CN116785312A - miR-15a-5p在治疗眼底疾病中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及miR‑15a‑5p或修饰的miR‑15a‑5p在治疗眼底疾病中的应用。所述miR‑15a‑5p或修饰的miR‑15a‑5p具有生物活性，可在体外被细胞吸收，或者在体内被视网膜细胞吸收，并迅速发挥生物学作用。通过局部给药的方式，所述miR‑15a‑5p或修饰的miR‑15a‑5p可以抑制病理性新生血管、促进无灌注区恢复、减少视网膜炎症因子表达、减轻视网膜纤维化并促进神经损伤修复。在生物医药领域中具有非常好的应用和研究价值。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及miR-15a-5p或修饰的miR-15a-5p在治疗眼底疾病中的应用。
背景技术
眼底是眼球最重要的生理结构，包括脉络膜、视网膜和玻璃体等。其中视网膜遍布了血管及神经，是承担视觉功能的主要结构，具有重要的生理作用。血糖升高或者缺氧等致病因素会导致视网膜损伤，造成视力的下降。例如早产儿视网膜病变（ROP）是常见于早产儿的致盲性眼底疾病，其病理机制为新生儿吸氧导致的视网膜血管退化以及持续大量的新生血管生成。在新生儿视网膜发育过程中血管的异常同时导致神经的变性及退化，极大的影响了婴幼儿的视网膜发育。目前的治疗方法为玻璃体腔注射抗血管内皮生长因子（VEGF）的单抗类药物，但是其靶点单一，无法改善视网膜的神经变性以及降低视网膜炎症水平；而且由于VEGF是重要的神经营养因子，使用抗VEGF治疗反而可导致视网膜神经细胞进一步损害和视网膜功能下降。而在劳动年龄发病率较高的糖尿病视网膜病变（DR）也是以新生血管和神经变性为主要特征的微血管疾病。其致病因素为持续升高的血糖，但后续病理机制较为复杂。现有的治疗方法为在非增殖期采取激光光凝破坏视网膜周边部以减少血管渗漏以及降低视网膜耗氧量，但是激光疗法具有一定的破坏性，并不能完全阻止新生血管的发生。而在增殖期一般采取玻璃体腔注射抗VEGF单抗类药物抑制新生血管或者进行玻璃体切割手术。如前所述，抗VEGF治疗无法改善视网膜神经损伤和功能。
MicroRNA（miRNA）是一类由内源基因编码的长度约为22个核苷酸的非编码单链RNA分子，它们在动植物中参与转录后基因表达调控。主要特点为人体天然存在，多靶向调控，生物学功能丰富。其中，miR-15a-5p与多种疾病的发生和发展密切相关。
专利文献：CN112575088B公开了一种血浆外泌体miRNA生物标记物在制备子宫内膜癌筛查诊断的试剂盒中的应用，所述生物标记物为miR-15a-5p，miR-106b-5p和miR-107的组合。
专利文献：CN109414459B公开了包含miR-15a-5p等等的外泌体可以促进伤口愈合。
专利文献：CN113943800A公开了检测外泌体miR-15a-5p的试剂在制备甲状腺癌碘抵抗筛查试剂盒中的用途。
专利文献：CN110205377A公开了基于miRNA分子标记物进行提前评估川崎病风险的方法，miRNA分子标记物为miR-30c-5p、miR-26a-5p、miR-27a-3p、miR-15a-5p、miR-186-5p、let-7g-5p、miR-941、miR-92a-3p、miR-22-3p、miR-151a-3p、miR-140-3p、miR-199a-3p、miR-4433b-5p。
目前现有技术对单一生物成分的miR-15a-5p在眼底疾病中的应用及机理研究较少。
发明内容
为弥补现有技术的不足，本申请展示了miR-15a-5p在治疗眼底疾病的有效性，miR-15a-5p或修饰的miR-15a-5p具有生物活性，可在体外被细胞吸收，或者在体内被视网膜细胞吸收，并迅速发挥生物学作用。通过局部给药的方式，所述miR-15a-5p或修饰的miR-15a-5p可以抑制病理性新生血管、促进无灌注区恢复、减少视网膜炎症因子表达、减轻视网膜纤维化并促进神经损伤修复。在生物医药领域中具有非常好的应用和研究价值。
具体方案如下：
本发明的第一方面，提供了一种miR-15a-5p和/或修饰的miR-15a-5p在制备治疗和/或预防眼底疾病的产品中的应用。
所述的眼底疾病选自玻璃体病变、视网膜病变、视神经病变或脉络膜病变中的一种或两种以上。
优选的，所述的眼底疾病选自早产儿视网膜疾病、视网膜新生血管疾病、脉络膜新生血管疾病或糖尿病视网膜病变中的一种或两种以上。
所述的miR-15a-5p包含SEQ ID NO：1或与SEQ ID NO：1的核苷酸序列具有80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96、97%、98%、99%、99.5%或99.9%以上同源性或包含一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入的核苷酸序列。
其中，SEQ ID NO：1为UAGCAGCACAUAAUGGUUUGUG。
所述的miR-15a-5p或其模拟物包含正义链和反义链。正义链为SEQ ID NO：1，反义链为CACAAACCAUUAUGUGCUGCUA（SEQ ID NO：6）。
所述的产品包含miR-15a-5p和/或修饰的miR-15a-5p和/或miR-15a-5p模拟物，或者，包含miR-15a-5p和/或修饰的miR-15a-5p和/或miR-15a-5p模拟物的载体（所述的载体可以为包裹或转录或表达miR-15a-5p的任何载体）。
所述的载体为病毒载体或非病毒载体。
优选的，所述病毒载体包括慢病毒载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、痘病毒载体或疱疹病毒载体中的一种或两种以上。
优选的，所述的非病毒载体包括脂质体、脂质纳米颗粒、聚合物、多肽、抗体、适配体或N-乙酰半乳糖胺中的一种或两种以上。
所述的修饰的miR-15a-5p包括在碱基上进行的修饰。
所述碱基的修饰位于反义链。优选包括3'端进行胆固醇修饰、5'端两个硫代骨架修饰、3'端四个硫代骨架修饰或全链甲氧基修饰中的一种或两种以上。
所述的产品包含正义链和反义链。
优选的，所述的正义链和/或反义链上包含悬挂碱基。
所述的悬挂碱基位于正义链和/或反义链的3'末端。
所述的悬挂碱基为脱氧核苷。优选的，所述的悬挂碱基为dTdT、dTdC或dUdU。例如，所述的miR-15a-5p或其模拟物包含的正义链可以为UAGCAGCACAUAAUGGUUUGUGdTdT（SEQ IDNO：7），反义链可以为CACAAACCAUUAUGUGCUGCUAdTdT（SEQ ID NO：8）。
miR-15a-5p或其模拟物包含的正义链和/或反义链经过全链甲氧基修饰、3'端胆固醇修饰、5'端硫代骨架修饰或3'端硫代骨架修饰中的一种或两种以上。
在本发明的一个具体实施方式中，miR-15a-5p或其模拟物的反义链经过全链甲氧基修饰、3'端胆固醇修饰、5'端2个硫代骨架修饰和3'端4个硫代骨架修饰。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的正义链为SEQ ID NO：1，所述的反义链为经5'端2个硫代骨架修饰，3'端4个硫代骨架修饰，3'端胆固醇修饰以及全链甲氧基修饰的SEQ ID NO：6。
所述的治疗和/或预防眼底疾病选自抑制视网膜血管内皮细胞（HRMECs）活力、抑制HRMECs增殖（尤其是减弱VEGF诱导的HRMECs的增殖）、抑制Smad2的磷酸化、抑制总Smad2的表达、抑制纤维化、抑制VEGF的表达、抑制视网膜的炎症、抗新生血管或促进无灌注区的恢复、改善视网膜变薄、恢复视功能或促进神经损伤修复中的一种或两种以上。
优选的，所述的抗新生血管包括抑制视网膜新生血管形成和/或脉络膜新生血管形成。
所述的治疗和/或预防眼底疾病包括向需要的受试者施用miR-15a-5p和/或修饰的miR-15a-5p或miR-15a-5p模拟物和/或施用包含miR-15a-5p和/或修饰的miR-15a-5p或miR-15a-5p模拟物的载体。
所述的施用部位可以为受试者的眼内空间或腔。例如前房中的房水、悬吊韧带、睫状体、睫状体内和肌肉、晶状体或虹膜、玻璃体、视网膜、脉络膜或视神经等中的一种或两种以上。
本发明的第二方面，提供了一种miR-15a-5p或其模拟物在制备TGF-β1/Smad2通路抑制剂中的应用。
所述的TGF-β1/Smad2通路抑制剂包括miR-15a-5p或修饰的miR-15a-5p或miR-15a-5p模拟物，或者，包含miR-15a-5p或修饰的miR-15a-5p或miR-15a-5p模拟物的载体。
本发明的第三方面，提供了一种包含转录为miR-15a-5p或miR-15a-5p模拟物的核酸的载体。
所述的miR-15a-5p包括SEQ ID NO：1。
能够转录为miR-15a-5p的核酸包含TAGCAGCACATAATGGTTTGTG（SEQ ID NO：9）。
所述的修饰的miR-15a-5p包括在碱基上进行的修饰。
所述碱基的修饰位于反义链，包括3'端进行胆固醇修饰、5'端两个硫代骨架修饰、3'端四个硫代骨架修饰或全链甲氧基修饰中的一种或两种以上。
所述的miR-15a-5p或其模拟物包含正义链和反义链。
所述的正义链和/或反义链上包含悬挂碱基。
所述的悬挂碱基位于正义链和/或反义链的3'末端。
所述的悬挂碱基为脱氧核苷。
所述的悬挂碱基为dTdT、dTdC或dUdU。
所述的载体为病毒载体或非病毒载体。
所述病毒载体包括慢病毒载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、痘病毒载体或疱疹病毒载体中的一种或两种以上。
所述的非病毒载体包括脂质体、脂质纳米颗粒、聚合物、多肽、抗体、适配体或N-乙酰半乳糖胺中的一种或两种以上。
本发明的第四方面，提供了一种包含转录为miR-15a-5p或miR-15a-5p模拟物的核酸的载体在制备治疗和/或预防眼底疾病的产品中的应用。
所述的miR-15a-5p包括SEQ ID NO：1。
能够转录为miR-15a-5p的核酸包含TAGCAGCACATAATGGTTTGTG（SEQ ID NO：9）。
所述的修饰的miR-15a-5p包括在碱基上进行的修饰。
所述碱基的修饰位于反义链，包括3'端进行胆固醇修饰、5'端两个硫代骨架修饰、3'端四个硫代骨架修饰或全链甲氧基修饰中的一种或两种以上。
