CN113186271A - 用于慢性心力衰竭的诊断和预后的方法 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及用于确定对象是否患有心力衰竭或处于患有心力衰竭风险之中的方法，所述心力衰竭特别地是左心室射血分数降低性心力衰竭(HFREF)和左心室射血分数保留性心力衰竭(HFPEF)，所述方法包括确定从对象获得的样品中观察到的选定miRNA的水平，并且其中与对照相比miRNA的水平改变指示对象患有心力衰竭或处于发生心力衰竭风险之中。本发明还包括基于从对象获得的样品中选定miRNA的改变来确定死亡或疾病发展至住院和死亡的风险改变的方法，及其试剂盒。
Description
本申请是申请日为2016年5月9日的PCT国际专利申请PCT/SG2016/050217进入中国国家阶段的中国专利申请号201680034445.9、发明名称为“用于慢性心力衰竭的诊断和预后的方法”的分案申请。
相关申请的交叉引用
本申请要求于2015年5月8日提交的新加坡专利申请No.10201503644Q的优先权权益，其内容出于所有目的而在此通过整体援引加入作为参考。
技术领域
本发明一般性地涉及分子生物学领域。特别地，本发明涉及使用生物标志物来检测和诊断心力衰竭。
背景技术
包括心力衰竭在内的心血管疾病是一个主要的健康问题，在全世界内占人死亡的约30％[1]。心力衰竭也是全球65岁年龄以上成人住院的主要原因[2]。处于中年的成人在其生命中发生心力衰竭的风险为20％。尽管治疗取得进展，但是心力衰竭的发病率和死亡率(5年约50％)仍然较高，并且在许多经济体中消耗约2％的卫生保健预算[3-6]。由于群体老龄化，例如糖尿病、肥胖的主要风险因素的流行率增加，以及急性心肌梗死和严重高血压的初期生存率增加，心力衰竭的流行率将会增加。
心力衰竭在传统上被视为收缩功能失效，并且左心室射血分数(leftventricular ejection fraction，LVEF)已被广泛用于限定收缩功能、评估预后和选择患者进行治疗干预。然而，认识到心力衰竭可以在正常或接近正常EF的存在下发生：所谓的“射血分数保留性心力衰竭(heart failure with preserved ejection fraction，HFPEF)”，其占心力衰竭的临床病例中的很大比例[7-9]。具有严重扩张和/或显著降低的EF的心力衰竭：所谓的“射血分数降低性心力衰竭(heart failure with reduced ejectionfraction，HFREF)”，是病理生理学和治疗方面得到最充分了解的心力衰竭类型[10]。HFREF患者与HFPEF患者之间存在一些流行病学差异。后者通常较年长且更常为女性，不太可能患有冠状动脉疾病(coronary artery disease，CAD)而更可能患有潜在的高血压[7,8,11]。另外，HFPEF患者不从血管紧张素转化酶抑制或血管紧张素受体阻滞获得与HFREF患者相似的临床益处[12,13]。心力衰竭的症状可能会突然发展为“急性心力衰竭”，导致入院，但其也可逐渐发展。
及时诊断、心力衰竭亚型-HFREF或HFPEF的分类和改进的风险分层对于心力衰竭的管理和治疗至关重要。因此，需要提供确定对象发生心力衰竭的风险的方法。还需要提供对心力衰竭亚型进行分类的方法。
发明内容
在一方面，提供了一种确定对象是否患有心力衰竭或处于发生心力衰竭风险之中的方法。在一些实例中，所述方法包括以下步骤：a)测量从对象获得的样品中表25或表20或表21或表22中列出的来自“提高”miRNA列表的至少一种miRNA或来自“降低”miRNA列表的至少一种的水平。在一些实例中，所述方法还包括以下步骤：b)确定来自miRNA列表的至少一种miRNA的水平与对照相比是否不同，其中miRNA的水平改变指示对象患有心力衰竭或处于发生心力衰竭风险之中。
在另一方面，提供了一种确定对象是否患有心力衰竭的方法。在一些实例中，心力衰竭选自左心室射血分数降低性心力衰竭(HFREF)和左心室射血分数保留性心力衰竭(HFPEF)。在一些实例中，所述方法包括以下步骤：a)检测从对象获得的样品中表9中列出的至少一种miRNA的水平。在一些实例中，所述方法还包括以下步骤：确定至少一种miRNA的水平是否指示对象患有左心室射血分数降低性心力衰竭(HFREF)或左心室射血分数保留性心力衰竭(HFPEF)或者处于其发生风险之中。
在另一方面，提供了一种用于确定心力衰竭患者的死亡风险改变的风险的方法。在一些实例中，所述方法包括以下步骤：a)检测从对象获得的样品中表14中列出的至少一种miRNA的水平。在一些实例中，所述方法还包括以下步骤：b)测量表14中列出的至少一种miRNA的水平。在一些实例中，所述方法还包括以下步骤：c)确定表14中列出的至少一种miRNA的水平与对照群体中miRNA的水平相比是否不同，其中miRNA的水平改变指示与对照群体相比，对象的死亡风险可能改变(观察(全因)生存率改变)。
在另一方面，提供了一种用于确定心力衰竭患者疾病发展至住院或死亡的风险改变的风险的方法。在一些实例中，所述方法包括以下步骤：a)检测从对象获得的样品中表15中列出的至少一种miRNA的水平。在一些实例中，所述方法包括以下步骤：b)测量表15中列出的至少一种miRNA的水平。在一些实例中，所述方法还包括以下步骤：c)确定表15中列出的至少一种miRNA的水平与对照群体中miRNA的水平相比是否不同，其中miRNA的水平改变指示与对照群体相比，对象的疾病发展至住院或死亡的风险可能改变(无事件生存率改变)。
在另一方面，提供了一种确定对象中发生心力衰竭的风险或确定对象是否患有心力衰竭的方法。在一些实例中，所述方法包括以下步骤：(a)检测从对象获得的样品中miRNA的存在。在一些实例中，所述方法还包括以下步骤：(b)测量样品中表16或表23中列出的至少三种miRNA的水平。在一些实例中，所述方法还包括以下步骤：(c)使用基于步骤(a)中所测量miRNA的水平的评分来预测对象发生或患有心力衰竭的可能性。
在另一方面，提供了一种确定对象中发生心力衰竭的风险或确定对象是否患有心力衰竭的方法。在一些实例中，所述方法包括以下步骤：(a)检测从对象获得的样品中miRNA的存在。在一些实例中，所述方法还包括以下步骤：(b)测量样品中表17中列出的至少三种miRNA的水平。在一些实例中，所述方法还包括以下步骤：(c)使用基于步骤(a)中所测量miRNA的水平的评分来预测对象发生或患有心力衰竭的可能性。
在另一方面，提供了一种确定对象患有左心室射血分数降低性心力衰竭(HFREF)或左心室射血分数保留性心力衰竭(HFPEF)的可能性的方法。在一些实例中，所述方法包括以下步骤：(a)检测从对象获得的样品中miRNA的存在。在一些实例中，所述方法还包括以下步骤：(b)测量样品中表18中列出的至少三种miRNA的水平。在一些实例中，所述方法包括：(c)使用基于步骤(a)中所测量miRNA的水平的评分来预测对象患有左心室射血分数降低性心力衰竭(HFREF)或左心室射血分数保留性心力衰竭(HFPEF)的可能性。
在另一方面，提供了一种确定对象患有左心室射血分数降低性心力衰竭(HFREF)或左心室射血分数保留性心力衰竭(HFPEF)的可能性的方法。在一些实例中，所述方法包括以下步骤：(a)检测从对象获得的样品中miRNA的存在。在一些实例中，所述方法包括以下步骤：(b)测量样品中表19或表24中列出的至少三种miRNA的水平。在一些实例中，所述方法还包括以下步骤：(c)使用基于步骤(a)中所测量miRNA的水平的评分来预测对象患有左心室射血分数降低性心力衰竭(HFREF)或左心室射血分数保留性心力衰竭(HFPEF)的可能性。
附图说明
当结合非限制性实例和附图考虑时，参照详细描述将更好地理解本发明，在附图中：
图1示出了显示从本文所述研究鉴定的miRNA数量的概述的示意图。
图2示出了N端脑钠尿肽激素原(NT-proBNP)和N端脑钠尿肽激素原的自然对数(ln_NT-proBNP)水平的直方图和偏斜度图。对照对象(A、D)、左心室射血分数减低性心力衰竭对象(HFREF)(B、E)和左心室射血分数保留性心力衰竭对象(HFPEF)(C、F)的NT-proBNP水平(A至C)和ln_NT-proBNP水平(NT-proBNP的自然对数，D至F)的分布。计算并显示每副图的偏斜度。图2显示，所有组中的N端脑钠尿肽激素原(NT-proBNP)均呈正偏斜。相比之下，N端脑钠尿肽激素原的自然对数(ln_NT-proBNP)水平具有较低的偏斜度。因此，将N端脑钠尿肽激素原的自然对数水平用于涉及NT-proBNP的所有分析。
图3示出了N端脑钠尿肽激素原的自然对数(ln_NT-proBNP)作为心力衰竭的生物标志物的性能的分析结果。特别地，(A)示出了ln_NT-proBNP(NT-proBNP的自然对数)水平的箱线图。每个箱线图表示在分布中的第25、第50和第75百分位数。(B至D)示出了对照相对于心力衰竭(HFREF和HFPEF，B)、HFREF相对于心脏HFPEF(C)、对照相对于HFREF(D)和对照相对于HFPEF(E)的ln_NT-proBNP的接受者操作特征曲线。AUC：接受者操作特征曲线下面积，C：对照(健康的)，HF：心力衰竭，HFREF：左心室射血分数降低性心力衰竭对象，HFPEF：左心室射血分数保留性心力衰竭对象。图3A显示，在HFPEF中，NT-proBNP测试性能的损失更为明显。图3B至D示出了在检测HFREF方面比HFPEF表现得更好的N端脑钠尿肽激素原的自然对数(ln_NT-proBNP)。
