CN117486995A - Kncn蛋白在结核诊断试剂中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于结核病诊断领域，具体的涉及一种KNCN重组蛋白在结核诊断中的应用，所述KNCN重组蛋白有能够特异、高效的捕获多种结核抗原的特性，本发明利用KNCN蛋白可以同时捕获结核患者标本中几种或十几种结核抗原的性能，通过重组KNCN蛋白病表达纯化，以此来检测捕获结合抗原的能力。
Description
技术领域
本发明属于结核病诊断领域，具体的涉及一种KNCN蛋白在结核诊断试剂中的应用。
背景技术
结核病是由细胞内细菌病原体结核分枝杆菌引起的慢性传染病。由于结核分枝杆菌其独特的致病特点及流行和传播方式，特别是近年来耐药结核分枝杆菌的产生以及与人类免疫缺陷症病毒(HIV)的交叉感染等原因导致结核病的流行再度呈现上升趋势。结核分枝杆菌是一种胞内感染菌，它是最成功的病原体之一，已经进化出适应宿主细胞和逃避免疫监视的各种策略。结核分枝杆菌经过呼吸道进入人体后，主要在巨噬细胞内寄生，并采用多种策略逃避宿主细胞的免疫杀伤作用，其可以在巨噬细胞内长期存活并缓慢增殖。当宿主免疫力低下时，休眠的结核分枝杆菌可以被重新活化，导致机体发展为活动性结核病。感染结核分枝杆菌后病原体能在宿主体内长期潜伏或造成持续性感染，为该疾病的治疗和预防造成了极大的障碍。此外，现阶段结核病的治疗难点还在于多重耐药性和广泛耐药性结核病。结核病新药的匮乏以及结核分枝杆菌相关基础研究的不足是耐药性结核病治愈率低下的主要原因。因此，迫切需要寻找新的药物靶点，开发新的抗结核病药物来治疗结核病。
根据世界卫生组织2022年发布的《全球结核病报告》，全球每年新发结核病例约有1000万人，全球每年因结核病死亡的病例数约为140万人。目前结核病诊断仍面临多种技术困境，主要有以下几个方面：1)结核菌生长缓慢，培养需要耗时长。2)检测技术不够灵敏，检测方法不够可靠。3)成本高和易受到环境影响。4)诊断复杂性高,难于及时准确诊断。
结核病抗原检测方法已经发展多年，涵盖了多种检测方法，包括免疫层析试纸法、酶联免疫吸附法(ELISA)、化学发光法、荧光免疫分析法(FIA)等。这些抗原检测方法都基于在患者体液或组织中检测结核病抗原，具有快速、准确、灵敏的特点，但这些结核病抗原检测方法仍存在很大缺陷，其中一些试剂盒的敏感性和特异性仍然存在较大的误差，另外一些方法的价格较高，需要引进设备和技术培养，临床适用性差。因此，结核病抗原检测技术还需要进一步完善和发展，亟待开发一种高灵敏度、特异性好、使用方便、价格低廉的结核病抗原检测方法。
KNCN(kinocilin)蛋白是由124个氨基酸组成的一种人类蛋白质。它属于肌球蛋白超家族的一员，参与细胞内运输和分裂等生物过程。KNCN蛋白能够通过与微管结合并进行转动活动来驱动细胞内运输。KNCN蛋白在神经细胞中具有重要的作用，特别是在神经元轴突的生长和维持中。它能够将细胞器、RNA和其他重要分子沿着微管轨道进行运输，确保神经细胞正常的生理功能。此外，KNCN蛋白还参与细胞周期和细胞分裂过程，在有丝分裂中，它负责将染色体从一个细胞极向另一个移动，确保正常的染色体分离和细胞分裂。研究表明，KNCN蛋白功能异常与一些疾病的发生和发展密切相关，如神经系统疾病和癌症。因此，调节KNCN蛋白的活性将会对机体产生重要的影响，还可能在某些疾病的预防或治疗中发挥重要作用。调节KNCN蛋白活性的一个重要途径可以依靠通过能够与KNCN蛋白发生直接相互作用的蛋白质来实现。因此，能够与KNCN蛋白发生直接相互作用的蛋白质，将具有重要的药用价值，可开发为某些疾病预防或治疗的蛋白或多肽药物。
发明内容
本发明利用KNCN蛋白可以同时捕获结核患者标本中几种或十几种结核抗原的性能，通过重组KNCN蛋白并表达纯化，以此来检测捕获结核抗原的能力。
第一方面，本发明提供一种KNCN重组蛋白，所述KNCN重组蛋白具有捕获结核杆菌抗原的性能，所述KNCN重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，
SEQ ID NO.1：
