CN115598355A - 测定外泌体含量的检测方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本申请提供一种测定外泌体含量的检测方法及应用。其中，所述方法包括：制备包含外泌体的待测样品溶液；利用TIM4蛋白包被酶标板；在包被完成的酶标板中加入待测样品溶液；在包含外泌体的酶标板中加入浓度最低为1:6000、包含抗人CD63一抗抗体的一抗溶液；加入包含被辣根过氧化物酶标记的二抗抗体的二抗溶液；加入显色液、显色终止液；通过选用第一波长的测试光波的酶标仪检测吸光度；根据吸光度的检测结果并通过吸光度‑外泌体个数的函数，计算酶标板中外泌体的个数。通过对外泌体灵敏度更高、浓度更低的CD63一抗结合外泌体，使得最终检测准确度以及检测效率更高，并且还可降低检测成本。
Description
技术领域
本申请涉及生物技术检测技术领域，尤其涉及一种测定外泌体含量的检测方法及应用。
背景技术
外泌体是直径在30-150nm的细胞外囊泡，由几乎所有的细胞分泌。外泌体通过运输其携带的蛋白质、脂质和核酸等物质，在细胞之间的通讯中发挥着重要作用。近年来，对于外泌体的研究日益丰富。外泌体的检测在外泌体的研究及应用中有很重要的作用。例如，对不同来源及不同处理方式的外泌体数量进行对比分析；支持药效药理分析评价；质量控制等。传统的蛋白免疫印迹实验方法费时费力，需要两天的实验时间且不能实现对外泌体高效定量；纳米粒子追踪分析与纳米流式仪的设备价格昂贵，难以普及频繁使用；BCA蛋白浓度检测只能测定样本中的总蛋白量，不能实现针对外泌体的浓度的鉴定。因此，越来越多的人采用酶联免疫吸附测定ELISA进行外泌体的定量检测。通过酶联免疫吸附测定进行外泌体的定量检测时，通常将CD63、CD81等特异性蛋白作为一抗的抗体。
在实现现有技术的过程中，发明人发现：
采用相同浓度的CD63与CD81进行外泌体的特异性结合，其对外泌体的结合效率有着较大的差异。即，相同条件下，CD63与CD81对外泌体有着不同的灵敏度。相同条件下，若选用对外泌体灵敏度交底的标志蛋白作为一抗，将进一步影响到酶联免疫吸附测定的检测结果，使其准确度降低。选用对外泌体灵敏度交底的标志蛋白作为一抗，需要提高一抗溶液的浓度，增大了检测成本。
因此，需要提供一种能够提高酶联免疫吸附测定结果准确度且检测成本低的技术方案。
发明内容
本申请实施例提供一种测定外泌体含量的检测方法及应用，用以解决酶联免疫吸附测定中，用于结合外泌体的一抗抗体灵敏度低导致检测结果准确度差的技术问题。
具体的，一种测定外泌体含量的检测方法，包括：
制备包含外泌体的待测样品溶液；
利用TIM4蛋白溶液进行酶标板的包被，得到被TIM4蛋白包被的酶标板；
在所述被TIM4蛋白包被的酶标板中加入所述待测样品溶液，通过包被于酶标板的TIM4蛋白捕获所述待测样品溶液中的外泌体，得到包含第一个数数量外泌体的酶标板；
在所述包含第一个数数量外泌体的酶标板中，加入浓度最低为1:6000、包含抗人CD63一抗抗体的一抗溶液，得到结合有抗人CD63一抗抗体的酶标板；
在所述结合有抗人CD63一抗抗体的酶标板中，加入具有第一浓度值、包含被辣根过氧化物酶标记的二抗抗体的二抗溶液，得到结合有被辣根过氧化物酶标记的二抗抗体的酶标板；
在所述结合有被辣根过氧化物酶标记的二抗抗体的酶标板中，加入显色液，进行辣根过氧化物酶与显色液的显色反应；
当所述显色反应持续第一时长后，在显色完成后的酶标板中加入显色终止液，以终止所述显色反应；
通过选用第一波长的测试光波的酶标仪，检测显色终止后的酶标板的吸光度；
根据所述吸光度的检测结果，并通过吸光度-外泌体个数的函数，计算酶标板中外泌体的个数。
进一步的，在所述包含第一个数数量外泌体的酶标板中，加入浓度最低为1:6000、包含抗人CD63一抗抗体的一抗溶液，具体包括：
在所述包含第一个数数量外泌体的酶标板中，加入浓度为1:6000、包含抗人CD63一抗抗体的一抗溶液。
进一步的，加入具有第一浓度值、包含被辣根过氧化物酶标记的二抗抗体的二抗溶液，具体包括：
加入浓度最低为1:2000的第一浓度值、包含被辣根过氧化物酶标记的二抗抗体的二抗溶液。