图4示出了高通量miRNART-qPCR测量的示例性工作流程。图4所示的步骤包括分离、多重组、多重RT、增加、单重PCR和合成miRNA标准曲线。每个步骤的细节如下：分离是指从血浆样品中分离并纯化miRNA的步骤；加标(spike-in)miRNA是指添加到样品中以监测每个步骤(包括分离、逆转录、增加和qPCR)的效率的非天然合成miRNA模拟物(长度范围为22至24个碱基的小单链RNA)；多重设计是指有意地通过计算机分为多个多重组(每组45至65种miRNA)以最小化RT和增加过程期间的非特异性扩增和引物-引物相互作用的miRNA测定；多重逆转录是指将不同的逆转录引物库组合并添加到不同的多重组中以产生cDNA；增加是指将PCR引物库组合并添加到由某个多重组产生的每个cDNA库中，并进行经优化的降落PCR(touch down PCR)以同时增加组中所有cDNA的量；单重qPCR是指将增加的cDNA库分布到384孔板中的不同孔中，然后进行单重qPCR反应；合成miRNA标准曲线是指与样品一起测量用于在所有测量中内插绝对拷贝数的合成miRNA标准曲线。
图5示出了主成分分析的条形图结果。基于log2标度表达水平(拷贝/mL)对所有137种可靠检测到的成熟miRNA(表4)进行主成分分析。(A)：前15个主成分的本征值。(B)：前15个主成分对分离对照(C)和心力衰竭(HF)的分类效率(AUC)。(C)：前15个主成分对分离HFREF(射血分数降低性心力衰竭)和HFPEF(射血分数保留性心力衰竭)的分类效率(AUC)。AUC：接收者操作特征曲线下面积。图5显示，可需要多变量测定来在用于分类HFREF和HFPEF的多个维度中捕获信息。
图6示出了与对照相比心力衰竭对象中靠前(AUC)的主成分的散点图。特别地，在A中示出了用于辨别对照(C，黑色圆圈)与心力衰竭(HF，白色三角形)对象的靠前(AUC)主成分。在B中示出了用于区分HFREF(射血分数降低性心力衰竭，黑色圆圈)与HFPEF(射血分数保留性心力衰竭，白色三角形)对象的靠前(AUC)的两个主成分。AUC：接受者操作特征曲线下面积。PC：基于图10的主成分编号。变化：由本征值计算的主成分所表示变化的百分比。图6显示，可以基于其miRNA谱来分离对照、HFREF和HFPEF对象。
图7示出了显示可用于检测心力衰竭的生物标志物的重叠的维恩图(Venndiagrams)。通过单变量分析(t检验)以及并入年龄和AF(心房颤动或心房扑动)、高血压和糖尿病的多变量分析(逻辑回归)进行对照(健康)与不同组心力衰竭患者(HF、HFREF和HFPEF)之间的比较。对于三个比较：C与HF(HFREF和HFPEF)、C与HFREF和C与HFPEF，示出了单变量分析(A)和多变量分析(B)中p值(经错误发现率校正后)低于0.01的miRNA的数量和重叠。HF：心力衰竭，HFPEF：射血分数保留性心力衰竭，HFREF：射血分数降低性心力衰竭，C：对照(健康的)。图7显示，许多miRNA被发现在对照与仅两种心力衰竭亚型之一之间不同，从而证明两种亚型之间在miRNA表达方面的真正差异。
图8示出了健康对照与心力衰竭患者之间靠前的上调和下调miRNA的箱线图和接受者操作特征曲线。与对照(健康的)对象相比，所有心力衰竭患者中靠前(基于AUC)的上调(A：ROC曲线，C：箱线图)和下调(B：ROC曲线，D：箱线图)miRNA的箱线图和接受者操作特征(ROC)曲线。miRNA的表达水平(拷贝/ml)以log2标度表示。箱线图示出了在表达水平的分布中的第25、第50和第75百分位数。C：对照(健康的)、HF：心力衰竭。AUC：接受者操作特征曲线下面积。图8显示多种miRNA的组合可增强心力衰竭诊断的性能。
图9示出了显示用于检测心力衰竭和分类心力衰竭亚型的生物标志物的重叠的维恩图。通过单变量分析(t检验)以及并入年龄、性别、BMI(体重指数)和AF(心房颤动或心房扑动)、高血压(p值，ln_BNP)的多变量分析(逻辑回归)进行HFREF和HFPEF之间的比较。将单变量分析(A)和多变量分析(B)中p值(经错误发现率校正后)低于0.01的miRNA与用于检测心力衰竭的miRNA(C与HF或C与HFREF或C与HFPEF，图5)进行比较。HF：心力衰竭，HFPEF：射血分数保留性心力衰竭，HFREF：射血分数降低性心力衰竭，C：对照(健康)对象。
图10示出了与HFREF患者相比，HFPEF患者名靠前的上调和下调miRNA的箱线图和接受者操作特征(ROC)曲线。与HFREF患者相比，HFPEF患者中靠前(基于AUC)的上调(A：ROC曲线，C：箱线图)和下调(B：ROC曲线，D：箱线图)miRNA的箱线图和接受者操作特征(ROC)曲线。miRNA的表达水平(拷贝/ml)以log2标度表示。箱线图示出了在表达水平的分布中的第25、第50和第75百分位数。HFPEF：射血分数保留性心力衰竭，HFREF：射血分数降低性心力衰竭，AUC：接受者操作特征曲线下面积。图10显示，在多变量指标测定中组合多种miRNA可以为亚型分类提供更多诊断力。
图11示出了用于检测心力衰竭和用于分类心力衰竭亚型的重叠miRNA的线图。基于变化，将对照、心力衰竭(HFREF或HFPEF)和HFREF,HFPEF(图7，A)之间的38种重叠miRNA分为7组。如果在错误发现测试后miRNA的p值(t检验)高于0.01，则两组被定义为相等的。表达水平基于log2标度，并且对于每种miRNA，相对于零平均值标准化。HFPEF：射血分数保留性心力衰竭，HFREF：射血分数降低性心力衰竭，C：对照(健康的)。图11显示，与健康对照相比，不同于LVEF和NT-proBNP，HFPEF比HFREF亚型具有更特别的miRNA谱。图11表明miRNA可以与NT-proBNP互补以提供更好的HFPEF辨别。
图12示出了所有可靠检测到的miRNA之间的相关分析的散点图。基于log2标度表达水平(拷贝/mL)，在所有137种可靠检测到的miRNA靶标之间计算Pearson线性相关系数(表4)。每个点表示相关系数高于0.5(A，正相关)或低于-0.5(B，负相关)的一对miRNA。C与HF和HFREF与HFPEF的差异表达的miRNA在水平维度上表示为黑色。HF：心力衰竭，HFPEF：射血分数保留性心力衰竭，HFREF：射血分数降低性心力衰竭，C：对照(健康的)。图12表明，在所有对象中，许多miRNA对类似地调节。
图13示出了代表HFREF和HFPEF的药物治疗的条形图。总结了包括在预后分析中分为HFREF和HFPEF亚型的327个对象的不同抗HF药物治疗的病例数。应用卡方检验以比较每种处理的两种亚型。*：p值<0.05，**：p值<0.01，***：p值<0.001。图13是根据当前临床实践的治疗的总结，并且包括在用于分析预后标志物的临床变量中。
图14示出了对象的生存分析。特别地，(A)示出了基于单变量分析(p值<0.05)的显著预测观察生存的临床变量(表14)的Kaplan-Meier图。对于分类变量，比较阳性组(黑色)和阴性组(灰色)。对于正态分布的变量，比较具有中值上(黑色)和中值下(灰色)值的对象。进行对数秩检验以在两组之间测试每个变量，并且p值显示在每个图上方。(B)示出了表示治疗后750天观察生存(observed survival，OS)的百分比的条形图。
图15示出了无事件生存的生存分析。特别地，(A)示出了基于单变量分析(p值<0.05)显著预测无事件生存的临床变量(表14)的Kaplan-Meier图。对于分类变量，比较阳性组(黑色)和阴性组(灰色)。对于正态分布的变量，比较具有中值上(黑色)和中值下(灰色)值的对象。进行对数秩检验以在两组之间测试每个变量，并且p值显示在每个图上方。(B)示出了表示处理后750天无事件生存(event free survival，EFS)的百分比的条形图。
图16示出了用于观察生存(OS)和无事件生存(EFS)的生物标志物之间的比较的维恩图。特别地，(A)示出了用CoxPH模型通过单变量分析和多变量分析鉴定的对OS具有显著预后性的miRNA之间的比较。(B)示出了OS预后和EFS预后的显著miRNA之间的比较。用CoxPH模型通过单变量分析或多变量分析鉴定miRNA。图16显示死亡和复发性代偿失调性心力衰竭的不同机制。
图17示出了用于观察生存(OS)和无事件生存(EFS)的生物标志物之间的比较的维恩图。特别地，(A)示出了通过CoxPH模型具有显著预后性(对于OS或对于EFS)和用于检测HF(任一种亚型)的miRNA之间的比较。通过单变量分析或多变量分析鉴定所有miRNA。(B)示出了通过CoxPH模型用于预后鉴定(对于OS或对于EPS)和用于分类两种HF亚型的显著miRNA之间的比较。通过单变量分析或多变量分析鉴定所有miRNA。图17显示，在其他两个列表中没有发现大部分预后性标志物，表明可以使用或组合单独的miRNA组形成预后测定。
图18示出了用于观察生存(OS)的具有最大和最小危险比(hazard ratio)的miRNA的分析。在(A)中，使用用于观察生存(OS)的具有最大危险比(hsa-miR-503)和最小危险比(hsa-miR-150-5p)的miRNA构建单变量CoxPH模型或包括六个另外临床变量的多变量CoxPH模型：用于观察生存(OS)的性别、高血压、BMI、ln_NT-proBNP、β-阻滞剂和华法林。所有正常变量水平(包括BMI、ln_NT-proBNP和miRNA表达水平(log2标度))被按比例调整为具有一个标准偏差。基于根据CoxPH模型的解释评分值，比较了前50％对象(黑色)和后50％对象(灰色)。进行对数秩检验以在两组之间进行测试，示出了p值(B)，处理后750天的观察生存(OS)。
图19示出了用于EFS的具有最大和最小危险比的miRNA的分析。在(A)中，使用用于EFS的具有最大危险比(hsa-miR-331-5p)和最小危险比(hsa-miR-191-5p)的miRNA构建单变量CoxPH模型或包括2个另外临床变量的多变量CoxPH模型：用于EFS的糖尿病状态和ln_NT-proBNP。所有正常变量水平(包括糖尿病状态ln_NT-proBNP和miRNA表达水平(log2标度))被按比例调整为具有一个标准偏差。基于根据CoxPH模型的解释得评分值，比较了前50％对象(黑色)和后50％对象(灰色)。进行对数秩检验以在两组之间进行测试，并且示出了p值(B)，处理后750天的EFS。