所述的miR-15a-5p或其模拟物包含正义链和反义链。
所述的正义链和/或反义链上包含悬挂碱基。
所述的悬挂碱基位于正义链和/或反义链的3'末端。
所述的悬挂碱基为脱氧核苷。
所述的悬挂碱基为dTdT、dTdC或dUdU。
所述的载体为病毒载体或非病毒载体。
所述病毒载体包括慢病毒载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、痘病毒载体或疱疹病毒载体中的一种或两种以上。
所述的非病毒载体包括脂质体、脂质纳米颗粒、聚合物、多肽、抗体、适配体或N-乙酰半乳糖胺中的一种或两种以上。
所述的眼底疾病选自玻璃体病变、视网膜病变、视神经病变或脉络膜病变中的一种或两种以上。
优选的，所述的眼底疾病选自早产儿视网膜疾病、视网膜新生血管疾病、脉络膜新生血管疾病或糖尿病视网膜病变中的一种或两种以上。
所述的治疗和/或预防眼底疾病选自抑制HRMEC活力、抑制HRMEC增殖、抑制Smad2的磷酸化、抑制总Smad2的表达、抑制纤维化、抑制VEGF的表达、抑制视网膜的炎症、抗新生血管或促进无灌注区的恢复、改善视网膜变薄、恢复视功能或促进神经损伤修复中的一种或两种以上。
优选的，所述的抗新生血管包括抑制视网膜新生血管形成和/或脉络膜新生血管形成。
所述的治疗和/或预防眼底疾病包括向需要的受试者施用包含转录为miR-15a-5p或miR-15a-5p模拟物的核酸的载体。
所述的施用部位可以为受试者的眼内空间或腔。例如前房中的房水、悬吊韧带、睫状体、睫状体内和肌肉、晶状体或虹膜、玻璃体、视网膜、脉络膜或视神经等中的一种或两种以上。
本发明的第五方面，提供了一种修饰的miR-15a-5p或miR-15a-5p模拟物。
所述的修饰的miR-15a-5p包括在碱基上进行的修饰。
所述碱基的修饰位于反义链。优选包括3'端进行胆固醇修饰、5'端两个硫代骨架修饰、3'端四个硫代骨架修饰或全链甲氧基修饰中的一种或两种以上。
所述的miR-15a-5p或其模拟物包含的正义链和/或反义链经过全链甲氧基修饰、3'端胆固醇修饰、5'端硫代骨架修饰或3'端硫代骨架修饰中的一种或两种以上。
在本发明的一个具体实施方式中，miR-15a-5p或其模拟物的反义链经过全链甲氧基修饰、3'端胆固醇修饰、5'端2个硫代骨架修饰和3'端4个硫代骨架修饰。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的正义链为SEQ ID NO：1，所述的反义链为经5'端2个硫代骨架修饰，3'端4个硫代骨架修饰，3'端胆固醇修饰以及全链甲氧基修饰的SEQ ID NO：6。
本发明的第六方面，提供了一种药物或药物组合物，所述的药物或药物组合物包括miR-15a-5p和/或修饰的miR-15a-5p和/或miR-15a-5p模拟物和/或上述第三方面所述的包含转录为miR-15a-5p或miR-15a-5p模拟物的核酸的载体，以及药学上可接受的辅料。
所述的药物或药物组合物可以治疗眼底疾病。
所述的药物组合物还可以包含其他治疗或预防眼底疾病的核酸、多肽、蛋白、化合物等或者降低副作用的核酸、多肽、蛋白、化合物等。
所述的药物或药物组合物可以采用任何合适的给药途径，例如胃肠道给药（例如口服）或非胃肠道给药（例如，静脉内、肌内、皮下、皮内、器官内、鼻内、眼内、滴注、脑内、鞘内、透皮、直肠内等）途径。
所述的药物或药物组合物可以为任何合适的剂型，例如经胃肠道给药剂型或非经胃肠道给药剂型，优选包括但不限于片剂、丸剂、粉剂、颗粒剂、胶囊剂、锭剂、糖浆剂、液体、乳剂、微乳剂、混悬剂、注射剂、喷雾剂、气雾剂、粉雾剂、洗剂、软膏剂、硬膏剂、糊剂、贴剂、滴眼剂、滴鼻剂、舌下片剂、栓剂、气雾剂、泡腾片、滴丸剂、凝胶剂等等。
所述药物或药物组合物的各种剂型可以按照药学领域的常规生产方法制备。
所述的药物或药物组合物可以含有重量比为0.01-99.5%（具体如，0.01%、0.1%、0.5%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%、99.5%）的所述miR-15a-5p、修饰的miR-15a-5p、包含miR-15a-5p或修饰的miR-15a-5p的载体。
所述的药物或药物组合物可以为人用药或兽用药。
本发明的第七方面，提供了一种治疗或预防眼底疾病的方法，所述的方法包括向有需要的受试者施用有效量的miR-15a-5p和/或修饰的miR-15a-5p和/或miR-15a-5p模拟物和/或包含miR-15a-5p或修饰的miR-15a-5p或miR-15a-5p模拟物的载体和/或药物组合物。
所述的治疗和/或预防眼底疾病选自抑制HRMECs活力、抑制HRMECs增殖（尤其是减弱VEGF诱导的HRMECs的增殖）、抑制Smad2的磷酸化、抑制总Smad2的表达、抑制纤维化、抑制VEGF的表达、抑制视网膜的炎症、抗新生血管或促进无灌注区的恢复、改善视网膜变薄、恢复视功能或促进神经损伤修复中的一种或两种以上。
优选的，所述的抗新生血管包括抑制视网膜新生血管形成和/或脉络膜新生血管形成。
优选的，所述的方法包括每只眼施用0.5-5μg（例如0.5、1、2、3、4、5μg）的miR-15a-5p、修饰的miR-15a-5p、miR-15a-5p模拟物、包含miR-15a-5p或修饰的miR-15a-5p或miR-15a-5p模拟物的载体或上述的药物或药物组合物。
优选的，所述的方法包括施用至受试者的眼内空间或腔。例如前房中的房水、悬吊韧带、睫状体、睫状体内和肌肉、晶状体或虹膜、玻璃体、视网膜、脉络膜或视神经等中的一种或两种以上。
Agomir-15a-5p在体内实验的验证均与临床上经典的Anti-VEGF药物雷珠单抗雷珠单抗做对比。结果表明其抑制视网膜及脉络膜新生血管的作用与雷珠单抗相当，优于雷珠单抗在于以下三点，一是抑制新生血管的同时促进视网膜血运恢复，减少视网膜无灌注区面积；二是具有视神经保护作用；三是具有抑制视网膜炎症因子及炎症介质的作用。
本发明所述的“药学上可接受的”是指既不显著刺激生物体也不抑制所施用的产品的活性物质的生物学活性及特性。
本发明所述的“药学上可接受的辅料”，包括但不限于载体、赋形剂、稀释剂、润湿剂、填充剂、粘合剂、润滑剂、崩解剂、抗氧化剂、缓冲剂、助悬剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂、矫味剂或防腐剂等中的一种或两种以上。
本发明所述的“治疗”表示在疾病已开始发展后减缓、中断、阻止、控制、停止、减轻、或逆转一种体征、症状、失调、病症、或疾病的进展或严重性，但不一定涉及所有疾病相关体征、症状、病症、或失调的完全消除。
本发明所述“有效量”是指在以单个或多个剂量给予至个体或器官之后提供所希望的治疗或预防的本发明的miR-15a-5p、miR-15a-5p模拟物、修饰的miR-15a-5p、药物或药物组合物的量或剂量。
本发明所述的“预防”表示为了阻止或延迟疾病或病症或症状在机体内的发生而实施的方式。
本发明所述的“受试者”可以为人或非人哺乳动物，所述的非人哺乳动物可以为野生动物、动物园动物、经济动物、宠物、实验动物等等。优选的，所述的非人哺乳动物包括但不限于猪、牛、羊、马、驴、狐、貉、貂、骆驼、狗、猫、兔、鼠（例如大鼠、小鼠、豚鼠、仓鼠、沙鼠、龙猫、松鼠）或猴等等。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施例，其中：
图1：向视网膜血管内皮细胞分别转染miR-15a-5p的模拟物对照/模拟物/抑制剂对照/抑制剂后，检测视网膜血管内皮细胞中miR-15a-5p的表达量。模拟物可以增加细胞内miR-15a-5p的表达量，抑制剂可以减少细胞内miR-15a-5p的表达量。
图2：不同浓度的VEGF刺激视网膜血管内皮细胞对细胞增殖的影响。10ng/ml的VEGF即可引起细胞异常增殖。
图3：不同浓度的VEGF刺激视网膜血管内皮细胞对miR-15a-5p相对表达量的影响。10ng/ml的VEGF不会影响细胞内miR-15a-5p的表达量。
图4：CCK-8试剂盒检测miR-15a-5p对细胞增殖活力的影响。miR-15a-5p模拟物减弱VEGF诱导的视网膜血管内皮细胞病理性增殖。
图5：细胞划痕实验检测miR-15a-5p对细胞增殖能力的影响。
图6：细胞划痕定量统计分析，miR-15a-5p模拟物减少VEGF诱导的视网膜内皮细胞病理性增殖。
图7：Transwell实验检测miR-15a-5p对细胞迁移能力的影响。
图8：对Transwell实验细胞迁移数量的定量统计分析，miR-15a-5p模拟物减少VEGF诱导的视网膜血管内皮细胞病理性迁移。
图9：管腔形成实验检测miR-15a-5p对细胞体外成管能力的影响。
图10：对管腔形成实验细胞形成的血管管腔总长度的定量统计分析，miR-15a-5p模拟物减少VEGF诱导的视网膜血管内皮细胞血管管腔生成。
图11：对管腔形成实验细胞形成的血管管腔节点数的定量统计分析，miR-15a-5p模拟物减少VEGF诱导的视网膜血管内皮细胞血管管腔生成。
图12：小鼠视网膜吸收修饰（Agomir）及未修饰（mimic）的miR-15a-5p模拟物的差异。为模拟物（mimic）组与对照组比P<0.05，@为修饰的模拟物（Agomir）与对照组比P<0.05，#为模拟物（mimic）组与修饰的模拟物（Agomir）比P<0.05。
图13：氧诱导的小鼠视网膜新生血管模型流程图。P代表小鼠出生后的天数。
图14：氧诱导的视网膜新生血管小鼠发育过程中视网膜miR-15a-5p的表达水平。常氧为未处理鼠，高氧为新生血管造模组。
图15：不同剂量miR-15a-5p模拟物治疗氧诱导的视网膜新生血管的作用。常氧为未处理鼠，高氧为新生血管造模组，模拟物为Agomir。
图16：不同剂量miR-15a-5p模拟物治疗氧诱导的视网膜新生血管的作用统计图。常氧为未处理鼠，高氧为新生血管造模组，模拟物为Agomir，模拟物对照为乱序的Agomir。
图17：1μg的miR-15a-5p模拟物治疗氧诱导的视网膜新生血管的作用示意图。常氧为未处理鼠，高氧为新生血管造模组，模拟物为Agomir，模拟物对照为乱序的Agomir，VEGF单抗为雷珠单抗。
图18：1μg的miR-15a-5p模拟物治疗氧诱导的视网膜新生血管的新生血管面积统计图。常氧为未处理鼠，高氧为新生血管造模组，模拟物为Agomir，模拟物对照为乱序的Agomir，VEGF单抗为雷珠单抗。