进一步的，加入浓度最低为1:2000的第一浓度值、包含被辣根过氧化物酶标记的二抗抗体的二抗溶液，具体包括：
加入浓度为1:2000的第一浓度值、包含被辣根过氧化物酶标记的二抗抗体的二抗溶液。
进一步的，利用TIM4蛋白溶液进行酶标板的包被，得到被TIM4蛋白包被的酶标板，具体包括：
在酶标板中加入TIM4蛋白溶液，以进行TIM4蛋白与酶标板的结合，得到结合有TIM4蛋白的酶标板；
在所述结合有TIM4蛋白的酶标板中加入含有与TIM4蛋白不相关的蛋白的封闭液，进行酶标板的封闭。
进一步的，在所述方法还包括：
当所述吸光度的检测结果高于预设的第一阈值时，对所述待测样品溶液执行稀释操作。
进一步的，通过选用第一波长的测试光波的酶标仪，检测显色终止后的酶标板的吸光度，具体包括：
通过选用第一波长为450nm的测试光波的酶标仪，检测显色终止后的酶标板的吸光度。
进一步的，制备包含外泌体的待测样品溶液，具体包括：
制备包含来源于人脐带间充质干细胞的外泌体的待测样品溶液。
本申请实施例还提供一种测定外泌体含量的检测方法在酶联免疫吸附测定试剂盒中的应用。
本申请实施例提供的技术方案，至少具有如下有益效果：
通过选用浓度低、灵敏度高的CD63标志蛋白作为一抗抗体进行外泌体的特异性结合，能够实现利用低浓度CD63的一抗溶液达到较高的检测准确度。这样，在保证外泌体定量检测结果的准确度的同时，还可以降低检测成本。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本申请的进一步理解，构成本申请的一部分，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。在附图中：
图1为本申请实施例提供的一种测定外泌体含量的检测方法的流程示意图。
图2为本申请实施例提供的一种吸光度-外泌体个数的曲线对比图。
具体实施方式
为使本申请的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本申请具体实施例及相应的附图对本申请技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
可以理解的是，进行外泌体含量的检测，能够为药效药理分析评价、质量控制等方面提供有力的支持。目前，进行外泌体含量的检测，可以通过蛋白免疫印迹实验方法、纳米粒子追踪分析、BCA蛋白浓度检测等方法。但是，蛋白免疫印迹方需要两天的实验时间，且不能实现对外泌体高效定量，费时费力；纳米粒子追踪分析与纳米流式仪的设备价格昂贵，难以普及频繁使用；BCA蛋白浓度检测只能测定样本中的总蛋白量，不能实现针对外泌体的浓度的鉴定。因此，越来越多的人采用简便、高效的酶联免疫吸附测定ELISA进行外泌体的定量检测。
实际应用中，可以通过双抗体夹心酶联免疫吸附测定ELISA法进行外泌体含量的检测。采用此方法时，在将外泌体捕获之后，需要将能够与其特异性结合的蛋白作为一抗抗体，并利用被相关酶标记的、能够与一抗抗体结合的二抗抗体进行一抗抗体的结合。之后，在二抗抗体标记酶的催化下，显色液开始显色。加入终止液，显色结束。通过酶标仪，并在一定的波长下即可测得相应酶标板的吸光度。吸光度的测量结果可以用光密度OD（Opticaldensity，简称OD）值表示。根据OD值测量结果，即可确定外泌体的含量。这样，无需借助昂贵的实验仪器即可完成对外泌体的定量检测，且操作较为简便。
目前往往采用CD63与CD81这两种标志蛋白作为一抗抗体，以进行外泌体的特异性结合。但是，相同条件下，CD63与CD81对外泌体有着不同的灵敏度。相同条件下，若选用对外泌体灵敏度交底的标志蛋白作为一抗，将直接影响最终被成功结合的外泌体数量，从而影响到酶联免疫吸附测定的检测结果，使其准确度降低。并且，选用对外泌体灵敏度交底的标志蛋白作为一抗，需要提高一抗溶液的浓度，无疑增大了检测成本。因此，需要选用合适的一抗抗体，以提高酶联免疫吸附测定结果准确度并且检测成本低的技术方案。
具体的，请参照图1，为本申请实施例提供的一种测定外泌体含量的检测方法，包括：
S100：制备包含外泌体的待测样品溶液。