图20示出了生成用于心力衰竭检测的多变量生物标志物组的代表性结果。在(A)中，箱线图示出了在计算机两折交叉验证期间在心力衰竭检测的发现和验证阶段中多变量生物标志物组(miRNA数＝3至10)的诊断力(AUC)。箱线图示出了在健康和心力衰竭患者的分类的AUC中的第25、第50和第75百分位数。(B)中示出了发现组(黑色)和验证组(灰色)的结果的定量表示。误差条表示AUC的标准偏差。为了测试在组中包括更多miRNA时验证组中AUC提高的显著性，进行了右尾t检验以比较所有相邻的灰色条。*：p值<0.05；**：p值<0.01；***：p值<0.001。
图21示出了使用二维图的在HF检测方面的多变量miRNA评分与NT-proBNP之间的比较。(A)示出了所有对象的NT-proBNP水平(y轴)和6-miRNA组评分(x轴)之一的二维图。NT-proBNP(125)的阈值用虚线表示。根据NT-proBNP的错误阳性和错误阴性对象被加框。(B)示出了使用125pg/ml阈值根据NT-proBNP分类的错误阳性和错误阴性对象的NT-proBNP水平(y轴)和6-miRNA组评分(x轴)的二维图。阈值miRNA评分(0)用虚线表示。对照对象用十字表示；HFREF对象用填充圆圈表示，HFPEF对象用空三角形表示。图21验证了以下假设：miRNA生物标志物与N端脑钠尿肽激素原(NT-proBNP)携带不同信息的假设。
图22示出了将miRNA与NT-proBNP组合的用于心力衰竭检测的多变量生物标志物组的分析。(A)示出了在计算机两折交叉验证期间在HF检测的发现和验证阶段中多变量生物标志物组(ln_NT-proBNP加2至8种miRNA)的诊断力(AUC)的一系列箱线图。箱线图示出了用于分类健康和HF患者的AUC中的第25、第50和第75百分位数。(B)示出了了发现组(黑色)和验证组(灰色)以及ln-NT-proBNP本身(第一列)的结果的定量表示。误差条表示AUC的标准偏差。为了测试在组中包括更多miRNA时验证组中AUC提高的显著性，进行右尾t检验以比较所有相邻的灰色条。*：p值<0.05；**：p值<0.01；***：p值<0.001。因此，图22显示，在将miRNA与N端脑钠尿肽激素原(NT-proBNP)组合时分类效率显著提高。
图23示出了在增加或不增加N端脑钠尿肽激素原(NT-proBNP)下多变量选用于多变量HF检测组的miRNA的重叠的维恩图。在多变量生物标志物检索过程期间选用于使用miRNA单独(表16)或使用miRNA与NT-proBNP(表17)进行HF检测的生物标志物之间的比较。分别比较了显著miRNA(A)和不显著miRNA(B)。图23显示，当使用NT-proBNP时，可以使用不同的miRNA列表。
图24示出了生成用于在增加和不增加NT-proBNP下进行心力衰竭亚型分层的多miRNA组的代表性结果。(A)示出了用于心力衰竭亚型分类的多变量miRNA生物标志物组检索(3至10种miRNA)。示出了发现组(黑色条)和验证组(灰色条)的AUC结果。(B)示出了用于心力衰竭亚型分类的多变量miRNA和NT-proBNP生物标志物组检索(ln_NT-proBNP加2至8种miRNA)。示出了发现组(黑色条)和验证组(灰色条)以及ln_NT-proBNP本身(第一列)的AUC结果。误差条表示AUC的标准偏差。进行右尾t检验以比较所有相邻的灰色条。*：p值<0.05；**：p值<0.01；***：p值<0.001。图24显示，当使用miRNA和NT-proBNP二者时，甚至可以实现更清晰的分类。
附表简述
当结合非限制性实例和附表考虑时，参考详细描述将更好地理解本发明，在附表中：
表1是用于心力衰竭的已报道血清/血浆miRNA生物标志物的总结。测量无细胞血清/血浆miRNA或全血的研究包括在表格中。仅示出了用qPCR验证的miRNA。上调：与对照(健康的)对象中相比，在HF患者中具有较高水平的miRNA。下调：与对照(健康的)对象中相比，在HF患者中具有较低水平的miRNA。“研究设计”中的数字表示研究中使用的样品数。PBMC：外周血单个核细胞，AMI：急性心肌梗死，HF：心力衰竭，HF：心力衰竭，HFPEF：左心室射血分数保留性心力衰竭，HFREF：左心室射血分数降低性心力衰竭，BNP：脑钠尿肽，C：对照(健康对象)。
表2是列出了研究中包括的对象的临床信息的表格。该研究中包括546个对象的临床信息。所有血浆样品在使用前均储存在-80℃。N.A.:不可用，C：对照(健康对象)，PEF：左心室射血分数保留性心力衰竭，REF：左心室射血分数降低性心力衰竭。
表3是列出了健康对象和心力衰竭患者的特征的表格。射血分数(左心室射血分数)、ln_NT-proBNP、年龄、体重指数示为算术平均值±标准偏差，并且NT-proBNP示为几何平均值。紧挨变量的百分比表示具有变量的已知值的对象的百分比。HF：心力衰竭，HFPEF：射血分数保留性心力衰竭，HFREF：射血分数降低性心力衰竭，C：对照(健康)对象。对于对照与心力衰竭(C与HF)和HFPEF与HFREF(HFREF与HFPEF)之间变量的比较，t检验用于正常变量，卡方检验用于分类变量。
表4是列出137种可靠检测到的成熟miRNA的序列的表格。在血浆样品中可靠检测到137种成熟miRNA。“可靠检测到”的定义为至少90％的血浆样品的浓度高于500拷贝/ml。根据miRBase V18版本命名miRNA。
表5是列出了在对照和所有心力衰竭对象之间差异表达的miRNA的表格。通过单变量分析(p值，t检验)和针对年龄和AF(心房颤动或心房扑动)、高血压、糖尿病调整的多变量分析(p值，逻辑回归)进行对照(健康的)与所有心力衰竭对象(HFREF和HFPEF二者)之间的比较。用针对年龄和AF(心房颤动或心房扑动)、高血压和糖尿病调整的逻辑回归测试miRNA对ln_NT-proBNP对心力衰竭的诊断性能的增强(p值，ln_BNP)。使用Bonferroni方法针对错误发现率校正调整所有p值。仅示出了对“p值，t检验”检验和“p值，逻辑回归”检验二者均具有低于0.01的p值的那些miRNA。倍数变化：心力衰竭对象的miRNA表达水平除以对照对象的miRNA表达水平。
表6是列出了在对照和HFREF对象之间差异表达的miRNA的表格。通过单变量分析(p值，t检验)和针对年龄、AF(心房颤动或心房扑动)、高血压和糖尿病调整的多变量分析(p值，逻辑回归)进行对照(健康的)与HFREF对象(左心室射血分数降低性心力衰竭)之间的比较。通过针对年龄和AF(心房颤动或心房扑动)、高血压和糖尿病调整的逻辑回归测试miRNA对ln_NT-proBNP的HFREF辨别的增强(p值，ln_BNP)。使用Bonferroni方法针对错误发现率校正调整所有p值。仅示出了对“p值，t检验”检验和“p值，逻辑回归”检验二者均具有p值<0.01的那些miRNA。倍数变化：HFREF对象的miRNA表达水平除以对照对象的miRNA表达水平。
表7是列出了在对照和HFPEF对象之间差异表达的miRNA的表格。通过单变量分析(p值，t检验)和针对年龄和AF(心房颤动或心房扑动)、高血压和糖尿病调整的多变量分析(p值，逻辑回归)进行对照(健康的)与HFPEF对象(左心室射血分数保留性心力衰竭)之间的比较。通过针对年龄、AF(心房颤动或心房扑动)、高血压和糖尿病调整的逻辑回归测试miRNA对ln_NT-proBNP对HFPEF诊断的辨别的增强(p值，ln_BNP)。使用Bonferroni方法针对错误发现率校正调整所有p值。仅示出了对“p值，t检验”检验和“p值，逻辑回归”检验二者均具有p值<0.01的那些miRNA。倍数变化：HFPEF对象的miRNA表达水平除以对照对象的miRNA表达水平。
表8是列出了当前研究与先前公开的报道之间的比较的表格。表4中未列出的miRNA(表达水平≥500拷贝/ml)表示为N.A.(不可用)，其可不包括在研究中或低于检测限。上：与对照(健康的)对象相比，在心力衰竭患者中miRNA具有较高的表达水平。下：与对照(健康的)对象相比，在心力衰竭患者中miRNA具有较低的表达水平。在错误发现率校正之后p值低于0.01的那些miRNA表示为无变化。对于hsa-miR-210，在不同文献报道中关于变化方向存在矛盾(表示上和下)。
表9是列出了在HFREF和HFPEF对象之间差异表达的miRNA的表格。通过单变量分析(p值，t检验)和针对年龄、性别、BMI(体重指数)和AF(心房颤动或心房扑动)和高血压调整的多变量分析(p值，逻辑回归)进行HFREF(左心室射血分数降低性心力衰竭)与HFPEF对象(左心室射血分数保留性心力衰竭)之间的比较。用针对年龄、性别、BMI(体重指数)、AF(心房颤动或心房扑动)和高血压调整的逻辑回归测试miRNA对ln_NT-proBNP区别HFREF与HFPEF分类的能力的增强(p值，ln_BNP)。使用Bonferroni方法针对错误发现率校正调整所有p值。仅示出了对“p值，t检验”检验具有p值<0.01的那些miRNA。倍数变化：HFPEF对象的miRNA表达水平除以HFREF对象的miRNA表达水平。
表10是列出了预后研究中包括的对象的临床信息的表格。包括在预后研究中的327个对象的临床信息。所有对象在招募到SHOP组群研究后随访两年。在随访期间，49名患者过世。
表11是列出了预后研究中包括的对象的处理的表格。预后研究中包括327个对象的药物处理；药物名称，Me1：ACE抑制剂，Me2：血管紧张素2受体阻滞剂，Me3：环/噻嗪类利尿剂，Me4：β-阻滞剂，Me5：阿司匹林或波立维(Plavix)，Me6：他汀类，Me7：地高辛，Me8：华法林(Warfarin)，Me9：硝酸盐类，Me10：钙通道阻滞剂，Me11：螺内酯，Me12：贝特类(Fibrate)，Me13：抗糖尿病剂，Me14：肼苯哒嗪，Me15：铁补充剂。
表12是列出了观察生存的临床变量的分析的表格。使用Cox比例风险模型分析观察生存中包括的临床参数包括药物处理和其他变量。年龄、BMI、LVEF和ln_NT-proBNP的水平按比例调整为具有一个标准偏差。在多变量分析中，包括所有变量。p值小于0.05的那些变量的单元格用灰色表示。ln(HR)：危险比的自然对数(正值表示：变量的值越高，死亡机率越高)，SE：标准误差。
