4)采用PCR产物纯化试剂盒，先提取目的DNA扩增条带；然后采用T-A克隆试剂盒，用T4DNA连接酶将提纯的DNA条带与克隆质粒如pUC-M-T连接；5)取用大肠杆菌DH5α株，将其接种、培养，然后收集细菌沉淀，制备成感受态E.coli DH5α悬液；6)在上述感受态E.coli DH5α悬液中加入上述连接产物，加入SOC培养液培养；7)在LB琼脂平板上涂布接种上述SOC培养物；8)选取SOC培养物上的白色菌落在含LB培养液中培养，采用细菌质粒提取试剂盒进行质粒提取，提取的质粒进行NdeI和XhoI酶切、电泳分离，在紫外线下分别确认有目的DNA片段tpN15、tpN17和tpN47后，测定克隆片段的核苷酸序列，序列正确者即为重组质粒pUC-M-TtpN15、pUC-M-TtpN17或pUC-M-TtpN47。
所述人工融合基因tpN15-17-47的制备方法是：1)上述含有重组质粒pUC-M-TtpN15、pUC-M-TtpN17或pUC-M-TtpN47的E.coli DH5α分别在LB培养液中培养后，采用细菌质粒提取试剂盒，分别提取E.coli DH5α中的重组质粒pUC-M-TtpN15、pUC-M-TtpN17或pUC-M-TtpN47；2)根据柔性肽核苷酸序列，设计分别扩增tpN15、tpN17或tpN47基因片段的引物，其中tpN15、tpN17基因下游引物含柔性肽正链序列，tpN17、tpN47基因上游引物含柔性肽负链序列，tpN15基因上游引物不含柔性肽序列但设置限制性核酸内切酶NdeI位点，tpN17基因下游引物不含柔性肽序列但设置限制性核酸内切酶XhoI位点，然后分别以重组质粒pUC-M-TtpN15、pUC-M-TtpN17或pUC-M-TtpN47为模板，采用PCR扩增出带有柔性肽序列的tpN15、tpN17和tpN47基因片段；3)各PCR产物经电泳分离后，在紫外线下确认分别有tpN15、tpN17或tpN47基因扩增片段后，采用PCR产物纯化试剂盒，提纯各目的扩增片段后测定各提取物DNA浓度；4)将提纯的tpN15基因扩增片段和提纯的tpN17基因扩增片段混合，加入除引物外的其它PCR试剂进行反应，利用柔性肽正、负链互补性形成tpN15-17复合模板，然后加入tpN15基因上游引物及tpN17基因下游引物进行PCR扩增；按上述方法进行PCR产物电泳分离、紫外线下观察、提纯tpN15-17扩增片段、测定提取物DNA浓度；5)将提纯的tpN15-17扩增片段与提纯的tpN47基因扩增片段混合，加入除引物外的其它PCR试剂进行反应，利用柔性肽正、负链互补性形成tpN15-17-47复合模板，然后加入tpN15基因上游引物及tpN47基因下游引物进行PCR扩增，按上述方法进行PCR产物电泳分离、紫外线下观察、提纯tpN15-17-47扩增片段；6)采用T-A克隆试剂盒，用T4DNA连接酶将提纯的tpN15-17-47片段与重组质粒连接，获得连接产物；6)E.coli DH5α接种于LB培养液中培养，离心收集细菌沉淀，制备成感受态E.coli DH5α悬液；7)在上述感受态E.coli DH5α悬液中加入上述连接产物，混匀后加入SOC培养液培养；8)在LB琼脂平板上分别用X-gal溶液、IPTG均匀涂布，然后涂布接种上述SOC培养物培养、观察；9)选取SOC培养物上的白色菌落在LB培养液中培养，采用细菌质粒提取试剂盒进行质粒提取，提取的质粒按上述方法进行NdeI和XhoI酶切、电泳分离，在紫外线下分别确认有目的DNA片段tpN15-17-47后，测定克隆片段的核苷酸序列；序列正确者即为含人工融合基因tpN15-17-47片段的重组质粒pUC-M-TtpN15-17-47。
所述人工融合基因tpN15-17-47原核表达系统E.coliBL21DE3pET42a-tpN15-17-47的制备方法是：1)含有重组质粒pUC-M-TtpN15-17-47的大肠杆菌E.coli DH5α在LB培养液中培养后，采用细菌质粒提取试剂盒，提取E.coli DH5α中的重组质粒pUC-M-TtpN15-17-47；2)提取的质粒用限制性核酸内切酶NdeI和XhoI酶切，酶切产物经电泳分离后，在紫外线下确认有目的DNA片段tpN15-17-47后，采用DNA胶回收试剂盒，切胶回收tpN15-17-47片段；3)原核表达载体pET42a用限制性核酸内切酶NdeI和XhoI酶切，酶切产物用电泳分离线性化的pET42a，采用DNA胶回收试剂盒，回收线性化pET42a片段；4)根据tpN15-17-47与线性化pET42a片段估计浓度，然后tpN15-17-47与线性化pET42a片段按3∶1的比例混合，加入连接酶T4DNA连接，获得连接产物；5)取用大肠杆菌BL21(DE3)，接种于LB培养液中培养，离心收集细菌沉淀，制备成感受态E.coli BL21DE3悬液；6)在上述感受态悬液中加入上述连接产物，再加入SOC培养液培养；7)在LB琼脂平板上涂布接种上述SOC培养物培养；8)挑取SOC培养物上的菌落在LB培养液中培养4-6h，采用细菌质粒提取试剂盒进行质粒提取，提取的质粒按上述方法进行NdeI和XhoI酶切、电泳分离后，在紫外线下确认有目的DNA片段tpN15-17-47，测定目的片段的核苷酸序列，序列正确者即为目的原核表达系统E.coliBL21DE3pET42a-tpN15-17-47。
所述重组表达产物rTpN15-17-47的表达和提纯方法是：1)在LB液体培养液中接种E.coliBL21DE3pET42a-tpN15-17-47培养，加入IPTG继续培养；2)上述培养物离心、收集细菌沉淀用超声破碎，采用Ni-NTA亲和层析柱，将破碎产物过Ni-NTA柱，利用重组表达产物rTpN15-17-47羧基端8×His标签进行分离、洗脱、收集目的重组表达产物rTpN15-17-47。
所述rTpN15-17-47-ELISA的建立包括以下步骤：1)用紫外分光光度法测定提纯的重组蛋白的浓度；2)抗原包被：用pH9.6、0.01mol/L碳酸盐缓冲液配制蛋白浓度为50μg/ml的重组蛋白溶液，96孔聚苯乙烯反应板每孔包被100μl，37℃温育2h后4℃过夜；次日以0.05％Tween20-0.01mol/L PBS(pH7.4)洗涤3次后用5％BSA封闭；3)分别以1∶800稀释的250例正常人血清为一抗，HRP标记羊抗人IgG(Jackson ImmunoResearch)为二抗，TMB为显色底物，终止反应后用BioRad酶标仪测定各孔OD450值，了解健康人血清OD450值范围并计算其OD450均值和SD值；
为了保证融合基因原核重组表达产物中三个蛋白抗原有良好的空间构型，构建融合基因时，在tpN15与tpN17、tpN17与tpN47基因之间用相同的两条柔性肽序列(Gly Gly Gly GlySer Gly Gly Gly Gly Ser)连接，构建了tpN15-17-47融合基因原核表达载体pET42atpN15-17-47，转化入大肠杆菌E.coli BL21DE3中，建立了重组原核表达系统E.coli BL21DE3pET42a-tpN15-17-47；其表达产物rTpN15-17-47分子中同时含有rTpN15、rTpN17和rTpN47三种重组蛋白抗原，提高了基于rTpNs抗原的梅毒血清检测方法的敏感性，不需要分别重组表达rTpN15、rTpN17和rTpN47，降低了生产成本，同时使制备方法更为简便可靠。
本发明的有益效果是：1)本发明通过人工融合基因及其原核表达的三价融合重组蛋白rTpN15-17-47能检测不同期梅毒抗体的ELISA，rTpN17-47-ELISA检测965例临床确诊梅毒患者血清标本的阳性率为99.5％，仅略高于TPHA(98.3％)(P＞0.05)，但明显高于TpN15-ELISA(83.1％)、rTpN17-ELISA(84.4％)、rTpN47-ELISA(82.1％)和TRUST(72.2％)(P＜0.01)。上述ELISAs和TPHA对62例SLE、86例RA患者和250例健康体检者的血清标本检测结果均为阴性，但TRUST分别有5、7和2例标本检测结果为阳性。上述研究结果表明，我们成功地构建了rTpN15-17-47融合基因及其高效原核表达系统，我们建产的rTpN15-17-47-ELISA是一种敏感和特异的梅毒血清筛查或诊断的新方法；2)本发明制备的多价重组蛋白rTpN15-17-47是一种对人体无害的细菌融合蛋白，克服梅毒血清学试验中梅毒抗原试验用兔睾丸中传代和繁殖梅毒螺旋体Nichols株导致成本较高的缺点，而且制备方法安全可靠；3)本发明抗原性强、天然表达量高，其抗体存在于各期梅毒患者血清中的TpN15、TpN17和TpN47梅毒螺旋体外膜蛋白融合基因重组蛋白rTpN15-17-47为包被抗原建立ELISA检测梅毒病人血清抗体，是以基因工程技术一次性表达和提纯三种抗原融合的蛋白分子，故减少了制备环节而成本较低，有利于推广应用。