可以理解的是，外泌体是由细胞内多泡体与细胞膜融合后，释放到细胞外基质中的膜性囊泡。几乎所有类型的细胞，都可以产生并释放外泌体。外泌体是一种直径为30-150nm的纳米级脂质包裹体结构。外泌体天然存在于人类和动作的体液中，包括血液、唾液、尿液和母乳，被分泌出的外泌体会进入血液、唾液、尿液、及乳汁等体液中，通过循环系统到达其他细胞与组织，产生远程调控作用。外泌体主要有蛋白质、核酸、脂质这三大组成部分。外泌体中的蛋白可分为膜蛋白与膜内蛋白。需要指出的是，膜蛋白中存在着一类所有外泌体均含有的蛋白。这类蛋白可作为外泌体区别于其他囊泡的标志物，如CD9、CD63、CD81、CD326等蛋白。
还可以理解的是，进行外泌体含量的测定，首先需要得到包含外泌体的待测样品。首先，需要将外泌体从相应的细胞/体液内提取出来。进行外泌体的提取，可以通过超速离心、过滤离心、密度梯度离心、免疫磁珠法、磷脂酰丝氨酸PS亲合法、色谱法、微流控分离法等方法。之后，即可根据实际需要制备相应的浓度的、包含外泌体的待测样品溶液，并进行外泌体含量的检测。
通过对外泌体含量的检测，有助于开展外泌体相关的药物筛选、对外泌体药物浓度鉴定、以获得外泌体为目的的优化细胞培养方案等研究工作。例如，通过检测来源于禽类的外泌体含量，可以辅助禽类疾病的研究以及病毒防控；通过检测膀胱癌患者尿液中外泌体的含量，可以进行癌症的无创诊断分析。由此可知，进行外泌体含量的测定，具有极高的应用价值。
进一步的，在本申请提供的一种优选实施方式中，制备包含外泌体的待测样品溶液，具体包括：制备包含来源于人脐带间充质干细胞的外泌体的待测样品溶液。
需要指出的是，与其他来源的间充质干细胞相比，来源于脐带的间充质干细胞具有采集方便、免疫原性低、自我更新快、倍增速度稳定和增殖能力强等特点，更适合用于临床研究和应用。而来源于人脐带间充质干细胞的外泌体具有低免疫原性、强大的组织修复和免疫调节作用，并且拥有更显著的安全性，对肾脏和肝脏也没有不良影响。因此，本申请优选地测定来源于人脐带间充质干细胞的外泌体含量。这样，便于获取相关的细胞，从而能够根据测量结果进行适用于相关疾病的药物的研究或细胞培养。例如，脐带间充质干细胞的外泌体在体外和体内，对抗癌化疗药物顺铂诱导的肾毒性具有治疗作用，通过检测来源于人脐带间充质干细胞的外泌体含量，可以用于适用于肾脏疾病药物的药理研究。又或者，可以通过检测来源于人脐带间充质干细胞的外泌体含量，进行阿尔茨海默病的病例研究。
在本申请提供的一种具体实施方式中，制备包含来源于人脐带间充质干细胞的外泌体的待测样品溶液，具体操作步骤为：
将脐带间充质干细胞的细胞培养的上清，用1000 rpm 转速离心5 min，以去除死细胞；
之后，用3000 rpm转速离心5 min，以去除细胞碎片；
用7000×g的离心力离心30 min后，取出一定体积，并再加入终浓度为2 mM的CaCl2溶液。
这样，制得不含死细胞以及细胞碎片的待测样品溶液。之后，即可进行外泌体的双抗体夹心酶联免疫吸附ELISA检测。
S200：利用TIM4蛋白溶液进行酶标板的包被，得到被TIM4蛋白包被的酶标板。
这里的TIM4蛋白是T细胞免疫球蛋白和粘蛋白结构域蛋白4的简称。TIM4蛋白与磷脂酰丝氨酸有极高的亲和力作用。因此，本申请利用TIM4蛋白与磷脂酰丝氨酸之间的强亲和力，选用TIM4蛋白作为捕获外泌体的受体，以实现外泌体的高灵敏度检测。酶标板是在酶联免疫吸附测定中，参与反应的抗原、抗体、标记抗体的固相载体，对抗原、抗体或抗原抗体复合物的吸附起着重要作用。即，可以将抗原、抗体或抗原抗体复合物吸附于表面。酶标板可以由聚乙烯、聚丙烯、聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚碳酸酯等材料制成。但在酶联免疫吸附检测中，一般采用由吸附性能好、空白值低的聚苯乙烯材料制成的酶标板。利用TIM4蛋白溶液进行酶标板的包被，即通过酶标板的吸附作用将TIM4蛋白吸附于其表面，以进行后续的酶联免疫吸附检测。具体的，需要在一定温度下执行TIM4蛋白在酶标板中的孵育操作，以将TIM4蛋白包被于酶标板，并使TIM4蛋白与酶标板之间具有最佳的结合力。