图19：1μg的miR-15a-5p模拟物治疗氧诱导的视网膜新生血管的无灌注区面积统计图。常氧为未处理鼠，高氧为新生血管造模组，模拟物为Agomir，模拟物对照为乱序的Agomir，VEGF单抗为雷珠单抗。
图20：包含miR-15a-5p的腺相关病毒的结构示意图。
图21：包含miR-15a-5p的腺相关病毒感染视网膜的示意图。
图22：PCR结果显示腺相关病毒感染视网膜后，视网膜miR-15a-5p过表达倍数。其中OIR-AAV-NC为注射对照病毒组，OIR-AAV-15a为注射包含miR-15a-5p的腺相关病毒。
图23：包含miR-15a-5p的腺相关病毒对视网膜新生血管和无灌注区的治疗效果示意图。其中OIR-AAV-NC为注射对照病毒组，OIR-AAV-15a为注射包含miR-15a-5p的腺相关病毒。
图24：包含miR-15a-5p的腺相关病毒对无灌注区的治疗效果统计结果。
图25：包含miR-15a-5p的腺相关病毒对氧诱导的视网膜新生血管的治疗效果统计结果。
图26：激光诱导的脉络膜新生血管模型流程图。
图27：眼底荧光造影（FFA）观察miR-15a-5p抑制脉络膜新生血管作用。
图28：对渗漏的荧光进行定量分析结果。
图29：脉络膜铺片行IB4染色以定量新生血管簇的面积察miR-15a-5p抑制脉络膜新生血管作用。IB4阳性示新生血管团簇。
图30：对新生血管团簇进行定量分析结果。
图31：包含miR-15a-5p的腺相关病毒感染视网膜脉络膜的荧光示意图。
图32：PCR结果腺相关病毒感染视网膜脉络膜后，视网膜和脉络膜miR-15a-5p过表达倍数。其中CNV-AAV-NC为脉络膜新生血管并且注射对照病毒组，CNV-AAV-15a为脉络膜新生血管并且注射包含miR-15a-5p的腺相关病毒组。
图33：脉络膜铺片行IB4染色以定量新生血管簇的面积观察包含miR-15a-5p的腺相关病毒抑制脉络膜新生血管的示意图。
图34：脉络膜铺片行IB4染色以定量新生血管簇的面积观察包含miR-15a-5p的腺相关病毒抑制脉络膜新生血管的统计结果图。
图35：在小鼠出生后第42天使用光学相干层析成像（OCT）量化视网膜各层厚度的示意图，IPL代表内丛状层，INL代表内核层，OPL代表外丛状层，ONL代表外核层。常氧代表未处理小鼠，高氧代表氧诱导的视网膜新生血管模型鼠。
图36：在小鼠出生后第42天使用光学相干层析成像（OCT）量化视网膜各层厚度的地形图。常氧代表未处理小鼠，高氧代表氧诱导的视网膜新生血管模型鼠。
图37：在小鼠出生后第42天使用光学相干层析成像（OCT）量化视网膜各层厚度的统计结果，确定miR-15a-5p对视网膜结构的保护作用。常氧代表未处理小鼠，高氧代表氧诱导的视网膜新生血管模型鼠。
图38：在小鼠出生后25天及42天使用视网膜电生理检查（ERG）分析视网膜功能的示意图。常氧代表未处理小鼠，高氧代表氧诱导的视网膜新生血管模型鼠。
图39：在小鼠出生后25天及42天使用视网膜电生理检查（ERG）分析视网膜功能的统计结果图，确认miR-15a-5p对视网膜功能的保护作用。常氧代表未处理小鼠，高氧代表氧诱导的视网膜新生血管模型鼠。
图40：视网膜H&E染色示视网膜层间结构及细胞形态。星号表示外丛状层。GCL代表神经节细胞层，IPL代表内丛状层，INL代表内核层，OPL代表外丛状层，ONL代表外核层，RPE代表色素上皮层。常氧代表未处理小鼠，高氧代表氧诱导的视网膜新生血管模型鼠。
图41：视网膜脉络膜H&E染色示视网膜脉络膜层间结构及细胞形态。GCL代表神经节细胞层，IPL代表内丛状层，INL代表内核层，OPL代表外丛状层，ONL代表外核层，RPE代表色素上皮层。
图42：使用视网膜电生理检查（ERG）分析视网膜功能的示意图。
图43：使用视网膜电生理检查（ERG）分析视网膜功能的统计结果图。
图44：酶联免疫吸附实验（ELISA）检测不同时间点氧诱导的视网膜病变小鼠视网膜中TNFα的含量。
图45：Western Blot示氧诱导视网膜病变各组小鼠视网膜细胞间粘附分子1(ICAM-1)表达量示意图。
图46：Western Blot示氧诱导视网膜病变各组小鼠视网膜细胞间粘附分子1(ICAM-1)表达量统计结果。
图47：PCR结果示激光诱导的各组小鼠视网膜炎症因子水平。A图为TNFα，B图为ICAM-1，C图为IL-1β。
图48：miR-15a-5p靶向VEGF的碱基互补配对图。
图49：PCR结果显示miR-15a-5p可以减少TGF-β1引起的RPE细胞中VEGF的mRNA水平。
图50：Western Blot示miR-15a-5p可以减少TGF-β1引起的RPE细胞中VEGF的蛋白水平升高示意图。
图51：Western Blot示miR-15a-5p可以减少TGF-β1引起的RPE细胞中VEGF的蛋白水平升高统计结果。
图52：Elisa示miR-15a-5p可以减少TGF-β1引起的RPE细胞上清中VEGF的蛋白水平升高。
图53：双荧光素酶报告实验显示miR-15a-5p可以在体外与VEGF的mRNA靶向结合。其中pmirGLO载体为空载质粒，VEGF野生型为VEGF碱基序列，突变型为结合区碱基不同的VEGF碱基序列。
图54：玻璃体腔注射Agomir-15a-5p模拟物可以逆转高氧诱导的小鼠视网膜VEGF表达水平增加。
图55：玻璃体腔注射Agomir-15a-5p模拟物可以逆转高氧诱导的小鼠视网膜VEGF表达水平增加。
图56：玻璃体腔注射Agomir-15a-5p模拟物可以逆转激光诱导的小鼠视网膜VEGF表达水平增加。
图57：miR-15a-5p模拟物相较VEGF单抗可以更长时间抑制视网膜ERK磷酸化信号激活。其中，A图为示意图，在出生后第12天进行玻璃体腔注射后，在P13、P14、P15、P17、P20、P25取材视网膜。B图为P12时，高氧组小鼠视网膜ERK的磷酸化信号增强。C图为P13时，VEGF单抗组视网膜ERK的磷酸化信号降低。D图为P14时，miR-15a-5p模拟物组和VEGF单抗组视网膜ERK的磷酸化信号降低。E图为P15时，miR-15a-5p模拟物组视网膜ERK的磷酸化信号降低。F图为P17时，miR-15a-5p模拟物组视网膜ERK的磷酸化信号降低。G图为P20时，各视网膜ERK的磷酸化信号无明显差异。H图为P25时，各视网膜ERK的磷酸化信号无明显差异。I图、J图、K图、L图、M图、N图、O图分别为P12、P13、P14、P15、P17、P20、P25的统计结果。P图为各组小鼠视网膜在不同时间点视网膜磷酸化ERK信号相对表达量。
图58：miR-15a-5p与Smad2构成碱基互补配对示意图。
图59：PCR结果显示miR-15a-5p可以降低视网膜血管内皮细胞中Smad2的mRNA水平。
图60：Western Blot结果显示miR-15a-5p可以降低视网膜血管内皮细胞中Smad2的蛋白水平示意图。
图61：Western Blot结果显示miR-15a-5p可以降低视网膜血管内皮细胞中Smad2的蛋白水平统计结果。
图62：双荧光素酶报告实验显示miR-15a-5p可以在体外与Smad2的mRNA靶向结合。其中pmirGLO载体为空载质粒，Smad2野生型为Smad2碱基序列，突变型为结合区碱基不同的Smad2碱基序列。
图63：转染miR-15a-5p模拟物后，经TGF-β1刺激的视网膜血管内皮细胞纤维化标志物α-SMA和CD31的免疫荧光染色结果图。
图64：转染miR-15a-5p模拟物后，经TGF-β1刺激的视网膜血管内皮细胞波形蛋白的免疫荧光染色结果图。
图65：转染miR-15a-5p模拟物后，经TGF-β1刺激的视网膜血管内皮细胞纤维化标志物波形蛋白、α-SMA以及CD31的变化Western Blot示意图。
图66：转染miR-15a-5p模拟物后，经TGF-β1刺激的视网膜血管内皮细胞纤维化标志物波形蛋白、α-SMA以及CD31的变化Western Blot统计结果图。
图67：转染miR-15a-5p模拟物后，经TGF-β1刺激的视网膜血管内皮细胞磷酸化-Smad2，总Smad2变化Western Blot示意图。
图68：转染miR-15a-5p模拟物后，经TGF-β1刺激的视网膜血管内皮细胞磷酸化-Smad2，总Smad2变化Western Blot统计结果图。
图69：Western Blot结果示不同浓度的TGF-β2刺激Müller细胞后纤维化相关蛋白表达水平示意图。
图70：Western Blot结果示不同浓度的TGF-β2刺激Müller细胞后纤维化相关蛋白表达水平统计结果。
图71：Western Blot结果示转染miR-15a-5p模拟物及模拟物对照后，TGF-β2刺激Müller细胞后纤维化相关蛋白表达水平示意图。
图72：Western Blot结果示转染miR-15a-5p模拟物及模拟物对照后，TGF-β2刺激Müller细胞后纤维化相关蛋白表达水平统计结果。
图73：Western Blot结果示转染miR-15a-5p模拟物及模拟物对照后，TGF-β2刺激Müller细胞后Smad2总蛋白及磷酸化水平示意图。其中P-Smad2为磷酸化Smad2，T-Smad2为总Smad2。
图74：Western Blot结果示转染miR-15a-5p模拟物及模拟物对照后，TGF-β2刺激Müller细胞后Smad2总蛋白及磷酸化水平统计结果。其中P-Smad2为磷酸化Smad2，T-Smad2为总Smad2。
图75：高氧诱导小鼠各组视网膜冰冻切片示α-SMA和视网膜血管的表达定位。
图76：高氧诱导小鼠各组视网膜冰冻切片示纤维连接蛋白和视网膜血管的表达定位。
图77：高氧诱导小鼠各组视网膜冰冻切片示α-SMA和视网膜活化的Müller细胞表达定位。其中GFAP示活化的Müller细胞。
图78：Western Blot检测示视网膜纤维化蛋白的表达。A图示高氧诱导小鼠各组视网膜纤维连接蛋白表达情况。B图为纤维蛋白表达水平统计结果。C图示高氧诱导小鼠各组视网膜TGFβ受体2蛋白和α-SMA蛋白表达情况。D图为TGFβ受体2蛋白和α-SMA蛋白表达水平统计结果。E图为高氧诱导小鼠各组视网膜磷酸化Smad2和总Smad2表达情况。F图为视网膜磷酸化Smad2和总Smad2表达水平统计结果。