具体实施方式
序列表说明
序列1是梅毒螺旋体外膜蛋白tpN15基因核苷酸和氨基酸序列(梅毒螺旋体基因组提取来自梅毒病人硬性下疳分泌物与报道的相应序列(GenBank accession No.：NC_000919)比较，所克隆的tpN15基因核苷酸和氨基酸序列相似性均为100％)，每排上一行为核苷酸序列，下一行为氨基酸序列，tpN15基因去除信号肽序列及终止密码TAA)。
序列2是梅毒螺旋体外膜蛋白tpN17基因核苷酸和氨基酸序列(梅毒螺旋体基因组提取来自梅毒病人硬性下疳分泌物与报道的相应序列(GenBank accession No.：NC_000919)比较，所克隆的tpN17基因核苷酸和氨基酸序列相似性均为100％)，每排上一行为核苷酸序列，下一行为氨基酸序列，tpN17基因去除信号肽序列及启动密码ATG和终止密码TAA)。
序列3是梅毒螺旋体外膜蛋白tpN47基因核苷酸和氨基酸序列(梅毒螺旋体基因组提取来自梅毒病人硬性下疳分泌物与报道的相应序列(GenBank accession No.：NC_000919)比较，所克隆的tpN47基因核苷酸和氨基酸序列相似性均为100％)，每排上一行为核苷酸序列，下一行为氨基酸序列，tpN47基因去除信号肽序列及及启动密码ATG)。
序列4是用于连接各目的基因的柔性肽序列(柔性肽序列为自行设计，每排上一行为核苷酸序列，下一行为氨基酸序列)。
序列5是梅毒螺旋体外膜蛋白人工融合基因tpN15-17-47核苷酸和氨基酸序列[梅毒螺旋体基因组提取来自梅毒病人的硬性下疳分泌物与报道的相应序列(GenBank accession No.：NC_000919)比较，所克隆的tpN15、tpN17和tpN47基因核苷酸和氨基酸序列相似性均为100％]，每排上一行为核苷酸序列，下一行为氨基酸序列，下划横线区为柔性肽序列，有方框区为表达载体自行携带、用于Ni-NTA亲和层析提取重组融合抗原rTpN15-17-47的8×His标签，*表示终止密码TAA)
以下结合实施例进一步说明
实施例：实施例建立用于检测梅毒血清抗体的rTpN15-17-47-ELISA是采用基因工程技术，首先分别获得tpN15、tpN17和tpN47基因克隆，然后采用相同的两条柔性肽序列分别连接外膜蛋白tpN15与tpN17基因、tpN17与tpN47基因，构建出同时含外膜蛋白TpN15、TpN17和TpN47三种梅毒螺旋体外膜蛋白抗原。
本发明采用基因工程技术构建人工融合基因tpN15-17-47及其原核表达系统E.coliBL21DE3pET42a-tpN15-17-47，提纯的该表达系统的重组表达产物rTpN15-17-47抗原包被，建立用于检测梅毒血清抗体的rTpN15-17-47-ELISA。
基因的选择依据：有文献报道，早期梅毒患者血清中存在梅毒螺旋体TpN30、TpN33和TpN37等抗体，但在中、晚期梅毒或治疗后患者血清中，此等抗体水平往往明显下降甚至消失；在早、中期梅毒患者血清中，可检测出TpN15、TpN17、TpN34和TpN47等抗体。由于TpN15、TpN17和TpN47抗体水平较高且稳定、维持时间较长，故被认为是最有临床应用前景的梅毒螺旋体TpNs抗原。我们构建了梅毒螺旋体tpN15、tpN17和tpN47融合基因tpN15-17-47，然后构建了tpN15、tpN17和tpN47基因和原核表达系统，采用Ni-NTA亲和层析法提纯上述目的重组蛋白。分别以rTpN15、rTpN17和rTpN47和rTpN15-17-47为包被抗及原，建立用于检测梅毒血清抗体的rTpN15-ELISA、rTpN17-ELISA、rTpN47-ELISA和rTpN15-17-47-ELISA。上述ELISAs与TRUST及TPHA检测965例梅毒病人、62例SLE、86例RA患者和250例健康体检者的血清血清标本，与单个外膜蛋白TpN15、TpN17和TpN47原核表达重组蛋白的证明rTpN15-17-47-ELISA是敏感和特异的梅毒血清学筛查或诊断新方法。
本发明采用rTpN15-17-47融合蛋白抗原包被的理由是：目前以单一rTpNs为抗原所建立血清抗体检测方法已有不少研究报道，但单一重组抗原的灵敏度和特异性较低。为了提高基于rTpNs抗原的梅毒血清学检测方法的敏感性和特异性，我们构建了梅毒螺旋体tpN15、tpN17和tpN47融合基因(tpN15-17-47)原核表达系统，可一次性表达和提纯同时含有rTpN15、rTpN17和rTpN47抗原的一个融合蛋白抗原分子rTpN15-17-47，减少了表达和提纯工序并由此降低了成本，同时抗原分子量增大可具有提高抗原性的效果。
本实施例检测梅毒血清抗体的rTpN15-17-47-ELISA构建包含以下的步骤：：1)梅毒螺旋体tpN15、tpN17和tpN47基因的克隆和测序；2)tpN15-17-47人工融合基因及其原核表达系统构建和测序；3)含IPTG的LB培养基中诱导三价重组蛋白抗原分子rTpN15-17-47表达，SDS-PAGE和BioRad凝胶图象分析系统确定表达情况和产量；4)Ni-NTA亲和层析法提纯rTpN15-17-47；5)rTpN15-17-47作为包被抗原的ELISA的建立。
本实施例中的梅毒螺旋体从梅毒病人硬性下疳分泌物中提取；本实施例中所用的一切实验用材料和试剂及相关设备均可从各自国内外相关产业公司或国外公司国内销售代理公司购得。在微生物学、分子生物学等技术领域的专业人员，均可重复本实施例中的制备方法并进行试用。
以梅毒病人硬性下疳分泌物中提取基因组DNA为模板，采用PCR分别扩增tpN15、tpN17和tpN47基因，各上下游引物序列中均分别设置限制性核酸内切酶位点Nde I和XhoI，PCR参数：94℃5分钟；94℃30秒、52℃30秒、72℃30秒(其中扩增tpN47需90秒)，30个循环；72℃10分钟；4)PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳后，在紫外线下观察目的DNA扩增条带；5)采用多家公司均可提供的PCR产物纯化试剂盒，根据其操作说明书，先提取目的DNA扩增条带；然后采用多家公司均可提供的T-A克隆试剂盒，根据其操作说明书，用T4DNA连接酶16℃作用12小时将提纯的DNA条带与克隆质粒如pUC-M-T连接，反应总体积20μl；6)取用可购自多家分子生物学试剂公司大肠杆菌DH5α株，大肠杆菌拉丁文名是Escherichia coli(E.coli)，该菌(E.coli DH5α)接种于LB培养液中37℃培养24小时，5000转/分4℃离心15分钟，收集细菌沉淀悬于冰浴预冷的1ml 0.1mol/L CaCl2溶液中冰浴30分钟，4000转/分4℃离心10分钟，收集细菌沉淀悬于冰浴预冷的100μl上述CaCl2溶液中，冰浴30分钟，制备成感受态E.coli DH5α；7)在上述100μl感受态E.coli DH5α悬液中加入上述连接产物2μl，轻轻混匀后冰浴30分钟，42℃水浴热激90秒，再冰浴2分钟后加入SOC培养液500μl，37℃旋转培养(160-180转/分)培养1小时；8)在含100μg/ml氨苄青霉素LB琼脂平板上分别用浓度为20mg/ml的X-gal溶液40μl、100mmol/L IPTG 20μl均匀涂布，37℃干燥30分钟，然后涂布接种上述SOC培养物37℃培养24小时后观察菌落产生情况；9)选取白色菌落在含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养液中37℃旋转培养(160-180转/分)培养4-6小时，采用多家公司均可提供的细菌质粒提取试剂盒，按说明书操作进行质粒提取，提取的质粒按上述方法进行Nde I和XhoI酶切、1.5％琼脂糖凝胶电泳分离，在紫外线下分别确认有目的DNA片段tpN15、tpN17和tpN47后，委托上海Invetrogen等专业公司采用双末端脱氧法测定克隆片段的核苷酸序列，序列正确者即为重组质粒pUC-M-TtpN15、pUC-M-TtpN17或pUC-M-TtpN47。