进一步的，在本申请提供的一种优选实施方式中，利用TIM4蛋白溶液进行酶标板的包被，得到被TIM4蛋白包被的酶标板，具体包括：在酶标板中加入TIM4蛋白溶液，以进行TIM4蛋白与酶标板的结合，得到结合有TIM4蛋白的酶标板；在所述结合有TIM4蛋白的酶标板中加入含有与TIM4蛋白不相关的蛋白的封闭液，进行酶标板的封闭。
在酶标板中加入TIM4蛋白溶液进行TIM4蛋白与酶标板的结合，可以理解为TIM4蛋白在酶标板中的孵育。酶标板的封闭可以理解为通过封闭液中的相关成分将酶标板中未被TIM4蛋白包被的区域填充，以防止后续的检测过程中酶标板继续吸附会对检测有干扰的物质。可以理解的是，当在酶标板中加入的TIM4蛋白溶液浓度较高时，足以将酶标板完全包被，可以不进行酶标板的封闭。但是，这对于TIM4蛋白溶液有较高的浓度要求。因此，为了避免酶联免疫吸附检测过程中，其他物质的干扰，本申请优选地对酶标板进行了封闭。封闭液可以选用与包被蛋白不相关的其它蛋白，例如可以选用牛血清蛋白。在实际应用中，还可以选用明胶进行酶标板的封闭。
需要说明的是，本申请选用37℃-40℃的温度进行在酶标板上孵育抗体，主要是考虑到抗体的结合效率。经试验，在37℃-40℃的温度下进行抗体孵育，有利于进行一抗与外泌体的结合，和二抗与一抗的结合，可以节省分别时长，提升结合效率，有利于吸光度的准确测定。经试验，37-40°为抗体结合最佳孵育温度，有利于抗原抗体的结合的培养箱中静置。这样，可以提升相关反应的反应效率，从而提升酶联免疫吸附检测的检测效率。
在本申请提供的一种具体实施方式中，利用TIM4蛋白溶液进行酶标板的包被，得到被TIM4蛋白包被的酶标板的操作步骤为：
（1）溶液配置
配制TIM4稀释液：
加入1ml PBS（磷酸盐缓冲液）溶解100 μg的TIM4蛋白，并用PBS将其浓度稀释为1μg/mL；
配制TBS-TCa缓冲液：
终浓度0.05% v/v tween20的TBS（Tris盐缓冲液）：20 ul tween20加入40 mL TBS中，得到TBS-T溶液；
在TBS-T溶液中加入终浓度2mM的CaCl2；
配制1% BSA封闭液：
PBS buffer中加入终浓度2mM CaCl2（储液250mM 125X），得到PBS-Tca溶液；
用PBS-TCa缓冲液配制1% BSA封闭液：10ml加0.1g BSA（牛血清白蛋白）；
（2）具体操作
取出酶标板6孔，计算需要用的孔的数量；
每个孔加入100μL的TIM4稀释液，在4℃的温度下过夜孵育；
拍干孔中孵育液，用PBS-TCa缓冲液洗板2次：每次在孔中加入200-400 μL缓冲液，沿孔壁加入，放置3min；
每孔加入100 μL的1% BSA封闭液，40℃孵育1小时50分钟左右；
拍干孔中封闭液，用TBS-TCa缓冲液洗板2次：每次孔中加入200-400 μL缓冲液。
这样，得到了吸附有TIM4蛋白、牛血清蛋白的酶标板。
S300：在所述被TIM4蛋白包被的酶标板中加入所述待测样品溶液，通过包被于酶标板的TIM4蛋白捕获所述待测样品溶液中的外泌体，得到包含第一个数数量外泌体的酶标板。
在被TIM4蛋白包被的酶标板中加入待测样品溶液，可以理解为通过包被于酶标板的TIM4蛋白捕获待测样品溶液中的外泌体。可以理解的是，TIM4蛋白与磷脂酰丝氨酸之间的强亲和力，可用于高效捕获外泌体。因此，在吸附有TIM4蛋白的酶标板中加入包含外泌体的待测样品溶液，可以进行外泌体的捕获，这样，实现了外泌体与酶标板的结合，得到包含有一定个数的外泌体。
在本申请提供的一种具体实施方式中，通过包被于酶标板的TIM4蛋白进行待测样品中外泌体的捕获，具体操作步骤为：
待测外泌体样品加入终浓度为2mM的CaCl2；
稀释适当梯度加入到孔中，每孔100 ul；三个梯度的标准外泌体样品（4*10E9个/mL；8*10E9个/mL；16*10E9个/mL）加入到孔中，每孔100 μL；
40℃孵育1.5小时；
拍干孔中样品液，用TBS-TCa缓冲液洗板5次，每次孔中加入200-400 μL，每次拍干。
这样，得到了捕获有一定数量外泌体的酶标板。