图79：眼内给药miR-15a-5p通过拯救星形胶质细胞为内皮顶端细胞的生长提供模板。其中A图为各组视网膜血管分布与星形胶质细胞形态。第一行显示常氧组小鼠视网膜没有无灌注区，高氧组小鼠使用模拟物治疗组无灌注区最小。第一行显示模拟物对照以及VEGF单抗治疗组小鼠视网膜无灌注区星形胶质细胞排列紊乱，而模拟物治疗组的星形胶质细胞排列整齐。B图为局部血管放大图，模拟物组血管顶端细胞发出细丝，而对照组和VEGF单抗组细丝较少（见箭头）。C图为血管和星形胶质细胞的双染放大图，常氧组星形胶质细胞与血管存在明显攀附，模拟物对照组缺乏攀附，模拟物组血管顶端细胞与星形胶质细胞存在攀附（见箭头），有利于血管生长，而VEGF单抗组也缺乏血管顶端细胞丝状缠绕。
图80：眼内给药miR-15a-5p对氧诱导小鼠发育的安全性评估。其中，A图示自给药当天P12（出生后第12天）至小鼠基本成年P42（出生后42天），小鼠的体重变化。B图示各组血浆颜色。C图示小鼠血清肌酐水平。D图示小鼠小鼠血清尿素水平。E图示小鼠血浆甘油三酯水平。F图示小鼠血浆总胆固醇水平。G图和H图示小鼠的出生后17天（P12），25天（P25），42天（P42）的肝脏及肾脏结构H&E染色。
图81：眼内给药miR-15a-5p对正常小鼠发育及视网膜的安全性评估。其中，A图示自给药当天P12（出生后第12天）至小鼠基本成年P42（出生后42天），小鼠的体重变化。B图示小鼠血清肌酐水平。C图示小鼠血清尿素水平。D图示小鼠血浆甘油三酯水平。E图示小鼠血浆总胆固醇水平。F图示注药后不同时间点肝肾的荧光切片。G图和H图示小鼠的出生后17天（P12），25天（P25），42天（P42）的肝脏及肾脏结构H&E染色。I图、J图、K图为OCT结果示玻璃体腔注射miR-15a-5p模拟物、模拟物对照以及VEGF单抗对视网膜厚度的影响。L图、M图为视网膜冰冻切片，示玻璃体腔注射miR-15a-5p模拟物、模拟物对照以及VEGF单抗后视网膜小胶质细胞的激活情况。
图82：在糖尿病鼠（瘦素受体缺乏模型鼠）中观察了玻璃体腔注射miR-15a-5p模拟物对糖尿病鼠视网膜光感受器损伤和视网膜双极细胞损伤的治疗作用。其中a波代表光感受器细胞对光刺激的反应，b波代表双极细胞对光刺激的反应。
图83：在糖尿病鼠（瘦素受体缺乏模型鼠）中观察了玻璃体腔注射miR-15a-5p模拟物对糖尿病鼠视网膜光感受器损伤的治疗作用统计结果。其中a波代表光感受器细胞对光刺激的反应。
图84：在糖尿病鼠（瘦素受体缺乏模型鼠）中观察了玻璃体腔注射miR-15a-5p模拟物对糖尿病鼠视网膜双极细胞损伤的治疗作用统计结果。其中b波代表双极细胞对光刺激的反应。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的部分实施例，而不是全部。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例中涉及的实验方法如下：
1、miR-15a-5p对人视网膜血管内皮细胞的影响
1.1细胞培养
人视网膜血管内皮细胞（Human retinal microvascular endothelial cells，HRMEC）从angiopromie公司购买，将其在内皮细胞基本培养基（ECM）中与体积分数5％胎牛血清，体积分数1％青霉素-链霉素和内皮细胞生长补充剂（ECGS）一起培养。将细胞在37℃和体积分数5％的二氧化碳中孵育。每2天更换一次培养基。取第三至第六代细胞进行实验。
1.2 CCK-8试剂盒检测细胞增殖
使用Cell Counting Kit（CCK-8）CCK-8/WST-8试剂盒：消化细胞并制成单细胞悬浮液，以2000个/孔的密度于96孔板中接种，每组设置5个复孔，细胞贴壁后进行换液，加入目的培养基并在24小时检测细胞活性。检测前，每孔加入10μl CCK-8试剂，37℃避光孵育2h；然后将孵育后的培养基移到酶标板中，450nm处用BIO-RAD酶标仪测定的吸光度。
1.3细胞转染
在96孔板中按2000个/孔的密度接种HRMECs，细胞培养箱中培养过夜。在2个EP管中分别加入5μl Opti-MEM培养基，再向第一管中加入0.15μl的Lipofectamine 3000试剂，第二管中加入0.15μl的模拟物对照/模拟物/抑制剂对照/抑制剂，将两管液体混合，室温孵育5min，之后将10μl的混合液加入一个孔中。配液时一般需要算出所有孔加液的总量，混合后逐个孔添加，而不要每个孔单独配液避免误差。其它的模拟物对照、抑制剂对照和抑制剂也用同样的方法转染入细胞，但抑制剂对照和抑制剂需要加入比模拟物多一倍的量。
1.4细胞总RNA的提取
在细胞中加入500μl的Trizol，吹打后室温静置5min，加入100μl buffer A，剧烈震荡15s后室温静置3min，分层后4℃、15000g离心5min，吸取上层水相200μl于另一个1.5mlEP管中，加入1.5倍体积的无水乙醇，上下颠倒，加至试剂盒(EZB公司，货号EZB-RN5)提供的RNA吸附柱中，4000g离心1min，取出后倒掉收集管内的液体，将500μl的wash buffer 1液体加入离心柱然后12000g离心1min，离心直到所有液体都经过离心柱。之后向离心柱中加入500μl的wash buffer 2清洗缓冲液，12000g离心1min，取出后倒掉收集管内的液体，12000g离心1min，取出后倒掉收集管内的液体，将吸附柱换到新的1.5ml EP管中，开盖晾2min，加入20μl DEPC水，12000g离心1min，将离心液再加入吸附柱中，室温5 min，12000g离心1min，收集管中液体即总RNA，用Nano Drop测浓度。
1.5逆转录
按照下述的比例在200μl的EP管中加入试剂，其中RNA的体积根据RNA浓度不同而有所不同，RNA总量500ng，之后加gDNA remover 1μl混匀室温存放5分钟。按表1加入试剂。放入PCR仪中设置程序：37℃加热15min，之后42℃加热10min，之后95℃加热3min，结束后将得到的cDNA迅速放置于冰上。
表1
1.6qRT-PCR
按照表2比例配制每孔中的反应液体，SYBR Green Master与cDNA混合，上下游引物和水混合，cDNA不足的部分用RNeasy free water补足，混匀后加入384孔板中。注意避光。加样完成后贴上封板膜，4℃ 2000rpm离心3分钟，然后上机。程序设置为：第一步95℃15 min，第二步94℃ 15 s——55℃ 30 s——70℃ 30 s并循环40次，第三步95℃ 15s——55℃ 15 s——95℃ 15 s。sEVs使用U6作为内参，血浆和玻璃体使用cel-miR-39作为外参。miRNA的表达水平用来表示。各miRNA的引物序列见表3。
表2
表3
1.7细胞划痕实验
将HRMECs消化后接种于6孔板上，细胞融合度达到75%-80%时分别转染模拟物对照、模拟物、抑制剂对照和抑制剂，6h后吸去含转染试剂的培养基并用1ml枪头在每孔细胞中央以相同的力度划一道线，之后用PBS缓冲液清洗2次洗去脱落的细胞，镜下拍照并保存，记录拍照的地方以保证之后拍照都是同一个地方，24h后再次拍照保存。图片用image J软件分析计算划痕的面积。
1.8 Transwell细胞迁移实验
Transwell细胞迁移实验用于检测miR-15a-5p转染后对细胞迁移能力的影响。预处理后，用胰蛋白酶消化HRMECs，并将8000个细胞接种入小孔上室，培养24小时后，用PBS洗涤三次。然后用PFA固定细胞并使用0.01%结晶紫缓冲液染色细胞。在显微镜下随机选择5个视野，并计数发生迁移的细胞数量。
1.9内皮细胞管腔形成实验
将Matrigel基质胶（Corning公司，货号354234）在4℃下融化12小时，在48孔细胞板的表层铺适量的基质胶，为管腔形成提供支持。然后在37℃下在固化40分钟。预处理后，将HRMECs接种到涂有Matrigel的48孔板中。3小时后，使用反相显微镜采集每个孔的五个区域。使用image-J软件计算血管管腔的总长度和管腔节点个数。
1.10免疫荧光细胞染色
预处理后，将HRMECs固定在4%多聚甲醛中15分钟，并在PBS中用0.1Triton-X100（PBST）浸泡15分钟。在室温下用5%牛血清白蛋白（BSA）封闭后，将细胞与一级抗体波形蛋白（1:300，Abcam，ab45939）、a-SMA（1:500，Abcam，ab124964）、CD31（1:150，Abcam，ab24590）在4℃下孵育过夜。用PBST洗涤三次后。然后在室温下将细胞与Alexa fluorR 488缀合的山羊抗兔IgG H&L（1：1000 Abcam）孵育波形蛋白，与'Alexa fluorB-647缀合的羊抗小鼠IgG H&L（1：1000，Abcam。用4，6-二氨基-2-苯基吲哚（1:500，Solarbio）标记细胞核。在共聚焦激光扫描显微镜（LSM800，蔡司德国）下观察并拍摄细胞。
2.miR-15a-5p靶基因的筛选和验证
2.1.靶基因预测
在三个数据库TargetScan, PITA, microRNAorg中分别预测筛选出的差异miRNA的靶基因。
2.2双荧光素酶报告基因实验
使用荧光素酶报告基因测定来验证Smad2是否为miR-15a-5p的靶基因。双荧光素酶报告质粒：构建了pmIRGLO-Smad2野生型和pmIRGLO-Smad2突变体，空载质粒作为对照质粒。将报告质粒与miR-15a-5p模拟物或乱序对照共转染到HEK-293细胞中。转染48小时后，根据双荧光素酶报告物测定系统（Gene Pharma公司，货号G06001）的步骤裂解细胞并收集上清液。TECAN Infinite 200（德国）用于检测萤火虫荧光素酶报告基因和雷尼拉荧光素酶报告基因的活性。萤火虫荧光素酶的比率，以Renilla荧光素酶为相对荧光素酶活性。每个实验重复3次。
3. 动物实验操作
3.1小鼠OIR模型的建立
C57BL/6J小鼠用于建立氧诱导的新生血管性视网膜病变模型。新生小鼠和哺乳期雌性小鼠在乳鼠出生后第7天（P7）至第12天（P12）暴露于75%氧气中。第12天从氧舱中取出，放置于常氧中。由于缺氧会导致新生血管生成，在出生后第17天（P17），达到视网膜新生血管的高峰。其间伴随视网膜炎症、神经损伤及纤维化改变。
3.2 小鼠玻璃体腔注药
在第12天使用34号针头（Hamilton，Reno，NV，United States）将浓度为1μg的经修饰的miR-15a-5p模拟物（Agomir）注射到小鼠玻璃体腔中。将相同数量的小鼠注射乱序的Agomir作为阴性对照组。或者，将1μl腺相关病毒注射到小鼠玻璃体腔中，滴度为1×1012。注射后使用抗生素凝胶覆盖眼表防止角膜水肿。
3.3小鼠视网膜对修饰及未修饰的miR-15a-5p的吸收差异