上述人工融合基因tpN15-17-47-的制备方法是：1)上述含有重组质粒pUC-M-TtpN15、pUC-M-TtpN17或pUC-M-TtpN47的E.coli DH5α分别在含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养液中37℃旋转培养(160-180转/分)培养4-6小时，采用多家公司均可提供的细菌质粒提取试剂盒，按说明书操作，分别提取E.coli DH5α中的重组质粒pUC-M-TtpN15、pUC-M-TtpN17或pUC-M-TtpN47；2)根据柔性肽(Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser)核苷酸序列，设计分别扩增tpN15、tpN17或tpN47基因片段的引物，其中tpN15、tpN17基因下游引物含柔性肽正链序列，tpN17、tpN47基因上游引物含柔性肽负链序列，tpN15基因上游引物不含柔性肽序列但设置限制性核酸内切酶Nde I位点，tpN47基因下游引物不含柔性肽序列但设置限制性核酸内切酶XhoI位点，各引物委托上海Invetrogen等专业公司合成，然后分别以重组质粒pUC-M-TtpN15、pUC-M-TtpN17或pUC-M-TtpN47为模板，采用PCR扩增出带有柔性肽序列的tpN15、tpN17和tpN47，PCR参数：94℃5分钟；94℃30秒、52℃30秒、72℃30秒(扩增tpN47基因片段延伸时间用90秒)，30个循环；72℃10分钟；3)各PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳分离后，在紫外线下确认分别有tpN15、tpN17或tpN47基因扩增片段后，采用多家分子生物学试剂公司均可提供的PCR产物纯化试剂盒，按说明书操作，提纯各目的扩增片段后用紫外分光广度法测定各提取物DNA浓度；4)将100ng提纯的tpN15基因扩增片段和100ng提纯的tpN17基因扩增片段混合，加入除引物外的其它PCR试剂进行反应(反应参数：94℃5分钟；94℃30秒、45℃30秒、72℃45秒，10个循环)，利用柔性肽正、负链互补性形成tpN15-17复合模板，然后加入tpN15基因上游引物及tpN17因下游引物进行PCR扩增(PCR参数：94℃5分钟；94℃30秒、52℃30秒、72℃60秒，30个循环；72℃10分钟)，按上述方法进行PCR产物琼脂糖凝胶电泳分离、紫外线下观察、提纯tpN15-17扩增片段、测定提取物DNA浓度；5)将100ng提纯的tpN15-17扩增片段与100ng提纯的tpN47基因扩增片段混合，加入除引物外的其它PCR试剂进行反应(反应参数：94℃5分钟；94℃30秒、45℃30秒、72℃45秒，10个循环)，利用柔性肽正、负链互补性形成tpN15-17-47复合模板，然后加入tpN15基因上游引物及tpN47基因下游引物进行PCR扩增(PCR参数：94℃5分钟；94℃30秒、50℃30秒、72℃120秒，30个循环；72℃15分钟)，按上述方法进行PCR产物琼脂糖凝胶电泳分离、紫外线下观察、提纯tpN15-17-47扩增片段；6)采用多家公司均可提供的T-A克隆试剂盒，根据其操作说明书，用T4DNA连接酶16℃作用12小时将提纯的tpN15-17-47片段与克隆质粒如pUC-M-T连接，反应总体积20μl；6)E.coli DH5α接种于LB培养液中37℃培养24小时，5000转/分4℃离心15分钟，收集细菌沉淀悬于冰浴预冷的1ml 0.1mol/L CaCl2溶液中冰浴30分钟，4000转/分4℃离心10分钟，收集细菌沉淀悬于冰浴预冷的100μl上述CaCl2溶液中，冰浴30分钟，制备成感受态E.coli DH5α；7)在上述100μl感受态E.coli DH5α悬液中加入上述连接产物2μl，轻轻混匀后冰浴30分钟，42℃水浴热激90秒，再冰浴2分钟后加入SOC培养液500μl，37℃旋转培养(160-180转/分)培养1小时；8)在含100μg/ml氨苄青霉素LB琼脂平板上分别用浓度为20mg/ml的X-gal溶液40μl、100mmol/L IPTG 20μl均匀涂布，37℃干燥30分钟，然后涂布接种上述SOC培养物37℃培养24小时后观察菌落产生情况；9)选取白色菌落在含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养液中37℃旋转培养(160-180转/分)培养4-6小时，采用多家公司均可提供的细菌质粒提取试剂盒，按说明书操作进行质粒提取，提取的质粒按上述方法进行Nde I和XhoI酶切、1.5％琼脂糖凝胶电泳分离，在紫外线下分别确认有目的DNA片段tpN15-17-47后，委托上海Invetrogen等专业公司采用双末端脱氧法测定克隆片段的核苷酸序列，序列正确者即为含人工融合基因tpN15-17-47片段的重组质粒pUC-M-TtpN15-17-47。
上述原核表达系统E.coliBL21DE3pET42a-tpN15-17-47的制备方法是：1)含有重组质粒pUC-M-TtpN15-17-47的E.coli DH5α在含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养液中37℃旋转培养(160-180转/分)培养4-6小时，采用多家公司均可提供的细菌质粒提取试剂盒，按说明书操作，提取E.coliDH5α中的重组质粒pUC-M-TtpN15-17-47；2)提取的质粒用8-16单位的限制性核酸内切酶NdeI和XhoI 37℃酶切12小时，酶切产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳分离后，在紫外线下确认有目的DNA片段tpN15-17-47后，采用多家分子生物学试剂公司均可提供的DNA胶回收试剂盒，按说明书操作，切胶回收tpN15-17-47片段；3)原核表达载体pET42a购自Novagen公司，用8-16单位的限制性核酸内切酶Nde I和XhoI 37℃酶切12小时，酶切产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳分离线性化的pET42a，采用多家分子生物学试剂公司均可提供的DNA胶回收试剂盒，按说明书操作，回收线性化pET42a片段；4)根据tpN15-17-47与线性化pET42a片段在琼脂糖凝胶中紫外线照射下的荧光强度估计其浓度，然后tpN15-17-47与线性化pET42a片段按3∶1的比例混合，加入T4DNA连接酶37℃连接12小时，反应总体积20μl；5)取用购自Novagen公司的大肠杆菌BL21DE3株(E.coli BL21DE3)，该菌接种于LB培养液中37℃培养24小时，5000转/分4℃离心15分钟，收集细菌沉淀悬于冰浴预冷的1ml 0.1mol/L CaCl2溶液中冰浴30分钟，4000转/分4℃离心10分钟，收集细菌沉淀悬于冰浴预冷的100μl上述CaCl2溶液中，冰浴30分钟，制备成感受态E.coli BL21DE3；6)在上述100μl感受态E.coli BL21DE3悬液中加入上述连接产物2μl，轻轻混匀后冰浴30分钟，42℃水浴热激90秒，再冰浴2分钟后加入SOC培养液500μl，37℃旋转培养(160-180转/分)培养1小时；7)在含100μg/ml氨苄青霉素LB琼脂平板上涂布接种上述SOC培养物，37℃培养24小时；8)挑取菌落在含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养液中37℃旋转培养(160-180转/分)培养4-6小时，采用多家公司均可提供的细菌质粒提取试剂盒，按说明书操作进行质粒提取，提取的质粒按上述方法进行Nde I和XhoI酶切，1.5％琼脂糖凝胶电泳分离后，在紫外线下确认有目的DNA片段tpN15-17-47后，委托上海Invetrogen等专业公司采用双末端脱氧法测定目的片段的核苷酸序列，序列正确者即为目的原核表达系统E.coliBL21DE3pET42a-tpN15-17-17。
上述重组表达产物rTpN15-17-47的表达和提纯方法是：1)在LB液体培养液中接种E.coliBL21DE3pET42a-tpN15-17-47，30℃或37℃、300转/分旋转培养4小时，加入0.5mol/L的IPTG，按上述条件继续培养4～6小时；2)上述培养物5000转/分4℃离心15分钟，收集细菌沉淀用超声破碎(电压300V，破碎3秒后间歇3秒，共200次)，采用多家公司均可提供的Ni-NTA亲和层析柱，根据说明书操作，将破碎产物过Ni-NTA柱，利用重组表达产物rTpN15-17-47羧基端8×His标签进行分离、洗脱、收集目的重组表达产物rTpN15-17-47。实验结果如下：1)E.coli BL21DE3pET42a-tpN15-17-47能有效表达rTpN15-17-47，经SDS-PAGE及Bio-Rad凝胶图象分析系统检测，rTpN15-17-47产量可达细菌总蛋白的32.1％；2)Ni-NTA亲和层析后rTpN15-17-47可达到电泳纯。