S400：在所述包含第一个数数量外泌体的酶标板中，加入浓度最低为1:6000、包含抗人CD63一抗抗体的一抗溶液，得到结合有抗人CD63一抗抗体的酶标板。
可以理解的是，CD63、CD83蛋白可以作为外泌体中区别于其他囊泡的标志物，是外泌体的标志性蛋白。因此，在进行外泌体的酶联免疫吸附检测时，往往采用CD63、CD83蛋白作为一抗抗体，进行与身为抗原的外泌体进行特异性结合。但是，需要指出的是，采用相同浓度的CD63与CD81进行外泌体的特异性结合，其对外泌体的结合效率有着较大的差异。即，相同条件下，CD63与CD81对外泌体有着不同的灵敏度。
具体的，通过对CD63抗体与CD81抗体进行在不同浓度下分别进行5组平行实验，并进行OD值检测，发现：在分别设定CD63抗体与CD81抗体在1:500、1:1000、1:2000、1:4000、1:6000等5个浓度进行与外泌体的结合时，当CD81抗体浓度大于1:2000时OD值的均一度可达98%以上，小于1:2000时OD值的均一度低于90%；CD63抗体浓度大于1:6000时OD值的均一度即可大于98%，小于1:6000时OD值的均一度低于90%。由此可知，CD81抗体的浓度检测下限为1:2000。即，CD81抗体浓度大于1:2000时才能基于该酶联免疫吸附检测方法得到稳定可重复的检测结果。相较之下，CD63抗体浓度大于1:6000，即可得到稳定可重复的检测结果。由此可知，选用CD63蛋白作为一抗抗体进行外泌体的特异性结合，具有更好的灵敏度。例如，当选用同一浓度的CD63抗体与CD81抗体记性外泌体结合，基于CD63抗体灵敏度更高，可快速结合外泌体，节省了检测时间，且具有较好的检测结果准确度。并且，利用较低浓度的一抗溶液进行外泌体的结合，可以有效节约检测成本。即，利用灵敏度高、浓度低的CD63一抗溶液记性外泌体的结合，可以提高外泌体含量的检测效率，且兼顾了检测准确度以及低成本。因此，本申请实施例优选浓度最低为1:6000的抗人CD63一抗抗体进行外泌体的特异性结合。在相应的CD63一抗抗体浓度下，CD63抗体可以与外泌体中的CD63蛋白特异性结合，从而得到结合有CD63一抗抗体的酶标板。
S500：在所述结合有抗人CD63一抗抗体的酶标板中，加入具有第一浓度值、包含被辣根过氧化物酶标记的二抗抗体的二抗溶液，得到结合有被辣根过氧化物酶标记的二抗抗体的酶标板。
这里的二抗抗体用于与一抗抗体特异性结合。两者之间进行的结合可以理解为抗原抗体的结合。其中，抗体可理解为被辣根过氧化物酶标记的二抗抗体；抗原可理解为CD63一抗抗体。经CD63一抗抗体与被辣根过氧化物酶标记的二抗抗体的结合，可得到结合有被辣根过氧化物酶标记的二抗抗体的酶标板。这里二抗抗体的选择标准为可与CD63一抗抗体进行特异性结合的相关抗体。例如，选用辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠作为二抗。这里二抗的具体可以根据一抗的浓度值进行设计。
进一步的，在本申请提供的一种优选实施方式中，在包含第一个数数量外泌体的酶标板中，加入浓度最低为1:6000、包含抗人CD63一抗抗体的一抗溶液，具体包括：在所述包含第一个数数量外泌体的酶标板中，加入浓度为1:6000、包含抗人CD63一抗抗体的一抗溶液。
可以理解的是，当CD63抗体浓度大于1:6000，即可得到稳定可重复的酶联免疫吸附测定的检测结果。因此，本申请实施例优选的在结合有外泌体的酶标板中加入浓度为1:6000的CD63一抗。这样，可以在满足检测结果准确度的同时，降低一抗试剂实际的应用浓度，从而有效降低检测成本。
进一步的，在本申请提供的一种优选实施方式中，加入具有第一浓度值、包含被辣根过氧化物酶标记的二抗抗体的二抗溶液，具体包括：加入浓度最低为1:2000的第一浓度值、包含被辣根过氧化物酶标记的二抗抗体的二抗溶液。