雄性6周龄的C57BL/6J小鼠用于该实验，麻醉后使用34号针头（Hamilton，Reno，NV，United States）将浓度为1μg（Genepharma公司）的未经修饰的miR-15a-5p模拟物（mimics）或者经修饰的miR-15a-5p模拟物（Agomir）注射到小鼠玻璃体腔中，将相同数量的小鼠注射PBS作为阴性对照组。在注射后8小时，24小时，48小时，5天和7天取视网膜进行miR-15a-5p水平的检测。
3.4视网膜铺片
在P17处死OIR小鼠，取出其眼球。剥离视网膜，用4%多聚甲醛固定，并切成4个放射状瓣。使用山羊血清封闭2小时，使用IB4（Thermo，货号I21411）或者GFAP进行视网膜血管染色。清洗5小时后，使用羊抗兔IgG（Abcam 150077）作为二抗进行染色，清洗5小时后使用抗荧光衰减封片剂进行封片。使用共焦激光扫描显微镜（LSM800，德国蔡司）拍摄视网膜血管图像。使用Photoshop进行新生血管和无灌注区的量化分析。
3.5组织免疫荧光染色。
将眼球解剖并在包埋胶中快速冷冻。将视网膜切片（8μm），并在室温下在4%多聚甲醛中固定20分钟。然后在4℃下分别与抗胶质纤维酸性蛋白（GFAP）抗体（Abcam，货号ab7260）α-SMA（Abcam，货号ab1224964），Fibronectin（Abcam，货号ab45688），IB4（Thermo，货号I21411）孵育过夜。用PBS洗涤三次后，将视网膜切片与Alexa Fluor 488缀合的IgG（Abcam，货号ab150077）孵育2小时，用PBS洗涤三次后，用4，6-二氨基-2-苯基吲哚（1:500，Solarbio）标记细胞核。用PBS洗涤三次后滴加抗荧光衰减封片剂，用盖玻片密封。然后用共焦激光扫描显微镜（LSM800，德国蔡司）对它们进行拍照。
3.6TUNEL分析
根据制造商的说明，使用TUNEL系统（Roche，货号11684795910）对视网膜冷冻切片进行TUNEL测定。
3.7蛋白质印迹分析
经BCA定量后，取等量的蛋白样品，加入PBS定容到20μl，加入5 μl蛋白上样缓冲液（5×），95℃加热，5分钟。蛋白电泳条件为100V，90min。电转条件为100V，100min。将电转后的PVDF膜取出，封闭，过夜孵育一抗。弃去一抗，洗涤3次。加入二抗，室温摇床孵育2小时。弃去二抗，加入TBST，洗涤3次，每次10分钟。使用ECL超敏发光液进行显影。
3.8组织病理学和免疫组织化学
在P17从安乐死小鼠中摘除眼睛，在P25和P42脱颈处死小鼠，取肾脏，肝脏进行固定。使用苏木精和伊红（H&E）方案对标本进行染色，并使用光学显微镜进行成像。
3.9视网膜电图（ERG）
小鼠暗适应18小时，按照说明书（Phoenix Micron VI）进行操作，并以0.01至1cd-s/m的范围发出白光闪光。使用陷波滤波来降低60 Hz的信号噪声；将低切滤波设置为0.3 Hz；将高切滤波设置在500 Hz。测量a波和b波的振幅。麻醉小鼠使用带有加热垫，并根据需要用一滴平衡盐水溶液湿润眼睛。
3.10OCT
使用德国海德堡SPECTRALIS-OCT观察小鼠眼底结构改变情况。使用托吡卡胺以滴眼液对小鼠双眼进行散瞳，待小鼠进入麻醉平稳期后，在小鼠眼部涂抹玻璃酸钠凝胶，进行视网膜扫描。扫描图像以小鼠视盘为中心，进行视网膜全层厚度的扫描。
3.11 激光诱导的小鼠脉络膜新生血管的模型建立
雄性6周龄的C57BL/6J小鼠用于该实验，麻醉后散大瞳孔，使用Phoenix激光发射器对准视网膜进行激光照射，破坏视网膜色素上皮层及脉络膜。7天后由脉络膜发出新生血管侵袭视网膜。
3.12 小鼠视网膜下注药
雄性6周龄的C57BL/6J小鼠用于该实验，麻醉后散大瞳孔，使用34号针头（Hamilton，Reno，NV，United States）从角巩膜缘进针，挑起视网膜将1μl腺相关病毒注射到小鼠视网膜下，滴度为1×1012。注射后使用抗生素凝胶覆盖眼表防止角膜水肿。
3.13 眼底照相及眼底荧光造影
取激光诱导的新生血管模型鼠，麻醉后散大瞳孔，在透明凝胶的帮助下，使用Phoenix眼底镜头对准视盘中心进行拍照。随后经腹腔注射10%荧光素钠（5mL/kg），10分钟后，在暗场滤镜下进行眼底照相显示渗漏斑。
3.14脉络膜新生血管量化
在成模后7天脱颈处死OIR小鼠，取出其眼球。剥离脉络膜，用4%多聚甲醛固定，并切成4个放射状瓣。使用山羊血清封闭2小时，使用IB4（Thermo，货号I21411）进行脉络膜血管染色。清洗5小时后，使用抗荧光衰减封片剂进行封片。使用共焦激光扫描显微镜（LSM800，德国蔡司）拍摄脉络膜血管图像。使用Photoshop进行新生血管量化分析。
4. 眼内注射miR-15a-5p对小鼠发育的安全性评估
4.1血液本的采集
眼球后采集血样，通过2000g离心15分钟，分离血清，然后在-80℃下储存。将肝脏、脾脏、大脑、肾脏解剖出来，
4.2 组织病理学检测
将主要器官样品（肝脏、脾脏、肾脏）用4%中性缓冲多聚甲醛固定24小时，将样品石蜡包埋，在3μm处切割并用苏木精和伊红染色。使用奥林巴斯BX51显微镜和奥林巴斯DP71CCD相机（日本东京奥林巴斯公司）拍摄显微照片
4.3 血清生化参数的测定
通过市售检测试剂盒测定肌酐（Elabscience，货号EBCK188M、尿素氮（Elabscience，货号EBCK183M）、甘油三酯（Elabscience，货号EBCK126M）、总胆固醇（Elabscience，货号EBCK109S）的血清浓度。根据制造商的说明计算每个参数的浓度。
另外，文本中使用的试剂来源：
Mimics（miR-15a-5p模拟物）购自上海吉玛制药技术有限公司，货号B02001；
Agomir（Agomir-15a-5p模拟物）购自上海吉玛制药技术有限公司，货号B06001；结构为：正义链为SEQ ID NO：1，反义链为SEQ ID NO：6再进行5'端2个硫代骨架修饰，3'端4个硫代骨架修饰，3'端胆固醇修饰以及全链甲氧基修饰。
Inhibitor（miR-15a-5p抑制剂）购自上海吉玛制药技术有限公司，货号B03001；
Smad2-WT载体购自上海吉玛制药技术有限公司，货号C09005-36176；
Smad2-mut载体购自上海吉玛制药技术有限公司，货号C09006-36176。
VEGF-WT载体购自上海吉玛制药技术有限公司，货号C09005-56969；
VEGF-mut载体购自上海吉玛制药技术有限公司，货号C09006-56969。
腺相关病毒购自上海吉玛制药技术有限公司，货号D08001。
实施例1：向视网膜血管内皮细胞转染miR-15a-5p的模拟物或抑制剂可以分别升高和降低miR-15a-5p的表达水平
miRNA的模拟物和抑制剂可以在体外模拟其生物学作用，miR-15a-5p的模拟物是体外合成的miR-15a-5p的碱基序列，miR-15a-5p的抑制剂是体外合成的miR-15a-5p的碱基互补序列。
miR-15a-5p的模拟物：
正义链：UAGCAGCACAUAAUGGUUUGUG（SEQ ID NO：1）；
反义链：CACAAACCAUUAUGUGCUGCUA（SEQ ID NO：6）。
首先要确定使用lipofectamine 3000助转染剂转染miR-15a-5p的模拟物或抑制剂确实能够升高或降低细胞中miR-15a-5p的表达水平。qRT-PCR的结果显示与模拟物对照组（模拟物的乱序）相比，转染miR-15a-5p的模拟物可以将细胞内miR-15a-5p的含量提高约150倍（图1），且差异有统计学意义（P<0.05）。与抑制剂对照组（抑制剂的乱序）相比，转染miR-15a-5p抑制剂的细胞内miR-15a-5p的含量下降了80%（图1），差异有统计学意义（P<0.05）。
视网膜及脉络膜含有大量的血管，其中内皮细胞是维持血管通透性的重要细胞。因此选取视网膜内皮细胞（HRMECs）进行实验具有代表性。实施例1表明在体外向HRMECs转染miR-15a-5p的模拟物和抑制剂可以高表达或者降表达miR-15a-5p，为后续观察miR-15a-5p对细胞的作用提供研究基础。
实施例2：VEGF刺激视网膜血管内皮细胞引起病理性增殖的最佳浓度
VEGF是已知的诱导体内体外血管新生的强效因子，在早产儿视网膜病变，糖尿病视网膜病变，脉络膜新生血管中具有较强的致病作用。在体外实验中，VEGF作用于HRMECs可以建立病理性增殖的模型。因此需要确定VEGF刺激的浓度。选择了0、10、20ng/mL的VEGF分别刺激HRMECs，CCK-8检测结果显示10ng/mL以上浓度均可以引起HRMECs显著增殖（图2），同时该浓度不会引起HRMECs中miR-15a-5p表达量发生变化（图3）。
实施例3：miR-15a-5p在体外对视网膜血管内皮细胞病理性增殖的治疗作用
在确定10ng/mL的VEGF可引起HRMECs病理性增殖且miR-15a-5p表达水平不变后，继续研究miR-15a-5p在生理及病理条件（10ng/mL的VEGF）下对HRMECs的作用。CCK-8实验是对细胞增殖分裂活力进行测定的常用方法，结果显示，miR-15a-5p模拟物可以降低VEGF引起的细胞异常增殖（图4）。细胞划痕实验结果显示，miR-15a-5p模拟物可以减弱VEGF诱导的细胞增殖（图5-图6）。Transwell实验目的是观察细胞的迁移能力，结果显示miR-15a-5p模拟物可以减弱VEGF诱导的细胞异常迁移（图7-图8）。管腔形成实验模拟的是细胞在体外形成管腔的能力，结果显示miR-15a-5p模拟物可以减弱VEGF诱导的管腔增多（图9-图11）。以上差异均具有统计学意义（P<0.05）。
VEGF可以在体内引起内皮细胞增殖，进而诱导新生血管的发育，新生血管不同于生理性血管，新生血管壁缺少紧密连接，其内物质通过管壁渗漏到视网膜及玻璃体中，造成眼底渗出及出血，极大的影响了正常的视功能。在体外向HRMECs转染miR-15a-5p模拟物后，可以减少VEGF诱导的细胞异常增殖、迁移及管腔形成。这表明miR-15a-5p模拟物在体外对HRMECs的病理性增殖具有显著的治疗作用。
实施例4：小鼠视网膜对修饰后的miR-15a-5p模拟物的吸收更好