重组表达产物rTpN15-17-47的鉴定：分别以5份TPHA和TRUST确认的梅毒抗体阳性患者血清为一抗(1∶100稀释)、HRP标记羊抗人IgG(Jackson ImmunoResearch)为二抗(1∶3000稀释)，用Western Bolt检测上述目的重组蛋白rTpN15-17-47的免疫反应性。
TpN15-17-47-ELISA的建立及敏感性和特异性的检测：1)用紫外分光光度法测定提纯的重组蛋白的浓度；2)抗原包被：用pH9.6、0.01mol/L碳酸盐缓冲液配制蛋白浓度为50μg/ml的重组蛋白溶液，96孔聚苯乙烯反应板每孔包被100μl，37℃温育2h后4℃过夜。次日以0.05％Tween20-0.01mol/L PBS(pH7.4)洗涤3次后用5％BSA封闭。3)分别以1∶800稀释的250例正常人血清为一抗，HRP标记羊抗人IgG(Jackson ImmunoResearch)为二抗，TMB为显色底物，终止反应后用BioRad酶标仪测定各孔OD450值，了解健康人血清OD450值范围并计算其OD450均值和SD值。4)以1∶800稀释965例梅毒病人、62例SLE、86例RA患者和250例健康体检者的血清血清标本并测定OD450，若被检标本OD450值≥阴性对照OD450均值+3SD者为阳性。和36例RA患者血清进行检测。
所述rTpN15-17-47-ELISA方法特异性与灵敏度判定。
不同血清学方法TRUST、TPHA和rTpN15-ELISA、rTpN17-ELISA、rTpN47-ELISA、rTpN15-17-47-ELISA对梅毒、SLE、RA、健康体检者血清标本检测及比较结果见表1和2。
表1对梅毒病人血清标本检测及比较结果
rTpN15-17-47-ELISA检测梅毒病人血清阳性率略高于TPHA(P＜0.05)，显著高于rTpN15-ELISA、rTpN17-ELISA、rTpN47-ELISA和TRUST(P＜001)，TRUST检测梅毒病人血清阳性率最低。
表2不同梅毒血清学方法的特异性比较
所有健康人血清、RA和SLE患者血清标本的rTpNs-ELISAs和TPHA检测结果均为阴性，但有7例RA、5例SLE患者和2例健康人血清标本TRUST检测结果阳性。
序列表
<110>孙爱华，严杰
<120>一种检测梅毒血清抗体的rTpN15-17-47-ELISA的制备方法
<160>5
<170>WinBlast v.02.0
<210>1
<211>核苷酸354，氨基酸118
<212>DNA/PRT
<213>梅毒螺旋体(Treponema pallidum)
<220>
<221>梅毒螺旋体tpN15序列和氨基酸序列
<222>核苷酸序列(1)…(354)，氨基酸序列(1)…(118)
<400>1
ATG AAT GGC ACG TAC CGG GCG ACG TAT CAG GAT TTT GAT GAG AAT GGT 48
Met Asn Gly Thr Try Arg Ala Thr Try Gln Asp Phe Asp Glu Asn Gly 16
1 5 10 15
TGG AAG GAC TTT CTC GAG GTT ACT TTT GAT GGT GGC AAG ATG GTG CAG 96
Trp Lys Asp Phe Leu Glu Val Thr Phe Asp Gly Gly Lys Met Val Gln 32
20 25 30
GTG GTT TAC GAT TAT CAG CAT AAA GAA GGG CGG TTT AAG TCC CAG GAC 144
Val Val Try Asp Try Gln His Lys Glu Gly Arg Phe Lys Ser Gln Asp 48
35 40 45
GCT GAC TAC CAT CGG GTC ATG TAT GCA TCC TCG GGC ATA GGT CCT GAA 192
Ala Asp Try His Arg Val Met Try Ala Ser Ser Gly Ile Gly Pr Glu 64
50 55 60
AAG GCC TTC AGA GAG CTC GCC GAT GCT TTG CTT GAA AAG GGT AAT CCC 240
Lys Ala Phe Arg Glu Leu Ala Asp Ala Leu Leu Glu Lys Gly Asn Pro 80
65 70 75 80
GAG ATG GTG GAT GTG GTC ACC GGT GCA ACT GTT TCT TCC CAG AGT TTC 288
Glu Met Val Asp Val Val Thr Gly Ala Thr Val Ser Ser Gln Ser Phe 96
85 90 95
AGG AGG TTG GGT GCT GCG CTT CTG CAG AGT GCG CGG CGC GGC GAG AAG 336
Arg Arg Leu Gly Ala Ala Leu Leu Gln Ser Ala Arg Arg Gly Glu Lys 112
100 105 110
GAA GCC ATT ATT AGC AGG 354
Glu Ala Ile Ile Ser Arg 118
115
<110>孙爱华
<120>一种检测梅毒血清抗体的rTpN15-17-47-ELISA的制备方法
<160>5
<170>WinBlast v.0.2.0
<210>2
<211>核苷酸396，氨基酸132
<212>DNA/PRT
<213>梅毒螺旋体(Treponema pallidum)
<220>
<221>梅毒螺旋体tpN17序列和氨基酸序列
<222>核苷酸序列(1)…(396)，氨基酸序列(1)…(132)
<400>1
TGC ACA ACC GTG TGT CCG CAC GCC GGG AAG GCC AAA GCG GAA AAG GTA 48
Cys Thr Thr Val Cys Pro His Ala Gly Lys Ala Lys Ala Glu Lys Val 16
1 5 10 15
GAG TGC GCG TTG AAG GGA GGT ATC TTT CGG GGT ACG CTA CCT GCG GCC 96
Glu Cys Ala Leu Lys Gly Gly Ile Phe Arg Gly Thr Leu Pro Ala Ala 32
20 25 30
GAT TGC CCG GGA ATC GAT ACG ACT GTG ACG TTC AAC GCG GAT GGC ACT 144
Asp Cys Pro Gly Ile Asp Thr Thr Val Thr Phe Asn Ala Asp Gly Thr 48
35 40 45
GCG CAA AAG GTA GAG CTT GCC CTT GAG AAG AAG TCG GCA CCT TCT CCT 192
Ala Gln Lys Val Glu Leu Ala Leu Glu Lys Lys Ser Ala Pro Ser Pro 64
50 55 60
CTT ACG TAT CGC GGT ACG TGG ATG GTA CGT GAA GAC GGA ATT GTC GAA 240
Leu Thr Try Arg Gly Thr Trp Met Val Arg Glu Asp Gly Ile Val Glu 80
65 70 75 80
CTC TCG CTT GTG TCC TCG GAG CAA TCG AAG GCA CCG CAC GAG AAA GAG 288
Leu Ser Leu Val Ser Ser Glu Gln Ser Arg Ala Pro His Glu Arg Glu 96
85 90 95
CTG TAC GAG CTG ATA GAC AGT AAC TCC GTT CGC TAC ATG GGC GCT CCC 336
Leu Try Glu Leu Ile Asp Ser Asn Ser Val Arg Try Met Gly Ala Pro 112
100 105 110
GGC GCA GGA AAG CCT TCA AAG GAG ATG GCG CCG TTT TAC GTG CTC AAA 384
Gly Ala Gly Lys Pro Ser Lys Glu Met Ala Pro Phe Try Val Leu Lys 128
115 120 125
AAA ACA AAG AAA 396
Lys Thr Lys Lys 132
130
<110>孙爱华