可以理解的是，二抗浓度的选取，可根据一抗的实际应用浓度确定。在确定了1:6000的CD63抗体浓度为检测浓度，经试验，对二抗（辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠）的浓度进行筛选时，二抗的浓度梯度设定为1:1000、1:2000、1:4000。通过对不同浓度的二抗进行5组平行实验的OD值检测，发现：二抗浓度在1:1000时OD值的均一度达98.7%，1:2000时OD值的均一度达98.5%，1:4000时OD值的均一度达92%。由此可知，在二抗浓度大于1:2000即可得到稳定的可重复的检测结果。因此，将1:2000这一浓度作为检测效果最优的二抗浓度。即，二抗浓度大于1:2000即可得到稳定有效的酶标仪检测结果。并且，根据该酶联免疫吸附测定方法得到的最终结果与纳米粒子追踪分析方法得到的分析结果一致。这说明，选用大于1:2000的二抗浓度进行一抗、二抗的特异性结合，对最终的检测结果重复性好。因此，本申请优选大于1:2000的二抗浓度进行与一抗抗体的反应。
进一步的，在本申请提供的一种优选实施方式中，加入浓度最低为1:2000的第一浓度值、包含被辣根过氧化物酶标记的二抗抗体的二抗溶液，具体包括：加入浓度为1:2000的第一浓度值、包含被辣根过氧化物酶标记的二抗抗体的二抗溶液。
可以理解的是，当CD63抗体浓度为1:6000，被辣根过氧化物酶标记的二抗浓度大于1:2000，即可得到稳定可重复的酶联免疫吸附测定的检测结果。因此，本申请实施例优选的在确定一抗浓度为1:6000后，选用1:2000的浓度作为二抗浓度。这样，可以在满足检测结果准确度的同时，降低二抗试剂实际的应用浓度，可以有效降低检测成本。
在本申请提供的一种具体实施方式中，在结合有外泌体的酶标板中进行一抗、二抗的抗原抗体结合，具体操作步骤为：
用TBS-TCa缓冲液配制CD63一抗溶液，浓度为1:6000；
之后，每孔100 μL，40℃孵育2小时；
拍干孔中一抗溶液，用TBS-TCa缓冲液洗板5次：每次孔中加入200-400 μL，每次拍干。
用TBS-TCa缓冲液配制辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠（碧云天）的二抗溶液，浓度为1:2000；每孔100 μL，40℃孵育1小时；
这样，得到了被辣根过氧化物酶标记的酶标板。
S600：在所述结合有被辣根过氧化物酶标记的二抗抗体的酶标板中，加入显色液，进行辣根过氧化物酶与显色液的显色反应；
S700：当所述显色反应持续第一时长后，在显色完成后的酶标板中加入显色终止液，以终止所述显色反应。
可以理解的是，当一抗、二抗结合完毕，可以得到结合有被辣根过氧化物酶标记的酶标板。但是，由于抗原-抗体反应所形成的复合物本身无色，无法直接观察，因而需借助于某些化学基团的呈色作用，使其得以显示。辣根过氧化物酶可理解为所述的起呈色作用的化学物质。辣根过氧化物酶作为显色体系的关键成分，在该其催化下，可以与显色液进行显色反应，从而使抗原-抗体反应所形成的复合物显色，以便后续的检测。实际应用中，可以选取TMB（3,3’5,5’-四甲基联苯胺）显色液。在辣根过氧化物酶的催化下，TMB会产生可溶性蓝色产物。但是，由于辣根过氧化物酶与TMB的反应在一定时间内能持续进行，若不及时终止反应，可能会由于反应达到平台期等而影响实验结果。因此，需适时终止上述显色反应的进行。对应的，可以选用TMB终止液终止显色反应。加入TMB显色终止液后，溶液颜色可以从蓝色变为黄色。通过观察颜色的转变，可判断当前的反应进度。经显色反应，得到了结合有带相应颜色的外泌体的酶标板。
在本申请提供的一种具体实施方式中，被辣根过氧化物酶标记的酶标板进行显色反应，具体操作步骤为：
吸取适量TMB显色液与TMB终止液，做好标记，显色液避光预热；
拍干孔中二抗溶液，用TBS-TCa缓冲液洗板5次，每次孔中加入200-400 μL，每次拍干；
每孔加入100 μL TMB显色液，37℃孵育5 min，根据显色的程度决定终止时间；
每孔加入100μL TMB终止液；
这样，使得酶标板中的外泌体可以被响应的颜色标记，便于后续的酶标仪检测。