表13是列出了无事件生存的临床变量的分析的表格。用于分析无事件生存的临床参数使用年龄、BMI、LVEF和ln_NT-proBNP水平按比例调整为具有一个标准差的Cox比例风险模型。药物处理也包括在内。在多变量分析中，包括所有变量。p值<0.05的那些变量的单元格表示为灰色。ln(HR)：危险比的自然对数(正值表示：变量的值越高，死亡机率越高)，SE：标准误差。
表14是列出了显著预测观察生存的miRNA的表格。用单变量和多变量分析使用Cox比例风险模型分析每种miRNA与观察生存的关联，所述多变量分析包括另外的临床变量：性别、高血压、BMI、ln_NT-proBNP、β阻滞剂和华法林。包括ln_NT-proBNP、BMI和miRNA表达水平(log2标度)的所有正态分布变量均按比例调整为具有一个标准偏差。那些p值<0.05表示为灰色单元格。ln(HR)：危险比的自然对数(正值表示：变量的值越高，死亡机率越高)，SE：标准误差。
表15是列出了显著预测无事件生存的miRNA的表格。用单变量和多变量分析使用Cox比例风险模型分析每种miRNA与无事件生存的关联，所述多变量分析包括另外的临床变量：糖尿病和ln_NT-proBNP。包括ln_NT-proBNP和miRNA表达水平(log2标度)的所有正态分布变量均按比例调整为具有一个标准偏差。那些p值<0.05表示为灰色单元格。ln(HR)：危险比的自然对数(正值表示：变量的值越高，死亡机率越高)，SE：标准误差。
表16是列出了在用于心力衰竭检测的多变量组检索过程中鉴定的miRNA的表格。列出了选用于组装用于心力衰竭检测的具有6、7、8、9和10种miRNA的生物标志物组的miRNA。流行度通过将所有组中miRNA的计数除以组总数定义。排除具有前10％和后10％AUC的组以避免由于拟合来自交叉验证分析中由随机化过程生成的亚群的不准确数据而计数错误发现生物标志物。仅列出了超过2％组中使用的miRNA。不同心力衰竭亚型中miRNA的变化基于表5至7限定。
表17是列出了在用于心力衰竭(HF)检测的多变量组检索过程中结合NT-proBNP鉴定的miRNA的表格。列出了选用于组装用于心力衰竭检测的具有ln_NT-proBNP以及3、4、5、6、7和8种miRNA的生物标志物组的miRNA。流行度通过将所有组中miRNA的计数除以组总数定义。排除具有前10％和后10％AUC的组以避免由于拟合来自交叉验证分析中由随机化过程生成的亚群的不准确数据而计数错误发现生物标志物。仅列出了超过2％组中使用的miRNA。作为ln_NT-proBNP的补充的miRNA在辨别不同心力衰竭亚型方面的显著性基于使用选定miRNA和ln_NT-proBNP作为预测变量的逻辑回归确定，其中经FDR校正后显著性miRNA的p值为<0.01。
表18是列出了在用于HF亚型分类的多变量组检索过程中鉴定的miRNA的表格。列出了选用于组装用于心力衰竭(HF)亚型分类的具有6、7、8、9和10种miRNA的生物标志物组的miRNA。流行度通过将所有组中miRNA的计数除以组总数定义。排除具有前10％和后10％AUC的组以避免由于拟合来自交叉验证分析中由随机化过程生成的亚群的不准确数据而计数错误发现生物标志物。仅列出了超过2％组中使用的miRNA。HFREF和HFPEF亚型之间的miRNA变化基于表9确定。
表19是列出了在用于HF亚型分类的多变量组检索过程中结合NT-proBNP鉴定的miRNA的表格。列出了选用于组装用于HF亚型分类的具有ln_NT-proBNP以及5、6、7和8种miRNA的生物标志物组的miRNA。流行度通过将所有组中miRNA的计数除以组总数定义。排除具有前10％和后10％AUC的组以避免由于拟合来自交叉验证分析中由随机化过程生成的亚群的不准确数据而计数错误发现生物标志物。仅列出了超过2％组中使用的miRNA。作为ln_NT-proBNP的补充的miRNA的显著性基于使用选定miRNA和ln_NT-proBNP作为预测变量的逻辑回归确定，其中经FDR校正后显著性miRNA的p值为<0.01。
表20是列出了鉴定用于心力衰竭(HF)检测的miRNA的表格。通过单变量分析(p值，t检验)和针对年龄和AF(心房颤动或心房扑动)、高血压、糖尿病调整的多变量分析(p值，逻辑回归)进行对照(健康的)与所有心力衰竭对象(HFREF和HFPEF二者)之间的比较。用针对年龄和AF(心房颤动或心房扑动)、高血压、糖尿病调整的逻辑回归测试miRNA对ln_NT-proBNP对心力衰竭的诊断性能的增强(p值，ln_BNP)。使用Bonferroni方法针对错误发现率校正调整所有p值。仅示出了对“p值，t检验”检验和“p值，逻辑回归”检验二者具有低于0.01的p值的那些miRNA。倍数变化：HF对象中的miRNA表达水平除以对照对象中的miRNA表达水平。表20对应于表5，区别之处在于表20中列出的miRNA不是本领域已知的miRNA的一部分(即，如表1和表8中列出的)。
表21是列出了鉴定用于HFREF检测的miRNA的表格。通过单变量分析(p值，t检验)和针对年龄、AF(心房颤动或心房扑动)、高血压和糖尿病调整的多变量分析(p值，逻辑回归)进行对照(健康的)与HFREF对象(左心室射血分数降低性心力衰竭)之间的比较。用针对年龄和AF(心房颤动或心房扑动)、高血压和糖尿病调整的逻辑回归测试miRNA对ln_NT-proBNP的HFREF辨别的增强(p值，ln_BNP)。使用Bonferroni方法针对错误发现率校正调整所有p值。仅示出了对“p值，t检验”检验和“p值，逻辑回归”检验二者具有p值<0.01的那些miRNA。倍数变化：HFREF对象中的miRNA表达水平除以对照对象中的miRNA表达水平。表21对应于表6，区别之处在于表21中列出的miRNA不是本领域已知的miRNA的一部分(即，如表1和表8中列出的)。
表22是列出了鉴定用于HFPEF检测的miRNA的表格。通过单变量分析(p值，t检验)和针对年龄和AF(心房颤动或心房扑动)、高血压和糖尿病调整的多变量分析(p值，逻辑回归)进行对照(健康的)与HFPEF对象(左心室射血分数保留性心力衰竭)之间的比较。用针对年龄、AF(心房颤动或心房扑动)、高血压和糖尿病调整的逻辑回归测试miRNA对ln_NT-proBNP辨别HFPEF诊断的增强(p值，ln_BNP)。使用Bonferroni方法针对错误发现率校正调整所有p值。仅示出了对“p值，t检验”检验和“p值，逻辑回归”检验二者具有p值<0.01的那些miRNA。倍数变化：HFPEF对象中的miRNA表达水平除以对照对象中的miRNA表达水平。表22对应于表7，区别之处在于表22中列出的miRNA不是本领域已知的miRNA的一部分(即，如表1和表8中列出的)。
表23是列出了在多变量组检索过程中频繁选择的用于心力衰竭检测的miRNA的表格。列出了选用于组装用于心力衰竭检测的具有6、7、8、9和10种miRNA的生物标志物组的miRNA。流行度通过将所有组中miRNA的计数除以组总数定义。排除具有前10％和后10％AUC的组以避免由于拟合来自交叉验证分析中由随机化过程生成的亚群的不准确数据而计数错误发现生物标志物。仅列出了超过2％组中使用的miRNA。miRNA在不同心力衰竭HF亚型中的变化基于表20至22限定。表23对应于表16，区别之处在于表23中列出的miRNA不是本领域已知的miRNA的一部分(即，如表1和表8中列出的)。
表24是列出了在多变量组检索过程中频繁选择的结合NT-proBNP用于HF检测的miRNA的表格。列出了选用于组装用于HF检测的具有ln_NT-proBNP以及3、4、5、6、7和8种miRNA的生物标志物组的miRNA。流行度通过将所有组中miRNA的计数除以组总数定义。排除具有前10％和后10％AUC的组以避免由于拟合来自交叉验证分析中由随机化过程生成的亚群的不准确数据而计数错误发现生物标志物。仅列出了超过2％组中使用的miRNA。作为ln_NT-proBNP的补充的miRNA在辨别不同HF亚型方面的显著性基于使用选定miRNA和ln_NT-proBNP作为预测变量的逻辑回归确定，其中经FDR校正后显著性miRNA的p值为<0.01。表24对应于表17，区别之处在于表24中列出的miRNA不是本领域已知的miRNA的一部分(即，如表1和表8中列出的)。
表25是列出了可特异性用于心力衰竭检测的微RNA的表格。根据发明人的了解，这些miRNA仅与心力衰竭有关。表25中列出的miRNA不是本领域已知的miRNA的一部分(即，如表1和表8中列出的)。
表26是列出了用于心力衰竭检测的示例性生物标志物组的表格。基于所提供的生物标志物，在表格中提供了组的式、截止值和性能的实例。
表27是列出了用于心力衰竭亚型检测的示例性生物标志物组的表格。基于所提供的生物标志物，在表格中提供了组的式、截止值和性能的实例。
具体实施方式
及时诊断、对心力衰竭亚型(包括但不限于左心室射血分数降低性心力衰竭(HFREF)、左心室射血分数保留性心力衰竭(HFPEF)等)的准确分类和改善的风险分层对于心力衰竭的管理和治疗具有重要意义。一种有吸引力的方法是使用循环生物标志物[14]。心力衰竭中已确立的循环生物标志物是心脏利钠尿肽、B型钠尿肽(BNP)及其共同分泌的同类物、N端激素原脑钠尿肽(NT-proBNP)。二者均已证实在急性心力衰竭方面具有诊断效用，并且独立地与心力衰竭的各个阶段的预后相关，从而使其纳入心力衰竭诊断和管理的所有重要国际指南中[14,15]。然而，包括年龄、肾功能、肥胖和心房颤动在内的混淆因素确实会影响其诊断性能[16,17]。在无症状性左心室功能障碍、早期症状性心力衰竭和经治疗的心力衰竭中，B肽的辨别力显著降低，其中所有稳定HFREF病例中有一半表现出低于100pg/ml的BNP，20％具有低于用于排除处于急性症状性状态的心力衰竭的值的NT-proBNP[18]。测试性能的这种损失在HFPEF的情况下更为明显[19]。B肽反映了以下心室透壁扩张压和肌细胞伸展，其(依赖于室直径以及心室内压和壁厚)与具有典型扩张心室和偏心重塑的HFREF相比在具有正常或降低心室腔容积和增厚心室壁的HFPEF中降低得多[20]。因此，对于补充或替代B型肽在心力衰竭的早期或部分治疗状态筛选心力衰竭以及监测心力衰竭的慢性期的状态的生物标志物具有尚未满足的需求。这对于B肽水平低于HFREF且通常正常的HFPEF尤其如此[21]。目前，心力衰竭亚型的分类取决于心脏病学家的成像和成像解释。没有基于生物标志物的测试可用于此目的。因此，提高心力衰竭诊断以及HF亚型分类的最低侵入性方法是期望的。