<120>一种检测梅毒血清抗体的rTpN15-17-47-ELISA的制备方法
<160>5
<170>WinBlast v.0.2.0
<210>3
<211>核苷酸1239，氨基酸413
<212>DNA/PRT
<213>梅毒螺旋体(Treponema pallidum)
<220>
<221>梅毒螺旋体tpN47序列和氨基酸序列
<222>核苷酸序列(1)…(1239)，氨基酸序列(1)…(413)
<400>1
TCG TCT CAT CAT GAG ACG CAC TAT GGC TAT GCG ACG CTA AGC TAT GCG48
Ser Ser His His Glu Thr His Try Gly Try Ala Thr Leu Ser Try Ala 16
1 5 10 15
GAC TAC TGG GCC GGG GAG TTG GGG CAG AGT AGG GAC GTG CTT TTG GCG 96
ASP TRY Trp Ala Gly Glu Leu Gly Gln Ser Arg Asp Val Leu Leu Ala 32
20 25 30
GGT AAT GCC GAG GCG GAC CGC GCG GGG GAT CTC GAC GCA GGC ATG TTC 144
Gly Asn Ala Glu Ala Asp Arg Ala Gly Asp Leu Asp Ala Gly Met Phe 48
35 40 45
GAT GCA GTT TCT CGC GCA ACC CAC GGG CAT GGC GCG TTC CGT CAG CAA 192
Asp Ala Val Ser Arg Ala Thr His Gly His Gly Ala Phe Arg Gln Gln 64
50 55 60
TTT CAG TAC GCG GTT GAG GTA TTG GGC GAA AAG GTT CTC TCG AAG CAG 240
Phe Gln Try Ala Val Glu Val Leu Gly Glu Lys Val Leu Ser Lys Gln 80
65 70 75 80
GAG ACC GAA GAC AGC AGC GGA AGA AAA AAG TGG GAG TAC GAG ACT GAC 288
Glu Thr Glu Asp Ser Arg Gly Arg Lys Lys Trp Glu Try Glu Thr Asp 96
85 90 95
CCA AGC GTT ACT AAG ATG GTG CGT GCC TCT GCG TCA TTT CAG GAT TTG 336
Pro Ser Val Thr Lys Met Val Arg Ala Ser Ala Ser Phe Gln Asp Leu 112
100 105 110
GGA GAG GAC GGG GAG ATT AAG TTT GAA GCA GTC GAG GGT GCA GTA GCG 384
Gly Glu Asp Gly Glu Ile Lys Phe Glu Ala Val Glu Gly Ala Val Ala 128
115 120 125
TTG GCG GAT CGC GCG AGT TCC TTC ATG GTT GAC AGC GAG GAA TAC AAG 432
Leu Ala Asp Arg Ala Ser Ser Phe Met Val Asp Ser Glu Glu Try Lys 144
130 135 140
ATT ACG AAC GTA AAG GTT CAC GGT ATG AAG TTT GTC CCA GTT GCG GTT480
Ile Thr Asn Val Lys Val His Gly Met Lys Phe Val Pro Val Ala Val 160
145 150 155 160
CCT CAT GAA TTA AAA GGG ATT GCA AAG GAG AAG TTT CAC TTC GTG GAA 528
Pro His Glu Leu Lys Gly Ile Ala Lys Glu Lys Phe His Phe Val Glu 176
165 170 175
GAC TCC CGC GTT ACG GAG AAT ACC AAC GGC CTT AAG ACA ATG CTC ACT 576
Asp Ser Arg Val Thr Glu Asn Thr Asn Gly Leu Lys Thr Met Leu Thr 192
180 185 190
GAG GAT AGT TTT TCT GCA CGT AAG GTA AGC AGC ATG GAG AGC CCG CAC 624
Glu Asp Ser Phe Ser Ala Arg Lys Val Ser Ser Met Glu Ser Pro His 208
l95 200 205
GAC CTT GTG GTA GAC ACG GTG GGT ACC GGT TAC CAC AGC CGT TTT GGT671
Asp Leu Val Val Asp Thr Val Gly Thr Gly Try His Ser Arg Phe Gly 224
210 215 220
TCG GAC GCA GAG GCT TCT GTG ATG CTG AAA AGG GCT GAT GGC TCT GAG 720
Ser Asp Ala Glu Ala Ser Val Met Leu Lys Arg Ala Asp Gly Ser Glu 240
225 230 235 240
CTG TCG CAC CGT GAG TTC ATC GAC TAT GTG ATG AAC TTC AAC ACG GTC 768
Leu Ser His Arg Glu Phe Ile Asp Try Val Met Asn Phe Asn Thr Val 256
245 250 255
CGC TAC GAC TAC TAC GGT GAT GAC GCG AGC TAC ACC AAT CTG ATG GCG 816
Arg Try Asp Try Try Gly Asp Asp Ala Ser Try Thr Asn Leu Met Ala 272
260 265 270
AGT TAT GGC ACC AAG CAC TCT GCT GAC TCC TGG TGG AAG ACA GGA AGA 864
Ser Try Gly Thr Lys His Ser Ala Asp Ser Trp Trp Lys Thr Gly Arg 288
275 280 285
GTG CCC CGC ATT TCG TGT GGT ATC AAC TAT GGG TTC GAT CGG TTT AAA 912
Val Pro Arg Ile Ser Cys Gly Ile Asn Try Gly Phe Asp Arg Phe Lys 304
290 295 300
GGT TCA GGG CCG GGA TAC TAC AGG CTG ACT TTG ATT GCG AAC GGG TAT 960
Gly Ser Gly Pro Gly Try Try Arg Leu Thr Leu Ile Ala Asn Gly Try 320
305 310 315 320
AGG GAC GTA GTT GCT GAT GTG CGC TTC CTT CCC AAG TAC GAG GGG AAC 1008
Arg Asp Val Val Ala Asp Val Arg Phe Leu Pro Lys Try Glu Gly Asn 336
325 330 335
ATC GAT ATT GGG TTG AAG GGG AAG GTG CTG ACC ATA GGG GGC GCG GAC 1056
Ile Asp Ile Gly Leu Lys Gly Lys Val Leu Thr Ile Gly Gly Ala Asp 352
340 345 350
GCG GAG ACT CTG ATG GAT GCT GCA GTT GAC GTG TTT GCC GAT GGA CAG 1104
Ala Glu Thr Leu Met Asp Ala Ala Val Asp Val Phe Ala Asp Gly Gln 368
355 360 365
CCT AAG CTT GTC AGC GAT CAA GCG GTG AGC TTG GGG CAG AAT GTC CTC 1152
Pro Lys Leu Val Ser Asp Gln Ala Val Ser Leu Gly Gln Asn Val Leu 384