MDIPISSRDFRGLQLACVALGLVAGSIIIGISVSKAAAAMGGVFIGAAVLGLLILAYPFL KARFNLDHILPTIGSLRIHPHPGADHGEGRSSTNGNKEGARSSLSTVSRTLEKLKPGTRGA EEC。
第二方面，本发明提供一种KNCN重组蛋白的制备方法，所述方法包括如下步骤：
S1.获得KNCN蛋白的核苷酸序列，所述核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，
S2.在特定载体上装入步骤S1获得的核苷酸序列，构建重组质粒，
S3.步骤S2构建的重组质粒转染到菌株进行表达，获得本发明的重组蛋白；
本发明的KNCN重组蛋白具有捕获结核抗原的作用，
SEQ ID NO.2：
GGATCCATGGACATCCCCATCAGCAGCAGAGACTTCCGCGGCCTGCAGCTGGCCTGCGTGGCTCTCGGGCTGGTGGCTGGCAGCATCATTATCGGCATCTCCGTATCCAAGGCTGCAGCTGCCATGGGCGGTGTCTTTATTGGCGCTGCTGTTCTGGGGCTCCTCATCTTGGCCTACCCCTTCCTGAAGGCTCGGTTCAACCTGGACCACATCCTGCCTACCATAGGGAGCCTAAGAATCCATCCCCATCCAGGGGCAGACCACGGGGAAGGAAGATCCAGCACCAATGGCAACAAGGAAGGAGCCCGCAGCAGCCTGTCCACCGTGAGCAGGACCCTGGAGAAGCTGAAGCCGGGGACCCGGGGGGCTGAGGAATGCTGAGAATTC。
进一步的，所述载体包括但不限于pET-28a、pET-30a、pET-22b、pET-24a、pET-32c中的一种或多种，优选pET-28a。
进一步的，所述菌株选自E.coli BL21(DE3)。
第三方面，本发明提供一种检测结核杆菌的试剂盒，所述试剂盒包含检测结核杆菌的试剂和说明书，所述试剂进一步包含KNCN重组蛋白，所述KNCN重组蛋白具有捕获结核杆菌抗原的性能。
第四方面，本发明提供一种如第一方面所述的KNCN重组蛋白在制备检测结核抗原的试剂盒中的用途，所述KNCN重组蛋白具有捕获结核杆菌抗原的性能。
进一步的，所述结核抗原选自Rv0956、Rv1392、Rv1926c、Rv2232、Rv2892c中的一种或多种。
有益效果：
KNCN重组蛋白有能够特异、高效的捕获多种结核抗原的特性，可以通过KNCN重组蛋白高效、特异的捕获样本中结核抗原来提高结核病的检测灵敏度和特异性。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为可通过常规的商业途径购买得到。
捕获：蛋白间发生直接相互作用时，可以较为牢固的结合在一起，即也可描述为一种蛋白捕获另一种蛋白，此类蛋白间发生相互作用时主要依靠以下几种非共价作用力结合在一起：(1)静电相互作用力：带电氨基酸残基之间的相互作用。(2)范德华力：非极性氨基酸残基之间的短程吸引力。(3)疏水作用：非极性残基在水中聚集形成疏水核心，形成亲疏水相互作用。(4)氢键：极性残基之间的氢键相互作用。
重组蛋白：重组蛋白即为要保护的主体--配体蛋白，如果要实际应用必需要有相应的配体蛋白，自然界没有现成的配体蛋白，只能靠制备(通过重组表达的方法来获得相关的配体蛋白)，这是实际应用中重要的一部分。
结核抗原：可以作为结核病病原学的直接证据而用于结核病的诊断和确诊，同时患者机体被结核分枝杆菌感染后，体内首先会出现结核抗原，并伴随病程的发展而存在于患者体内，而结核抗原检测不受宿主免疫功能状态的影响，可以作为结核分枝杆菌存在的直接证据而进行诊断和确诊，避免了由于结核菌的抗原性较弱或结核病患者免疫应答低下而导致的体液免疫检测或细胞免疫检测的假阴性，患者体内结核抗原量的多寡还可以直接反映其疾病程度。
实施例1：KNCN蛋白编码基因的合成和重组质粒的构建
获得KNCN蛋白的核苷酸序列，装入载体pET-28a，随后经测序鉴定证实pET-28a-KNCN蛋白表达质粒成功构建，序列为SEQ ID NO.2所示。
SEQ ID NO.2：