微RNA(miRNA)是在调节基因表达中起中心作用的小非编码RNA，微RNA的调节异常涉及多种疾病的发病机制[22-26]。自其在1993年发现以来[27]，miRNA已被评估调节超过60％的所有人基因[28]，其中很多miRNA被鉴定为关键细胞功能(例如增殖[29]和凋亡[30])中的关键参与者。人血清和血浆中miRNA的发现已提高使用循环miRNA作为很多疾病的诊断、预后和治疗决策的生物标志物的可能性[31-35]。使用miRNA或结合BNP/NT-proBNP使用miRNA诊断HF的整合多维方法可提高诊断。与单独使用BNP/NT-proBNP相比，组合基因组标志物(例如miRNA)和蛋白质标志物(例如BNP/NT-proBNP)可以增强在HF中的诊断力。最近，已经进行了多种尝试来鉴定血清或血浆中的循环无细胞miRNA生物标志物以区别HF患者与健康对象[36-47](表1)。
表1.用于心力衰竭的已报道血清/血浆miRNA生物标志物的总结
这些研究报道了在心力衰竭对象中差异调节的miRNA组。然而，这这些公开的工作之间缺乏一致性。在67种已报道的miRNA中，只有三种被发现在多于一个报道中上调。特别地，hsa-miR-210在一个报道中被报道HF中上调，而在另一个中下调(表1)。研究之间缺乏一致性可能是由于多个原因，包括使用小样品尺寸或样品选择的变异性，例如疾病阶段以及重要地，所使用的对照[32,48]。包括实验设计和工作流程在内的分析前过程在生物标志物鉴定和验证中是至关重要的。迄今为止大多数研究已使用高通量阵列平台来筛选有限数量的样品。这种方法缺乏灵敏度和可重复性。其产生一小组靶标(少于10种miRNA)被鉴定用于进一步验证。大部分研究尚未在较大的患者组群中证实。另一种被广泛采用的方法基于使用定量实时聚合酶链反应(qPCR)筛选已报道的候选miRNA。评价基于阵列与qPCR平台的不同技术显示这些平台用于miRNA测量的性能存在实质性差异。这可能导致观察到的研究之间的不一致性[49]。迄今为止，关于可用作心力衰竭生物标志物的特定循环血清/血浆miRNA没有共识。之前报道的miRNA谱均不可用于心力衰竭亚型的分类。因此，需要建立用于心力衰竭生物标志物发现和验证的稳键预先指定技术平台，并且确保结果的可重复性。
在本公开内容中，鉴定了循环miRNA的组作为潜在的心力衰竭生物标志物。这些多变量指标测定由食品与药品管理局(Food and Drug Agency，FDA)指南限定，引用如下：“结合多变量的值使用解释函数产生一个单一的，病人特异性的结果(例如，“分类”“分数”“指数”等)，其用于疾病或其他状况的诊断，或疾病的治疗，缓解，治疗或预防，并且提供的结果的推导是非透明的，不能由最终用户独立得出或验证(combines the values of multiplevariables using an interpretation function to yield a single,patient-specificresult(e.g.,a“classification,”“score,”“index,”etc.),that is intended for usein the diagnosis of disease or other conditions,or in the cure,mitigation,treatment or prevention of disease,and provides a result whose derivation isnon-transparent and cannot be independently derived or verified by the enduser)”。因此，根据MIQE(用于公开定量实时PCR实验的最少信息)指南的基于qPCR的高度可靠定量数据是先决条件，并且使用现有技术的数学和生物统计学工具对于同时确定这多个变量的相互关系是至关重要的。
有多种miRNA测量方法，包括基于杂交(微阵列、northern印迹、生物发光)、基于测序和基于qPCR[50]。由于miRNA的小尺寸(约22个核苷酸)，以最大动态范围提供精确、可重复且准确的定量结果的最稳健技术是基于qPCR的平台[51]；目前，其是常用于验证来自其他技术的结果(例如测序和微阵列数据)的金标准。这种方法的一种变化形式是数字PCR[52]，其是一种基于类似原理但尚未得到广泛认可和使用的新兴技术。
在该研究中，通过qPCR在338位慢性心力衰竭患者(180个HFREF和158个HFPEF)和208位非心力衰竭患者(对照组)的血浆中图谱绘制203种miRNA。这是心力衰竭中miRNA筛选的迄今为止比在文献中报道的任何组群都要大的组群。图1中描述了本研究中使用的不同提议方法所鉴定的miRNA数量的总结。
本公开内容的发明人已建立了具有多层技术和样品控制的精心设计的工作流程。这是为了确保测定的可靠性并且最小化污染物和技术噪音的可能交叉。对于心力衰竭诊断生物标志物发现，筛选了203种miRNA，并且发明人检测到137种miRNA在所有血浆样品中都表达。其中，75种miRNA被鉴定在心力衰竭(HFREF和/或HFPEF)与对照之间显著改变。52种miRNA的列表能够区别HFREF与对照，并且68种被发现在HFPEF与对照之间显著差异表达。因此，本发明人发现了能够区别HFREF与HFPEF的miRNA组。本发明人还发现了与对照相比在心力衰竭中调节异常的miRNA组。
因此，在一个方面，提供了确定对象是否患有心力衰竭或处于发生心力衰竭风险之中的方法。在一些实例中，所述方法包括以下步骤：a)测量从对象获得的样品中表25或表20或表21或表22中列出的来自“提高”(高于对照)miRNA列表的至少一种miRNA或来自“降低”(低于对照)miRNA列表的至少一种的水平。在一些实例中，所述方法还包括：b)确定与对照相比，miRNA的水平是否不同，其中所述miRNA的水平改变指示对象患有心力衰竭或处于发生心力衰竭风险之中。
表20.用于心力衰竭检测的miRNA
表21.鉴定用于HFREF检测的miRNA
表22.鉴定用于HFPEF检测的miRNA
表25.用于心力衰竭检测的特定新微RNA
如本文在本公开内容通篇使用的，术语“miRNA”是指微RNA，小的非编码RNA分子，并且见于植物、动物和一些病毒中。已知miRNA在RNA沉默和基因表达的转录后调节中具有功能。这些高度保守的RNA通过与特定mRNA的3’非翻译区(3’-UTR)结合来调节基因的表达。例如，每个miRNA被认为调节多个基因，并且因此预测在高等真核生物中存在数百个miRNA基因。miRNA可以是共价连接在一起的至少10个核苷酸且不多于35个核苷酸。在一些实例中，miRNA可以是长度为10至33个核苷酸、或15至30个核苷酸或者长度为17至27个核苷酸、或18至26个核苷酸的分子。在一些实例中，miRNA可以是长度为10、或11、或12、或13、或14、或15、或16、或17、或18、或19、或20、或21、或22、或23、或24、或25、或26、或27、或28、或29、或30、或31、或32、或33、或34、或35个核苷酸的分子，所述长度不包括任选地标记和/或延长序列(例如，例如生物素延伸段)。miRNA调节基因表达，并且由以下基因编码，miRNA从所述基因的DNA转录而来但是miRNA不翻译成蛋白质(即，miRNA是非编码RNA)。如本文在本公开内容通篇使用的，所测量的miRNA可以与本公开内容中提供的任一表格中列出的miRNA具有至少90％、95％、97.5％、98％或99％序列同一性。因此，在一些实例中，测量miRNA与表9、表14、表15、表16、表17、表18、表19、表20、表21、表22、表23、表24或表25中任一个中列出的miRNA具有至少90％、95％、97.5％、98％或99％序列同一性。如本文使用的，术语“序列同一性”“序列同一性”是指两个或更多个多肽序列或者两个或更多个多核苷酸序列(即，参考序列与待与参考序列进行比较的给定序列)之间的关系。序列同一性通过在将序列最佳对齐以产生最高程度序列相似性之后将给定序列与参考序列进行比较来确定，如通过这样的序列的串之间的匹配所确定的。在这样的对齐之后，序列同一性基于一个位置接一个位置来确定，例如，如果在特定位置，核苷酸或氨基酸残基相同，则在该位置，序列是“相同”的。然后，将这样的位置身份的总数除以参考序列中核苷酸或残基的总数以给出序列同一性％。序列同一性可容易地通过本领域技术人员已知的方法来计算。
如本文在本公开内容通篇使用的，术语“心力衰竭”或“HF”是指其中心脏的泵送功能变得不足(心室功能障碍)以满足机体重要系统和组织的需求的复杂临床综合征。心力衰竭的严重程度可以为不严重(轻度)(其表现在对象的身体活动不具有限制)到严重程度递增(其表现在对象不能够进行任何身体活动，但没有不适)不等。心力衰竭是一种进行性的慢性疾病，随着时间的推移而恶化。在极端情况下，心力衰竭可导致需要心脏移植。在一些实例中，如果对象可具有进一步的心力衰竭，例如在患有已知慢性心力衰竭的那些中恶化为复发性急性代偿失调性心力衰竭或死亡，则可以确定对象处于发生心力衰竭风险之中。