370 375 380
TCT GCG GAT TTC ACT CCC GGC ACT GAG TAC ACG GTT GAG GTT AGG TTC 1200
Ser Ala Asp Phe Thr Pro Gly Thr Glu Try Thr Val Glu Val Arg Phe 400
385 390 395 400
AAG GAA TTC GGT TCT GTG CGT GCG AAG GTA GTG GCC CAG 1239
Lys Glu Phe Gly Ser Val Arg Ala Lys Val Val Ala Gln 413
405 410
<110>孙爱华
<120>一种检测梅毒血清抗体的rTpN15-17-47-ELISA的制备方法
<160>5
<170>WinBlast v.0.2.0
<210>4
<211>核苷酸30，氨基酸10
<212>DNA/PRT
<213>人工序列
<220>
<222>核苷酸序列(1)…(30)，氨基酸序列(1)…(10)
<223>用于连接梅毒螺旋体tpN15基因、tpN17基因和tpN47基因的柔性肽核苷酸序列和氨基酸序列
<400>1
GGC GGC GGT GGC AGC GGC GGC GGT GGC AGC 30
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 10
1 5 10
<110>孙爱华
<120>一种检测梅毒血清抗体的rTpN15-17-47-ELISA的制备方法
<160>5
<170>WinBlast v.0.2.0
<210>5
<211>核苷酸2049，氨基酸683
<212>DNA/PRT
<213>人工序列
<220>
<222>核苷酸序列(1)…(2073)，氨基酸序列(1)…(691)
<223>用柔性肽序列连接而成的梅毒螺旋体tpN15基因、tpN17基因和tpN 47的人工融合基因核苷酸序列
和氨基酸序列
<400>1
ATG AAT GGC ACG TAC CGG GCG ACG TAT CAG GAT TTT GAT GAG AAT GGT 48
Met Asn Gly Thr Try Arg Ala Thr Try Gln Asp Phe Asp Glu Asn Gly 16
1 5 10 15
TGG AAG GAC TTT CTC GAG GTT ACT TTT GAT GGT GGC AAG ATG GTG CAG 96
Trp Lys Asp Phe Leu Glu Val Thr Phe Asp Gly Gly Lys Met Val Gln 32
20 25 30
GTG GTT TAC GAT TAT CAG CAT AAA GAA GGG CGG TTT AAG TCC CAG GAC 144
Val Val Try Asp Try Gln His Lys Glu Gly Arg Phe Lys Ser Gln Asp 48
35 40 45
GCT GAC TAC CAT CGG GTC ATG TAT GCA TCC TCG GGC ATA GGT CCT GAA 192
Ala Asp Try His Arg Val Met Try Ala Ser Ser Gly Ile Gly Pr Glu 64
50 55 60
AAG GCC TTC AGA GAG CTC GCC GAT GCT TTG CTT GAA AAG GGT AAT CCC 240
Lys Ala Phe Arg Glu Leu Ala Asp Ala Leu Leu Glu Lys Gly Asn Pro 80
65 70 75 80
GAG ATG GTG GAT GTG GTC ACC GGT GCA ACT GTT TCT TCC CAG AGT TTC 288
Glu Met Val Asp Val Val Thr Gly Ala Thr Val Ser Ser Gln Ser Phe 96
85 90 95
AGG AGG TTG GGT GCT GCG CTT CTG CAG AGT GCG CGG CGC GGC GAG AAG 336
Arg Arg Leu Gly Ala Ala Leu Leu Gln Ser Ala Arg Arg Gly Glu Lys 112
100 105 110
GAA GCC ATT ATT AGC AGG GGC GGC GGT GGC AGC GGC GGC GGT GGC AGC 384
Glu Ala Ile Ile Ser Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 128
115 120 125
TGC ACA ACC GTG TGT CCG CAC GCC GGG AAG GCC AAA GCG GAA AAG GTA 432
Cys Thr Thr Val Cys Pro His Ala Gly Lys Ala Lys Ala Glu Lys Val 144
130 135 140
GAG TGC GCG TTG AAG GGA GGT ATC TTT CGG GGT ACG CTA CCT GCG GCC 480
Glu Cys Ala Leu Lys Gly Gly Ile Phe Arg Gly Thr Leu Pro Ala Ala 160
145 150 155 160
GAT TGC CCG GGA ATC GAT ACG ACT GTG ACG TTC AAC GCG GAT GGC ACT 528
Asp Cys Pro Gly Ile Asp Thr Thr Val Thr Phe Asn Ala Asp Gly Thr 176
165 170 175
GCG CAA AAG GTA GAG CTT GCC CTT GAG AAG AAG TCG GCA CCT TCT CCT 576
Ala Gln Lys Val Glu Leu Ala Leu Glu Lys Lys Ser Ala Pro Ser Pro 192
180 185 190
CTT ACG TAT CGC GGT ACG TGG ATG GTA CGT GAA GAC GGA ATT GTC GAA 624
Leu Thr Try Arg Gly Thr Trp Met Val Arg Glu Asp Gly Ile Val Glu 208
195 200 205
CTC TCG CTT GTG TCC TCG GAG CAA TCG AAG GCA CCG CAC GAG AAA GAG 672
Leu Ser Leu Val Ser Ser Glu Gln Ser Arg Ala Pro His Glu Arg Glu 224
210 215 220
CTG TAC GAG CTG ATA GAC AGT AAC TCC GTT CGC TAC ATG GGC GCT CCC 720
Leu Try Glu Leu Ile Asp Ser Asn Ser Val Arg Try Met Gly Ala Pro 240
225 230 235 240
GGC GCA GGA AAG CCT TCA AAG GAG ATG GCG CCG TTT TAC GTG CTC AAA 768
Gly Ala Gly Lys Pro Ser Lys Glu Met Ala Pro Phe Try Val Leu Lys 256
245 250 255
AAA ACA AAG AAA GGC GGC GGT GGC AGC GGC GGC GGT GGC AGC TCG TCT 816
Lys Thr Lys Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Ser 272
260 265 270
CAT CAT GAG ACG CAC TAT GGC TAT GCG ACG CTA AGC TAT GCG GAC TAC 864
His His Glu Thr His Try Gly Try Ala Thr Leu Ser Try Ala Asp Try 288
275 280 285
TGG GCC GGG GAG TTG GGG CAG AGT AGG GAC GTG CTT TTG GCG GGT AAT 912
Trp Ala Gly Glu Leu Gly Gln Ser Arg Asp Val Leu Leu Ala Gly Asn 304
290 295 300
GCC GAGG CGG AC CGC GCG GGG GAT CTC GAC GCA GGC ATG TTC GAT GCA 960