GGATCCATGGACATCCCCATCAGCAGCAGAGACTTCCGCGGCCTGCAGCTGGCCTGCGTGGCTCTCGGGCTGGTGGCTGGCAGCATCATTATCGGCATCTCCGTATCCAAGGCTGCAGCTGCCATGGGCGGTGTCTTTATTGGCGCTGCTGTTCTGGGGCTCCTCATCTTGGCCTACCCCTTCCTGAAGGCTCGGTTCAACCTGGACCACATCCTGCCTACCATAGGGAGCCTAAGAATCCATCCCCATCCAGGGGCAGACCACGGGGAAGGAAGATCCAGCACCAATGGCAACAAGGAAGGAGCCCGCAGCAGCCTGTCCACCGTGAGCAGGACCCTGGAGAAGCTGAAGCCGGGGACCCGGGGGGCTGAGGAATGCTGAGAATTC。
实施例2：KNCN蛋白重组蛋白的表达与纯化
将构建成功重组质粒pET-28a-KNCN蛋白转染到E.coli BL21(DE3)表达重组蛋白。在IPTG诱导下，重组质粒转化菌成功表达了KNCN蛋白重组蛋白。经Ni-NTA-His柱亲和纯化后，获得了高纯度蛋白，相对分子量约为15kDa，符合预期大小。所述KNCN重组蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示。
SEQ ID NO.1：
MDIPISSRDFRGLQLACVALGLVAGSIIIGISVSKAAAAMGGVFIGAAVLGLLILAYPFL KARFNLDHILPTIGSLRIHPHPGADHGEGRSSTNGNKEGARSSLSTVSRTLEKLKPGTRGA EEC。
经BCA法测定，KNCN蛋白浓度为1.128mg/mL。具体如下：
1)将含pET-28a-KNCN蛋白表达质粒的E.coli BL21(DE3)菌株接种到5ml含相应抗性的LB液体培养基中，37℃，200rpm培养。
2)次日，菌种以1：100接入500mL LB液体培养基(卡那霉素浓度50μg/mL)，37℃培养至OD＝0.4-0.6，加入浓度为0.8mM的IPTG，25℃诱导表达12h，12000rpm、4℃离心15min，收集菌体。
3)将诱导后的菌液，6000rpm离心10min，弃上清，沉淀用200ml 500mM NaCl 20mMPBS pH8.0 buffer重悬。
4)将重悬后的菌超声破碎，然后12000rpm离心10min，取上清待用。
5)将处理好的Ni柱(GE)用5倍体积以上的Binding buffer(500mMNaCl 20mM PBSpH8.0)平衡柱子流速1-1.5ml/min，并调整好紫外检测仪的基线。
6)将处理好的样品上样，流速1ml/min。并收集流穿，上样结束后再用Bindingbuffer(500mM NaCl 20mM PBS pH8.0)将紫外检测仪的吸收值洗至基线。
7)用Washingbuffer(500mM NaCl 20mM PBS pH8.0 20mM咪唑)洗脱并收集洗脱峰。
8)用Elution buffer(500mM NaCl 20mM PBS pH8.0 60mM咪唑)洗脱并收集洗脱峰。
9)用Elutionbuffer(500mM NaCl 20mM PBS pH8.0 300mM咪唑)洗脱并收集洗脱峰。
10)将咪唑洗脱组分用20mM PBS pH8.0的缓冲液透析，透析后获得纯化的重组蛋白KNCN蛋白，采用BCA测定其蛋白浓度。
重组蛋白KNCN蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，
SEQ ID NO.1：
MDIPISSRDFRGLQLACVALGLVAGSIIIGISVSKAAAAMGGVFIGAAVLGLLILAYPFL KARFNLDHILPTIGSLRIHPHPGADHGEGRSSTNGNKEGARSSLSTVSRTLEKLKPGTRGA EEC。
实施例3质谱法鉴定KNCN重组蛋白捕获的结核抗原
利用KNCN重组蛋白能够特异、高效捕获多种结核抗原的特性，构建重组蛋白捕获法来检测患者样本中结核抗原。KNCN重组蛋白特异、高效捕获的多种结核抗原，利用生物质谱法鉴定KNCN重组蛋白所捕获的结核抗原。