如本文在本公开内容通篇使用的，术语“对象”和“患者”可互换使用，是指怀疑受心力衰竭影响的个体或哺乳动物。患者可被预测(或确定或诊断)受心力衰竭影响，即患病；或者可被预测不受心力衰竭影响，即是健康的。对象也可被确定受特定形式的心力衰竭影响。在一些实例中，心力衰竭患者可以是以下对象，其中所述心力衰竭患者是这样的对象，其已具有心力衰竭的初步诊断和/或经治疗3至5天在症状上已改善，具有心力衰竭床旁体征的消退并且被认为适合出院。因此，可以进一步确定对象发生心力衰竭或特定形式的心力衰竭。应注意的是，被确定健康，即未患心力衰竭或特定形式的心力衰竭的对象可能患有未测出/不知晓的其他疾病。如本文使用的，本公开内容的对象可以是任何哺乳动物，同时包括人和其他哺乳动物，例如如狗、猫、兔、小鼠、大鼠或猴的动物。在一些实例中，对象可以是人。因此，来自对象的miRNA可以是人miRNA，或来自其他哺乳动物的miRNA，例如如小鼠、猴或大鼠miRNA的动物miRNA，或者成组包含的miRNA可以是人miRNA，或来自其他哺乳动物的miRNA，例如如小鼠、猴或大鼠miRNA的动物miRNA。如实验部分中表2所示的，本公开内容的对象可以是亚洲血统或种族。在一些实例中，对象可以包括但不限于任何亚洲种族，包括中国人、印度人、马来人等。
在另一方面，如在本发明的上下文中使用的术语“对照”或“对照对象”可以是指已知受心力衰竭影响，即患病的对象(从其获得的样品)(阳性对照，例如良好预后、不良预后)，和/或患有心力衰竭亚型HFPEF和/或心力衰竭亚型HFREF的对象，和/或已知不受心力衰竭影响，即健康的对象(阴性对照)。其也可以是指已知受其他疾病/病症影响的对象(从其获得的样品)。应注意的是，已知是健康的，即未患心力衰竭的对照对象可能患有未测出/不知晓的其他疾病。因此，在一些实例中，对照可以是非心力衰竭对象(或有时称为正常对象)。对照对象可以是任何哺乳动物，同时包括人和其他哺乳动物，例如如兔、小鼠、大鼠或猴的动物。在一些实例中，对照是人。在一些实例中，对照可以是个体对象或对象组群(从其获得的样品)。
本领域技术人员将理解的是，本文描述的方法不能用于替代医师在诊断对象中病症中的作用。可以理解的是，对象中心力衰竭的临床诊断需要医师对医师可获得的其他症状和/或其他信息进行分析。如本文所述的方法旨在为医师作出患者/对象的最后诊断提供支持或附加信息。
如本文在本公开内容通篇使用的，术语“样品”是指体液或细胞外液。在一些实例中，体液可以包括但不限于羊水、母乳、支气管灌洗液、脑脊液、初乳、间质液、腹膜液、胸膜液、唾液、精液、尿液、泪液、全血的细胞和非细胞组分，包括血浆、红细胞、白细胞、血清等。在一些实例中，体液可以是血液、血清血浆和/或血浆。
在一些实例中，与对照相比，表20或表25中列为“提高”的miRNA的水平提高指示对象患有心力衰竭或处于发生心力衰竭风险之中。
在一些实例中，与对照相比，表20或表25中列为“降低”的miRNA的水平降低指示对象患有心力衰竭或处于发生心力衰竭风险之中。
如本文使用的，在本公开内容上下文中使用的术语“miRNA水平”或“miRNA的水平”代表样品中miRNA表达水平(或miRNA表达谱)的确定或与样品中miRNA表达水平相关的测量。miRNA表达水平可以通过本领域已知的任何方便方式产生，例如但不限于核酸杂交(例如与微阵列的核酸杂交)、核酸扩增(PCR、RT-PCR、qRT-PCR、高通量RT-PCR)、用于量化的ELISA、下一代测序(例如ABI SOLID、Illumina基因组分析仪、Roche/454GS FLX)、流式细胞术(例如LUMINEX)等，其允许分析miRNA表达水平并在对象(例如潜在患病的)和对照对象(例如参考样品)的样品之间进行比较。通过上述方式测量的样品材料可以是原始的或经处理的样品或总RNA、经标记总RNA、扩增的总RNA、cDNA、经标记cDNA、扩增的cDNA、miRNA、经标记miRNA、扩增的miRNA或可以由前述RNA/DNA物类产生的任何衍生物。通过确定miRNA表达水平，通过数值表示每种miRNA。单独miRNA的值越高，所述miRNA的(表达)水平越高，或者单独miRNA的值越低，所述miRNA的(表达)水平越低。当检测到单独miRNA的较高值高于和超过对照时，miRNA表达被称为“提高”或“上调”。在另一方面，当检测到单独miRNA的较低值低于对照，则miRNA表达被称为“降低”或“下调”。
如本文使用的，“miRNA(表达)水平”表示单一miRNA的表达水平/表达谱/表达数据，或者至少两种miRNA，或最少3种、或最少4种、或最少5种、或最少6种、或最少7种、或最少8种、或最少9种、或最少10种、或最少11种、或最少12种、或最少13种、或最少14种、或最少15种、或最少16种、或最少17种、或最少18种、或最少19种、或最少20种、或最少21种、或最少22种、或最少23种、或最少24种、或最少25种、或最少26种、或最少27种、或最少28种、或最少29种、或最少30种、或最少31种、或最少32种、或最少33种、或最少34种、或最少35种、或更多种、或多至所有已知miRNA的表达水平的集合。
在一些实例中，确定对象是否患有心力衰竭或处于患有心力衰竭风险之中的方法可以包括测量表20中列出的至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9种、至少10种、至少11种、至少2种至少20种、至少10种至少50种、至少40种至少66种或所有miRNA的水平的变化。在一些实例中，确定对象是否患有心力衰竭或处于患有心力衰竭风险之中的方法可以包括测量表25中列出的至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9种、至少10种、至少11种或所有miRNA的水平的变化。
在一些实例中，在本文所述的方法中，与对照相比，表21中列为“提高”的miRNA的水平提高可指示对象患有左心室射血分数降低性心力衰竭(HFREF)或可处于发生左心室射血分数降低性心力衰竭(HFREF)风险之中。在一些实例中，在本文所述的方法中，与对照相比，表21中列为“降低”的miRNA的水平降低可指示对象患有左心室射血分数降低性心力衰竭(HFREF)或可处于发生左心室射血分数降低性心力衰竭(HFREF)风险之中。在一些实例中，确定对象是否患有HFREF或处于患有HFREF风险之中的方法可以包括测量表21中列出的至少2种、或至少3种、或至少4种、或者至少5种、或至少6种、或者至少7种、或至少8种、或至少9种、或至少10种、或至少11种、或至少2至至少20种、或至少10至至少43种、或至少15至至少43种、或至少30至至少43种、或至少40种、或所有miRNA的水平的变化。
如本文使用的，术语“左心室射血分数降低性心力衰竭(HFREF)”或“左心室射血分数保留性心力衰竭(HFPEF)”是指与本领域中通常使用的相同的术语。例如，术语HFREF也可以称为收缩性心力衰竭。在HFREF中，心肌不能有效地收缩，并且较少的富氧血液被泵送到体外。相比之下，术语“左心室射血分数保留性心力衰竭(HFPEF)”是指舒张性心力衰竭。在HFPEF中，心肌正常收缩，但是心室不能像其在心室充盈期间或在心室松弛时应当的那样松弛。
在一些实例中，在本文所述的方法中，与对照相比，表22中列为“提高”的miRNA的水平提高可指示对象患有左心室射血分数保留性心力衰竭(HFPEF)或可处于发生左心室射血分数保留性心力衰竭(HFPEF)风险之中。在一些实例中，在本文所述的方法中，与对照相比，表22中列为“降低”的miRNA的水平降低可指示对象患有左心室射血分数保留性心力衰竭(HFPEF)或可处于发生左心室射血分数保留性心力衰竭(HFPEF)风险之中。在一些实例中，确定对象是否可能患有HFPEF或可能处于患有HFPEF风险之中的方法可以包括测量表22中列出的至少2种、或至少3种、或至少4种、或至少5种、或至少6种、或至少7种、或至少8种、或至少9种、或至少10种、或至少11种、或至少2至至少20种、或至少10至至少50种、或至少20至至少55种、或至少30至至少60种、或至少35至至少60种、或至少40至至少60种、或至少40至至少62种、或所有miRNA的水平的变化。
在另一个方面，提供了一种确定对象是否患有选自左心室射血分数降低性心力衰竭(HFREF)和左心室射血分数保留性心力衰竭(HFPEF)的心力衰竭的方法，所述方法包括以下步骤：a)检测(或测量)从对象获得的样品中表9中列出的至少一种miRNA的水平；以及b)确定其与对照相比是否不同，其中所述miRNA的水平改变可指示对象患有左心室射血分数降低性心力衰竭(HFREF)或左心室射血分数保留性心力衰竭(HFPEF)或者可能处于其发生风险之中。
表9.在HFREF与HFPEF对象之间差异表达的miRNA
在一些实例中，在本文所述的方法中，与对照相比，表9中列为“提高”的miRNA的水平提高可指示对象患有左心室射血分数降低性心力衰竭(HFREF)或左心室射血分数保留性心力衰竭(HFPEF)。在一些实例中，在本文所述的方法中，与对照相比，表9中列为“降低”的miRNA的水平降低可指示对象发生左心室射血分数降低性心力衰竭(HFREF)或左心室射血分数保留性心力衰竭(HFPEF)。
在用于确定对象是否患有选自左心室射血分数降低性心力衰竭(HFREF)和左心室射血分数保留性心力衰竭(HFPEF)的心力衰竭的方法的一些实例中，所述方法可以包括测量表9中列出的至少2种、或至少3种、或至少4种、或至少5种、或至少6种、或至少7种、或至少8种、或至少9种、或至少10种、或至少11种、或至少2至至少20种、或至少10至至少39种、或所有miRNA的水平的变化。
在用于确定对象是否患有选自左心室射血分数降低性心力衰竭(HFREF)和左心室射血分数保留性心力衰竭(HFPEF)的心力衰竭的方法的一些实例中，对照可以是患有左心室射血分数降低性心力衰竭(HFREF)或左心室射血分数保留性心力衰竭(HFPEF)的对象。在一些实例中，对照可以是患有左心室射血分数降低性心力衰竭(HFREF)的患者，表9中列出的miRNA的差异表达指示对象患有左心室射血分数保留性心力衰竭(HFPEF)。在一些实例中，当对照是患有左心室射血分数保留性心力衰竭(HFPEF)的患者时，表9中列出的miRNA的差异表达指示对象患有左心室射血分数降低性心力衰竭(HFREF)。