Ala Glu Ala Asp Arg Ala Gly Asp Leu Asp Ala Gly Met Phe Asp Ala 320
305 310 315 320
GTT TCT CGC GCA ACC CAC GGG CAT GGC GCG TTC CGT CAG CAA TTT CAG 1008
Val Ser Arg Ala Thr His Gly His Gly Ala Phe Arg Gln Gln Phe Gln 336
325 330 335
TAC GCG GTT GAG GTA TTG GGC GAA AAG GTT CTC TCG AAG CAG GAG ACC 1056
Try Ala Val Glu Val Leu Gly Glu Lys Val Leu Ser Lys Gln Glu Thr 352
340 345 350
GAA GAC AGC AGG GGA AGA AAA AAG TGG GAG TAC GAG ACT GAC CCA AGC 1104
Glu Asp Ser Arg Gly Arg Lys Lys Trp Glu Try Glu Thr Asp Pro Ser 368
355 360 365
GTT ACT AAG ATG GTG CGT GCC TCT GCG TCA TTT CAG GAT TTG GGA GAG 1152
Val Thr Lys Met Val Arg Ala Ser Ala Ser Phe Gln Asp Leu Gly Glu 384
370 375 380
GAC GGG GAG ATT AAG TTT GAA GCA GTC GAG GGT GCA GTA GCG TTG GCG 1200
Asp Gly Glu Ile Lys Phe Glu Ala Val Glu Gly Ala Val Ala Leu Ala 400
385 390 395 400
GAT CGC GCG AGT TCC TTC ATG GTT GAC AGC GAG GAA TAC AAG ATT ACG 1248
Asp Arg Ala Ser Ser Phe Met Val Asp Ser Glu Glu Try Lys Ile Thr 416
405 410 415
AAC GTA AAG GTT CAC GGT ATG AAG TTT GTC CCA GTT GCG GTT CCT CAT 1296
Asn Val Lys Val His Gly Met Lys Phe Val Pro Val Ala Val Pro His 432
420 425 430
GAA TTA AAA GGG ATT GCA AAG GAG AAG TTT CAC TTC GTG GAA GAC TCC 1344
Glu Leu Lys Gly Ile Ala Lys Glu Lys Phe His Phe Val Glu Asp Ser 448
435 440 445
CGC GTT ACG GAG AAT ACC AAC GGC CTT AAG ACA ATG CTC ACT GAG GAT 1392
Arg Val Thr Glu Asn Thr Asn Gly Leu Lys Thr Met Leu Thr Glu Asp 464
450 455 460
AGT TTT TCT GCA CGT AAG GTA AGC AGC ATG GAG AGC CCG CAC GAC CTT 1440
Ser Phe Ser Ala Arg Lys Val Ser Ser Met Glu Ser Pro His Asp Leu 480
465 470 475 480
GTG GTA GAC ACG GTG GGT ACC GGT TAC CAC AGC CGT TTT GGT TCG GAC 1488
Val Val Asp Thr Val Gly Thr Gly Try His Ser Arg Phe Gly Ser Asp 496
485 490 495
GCA GAG GCT TCT GTG ATG CTG AAA AGG GCT GAT GGC TCT GAG CTG TCG 1536
Ala Glu Ala Ser Val Met Leu Lys Arg Ala Asp Gly Ser Glu Leu Ser 512
500 505 510
CAC CGT GAG TTC ATC GAC TAT GTG ATG AAC TTC AAC ACG GTC CGC TAC 1584
His Arg Glu Phe Ile Asp Try Val Met Asn Phe Asn Thr Val Arg Try 528
515 520 525
GAC TAC TAC GGT GAT GAC GCG AGC TAC ACC AAT CTG ATG GCG AGT TAT 1632
Asp Try Try Gly Asp Asp Ala Ser Try Thr Asn Leu Met Ala Ser Try 544
530 535 540
GGC ACC AAG CAC TCT GCT GAC TCC TGG TGG AAG ACA GGA AGA GTG CCC 1680
Gly Thr Lys His Ser Ala Asp Ser Trp Trp Lys Thr Gly Arg Val Pro 560
545 550 555 560
CGC ATT TCG TGT GGT ATC AAC TAT GGG TTC GAT CGG TTT AAA GGT TCA 1728
Arg Ile Ser Cys Gly Ile Asn Try Gly Phe Asp Arg Phe Lys Gly Ser 576
565 570 575
GGG CCG GGA TAC TAC AGG CTG ACT TTG ATT GCG AAC GGG TAT AGG GAC 1776
Gly Pro Gly Try Try Arg Leu Thr Leu Ile Ala Asn Gly Try Arg Asp 592
580 585 590
GTA GTT GCT GAT GTG CGC TTC CTT CCC AAG TAC GAG GGG AAC ATC GAT 1824
Val Val Ala Asp Val Arg Phe Leu Pro Lys Try Glu Gly Asn Ile Asp 608
595 600 605
ATT GGG TTG AAG GGG AAG GTG CTG ACC ATA GGG GGC GCG GAC GCG GAG 1872
Ile Gly Leu Lys Gly Lys Val Leu Thr Ile Gly Gly Ala Asp Ala Glu 624
610 615 620
ACT CTG ATG GAT GCT GCA GTT GAC GTG TTT GCC GAT GGA CAG CCT AAG 1920
Thr Leu Met Asp Ala Ala Val Asp Val Phe Ala Asp Gly Gln Pro Lys 640
625 630 635 640
CTT GTC AGC GAT CAA GCG GTG AGC TTG GGG CAG AAT GTC CTC TCT GCG 1968
Leu Val Ser Asp Gln Ala Val Ser Leu Gly Gln Asn Val Leu Ser Ala 656
645 650 655
GAT TTC ACT CCC GGC ACT GAG TAC ACG GTT GAG GTT AGG TTC AAG GAA 2016
Asp Phe Thr Pro Gly Thr Glu Try Thr Val Glu Val Arg Phe Lys Glu 672
660 665 670
TTC GGT TCT GTG CGT GCG AAG GTA GTG GCC CAG CAC CAC CAC CAC CAC 2064
Phe Gly Ser Val Arg Ala Lys Val Val Ala Gln His His His His His 688
675 680 685
CAC CAC CAC 2073
His His His 691
690
Claims (8)
1.一种检测梅毒血清抗体的rTpN15-17-47-ELISA的制备方法，依次包括以下步骤：采用基因工程技术构建tpN15、tpN17和tpN47的人工融合基因tpN15-17-47及其原核表达系统E.coliBL21DE3pET42a-tpN15-17-47，提纯重组表达产物rTpN15-17-47为包被抗原，建立用于检测梅毒血清抗体的rTpN15-17-47-ELISA。