具体鉴定KNCN重组蛋白所捕获的结核抗原方法如下：
(1)KNCN重组蛋白的包被用包被液(0.05mol/LpH9.6的碳酸盐缓冲液)把KNCN重组蛋白稀释为4μg/ml，将稀释好的包被液于每个酶标板孔中加入100μl。把酶标板置入湿盒内，于4℃包被过夜。
(2)洗板移除酶标板孔中液体，随后用洗涤缓冲液(含0.05％Tween-20的0.15mol/LpH 7.4PBS)加满所有酶标孔，除去洗涤液，再用吸水纸包住扣干，洗板2次。
(3)封闭在酶联板上每孔加入250μl封闭液(pH9.6，0.05mol/L碳酸盐缓冲液含2.0％BSA)，酶标板置于湿盒内，37℃孵育2h。
(4)洗板移除封闭液，洗涤2次操作方法同上。
(5)加结核患者样本孵育在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液70μl，然后再加待测样品30μl。加样时将样品加入酶标板孔的底部，尽量不触及孔壁。37℃孵育1.5h。
(6)洗板移除酶标板孔中样本液，洗涤3次操作方法同上。
(7)质谱鉴定样本的制备将适量的质谱分析级胰蛋白酶液加入酶标板孔，37℃消化过夜，过夜后，加入终浓度0.1％的FA(甲酸)终止消化。
(8)取10ul样本上机，使用液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS，华大蛋白质研发中心有限公司)进行检测，利用MASCOT数据库(http://www.matrixscience.com/)中对检测获得质谱数据进行检索分析，鉴定出的结核抗原有：Rv0956、Rv1392、Rv1926c、Rv2232、Rv2892c。
实施例4用于检测结核分枝杆菌抗原的方法
利用KNCN重组蛋白能够特异、高效捕获多种结核抗原的特性，创建配体蛋白捕获法来检测结核抗原，即利用KNCN重组蛋白包被酶标板，封闭后洗脱；接着加入结核患者样本，孵育后洗脱，此时KNCN重组蛋白捕获样本中特定的结核抗原；再加入结核抗体(HRP酶标记)，孵育后洗脱；随后加入HRP酶底物显色，如果显色结果判定为阳性则提示为结核感染，否则为结核阴性。该方法为检测结核分枝杆菌感染的方法的一种，但不仅仅限于此种检测方法，亦可采用其他检测方法如荧光试纸条检测法或胶体金试纸条检测法等。具体样本中结核抗原的检测方法如下：
1.用于结核分枝杆菌抗原的检测试剂：
抗原包被液(0.05mol/LpH9.6的碳酸盐缓冲液)、洗涤缓冲液(含0.05％Tween-20的0.15mol/LpH 7.4PBS)、封闭液(含2％BSA的0.05mol/LpH9.6的碳酸盐缓冲液)、稀释液(含0.1％BSA的洗涤缓冲液)、1:1000稀释的HRP标记的兔抗结核IgG抗体(货号ab21189，购买自上海优宁维生物科技股份有限公司)、阳性血清、阴性血清、TMB-H2O2底物显色液[含TMB(四甲基联苯胺)的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液(pH5.5)]、2mol/L硫酸终止液。
2.用于结核分枝杆菌抗原的检测方法
(1)抗原包被用包被液把KNCN重组蛋白稀释为4μg/ml，将稀释好的抗原液于每个酶标板孔中加入100μl。把酶标板置入湿盒内，于4℃包被过夜。
(2)洗板移除酶标板孔中液体，随后用洗涤液加满所有酶标孔，除去洗涤塔液，再用吸水纸包住扣干，洗板2次。
(3)封闭在酶联板上每孔加入250μl封闭液(pH9.6，0.05mol/L碳酸盐缓冲液含2.0％BSA)，将酶联板置于湿盒内，37℃孵育2h。
(4)洗板移除封闭液，洗涤2次，操作方法同上。
(5)加样本孵育在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液90μl，然后再加待测样品10μl(样品最终稀释度为10倍)。加样时将样品加入酶标板孔的底部，尽量不触及孔壁。37℃孵育1.5h。
(6)洗板移除酶标板孔中样本液，洗涤3次操作方法同上。
(7)加酶标抗体孵育用抗体稀释液稀释酶标抗体(1:1000稀释)，将稀释后的酶标抗体每孔加入100μl，空白孔除外。37℃湿盒内孵育1h。
(8)洗板移除酶标抗体液，洗涤3次操作方法同上。