常见的miRNA的模拟物为mimic，其是由未经修饰的碱基组成，在体外，细胞对其有良好的吸收效果。在体内实验中，未经修饰的碱基容易被体内无处不在的核酸酶降解，因此，本实施例采用修饰后的miRNA，例如添加胆固醇等修饰。为对比视网膜对修饰及未修饰的模拟物的吸收效果，本实施例对比了小鼠在不同时间吸收同样量miR-15a-5p模拟物的效率。其中，经修饰的模拟物为Agomir。结果如图12所示，注射模拟物24小时后，出现明显差异，Agomir具有良好的组织相容性，视网膜对Agomir的吸收效果为mimic的2.5倍，并且高水平持续至注射后第7天。因此在后续动物实验中，选取Agomir（Agomir-15a-5p）作为miR-15a-5p的模拟物进行体内注射。
实施例5：miR-15a-5p对高氧诱导的小鼠视网膜新生血管的治疗作用
为探究miR-15a-5p对新生血管的作用，选择了氧诱导视网膜病变（OIR）模型，模型构建流程图见图13，该模型是最常用的视网膜新生血管模型，模拟视网膜新生血管（RNV）形成的病理过程。在此过程中，选取生长发育的时间点，检测视网膜中miR-15a-5p的表达水平，结果如图14所示，在新生血管的高峰期，出生后14天和17天，miR-15a-5p的表达水平升高，差异有统计学意义。随后为探索miR-15a-5p对体内新生血管的作用，首先设置Agomir-15a-5p模拟物的浓度梯度，在出生后第12天注射不同剂量的模拟物和模拟物对照，在出生后第17天经IB4染色视网膜新生血管分析。结果表明Agomir-15a-5p对新生血管的抑制作用具有剂量依赖性（图15-图16），0.5μg-1.5ug的Agomir-15a-5p模拟物可显著抑制视网膜新生血管（图15-图16）。随后选取1μg作为治疗浓度进行进一步验证，同时选取VEGF单抗作为阳性对照，结果表明Agomir-15a-5p模拟物可以降低视网膜新生血管至对照组的65%（图17-图18）。相比于VEGF单抗，Agomir-15a-5p模拟物还可以促进视网膜无灌注区的恢复，视网膜无灌注区的面积减少至对照组的73%（图17和图19）。
腺相关病毒是高效的基因递送工具，使用腺相关病毒可以感染视网膜细胞，使其高表达miR-15a-5p。其中，腺相关病毒携带的核酸序列为TAGCAGCACATAATGGTTTGTG（SEQ IDNO：9），其可以在体内转录为miR-15a-5p后发挥治疗作用。
在氧诱导小鼠出生后第五天，进行球内注射包含miR-15a-5p的腺相关病毒（1×1012）以及对照病毒（1×1012）。病毒结构如图20所示，在第12天取材视网膜，通过眼球冰冻切片观察腺相关病毒感染的部位，图21结果显示包含miR-15a-5p的腺相关病毒感染视网膜，视网膜出现弥散的荧光。随后通过PCR检测各组视网膜miR-15a-5p含量，结果如图22所示，注射了包含miR-15a-5p的腺相关病毒组视网膜的miR-15a-5p是对照组的13倍，说明该病毒可以成功过表达miR-15a-5p。在出生后第17天对氧诱导小鼠的视网膜新生血管进行定量，结果显示注射了包含miR-15a-5p的腺相关病毒组视网膜新生血管和无灌注区明显减少（图23-图25）。以上结果表明包含miR-15a-5p的腺相关病毒可以将miR-15a-5p成功递送到小鼠视网膜细胞中，并且对高氧诱导的小鼠视网膜新生血管具有治疗作用，可以促进无灌注区恢复。
实施例5采用了两种方法递送miR-15a-5p，一种是经修饰的miR-15a-5p，另一种是腺相关病毒。通过玻璃体腔注射两种物质分别达到了使视网膜中miR-15a-5p含量升高的目的。采取的氧诱导视网膜病变模型，是经典的眼底疾病模型，可以模拟多种眼底疾病，例如糖尿病视网膜病变和早产儿视网膜病变等疾病的新生血管表型。本实施例观察了miR-15a-5p对该模型的新生血管和无灌注区的治疗作用，发现miR-15a-5p对视网膜新生血管具有治疗作用，并且可以促进无灌注区恢复。
实施例6：miR-15a-5p对激光诱导的小鼠脉络膜新生血管的治疗作用
MiR-15a-5p对新生血管的抑制作用在脉络膜新生血管模型中也进行了验证。首先用激光诱导脉络膜新生血管模型，模型构建流程如图26所示，并向小鼠玻璃体腔注射Agomir-15a-5p的模拟物、模拟物对照和VEGF单抗。一周后，通过眼底荧光造影观察到与对照组相比，Agomir-15a-5p的模拟物及VEGF单抗组荧光渗漏面积明显减少，提示二者可抑制脉络膜新生血管的形成（图27-图28）。取脉络膜新生血管小鼠的脉络膜铺片行IB4染色以定量新生血管簇的面积（图29），经统计，Agomir-15a-5p的模拟物及VEGF单抗组两组可明显抑制脉络膜新生血管簇的形成（图30）。
在脉络膜新生血管模型中同样采取如图20所示的病毒进行miR-15a-5p的递送。其中，腺相关病毒携带的核酸序列为TAGCAGCACATAATGGTTTGTG（SEQ ID NO：9），其可以在体内转录为miR-15a-5p后发挥治疗作用。
在小鼠进行造模前7天，进行视网膜下注射包含miR-15a-5p的腺相关病毒（1×1012量）以及对照病毒（1×1012）。在注射后的第7天取材视网膜，通过眼球冰冻切片观察腺相关病毒感染的部位，图31结果显示包含miR-15a-5p的腺相关病毒感染视网膜和脉络膜，视网膜色素上皮层和脉络膜出现弥散的荧光。随后通过PCR检测各组视网膜脉络膜miR-15a-5p含量，结果如图32所示，注射了包含miR-15a-5p的腺相关病毒组视网膜脉络膜的miR-15a-5p是对照组的7倍，说明该病毒可以成功感染视网膜和脉络膜并过表达miR-15a-5p。在激光诱导后的第7天进行小鼠视网膜新生血管定量，结果显示注射了包含miR-15a-5p的腺相关病毒组视网膜新生血管明显减少（图33-图34）。以上结果表明包含miR-15a-5p的腺相关病毒可以将miR-15a-5p成功递送到小鼠视网膜脉络膜细胞中，并且对激光诱导的小鼠视网膜新生血管具有治疗作用。
实施例6同样采用了两种方法递送miR-15a-5p，一种是经修饰的miR-15a-5p，另一种是腺相关病毒。通过眼内注射两种物质分别达到了使视网膜脉络膜中miR-15a-5p含量升高的目的。采取的激光诱导脉络膜新生血管模型，可以模拟脉络膜新生血管。本实施例观察了miR-15a-5p对该模型的新生血管的治疗作用，发现miR-15a-5p对脉络膜新生血管具有治疗作用。
实施例7：miR-15a-5p对氧诱导的小鼠视网膜结构和功能损伤的治疗作用
实施例5表明miR-15a-5p可恢复OIR视网膜的早期血流灌注，这对视网膜神经细胞的营养及发育至关重要。本实施例继续从视网膜厚度及视神经功能两个方面进行miR-15a-5p对视网膜保护作用评估。首先通过光学相干层析成像OCT来量化视网膜各层厚度（图35-图36），结果显示，Agomir-15a-5p模拟物可明显改善氧诱导小鼠的视网膜变薄，而VEGF单抗组视网膜厚度与未处理小鼠无明显差异，无法改善氧诱导小鼠的视网膜变薄（图37）。视网膜电生理检测（ERG）广泛用于视网膜功能的评估，分别在早期（小鼠出生后25天）及晚期（小鼠出生后42天）观察了Agomir-15a-5p模拟物对氧诱导小鼠视网膜功能的治疗作用（图38）。与未处理的常氧组相比，氧诱导各组小鼠视网膜的a波及b波振幅均降低。但氧诱导组视网膜经Agomir-15a-5p模拟物治疗后均明显增加了早期及晚期a波及b波振幅。而VEGF单抗对氧诱导小鼠视网膜的神经功能损伤无治疗作用（图39）。采用H&E染色可以直观的观察到视网膜的结构改变，图40显示Agomir-15a-5p模拟物治疗组小鼠视网膜结构完整，外丛状层厚度正常，而VEGF单抗组小鼠外丛状层明显变薄。因此Agomir-15a-5p模拟物可明显改善氧诱导小鼠视网膜结构和功能的损伤。
视网膜是神经组织的一部分，其主要功能为将光信号转化为电信号并传导至大脑。视网膜的结构是正常发挥视功能的基础，视功能直接决定了患者的视力。各种眼底病变均伴随视网膜结构和功能的损耗。本实施例采取的氧诱导的视网膜病变模型，在发病后出现明显的视网膜变薄及电生理功能减弱，而眼内给药miR-15a-5p后，视网膜结构和神经功能均有显著改善，并且优于VEGF单抗组。
实施例8：miR-15a-5p对激光诱导的小鼠脉络膜视网膜结构和功能损伤的治疗作用
使用H&E染色评估视网膜层间结构、细胞形态和脉络膜新生血管的病灶。结果如图41所示，在对照组中，脉络膜发出新生血管长入视网膜层下，视网膜局部隆起。Agomir-15a-5p模拟物治疗组隆起较少，病灶基本消失，VEGF单抗组有少许病灶残留。使用ERG评估脉络膜新生血管小鼠视网膜电生理功能，结果如图42-图43显示，Agomir-15a-5p模拟物治疗组大幅改善脉络膜新生血管小鼠视网膜功能损伤，VEGF单抗组对视网膜功能损伤无显著治疗作用。
本实施例采取的激光诱导的脉络膜视网膜损伤模型，在发病后也出现明显的视网膜变薄及电生理功能减弱，而眼内给药miR-15a-5p后，视网膜结构和神经功能均有显著改善，并且优于VEGF单抗组。
实施例9：miR-15a-5p对高氧诱导和激光诱导的小鼠视网膜炎症的治疗作用
氧诱导的小鼠视网膜病变伴随炎症水平的增加，为探究miR-15a-5p对小鼠视网膜炎症的治疗作用，在P17、P25、P42取视网膜检测TNFα表达水平，图44结果显示，注射Agomir-15a-5p模拟物组小鼠在P17时TNFα蛋白表达水平降低，VEGF单抗组对视网膜TNFα水平升高无治疗作用。在P25和P42两个时间点各组间无统计学差异。细胞间粘附分子1 (ICAM-1)通常表达于内皮细胞和免疫细胞，对白细胞迁移和活化具有关键作用。氧诱导鼠视网膜ICAM-1表达水平升高，注射Agomir-15a-5p模拟物组小鼠ICAM-1表达水平降低（图45-图46）。激光诱导的小鼠眼底出现脉络膜新生血管，该病变伴随视网膜脉络膜的炎症水平的增加。图47结果显示，注射Agomir-15a-5p模拟物可以降低激光诱导的各组小鼠视网膜炎症因子水平。而VEGF单抗组对激光诱导的各组小鼠视网膜炎症无治疗作用。
眼底疾病常伴随炎症因子的表达水平升高，导致视网膜脉络膜疾病加重并迁延不愈。TNFα和IL-1常是经典的致炎因子，募集炎症细胞聚集。ICAM-1是内皮细胞黏附分子，可以募集白细胞黏附到内皮细胞表明，增加血管通透性。本实施例检测了不同治疗节点视网膜的炎症因子水平，结果表明眼内给药miR-15a-5p可以明显减少视网膜脉络膜的炎症因子的表达水平。VEGF单抗组并未显示明显的改善视网膜炎症的效果。
实施例10：miR-15a-5p靶向调节VEGF