需要说明的是，在本申请提供的优选实施方式中，除TIM4蛋白包被以外的孵育、洗板、封闭等操作均是在37℃-40℃温度中进行的。即，酶标板中进行的抗原-抗体的结合、显色等操作均是在这一温度范围内进行的。经试验，37-40°为抗体与抗原结合的最佳孵育温度，有利于抗原抗体的结合的培养箱中静置。即，步骤S400、S500优选的在37℃-40℃的温度范围中进行。在37℃-40℃的温度下进行抗体孵育，有利于进行一抗与外泌体的结合，和二抗与一抗的结合，可以节省分别时长，提升结合效率，有利于吸光度的准确测定。经试验，37-40°为抗体结合最佳孵育温度，有利于抗原抗体的结合的培养箱中静置。这样，可以提升相关反应的反应效率，从而提升酶联免疫吸附检测的检测效率。
S800：通过选用第一波长的测试光波的酶标仪，检测显色终止后的酶标板的吸光度。
利用酶标仪检测显色终止后的酶标板，可以根据实际得到的颜色选用相应的检测波长，以测量结合有外泌体的酶标板的吸光度。实际应用中，吸光度的测量结果可以用光密度OD（Optical density，简称OD）值表示。
进一步的，在本申请提供的一种优选实施方式中，通过选用第一波长的测试光波的酶标仪，检测显色终止后的酶标板的吸光度，具体包括：通过选用第一波长为450nm的测试光波的酶标仪，检测显色终止后的酶标板的吸光度。
这里选用波长为450nm的测试光波进行酶标仪的检测，主要是因为CD63浓度与450nm 波长下的吸光度检测结果之间呈正相关。由此可知，选用450nm的测试光波进行检测，可以使得最终的外泌体颗粒数量检测结果具有较高的准确度，且与纳米粒子追踪分析的结果一致，重复性好。因此，本申请优选酶标仪的检测波长为450nm。
S900：根据所述吸光度的检测结果，并通过吸光度-外泌体个数的函数，计算酶标板中外泌体的个数。
这里吸光度的检测结果用光密度OD值表示。当酶标仪选用450nm的检测波长进行光密度的检测时，吸光度的检测结果可记为OD450。
经试验，计算标准品和样本复孔的平均OD值并减去空白孔的OD值，作为校正值。以浓度为横坐标，OD值为纵坐标，得到在双对数坐标轴上拟合四参数逻辑函数的标准曲线。之后，计算标准品和样本复孔的平均OD值并减去空白孔的OD值，作为校正值。以浓度为横坐标，OD值为纵坐标。通过Excel的多项式拟合可得到最接近的拟合函数。根据所述得到的函数，即可根据酶标仪检测得到的OD值计算待测样品中样品中外泌体的个数。本申请的吸光度-外泌体个数的函数，可以理解为通过Excel的多项式拟合可得到最接近的拟合函数。请参照图2，其中的直线对应的函数为y=76.785x-37.332，可视为通过Excel的多项式拟合可得到最接近的拟合函数；曲线对应的函数为y=298.07x3-347.19x2+144.08x-17.196，可视为标准曲线对应的四参数逻辑函数。
需要重点强调的是，利用本申请提供的酶联免疫吸附检测体系，可以基于CD63的蛋白浓度与外泌体个数的相关关系，得到外泌体的定量数据。并且，不需对样本做纯化处理，对样本量的要求小、样本要求低，且对不同种类细胞分泌的外泌体均可鉴定。
进一步的，在本申请提供的一种优选实施方式中，测定外泌体含量的检测方法还包括：当所述吸光度的检测结果高于预设的第一阈值时，对所述待测样品溶液执行稀释操作。
这里的第一阈值可以理解为根据图2中的曲线确定的吸光度检测上限值。若超出所述上限值，说明吸光度检测结果存在一定的偏差。若根据该具有一定偏差的吸光度检测结果进行外泌体个数计算，得到的最终计算结果同样会存在一定偏差。因此，当吸光度的检测结果高于预设的第一阈值时，需要对待测样品进行稀释，之后，进行重测。并且，在计算样本浓度时，应乘以相应的稀释倍数。
进一步的，本申请实施例还提供一种测定外泌体含量的检测方法在酶联免疫吸附测定试剂盒中的应用。通过该试剂盒，可以快速进行外泌体含量的检测，从而为进行相关的药理研究提供辅助，实现药物筛选等研究工作，能够在生物医药领域大规模普及使用。
需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、商品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、商品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，有语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、商品或者设备中还存在另外的相同要素。