另外，本公开内容的发明人还检测了这些miRNA作为预后性标志物的用途。即，本公开内容的方法可用于预测未来死亡或住院事件的可能风险或者通过诊断疾病确定的进展前景。心力衰竭患者中的预后意指预测观察生存(无死亡生存)或无事件生存(无住院或死亡生存)的可能性。如本文使用的，术语“观察生存”或“全因(all-cause)生存”或“全因死亡率”或“全因死亡”是指考虑到任何死亡原因的对象的观察生存率。该术语与术语“无事件生存(EFS)”形成对比，无事件生存是指不存在因为心力衰竭的复发入院(即心力衰竭治疗后的时间长度，在此期间避免了由于代偿失调性心力衰竭的复发入院)和任何致死亡原因。
本公开内容的发明人发现有很多miRNA被发现是观察(全因)生存(OS)(即，由于所有死亡原因的观察生存率)或慢性心力衰竭患者中复发心力衰竭入院(即心力衰竭治疗后的时间长度，在此期间避免了由于代偿失调性心力衰竭的复发入院)和所有原因死亡的无事件生存(EFS)组合的良好预测物。因此，本公开内容还可以用于预测对象的预后的方法。因此，在本公开内容的另一个方面，提供了用于确定心力衰竭患者的死亡风险改变(或观察(全因)生存率降低)的风险的方法。在一些实例中，所述方法可以包括以下步骤：a)检测从对象获得的样品中表14中列出的至少一种miRNA的水平，和/或测量表14中列出的至少一种miRNA的水平；以及b)确定表14中列出的至少一种miRNA的水平与对照群体的所述miRNA的水平相比是否不同，其中所述miRNA的水平改变指示与对照群体相比，对象的死亡风险可能改变(观察(全因)生存率改变)。
表14.可用于预测观察生存的miRNA
如本文使用的，术语“危险比”是指本领域通常已知的术语，涉及在特定时刻每单位时间“死亡”或“入院”的可能性的比率或估计值(已知对象“生存”直至该时刻(“死亡”或“入院”))。危险比用于测量两个生存曲线之间的差异的幅度。危险比(HR)>1指示具有短生存时间的风险较高，危险比(HR)<1指示具有较长生存时间的风险较高。如本领域已知的，危险比可以通过Cox比例危险(CoxPH)模型来计算。
在一些实例中，在本文所述的方法中，与对照相比，表14中列为“危险比>1”的miRNA的水平提高可指示对象的死亡风险增加(观察(全因)生存率降低)。在一些实例中，在本文所述的方法中，与对照相比，表14中列为“危险比>1”的miRNA的水平降低可指示对象死亡风险降低(观察(全因)生存率提高)。
在一些实例中，在本文所述的方法中，与对照相比，表14中列为“危险比<1”的miRNA的水平提高可指示对象的死亡风险降低(观察(全因)生存率提高)。在一些实例中，在本文所述的方法中，与对照相比，表14中列为“危险比<1”的miRNA的水平降低可指示对象的死亡风险增加(观察(全因)生存率降低)。
在另一方面，提供了一种用于确定心力衰竭患者疾病发展至住院或死亡的风险改变(无事件生存率降低)的风险的方法。在一些实例中，所述方法包括以下步骤：a)检测从对象获得的样品中表15中列出的至少一种miRNA的水平和/或测量表15中列出的至少一种miRNA的水平，以及b)确定表15中列出的至少一种miRNA的水平与对照群体的所述miRNA的水平相比是否不同，其中所述miRNA的水平改变指示与对照群体相比，对象疾病发展至住院或死亡的风险可能改变(无事件生存率改变)。
表15.预测无事件生存的miRNA
在一些实例中，在本文所述的方法中，与对照相比，表15中列为“危险比>1”的miRNA的水平提高可指示对象疾病发展到住院或死亡的风险增加(无事件生存率降低)。在一些实例中，在本文所述的方法中，与对照相比，表15中列为“危险比>1”的miRNA的水平降低可指示对象疾病发展至住院或死亡的风险降低(无事件生存率提高)。
在一些实例中，在本文所述的方法中，与对照相比，表15中列为“危险比<1”的miRNA的水平提高可指示对象疾病发展至住院或死亡的风险增加(无事件生存率提高)。在一些实例中，在本文所述的方法中，与对照相比，表15中列为“危险比<1”的miRNA的水平降低可指示对象疾病发展至住院或死亡的风险增加(无事件生存率降低)。
在一些实例中，在本文所述的方法中，对照可以是心力衰竭对象的对照群体或组群。在一些实例中，对照群体可以是心力衰竭患者的群体或组群，其中可以确定群体的微RNA表达水平和死亡或疾病发展风险。在一些实例中，对照群体的微RNA的表达水平可以是群体中所有对象(包括所讨论患者)的平均或中值表达水平。在一些实例中，如果对照人群中10％的患者在5年内死亡，则该对照群体的5年内死亡风险为10％。在一些实例中，对照群体包括其死亡或疾病发展风险需要用微RNA表达水平来确定的心力衰竭患者。
在一些实例中，在本文所述的方法中，心力衰竭患者可以是以下对象，其已具有心力衰竭的初步诊断和/或在症状改善(心力衰竭的床旁身体症状消退)并且认为适合出院时治疗3至5天。在一些实例中，患者可以是稳定补偿性心力衰竭患者，其尚未进一步恶化成需要再住院或死亡的复发性急性代偿失调性心力衰竭。
在另一方面，提供了一种确定对象中发生心力衰竭的风险或确定对象是否患有心力衰竭的方法，其包括以下步骤：(a)检测从对象获得的样品中miRNA的存在和/或测量样品中表16或表23中列出的至少三种miRNA的水平；以及(b)使用基于步骤(a)中所测量miRNA的水平的评分来预测对象发生或患有心力衰竭的可能性。在一些实例中，所述方法还可以包括测量表16或表23中“不显著组”中列出的至少一种miRNA的水平，并且其中所述至少一种miRNA是hsa-miR-10b-5p。
如本文在本公开内容通篇并且参考本文所述的所有方法使用的，术语“评分”是指可以例如通过使用本领域已知的计算模型(作为一个实例，其可以包括但不限于SMV)数学确定的和出于统计学分类目的而使用本领域已知众多数学等式和/或算法中的任一种计算的整数或数字。这样的评分用于对可能结果的谱列出一个结果。这样的评分的相关性和统计学显著性取决于用于建立结果谱的基础数据集的大小和质量。例如，可以将盲样品输入算法中，其进而基于分析盲样品提供的信息计算评分。这使得生成所述盲样品的评分。根据该评分，可以作出决定，例如，从其获得盲样品的患者患有或不具有心力衰竭的可能性多大。谱的末端可以基于提供的数据逻辑限定，或根据实验者的要求任意限定。在两种情况下，均需要在测试盲样品之前限定谱。结果，由这样的盲样品生成的评分(例如数字“45”)可基于限定为1至50的标度的谱来指示对应患者患有心力衰竭，其中“1”限定为未患心力衰竭，“50”限定为患有心力衰竭。因此，术语“评分”是指数学评分，其可以出于统计学分类目的而使用本领域已知众多数学等式和/或算法中的任一种来计算。这样的数学等式和/或算法的实例可以是但不限于选自以下的(统计学)分类算法：支持向量机算法、逻辑回归算法、多项式逻辑回归算法、Fisher线性判别算法、二次分类器算法、感知器算法、k最近邻算法、人工神经网络算法、随机森林算法、决策树算法、朴素贝叶斯算法(naive Bayesalgorithm)、自适应贝叶斯网络算法以及组合多种学习算法的集成学习方法。在另一个实例中，使用对照的表达水平预先训练分类算法。在一些实例中，分类算法将对象的表达水平与对照的表达水平进行比较，并返回确定对象属于任一对照组的可能性的数学评分。在一些实例中，分类算法可以将对象的表达水平与对照的表达水平进行比较，并返回确定对象属于任一对照组的可能性的数学评分。以下提供了可以在本公开内容中使用的算法的一些实例。
表16.用于心力衰竭的多变量检测的miRNA
表23.用于心力衰竭检测的miRNA
在一些实例中，本文公开的方法测量以下的水平的变化：表16中列出的至少4种、或至少5种、或至少6种、或至少7种、或至少8种、或至少9种、或至少10种、或至少11种、或至少2至至少20种、或至少10至至少45种、或至少40至至少50种、或全部miRNA。在一些实例中，本文公开的方法测量表23中列出的至少4种、或至少5种、或至少6种、或至少7种、或至少8种、或至少9种、或至少10种、或至少11种、或至少2至至少20种、或至少10至至少41种、或所有miRNA。
在一些实例中，本文公开的方法测量(对象的血浆样品中)至少一种(或多种)miRNA的水平。可以将至少一种miRNA的测量组合以生成用于预测心力衰竭或分类HFREF和HFPEF亚型的评分。在一些实例中，生成评分的式可以是式1，该式如下：
式1-
其中log2拷贝_miRNAi是单独miRNA的log转换拷贝数(拷贝/ml血浆)；Ki是用于对多个miRNA靶标进行加权的系数；以及B是调整预测评分的标度的恒定值。
式1在此示出了线性模型用于预测心力衰竭或分类HFREF和HFPEF亚型的应用。预测评分(对于每个对象是特有的)是作出预测性或诊断性决策的数值。
在本公开内容的实验部分中，对所鉴定的miRNA的诊断用途进行进一步的统计学评价。然后，用重复计算机交叉验证通过序列正向浮动搜索(sequence forward floatingsearch，SFFS)[53]和支持向量机(support vector machine，SVM)[54]制定多变量miRNA生物标志物组(HF组、HFREF和HFPEF组)。本公开内容的发明人发现生物标志物组中的一些miRNA在接受者操作特征(ROC)图中一致地产生用于HF检测的≥0.92的AUC值(曲线下面积)(图20，B)和用于亚型分类的AUC≥0.75(图24，A)。当与NT-proBNP组合使用时，miRNA组对两个目的均显示出显著提高的辨别力和更佳的分类准确度(图22，B；和24，B)。
因此，在另一方面，提供了确定对象中发生心力衰竭的风险或确定对象是否患有心力衰竭的方法，其包括以下步骤：(a)检测从对象获得的样品miRNA的存在，和/或测量该样品中表17中列出的至少两种RNA的水平；以及(b)使用基于步骤(a)中所测量miRNA的水平的评分来预测对象发生或患有心力衰竭的可能性。
表17.与NP-proBNP联合用于心力衰竭检测的miRNA