miR-15a-5p是一段碱基序列，其调控下游基因的方式为碱基互补配对结合在目标基因的RNA上，阻碍目标基因翻译为蛋白质的过程。本实施例通过体内体外实验，观察miR-15a-5p对VEGF的靶向调节作用。体外实验使用未经修饰的miR-15a-5p模拟物（mimics），体内实验使用经修饰的miR-15a-5p模拟物（Agomir）。通过碱基互补配对发现miR-15a-5p可以与VEGF的mRNA特异性结合（图48），因此后续实施例分别在细胞和动物中进行验证。视网膜色素上皮（RPE）细胞是眼内VEGF的来源之一，已知TGF-β1可以在体外引起RPE细胞分泌的VEGF水平升高，因此向RPE细胞转染miR-15a-5p模拟物，并使用TGF-β1诱导VEGF分泌，结果显示，miR-15a-5p可以减少TGF-β1诱导的VEGF表达增加，图49示VEGF mRNA水平，图50-图51示VEGF蛋白水平，图52示RPE细胞上清中的VEGF蛋白水平。图53示双荧光素酶报告实验，野生的VEGF mRNA可以与miR-15a-5p结合，突变型的VEGF无法与miR-15a-5p结合，因此荧光仅在结合了的组中发生淬灭，提示miR-15a-5p可以特异性调控VEGF转录。图54-图55示玻璃体腔注射Agomir-15a-5p模拟物可以逆转高氧诱导的小鼠视网膜VEGF表达水平增加。图56示玻璃体腔注射Agomir-15a-5p模拟物可以逆转激光诱导的小鼠视网膜VEGF的mRNA表达水平增加。
实施例11：miR-15a-5p相较VEGF单抗可以更长时间抑制视网膜ERK磷酸化信号激活
miR-15a-5p特异性结合VEGF的mRNA抑制VEGF转录。VEGF单抗拮抗VEGF蛋白，二者原理不同。因此在对比二者疗效时，可以选择VEGF下游信号通路的激活情况进行观察。VEGF与其受体VEGFR2特异性结合后，通过磷酸化ERK等信号通路，激活内皮细胞增殖。因此选择ERK磷酸化信号通路作为观察指标。
注射及取材示意图见图57中A图。结果显示，高氧诱导组小鼠在注射当天即P12，视网膜出现磷酸化ERK信号增强（图57中B图和图57中I图）；在注射后第一天，即P13，VEGF单抗组小鼠视网膜磷酸化ERK信号首先出现降低趋势（图57中C图和图57中J图）；在注射后第二天，即P14，VEGF单抗和Agomir-15a-5p模拟物组均出现磷酸化ERK信号降低趋势（图57中D图和图57中K图）；在注射后的第四天，即P15，VEGF单抗组ERK磷酸化信号恢复高水平，而Agomir-15a-5p模拟物组保持磷酸化ERK信号降低趋势，且二者之间存在统计学差异（图57中E图和图57中L图）；新生血管的高峰期，P17同P15，Agomir-15a-5p模拟物组保持磷酸化ERK信号降低趋势，VEGF单抗组无抑制作用，且二者之间存在统计学差异（图57中F图和图57中M图）；新生血管恢复期即P20和P25，各组视网膜之间磷酸化ERK信号无显著差异（图57中G图、图57中H图、图57中N图和图57中O图）。在上述过程中ERK的总蛋白水平无明显差异，因此将各时间段磷酸化ERK信号的相对变化做折线图。图57中P图可以明显看出，未治疗组小鼠视网膜ERK的磷酸化信号自P13起升高，到P17逐渐降低，一直处于最高水平，VEGF单抗组在P13相较于Agomir-15a-5p模拟物抑制ERK磷酸化程度更高，但自P14起，Agomir-15a-5p模拟物抑制ERK磷酸化程度高于VEGF单抗，并在P15和P17和VEGF单抗组比较，差异有统计学意义。二者在P17时差距达到高峰，在P20和P25对ERK磷酸化均无抑制效果。这表明miR-15a-5p通过结合VEGF的mRNA能够更持久的抑制ERK信号通路，从而减少病理性新生血管的生成。
实施例12：miR-15a-5p靶向调节Smad2减少视网膜内皮细胞间充质转化
通过碱基互补配对发现miR-15a-5p可以与Smad2的mRNA特异性结合（图58），因此后续实施例分别在细胞和动物中进行验证。体外实验使用未经修饰的miR-15a-5p模拟物（mimic），体内实验使用经修饰的miR-15a-5p模拟物（Agomir）。首先在视网膜内皮细胞中转染了miR-15a-5p的模拟物和抑制剂，经PCR（图59）、Western Blot（图60-图61）实验表明，miR-15a-5p可抑制Smad2的RNA和蛋白表达水平，而miR-15a-5p的抑制剂可促进Smad2的RNA和蛋白表达水平。这提示miR-15a-5p可调节Smad2的表达。而为了确定miR-15a-5p与Smad2的直接结合，通过双荧光素酶报告进行验证（图62）。结果表明，与对照组相比，miR-15a-5p模拟物显著降低了Smad2野生型载体的荧光素酶活性，对突变型Smad2的荧光素酶活性没有任何影响。因此，miR-15a-5p通过结合Smad2 3’UTR抑制其转录及表达，即Smad2是miR-15a-5p的直接调控靶点。
在眼底疾病中，例如糖尿病视网膜病变，新生血管性视网膜疾病，脉络膜新生血管，增殖性玻璃体视网膜病变等疾病都伴随着视网膜纤维化的病理改变。而Smad2作为TGF-β信号通路中的一环，是典型的促纤维化通路蛋白。因此为了验证miR-15a-5p能否通过抑制Smad2抑制视网膜纤维化的发生，使用TGF-β1刺激视网膜内皮细胞诱导内皮-间充质转化（EndoMT）模型模拟视网膜纤维化改变，并向细胞内转染miR-15a-5p模拟物，观察miR-15a-5p模拟物对EndoMT的抑制作用。
通过细胞免疫荧光染色（图63-图64）和Western Blot（图65-图66）实验可以直观的观察到，TGF-β1刺激内皮细胞后，纤维化的标志物波形蛋白和α-SMA表达明显增高，而内皮细胞标志物CD31表达降低。这表明TGF-β1诱导内皮细胞向纤维细胞转化，也就是发生了EndoMT。而转染miR-15a-5p模拟物逆转了TGF-β1诱导后波形蛋白、α-SMA表达增高以及CD31表达降低。因此，miR-15a-5p可以通过抑制Smad2的磷酸化及总Smad2的表达而逆转TGF-β1所诱导的EndoMT（图67-图68）。
实施例13：miR-15a-5p靶向调节Smad2减少视网膜Müller细胞纤维化
Müller细胞是贯穿整个视网膜的一种特化的神经胶质细胞，具有维持视网膜的正常结构和功能的作用，还参与多种病理过程，尤其是眼底增殖性病变，如视网膜新生血管、糖尿病视网膜病变等，体外培养Müller细胞是研究这些增殖性眼底病变的途径之一。TGF-β2可以在体外刺激Müller细胞出现纤维化的表型。图69和图70结果显示1ng/mL的TGF-β2可以引起Müller细胞活化伴随纤维化相关蛋白表达水平升高。因此本实施例采取1ng/mL的TGF-β2进行造模。向Müller细胞转染了miR-15a-5p的模拟物及模拟物对照，随后加入1ng/mL的TGF-β2进行共培养，结果显示转染了miR-15a-5p的模拟物的Müller细胞GFAP表达水平降低，纤维化相关蛋白表达水平降低（图71和图72）。由于在视网膜内皮细胞中证实miR-15a-5p可以靶向调节Smad2减少TGFβ信号通路活化，因此在Müller细胞中进行验证，图73显示转染了miR-15a-5p的模拟物的Müller细胞总Smad2表达水平降低，磷酸化信号减弱（图74）。因此miR-15a-5p可以靶向调节Smad2表达减少视网膜Müller细胞纤维化。
实施例14：miR-15a-5p靶向调节Smad2减少高氧诱导小鼠视网膜纤维化趋势
在高氧诱导小鼠玻璃体腔中注射Agomir-15a-5p模拟物，模拟物对照以及VEGF单抗。在P17取小鼠的眼球进行冰冻切片，并提其蛋白进行Western Blot检测。图75示α-SMA和视网膜血管在视网膜上的表达共定位情况，可见高氧小鼠对照组α-SMA表达水平更高，与血管共定位，而玻璃体腔中注射Agomir-15a-5p模拟物组α-SMA表达水平更低，视网膜共定位少。图76示纤维连接蛋白和视网膜血管的表达定位，高氧小鼠对照组纤维连接蛋白表达水平更高，与血管共定位，而玻璃体腔中注射Agomir-15a-5p模拟物组纤维连接蛋白表达水平更低，视网膜共定位少，VEGF单抗组纤维连接蛋白表达水平更高。图77示α-SMA和视网膜活化的Müller细胞表达定位，其中GFAP示活化的Müller细胞。结果显示高氧小鼠对照组和VEGF单抗组的α-SMA和视网膜活化的Müller细胞共定位更显著。这表明Agomir-15a-5p模拟物可以抑制视网膜的纤维化趋势，而VEGF单抗会加重视网膜的纤维化趋势。Western Blot检测结果见图78，进一步证实miR-15a-5p可以减少视网膜纤维化蛋白的表达水平，减少视网膜纤维化改变。而VEGF单抗治疗加重了视网膜纤维化病变。
实施例15：miR-15a-5p通过拯救星形胶质细胞为内皮顶端细胞的生长提供模板
氧诱导小鼠模型视网膜存在大量无灌注区，是由于高氧造成的视网膜血管退化，与糖尿病视网膜病变患者视网膜无灌注区类似。在视网膜发育过程中，星形胶质细胞为血管提供生长模板，血管顶端细胞发出细小的丝，攀附在星形胶质细胞上，发育成完整的血管。实施例5表明miR-15a-5p可以促进氧诱导小鼠视网膜无灌注区恢复，而VEGF单抗并不具备促进无灌注区恢复的效果。因此对氧诱导小鼠视网膜进行血管染色，同时染色星形胶质细胞。图79中A图显示常氧组小鼠视网膜没有无灌注区，高氧组小鼠使用模拟物治疗组无灌注区最小。血管染色、星形胶质细胞的染色、模拟物对照以及VEGF单抗治疗组小鼠视网膜无灌注区星形胶质细胞排列紊乱，无法为血管提供模板，而模拟物治疗组的星形胶质细胞排列整齐。图79中B图将血管进一步放大，可以明显的观察到模拟物组血管顶端细胞发出细丝，而对照组和VEGF单抗组细丝较少（箭头）。图79中C图为血管和星形胶质细胞的双染放大图，在常氧组可以明显观察到星形胶质细胞与血管的攀附情况，模拟物对照组缺少丝状的星形胶质细胞（箭头），因此血管无法正常生长，模拟物组血管顶端细胞与星形胶质细胞存在攀附，有利于血管生长，而VEGF单抗组也缺乏血管顶端细胞丝状缠绕。
在临床应用中，VEGF单抗作为一线用药，需要进行多次玻璃体腔注射，在接受多次注射后，患者存在周边视野缺损，视网膜变薄，视功能下降等副作用。本实施例证实miR-15a-5p相较于VEGF单抗治疗可以促进星形胶质细胞存活，为血管发育提供模板，加速无灌注区恢复，改善视网膜功能。
实施例16：miR-15a-5p对氧诱导小鼠发育的安全性评估