(9)显色每孔加入显色液100μl，轻轻震荡混匀，室温避光显色10～20分钟。
(10)终止显色完成后，每孔加终止液50μl，终止反应(此时蓝色立转黄色)。
(11)测定迅速用酶标仪450nm波长测定酶标板各孔的吸光度(OD值)。测定应在加终止液后20分钟以内进行。
实施例5用于检测结核分枝杆菌感染
采用上述方法制备的用于结核分枝杆菌的检测试剂按照上述检测方法分别检测110份活动性结核病人的血清以及37份健康人的血清；以结核分枝杆菌核酸(PCR)检测102份
活动性结核病人样本作为对比，检测结果如表1所示。
表1不同检测方法检测结核病人的阳性率
由表1的结果可以看出，本发明用于结核分枝杆菌抗原的检测方法检测结核病人血清中结核抗原的敏感性为69.09％，明显高于结核分枝杆菌核酸(PCR)检测方法的54.9％。本检测方法的特异性为91.9％(1-8.11％＝91.9％)。
Claims (9)
1.一种KNCN重组蛋白，所述KNCN重组蛋白具有捕获结核杆菌抗原的性能，所述KNCN重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，
SEQ ID NO.1：
MDIPISSRDFRGLQLACVALGLVAGSIIIGISVSKAAAAMGGVFIGAAVLGLLILAYP FLKARFNLDHILPTIGSLRIHPHPGADHGEGRSSTNGNKEGARSSLSTVSRTLEKLKPGT RGAEEC。
2.一种KNCN重组蛋白的制备方法，所述方法包括如下步骤：
S1.获得KNCN蛋白的核苷酸序列，所述核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，
S2.在特定载体上装入步骤S1获得的核苷酸序列，构建重组质粒，
S3.步骤S2构建的重组质粒转染到菌株进行表达，获得本发明的重组蛋白；
本发明的KNCN重组蛋白具有捕获结核抗原的作用，
SEQ ID NO.2：
GGATCCATGGACATCCCCATCAGCAGCAGAGACTTCCGCGGCCTGCAGCTGGCCTGCGTGGCTCTCGGGCTGGTGGCTGGCAGCATCATTATCGGCATCTCCGTATCCAAGGCTGCAGCTGCCATGGGCGGTGTCTTTATTGGCGCTGCTGTTCTGGGGCTCCTCATCTTGGCCTACCCCTTCCTGAAGGCTCGGTTCAACCTGGACCACATCCTGCCTACCATAGGGAGCCTAAGAATCCATCCCCATCCAGGGGCAGACCACGGGGAAGGAAGATCCAGCACCAATGGCAACAAGGAAGGAGCCCGCAGCAGCCTGTCCACCGTGAGCAGGACCCTGGAGAAGCTGAAGCCGGGGACCCGGGGGGCTGAGGAATGCTGAGAATTC。
3.如权利要求2所述的一种KNCN重组蛋白的制备方法，其特征在于，所述载体选自pET-28a、pET-30a、pET-22b、pET-24a、pET-32c中的一种或多种。
4.如权利要求2所述的一种KNCN重组蛋白的制备方法，其特征在于，所述载体选自pET-28a。
5.如权利要求2所述的一种KNCN重组蛋白的制备方法，其特征在于，所述菌株选自E.coli BL21(DE3)。
6.如权利要求2-5任一项所述KNCN重组蛋白的制备方法，其中，所述KNCN重组蛋白捕获的结核抗原可以通过生物质谱法来鉴定。
7.一种检测结核杆菌的试剂盒，所述试剂盒包含检测结核杆菌的试剂和说明书，所述试剂进一步包含KNCN重组蛋白，所述KNCN重组蛋白具有捕获结核杆菌抗原的性能，所述KNCN重组蛋白捕获的结核抗原可以通过生物质谱法来鉴定。
8.一种如权利要求1所述的KNCN重组蛋白在制备检测结核抗原的试剂盒中的用途，所述KNCN重组蛋白具有捕获结核杆菌抗原的性能。
9.如权利要求8所述的KNCN重组蛋白在制备检测结核抗原的试剂盒中的用途，其特征在于，所述结核抗原选自Rv0956、Rv1392、Rv1926c、Rv2232、Rv2892c中的一种或多种。
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