以上所述仅为本申请的实施例而已，并不用于限制本申请。对于本领域技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原理之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的权利要求范围之内。
Claims (9)
1.一种测定外泌体含量的检测方法，其特征在于，包括：
制备包含外泌体的待测样品溶液；
利用TIM4蛋白溶液进行酶标板的包被，得到被TIM4蛋白包被的酶标板；
在所述被TIM4蛋白包被的酶标板中加入所述待测样品溶液，通过包被于酶标板的TIM4蛋白捕获所述待测样品溶液中的外泌体，得到包含第一个数数量外泌体的酶标板；
在所述包含第一个数数量外泌体的酶标板中，加入浓度最低为1:6000、包含抗人CD63一抗抗体的一抗溶液，得到结合有抗人CD63一抗抗体的酶标板；
在所述结合有抗人CD63一抗抗体的酶标板中，加入具有第一浓度值、包含被辣根过氧化物酶标记的二抗抗体的二抗溶液，得到结合有被辣根过氧化物酶标记的二抗抗体的酶标板；
在所述结合有被辣根过氧化物酶标记的二抗抗体的酶标板中，加入显色液，进行辣根过氧化物酶与显色液的显色反应；
当所述显色反应持续第一时长后，在显色完成后的酶标板中加入显色终止液，以终止所述显色反应；
通过选用第一波长的测试光波的酶标仪，检测显色终止后的酶标板的吸光度；
根据所述吸光度的检测结果，并通过吸光度-外泌体个数的函数，计算酶标板中外泌体的个数。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述包含第一个数数量外泌体的酶标板中，加入浓度最低为1:6000、包含抗人CD63一抗抗体的一抗溶液，具体包括：
在所述包含第一个数数量外泌体的酶标板中，加入浓度为1:6000、包含抗人CD63一抗抗体的一抗溶液。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，加入具有第一浓度值、包含被辣根过氧化物酶标记的二抗抗体的二抗溶液，具体包括：
加入浓度最低为1:2000的第一浓度值、包含被辣根过氧化物酶标记的二抗抗体的二抗溶液。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，加入浓度最低为1:2000的第一浓度值、包含被辣根过氧化物酶标记的二抗抗体的二抗溶液，具体包括：
加入浓度为1:2000的第一浓度值、包含被辣根过氧化物酶标记的二抗抗体的二抗溶液。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，利用TIM4蛋白溶液进行酶标板的包被，得到被TIM4蛋白包被的酶标板，具体包括：
在酶标板中加入TIM4蛋白溶液，以进行TIM4蛋白与酶标板的结合，得到结合有TIM4蛋白的酶标板；
在所述结合有TIM4蛋白的酶标板中加入含有与TIM4蛋白不相关的蛋白的封闭液，进行酶标板的封闭。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述方法还包括：
当所述吸光度的检测结果高于预设的第一阈值时，对所述待测样品溶液执行稀释操作。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，通过选用第一波长的测试光波的酶标仪，检测显色终止后的酶标板的吸光度，具体包括：
通过选用第一波长为450nm的测试光波的酶标仪，检测显色终止后的酶标板的吸光度。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，制备包含外泌体的待测样品溶液，具体包括：
制备包含来源于人脐带间充质干细胞的外泌体的待测样品溶液。
9.一种如权利要求1所述的检测方法在酶联免疫吸附测定试剂盒中的应用。
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2022
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