实施例5和实施例7确定了玻璃体腔注射Agomir-15a-5p模拟物对氧诱导小鼠的新生血管的治疗作用后，应对其药物安全性进行评估，以确定这种治疗方案对小鼠的生长发育、代谢及重要脏器有无不良影响。图80中A图显示自给药当天P12（出生后第12天）至小鼠基本成年P42（出生后42天），小鼠的体重变化。结果表明，从出生后15天开始常氧组小鼠的体重增长率明显高于高氧的三组小鼠，但从给药至成年，高氧的三组小鼠体重增长率无明显差异（图80中A图），因此玻璃体腔注射Agomir-15a-5p模拟物不会对高氧组小鼠的生长发育产生不良影响。为进一步观察玻璃体腔注射Agomir-15a-5p模拟物的安全性，分别在P17、P25、P42三个时间点收集小鼠的血清，检测总胆固醇、甘油三酯、肌酐及尿素氮等指标，评估各组小鼠的肝肾功能。如图80中B图显示，VEGF单抗治疗组小鼠血浆颜色与其余各组颜色不同。说明VEGF单抗治疗可能对小鼠脂代谢产生影响。如图80中C图显示，与常氧组相比，在P17和P25两个时间点显示，高氧的三组小鼠血清肌酐水平明显降低，但各组间无明显差异，可能与体重较低有关。图80中D图表明，P17时，与其他组相比，VEGF单抗治疗组的小鼠血清尿素水平明显升高。P25时，高氧对照组小鼠血清尿素水平明显升高，Agomir-15a-5p模拟物治疗组与常氧组小鼠血清尿素含量无明显差异。图80中E图显示血浆甘油三酯结果，除P17时，VEGF单抗治疗组的小鼠血清甘油三酯水平明显升高，其余组间无明显差异。图80中F图显示总胆固醇的变化趋势，在P17时，高氧组的总胆固醇水平表达均高于常氧组，但高氧组各组间无明显差异。此外，使用H&E染色观察了P17、P25及P42小鼠的肝脏及肾脏结构（图80中G图和图80中H图）。以上结果说明玻璃体腔注射Agomir-15a-5p模拟物不会对高氧组小鼠的生长发育、代谢及脏器产生不良影响。而VEGF单抗眼内注射会导致模型组小鼠血脂代谢异常。
实施例17：miR-15a-5p对正常小鼠发育及视网膜的安全性评估
按照上述治疗方案对未造模的小鼠进行玻璃体腔注射。对各组小鼠进行体重检测，发现从P21开始，VEGF单抗组的体重呈下降趋势，P24时，体重下降显著，与其余三组差异有统计学意义，并持续至P42。而Agomir-15a-5p模拟物不会对正常小鼠的体重造成影响（图81中A图）。同样分别在P17、P25、P42三个时间点收集小鼠的血清，观察肌酐（图81中B图）、尿素氮（图81中C图）、甘油三酯（图81中D图）和总胆固醇（图81中E图）等指标，评估各组小鼠脂质代谢的肝肾功能。发现除VEGF单抗组在P17时甘油三酯水平较常氧组升高外，其余均无差异，这表明VEGF单抗影响小鼠的甘油三酯代谢。玻璃体腔注射荧光分子（CY3）标记的Agomir-15a-5p模拟物后，取小鼠肝肾进行检测，结果显示肝肾无明显荧光，表明Agomir-15a-5p模拟物未在肝肾残留（图81中F图）。取小鼠肾（图81中G图）肝（图81中H图）的组织切片进行H&E染色，结果显示无明显异常。给未造模小鼠行玻璃体腔注药，观察玻璃体腔注射Agomir-15a-5p模拟物对正常小鼠的眼部及生长发育是否有副作用。OCT结果显示Agomir-15a-5p模拟物对视网膜厚度无影响，但是VEGF单抗组小鼠视网膜变薄（图81中I图、图81中J图、图81中K图）。经GFAP染色显示，玻璃体腔注射Agomir-15a-5p模拟物不会引起胶质细胞的激活（图81中L图、图81中M图）。这表明玻璃体腔注射VEGF单抗会导致小鼠发育迟缓，血脂代谢异常，视网膜变薄。
实施例18：miR-15a-5p对糖尿病鼠视网膜神经损伤的保护作用
糖尿病患者血糖水平较高，对神经系统产生不可逆损伤。糖尿病患者的视功能下降明显，本实施例选取自发的糖尿病模型鼠（瘦素敲除鼠）作为视网膜神经变性的模型进行研究，观察miR-15a-5p眼内注射对神经变性的保护作用。给12周龄的小鼠行玻璃体腔注射Agomir-15a-5p模拟物，给同样数量的小鼠玻璃体腔注射模拟物对照。在16周使用视网膜电生理检测糖尿病小鼠的视网膜功能。结果表明，Agomir-15a-5p模拟物相较于其对照可以明显改善糖尿病鼠视网膜光感受器细胞（图82-图83）和双极细胞（图82和图84）的振幅强度，即Agomir-15a-5p模拟物对糖尿病鼠视网膜神经损伤具有保护作用。
上述18个实施例中，实施例1和实施例4表明，未经修饰的miR-15a-5p或修饰的miR-15a-5p具有生物活性，可在体外被细胞吸收，或者在体内被视网膜细胞吸收，并迅速发挥生物学作用。实施例2和实施例3表明，在体外，miR-15a-5p可以抑制病理性新生血管生成。实施例5-9表明，在体内，通过眼内给药的方式，miR-15a-5p可以抑制病理性新生血管、促进无灌注区恢复、减少视网膜炎症因子表达并促进神经损伤修复。VEGF是经典的促新生血管生成因子，参与多种眼底疾病的进展。实施例10表明miR-15a-5p可以直接靶向调节VEGF的mRNA表达水平，实施例11进一步对比了miR-15a-5p与VEGF单抗在抑制视网膜新生血管信号通路的持久度，结果表明miR-15a-5p可以更持久的发挥抑制作用。在眼底疾病中，例如糖尿病视网膜病变，新生血管性视网膜疾病，脉络膜新生血管，增殖性玻璃体视网膜病变等疾病都伴随着视网膜纤维化的病理改变。而Smad2作为TGF-β信号通路中的一环，是典型的促纤维化通路蛋白。实施例12-14表明miR-15a-5p通过抑制Smad2抑制视网膜纤维化的发生。实施例15表明miR-15a-5p可以拯救星形胶质细胞，为血管顶端细胞提供模板，相较于VEGF单抗可以明显促进无灌注区恢复，血管的灌注对于神经细胞的存活至关重要。实施例16-17评估了眼内注射miR-15a-5p和VEGF单抗对氧诱导的小鼠发育及正常小鼠发育的影响，结果表明VEGF单抗可导致正常小鼠体重降低，血脂异常，而miR-15a-5p对小鼠发育无不良影响。实施例18表明miR-15a-5p可以缓解糖尿病鼠视网膜神经变性。综上表明，miR-15a-5p或修饰的miR-15a-5p在治疗眼底疾病方面具有明确效果，在生物医药领域中具有非常好的应用和研究价值。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
Claims (22)
1.miR-15a-5p和/或修饰的miR-15a-5p在制备治疗和/或预防眼底疾病的产品中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的眼底疾病选自玻璃体病变、视网膜病变、视神经病变或脉络膜病变中的一种或两种以上。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的眼底疾病选自早产儿视网膜疾病、视网膜新生血管疾病、脉络膜新生血管疾病或糖尿病视网膜病变中的一种或两种以上。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的miR-15a-5p包括SEQ ID NO：1。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的产品包含miR-15a-5p或其模拟物和/或修饰的miR-15a-5p，或者，包含miR-15a-5p和/或修饰的miR-15a-5p的载体。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的载体为病毒载体或非病毒载体。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的病毒载体包括慢病毒载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、痘病毒载体或疱疹病毒载体中的一种或两种以上。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的非病毒载体包括脂质体、脂质纳米颗粒、聚合物、多肽、抗体、适配体或N-乙酰半乳糖胺中的一种或两种以上。
9.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的修饰的miR-15a-5p包括在碱基上进行的修饰。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述碱基的修饰位于反义链，包括3'端进行胆固醇修饰、5'端两个硫代骨架修饰、3'端四个硫代骨架修饰或全链甲氧基修饰中的一种或两种以上。
11.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的产品包含正义链和反义链，所述的正义链为SEQ ID NO：1，所述的反义链为SEQ ID NO：6。
12.一种包含转录为miR-15a-5p的核酸的载体，其特征在于，所述的miR-15a-5p包括SEQ ID NO：1。
13.根据权利要求12所述的载体，其特征在于，所述转录为miR-15a-5p的核酸包含SEQID NO：9。
14.根据权利要求12所述的载体，其特征在于，所述的miR-15a-5p或其模拟物包含正义链和反义链，所述的正义链为SEQ ID NO：1，所述的反义链为SEQ ID NO：6。
15.根据权利要求12所述的载体，其特征在于，所述的载体为病毒载体或非病毒载体。
16.根据权利要求15所述的载体，其特征在于，所述病毒载体包括慢病毒载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、痘病毒载体或疱疹病毒载体中的一种或两种以上。
17.根据权利要求15所述的载体，其特征在于，所述的非病毒载体包括脂质体、脂质纳米颗粒、聚合物、多肽、抗体、适配体或N-乙酰半乳糖胺中的一种或两种以上。
18.一种包含转录为miR-15a-5p的核酸的载体在制备治疗和/或预防眼底疾病的产品中的应用。
19.根据权利要求18所述的应用，其特征在于，所述的包含转录为miR-15a-5p的核酸的载体选自权利要求12-17任一所述的载体。
20.根据权利要求18所述的应用，其特征在于，所述的眼底疾病选自玻璃体病变、视网膜病变、视神经病变或脉络膜病变中的一种或两种以上。
21.根据权利要求18所述的应用，其特征在于，所述的眼底疾病选自早产儿视网膜疾病、视网膜新生血管疾病、脉络膜新生血管疾病或糖尿病视网膜病变中的一种或两种以上。
22.一种药物或药物组合物，其特征在于，所述的药物或药物组合物包括miR-15a-5p或其模拟物、修饰的miR-15a-5p或者权利要求12-17任一所述的载体，以及药学上可接受的辅料。
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