2.根据权利要求1所述的一种检测梅毒血清抗体的rTpN15-17-47-ELISA的制备方法，其特征在于所述的人工融合基因tpN15-17-47具有序列表5所示的核苷酸序列和氨基酸序列。
3.根据权利要求2所述的一种检测梅毒血清抗体的rTpN15-17-47-ELISA的制备方法，具体包含以下步骤：
1)梅毒螺旋体tpN15、tpN17和tpN47基因的克隆和测序；
2)人工融合基因tpN15-17-47及其原核表达系统构建和测序；
3)含IPTG的LB培养基中诱导重组蛋白抗原分子rTpN15-17-47表达，SDS-PAGE和BioRad凝胶图象分析系统确定重组表达产物rTpN15-17-47的表达情况和产量；
4)Ni-NTA亲和层析法提纯重组表达产物rTpN15-17-47；
5)rTpN15-17-47作为包被抗原的ELISA的建立。
4.根据权利要求3所述的一种检测梅毒血清抗体的rTpN15-17-47-ELISA的制备方法，其特征在于所述梅毒螺旋体tpN15、tpN17和tpN47基因的克隆方法分别是：
1)取离心沉淀的梅毒病人硬性下疳分泌物，用苯酚-氯仿提取、乙酸钠和无水乙醇沉淀获得基因组DNA；2)以梅毒螺旋体基因组DNA为模板，采用PCR分别扩增tpN15、tpN17和tpN47基因，各上下游引物序列中均分别设置限制性核酸内切酶位点NdeI和XhoI；3)PCR产物经电泳后，在紫外线下观察目的DNA扩增条带；4)采用PCR产物纯化试剂盒，先提取目的DNA扩增条带；然后采用T-A克隆试剂盒，用T4DNA连接酶将提纯的DNA条带与克隆质粒如pUC-M-T连接；5)取用大肠杆菌DH5α株，将其接种、培养，然后收集细菌沉淀，制备成感受态E.coli DH5α悬液；6)在上述感受态E.coli DH5α悬液中加入上述连接产物，加入SOC培养液培养；7)在LB琼脂平板上涂布接种上述SOC培养物；8)选取SOC培养物上的白色菌落在含LB培养液中培养，采用细菌质粒提取试剂盒进行质粒提取，提取的质粒进行NdeI和XhoI酶切、电泳分离，在紫外线下分别确认有目的DNA片段tpN15、tpN17和tpN47后，测定克隆片段的核苷酸序列，序列正确者即为重组质粒pUC-M-TtpN15、pUC-M-TtpN17或pUC-M-TtpN47。
5.根据权利要求4所述的一种检测梅毒血清抗体的rTpN15-17-47-ELISA的制备方法，其特征在于所述人工融合基因tpN15-17-47的制备方法是：1)上述含有重组质粒pUC-M-TtpN15、pUC-M-TtpN17或pUC-M-TtpN47的E.coli DH5α分别在LB培养液中培养后，采用细菌质粒提取试剂盒，分别提取E.coli DH5α中的重组质粒pUC-M-TtpN15、pUC-M-TtpN17或pUC-M-TtpN47；2)根据柔性肽核苷酸序列，设计分别扩增tpN15、tpN17或tpN47基因片段的引物，其中tpN15、tpN17基因下游引物含柔性肽正链序列，tpN17、tpN47基因上游引物含柔性肽负链序列，tpN15基因上游引物不含柔性肽序列但设置限制性核酸内切酶NdeI位点，tpN17基因下游引物不含柔性肽序列但设置限制性核酸内切酶XhoI位点，然后分别以重组质粒pUC-M-TtpN15、pUC-M-TtpN17或pUC-M-TtpN47为模板，采用PCR扩增出带有柔性肽序列的tpN15、tpN17和tpN47基因片段；3)各PCR产物经电泳分离后，在紫外线下确认分别有tpN15、tpN17或tpN47基因扩增片段后，采用PCR产物纯化试剂盒，提纯各目的扩增片段后测定各提取物DNA浓度；4)将提纯的tpN15基因扩增片段和提纯的tpN17基因扩增片段混合，加入除引物外的其它PCR试剂进行反应，利用柔性肽正、负链互补性形成tpN15-17复合模板，然后加入tpN15基因上游引物及tpN17基因下游引物进行PCR扩增；按上述方法进行PCR产物电泳分离、紫外线下观察、提纯tpN15-17扩增片段、测定提取物DNA浓度；5)将提纯的tpN15-17扩增片段与提纯的tpN47基因扩增片段混合，加入除引物外的其它PCR试剂进行反应，利用柔性肽正、负链互补性形成tpN15-17-47复合模板，然后加入tpN15基因上游引物及tpN47基因下游引物进行PCR扩增，按上述方法进行PCR产物电泳分离、紫外线下观察、提纯tpN15-17-47扩增片段；6)采用T-A克隆试剂盒，用T4DNA连接酶将提纯的tpN15-17-47片段与重组质粒连接，获得连接产物；6)E.coli DH5α接种于LB培养液中培养，离心收集细菌沉淀，制备成感受态E.coli DH5α悬液；7)在上述感受态E.coli DH5α悬液中加入上述连接产物，混匀后加入SOC培养液培养；8)在LB琼脂平板上分别用X-gal溶液、IPTG均匀涂布，然后涂布接种上述SOC培养物培养、观察；9)选取SOC培养物上的白色菌落在LB培养液中培养，采用细菌质粒提取试剂盒进行质粒提取，提取的质粒按上述方法进行NdeI和XhoI酶切、电泳分离，在紫外线下分别确认有目的DNA片段tpN15-17-47后，测定克隆片段的核苷酸序列；序列正确者即为含人工融合基因tpN15-17-47片段的重组质粒pUC-M-TtpN15-17-47。
6.根据权利要求5所述的一种检测梅毒血清抗体的rTpN15-17-47-ELISA的制备方法，其特征在于所述人工融合基因tpN15-17-47原核表达系统E.coliBL2IDE3pET42a-tpN15-17-47的制备方法是：1)含有重组质粒pUC-M-TtpN15-17-47的大肠杆菌E.coli DH5α在LB培养液中培养后，采用细菌质粒提取试剂盒，提取E.coli DH5α中的重组质粒pUC-M-TtpN15-17-47；2)提取的质粒用限制性核酸内切酶NdeI和XhoI酶切，酶切产物经电泳分离后，在紫外线下确认有目的DNA片段tpN15-17-47后，采用DNA胶回收试剂盒，切胶回收tpN15-17-47片段；3)原核表达载体pET42a用限制性核酸内切酶NdeI和XhoI酶切，酶切产物用电泳分离线性化的pET42a，采用DNA胶回收试剂盒，回收线性化pET42a片段；4)根据tpN15-17-47与线性化pET42a片段估计浓度，然后tpN15-17-47与线性化pET42a片段按3∶1的比例混合，加入连接酶T4DNA连接，获得连接产物；5)取用大肠杆菌BL21(DE3)，接种于LB培养液中培养，离心收集细菌沉淀，制备成感受态E.coli BL21DE3悬液；6)在上述感受态悬液中加入上述连接产物，再加入SOC培养液培养；7)在LB琼脂平板上涂布接种上述SOC培养物培养；8)挑取SOC培养物上的菌落在LB培养液中培养4-6h，采用细菌质粒提取试剂盒进行质粒提取，提取的质粒按上述方法进行NdeI和XhoI酶切、电泳分离后，在紫外线下确认有目的DNA片段tpN15-17-47，测定目的片段的核苷酸序列，序列正确者即为目的原核表达系统E.coliBL21DE3pET42a-tpN15-17-47。
7.根据权利要求6所述的一种检测梅毒血清抗体的rTpN15-17-47-ELISA的制备方法，其特征在于所述重组表达产物rTpN15-17-47的表达和提纯方法是：1)在LB液体培养液中接种E.coliBL21DE3pET42a-t9N15-17-47培养，加入IPTG继续培养；2)上述培养物离心、收集细菌沉淀用超声破碎，采用Ni-NTA亲和层析柱，将破碎产物过Ni-NTA柱，利用重组表达产物rTpN15-17-47羧基端8×His标签进行分离、洗脱、收集目的重组表达产物rTpN15-17-47。
8.根据权利要求7所述的一种检测梅毒血清抗体的rTpN15-17-47-ELISA的制备方法，其特征在于所述rTpN15-17-47-ELISA的建立包括以下步骤：1)用紫外分光光度法测定提纯的重组蛋白的浓度；2)抗原包被：用pH9.6、0.01mol/L碳酸盐缓冲液配制蛋白浓度为50μg/ml的重组蛋白溶液，96孔聚苯乙烯反应板每孔包被100μl，37℃温育2h后4℃过夜；次日以0.05％Tween20-0.01mol/L PBS(pH7.4)洗涤3次后用5％BSA封闭；3)分别以1∶800稀释的250例正常人血清为一抗，HRP标记羊抗人IgG为二抗，TMB为显色底物，终止反应后用BioRad酶标仪测定各孔OD450值，了解健康人血清OD450值范围并计算其OD450均值和SD值。
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