在一些实例中，本文所述的方法还可包括确定脑钠尿肽(BNP)和/或N端脑钠尿肽激素原(NT-proBNP)的水平的步骤。在一些实例中，NT-proBNP和BNP二者都是心力衰竭(例如慢性心力衰竭)的预后和诊断的良好标志物。
一些实例中，本文所述的方法可测量表17中列出的至少3种、或至少4种、或至少5种、或至少6种、或至少7种、或至少8种、或至少9种、或至少10种、或至少11种、或至少2至少20种、或至少10至少45种、或至少40至少48种、或所有miRNA的改变水平。
在一些实例中，在本文公开的方法中，当BNP和/或NT-proBNP与miRNA一起使用时，可一作为替代地使用式2。在式2中，将血浆样品中BNP/NT-proBNP的水平包括在线性模型中。在一个实例中，式2如下：
式2-
其中log2拷贝_miRNAi是单独miRNA的log转换拷贝数(拷贝/ml血浆)；Ki是用于对多个miRNA靶标进行加权的系数；B是调整预测评分的标度的恒定值；BNP是与样品中BNP和/或NT-proBNP的水平正相关或负相关的量度。
另外，为了预测心力衰竭，预测评分(其对于每个对象是独有的)是指示对象患有心力衰竭的可能性的数值。在一些实例中，可以在式3中找到本文所述的方法的结果(即对可能性或诊断的预测)。如果值高于预设截止值，则对象将被诊断或预测为患有心力衰竭。如果值低于预设定截止值，则对象将被诊断或预测为未患心力衰竭。式3如下
式3-
在一些实例中，对于HFREF和HFPEF亚型的分类，预测评分(其对于每个对象是独有的)可以是指示心力衰竭对象患有HFPEF亚型心力衰竭的可能性的数值。在一些实例中，可以在式4中找到诊断结果。如果值高于预设截止值，则心力衰竭对象将被诊断为(或被预测)患有HFPEF亚型心力衰竭。如果该低于预设截止值，则通过该检验，心力衰竭对象将被诊断为(或被预测)患有HFREF亚型心力衰竭。
式4-
在另一方面，提供了一种确定对象患有左心室射血分数降低性心力衰竭(HFREF)或左心室射血分数保留性心力衰竭(HFPEF)的可能性的方法。在一些实例中，该方法包括以下步骤：(a)检测从对象获得的样品中miRNA的存在，和/或测量该样品中表18中列出的至少三种miRNA的水平；以及(b)使用基于步骤(a)中所测量miRNA的水平的评分来预测对象患有左心室射血分数降低性心力衰竭(HFREF)或左心室射血分数保留性心力衰竭(HFPEF)的可能性。
表18.用于确定心力衰竭亚型分类的miRNA
在一些实例中，本文所述的方法可以测量表18中列出的至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9种、至少10种、至少11种、至少2至至少20种、至少10至至少30种、至少40至至少45种、或全部miRNA的改变水平。
在一些实例中，可以通过本文提供的式来计算本文公开的方法中的评分。在一些实例中，所述式可以是包括但不限于式1和/或式2的式中的至少一个。本文公开的方法的结果可以例如但不限于式3、式4等的式来确定。
在另一方面，提供了一种确定对象患有左心室射血分数降低性心力衰竭(HFREF)或左心室射血分数保留性心力衰竭(HFPEF)的可能性的方法，其包括以下步骤：(a)检测从对象获得的样品中miRNA的存在，和/或测量该样品中表19或表24中列出的至少两种RNA的水平；以及(b)使用基于步骤(a)中所测量miRNA的水平的评分来预测对象患有左心室射血分数降低性心力衰竭(HFREF)或左心室射血分数保留性心力衰竭(HFPEF)的可能性。
表19.在对心力衰竭亚型进行分类时与NT-proBNP联合使用的miRNA
表24.在对心力衰竭亚型进行分类时与NT-proBNP联合使用的miRNA
如实验部分和附图如图22和24中所举例说明的，当本公开内容的方法与确定NT-proBNP的附加步骤一起使用时，该方法提供令人惊讶的准确预测。因此，在一些实例中，该方法还可包括确定脑钠尿肽(BNP)和/或N端脑钠尿肽激素原(NT-proBNP)的水平的步骤。
在一些实例中，本文所述的方法可以测量表19中列出的至少3种、或至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9种、至少10种、至少11种、至少2至至少20种、至少10至至少30种、或全部miRNA，或者表24中列出的至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9种、至少10种、至少11种、至少2至至少20种、至少10至至少41种、或全部miRNA的改变水平。
在一些实例中，当与对照比较时，步骤(b)中所测量至少一种miRNA的水平在对象中不改变。在这样的实例中，当与对照相比时水平在对象中不改变的miRNA是相应表中列为“不显著”的miRNA。
在一些实例中，可以通过式2来计算本文公开的方法中的评分。
如本领域技术人员理解的，本文中所描述的任何方法中使用的分类算法均可以使用对照的表达水平来预先训练。在其中使用预先存在的临床数据预先训练分类算法的实例中，对照可以是选自无心力衰竭对照(正常)和心力衰竭患者的至少一种。对照可以包括患有心力衰竭和/或未患心力衰竭(即无心力衰竭)的对象的组群。因此，在本文公开的方法的一些实例中，对照可以包括但不限于无心力衰竭对照和心力衰竭患者，HFPEF亚型心力衰竭患者、HFREF亚型心力衰竭患者等。
本公开内容讨论了在建立miRNA组中进行miRNA的表达水平的差异比较，基于该比较可以确定对象是否处于发生心力衰竭风险之中或确定对象是否患有心力衰竭。如本文公开的，本文公开的方法需要通常来自不同组的miRNA表达水平的差异比较。在一个实例中，在两个组之间进行比较。这些比较组可以被定义为但不限于心力衰竭、无心力衰竭(正常)。在心力衰竭组中，可以找到进一步的亚组，例如但不限于HFREF和HFPEF。也可以在本文所述的这些组之间进行差异比较。因此，在一些实例中，miRNA的表达水平可以表示为但不限于浓度、log(浓度)、阈值循环/定量循环(Ct/Cq)数、2的阈值循环/定量循环(Ct/Cq)数次方等。
在本文所述的任何方法中，所述方法还可包括但不限于以下步骤：在不同时间点从对象获得样品，监测心力衰竭的进程，对心力衰竭进行分期，测量对象(从其获得的样品)中的miRNA水平和/或NT-proBNP水平等。
在一些实例中，基于在以下实验部分中所述的当前组群，可开发包括多种miRNA的生物标志物组或包括多种miRNA和BNP/NT-proBNP的生物标志物组。预测评分计算可以通过本领域已知的方法，例如用线性SVM模型进行优化。在一些实例中，可以通过SFFS和SVM优化由不同数量的miRNA靶标组成的生物标志物组，其中AUC针对心力衰竭预测(表26)或心力衰竭亚型分类(表27)进行优化。表格中提供了示例性的式、截止值和性能。
表26.用于HF检测的示例性生物标志物组
如表26中使用的，符号“*”是指“×”或乘号；“-”是指负值；“+”是指加法；“log2(BNP)”是指BNP表达的log2值。表26的第二列还示出了如本文所使用方法中使用的用于计算评分的示例性式。在该式中，微RNA的测量单位是拷贝/ml血浆，而对于NT-proBNP是pg/ml血浆。对于本领域技术人员显而易见的是，式中的系数和截止值必须根据用于测量的不同检测系统和/或用于表示微RNA表达水平和BNP水平/类型的不同单位进行调整。式的调整将不会超出本领域普通技术人员的技能。
因此，在另一方面，提供了一种确定对象中发生心力衰竭的风险或确定对象是否患有心力衰竭的方法，其包括以下步骤：(a)检测从对象获得的样品中表26中列出的选定组中miRNA的存在，和/或测量该样品中表26的选定组中列出的miRNA的水平；以及(b)基于步骤(a)中所测量miRNA的水平来分配评分以预测对象发生或患有心力衰竭的可能性。在一个实例中，基于表26中列出的式计算评分。在一个实例中，当需要两种miRNA的生物标志物组时，该方法可以检测和测量表26中列为“2种miRNA的组”的miRNA的水平。在一些实例中，当需要三种miRNA的生物标志物组时，该方法可以检测和测量表26中列为“3种miRNA的组”的miRNA的水平。在一些实例中，当需要四种miRNA的生物标志物组时，该方法可以检测和测量表26中列为“4种miRNA的组”的miRNA的水平。在一些实例中，当需要5种miRNA的生物标志物组时，该方法可以检测和测量表26中列为“5种miRNA的组”的miRNA的水平。在一些实例中，当需要6种miRNA的生物标志物组时，该方法可以检测和测量表26中列为“6种miRNA的组”的miRNA的水平。在一些实例中，当需要7种miRNA的生物标志物组时，该方法可以检测和测量表26中列为“7种miRNA的组”的miRNA的水平。在一些实例中，当需要8种miRNA的生物标志物组时，该方法可以检测和测量表26中列为“8种miRNA的组”的miRNA的水平。在一些实例中，该方法可以与检测和测量其样品中NTproBNP的水平的附加步骤一起进行。
在一些实例中，为了预测心力衰竭，预测评分(其对于每个对象是独有的)是指示对象患有心力衰竭的可能性的数值。在一些实例中，可以在式3中找到本文所述的方法的结果(即对可能性或诊断的预测)。如果值高于预设截止值，则对象将被诊断或预测为患有心力衰竭。如果值低于预设截止值，则对象将被诊断或预测为未患心力衰竭。式3如下：
式3-
表27.用于心力衰竭亚型分类的示例性生物标志物组
如表27中使用的，符号“*”是指“×”或乘号；“-”是指负值；“+”是指加法；“log2(BNP)”是指BNP表达的log2值。表27的第二列还示出了如本文所使用方法中使用的用于计算评分的示例性式。在该式中，微RNA的测量单位是拷贝/ml血浆，而对于NT-proBNP是pg/ml血浆。对于本领域技术人员显而易见的是，式中的系数和截止值必须根据用于测量的不同检测系统和/或用于表示微RNA表达水平和BNP水平/类型的不同单位进行调整。式的调整将不会超出本领域普通技术人员的技能。
在另一方面，提供了一种确定对象患有左心室射血分数降低性心力衰竭(HFREF)或左心室射血分数保留性心力衰竭(HFPEF)的可能性的方法，其包括以下步骤：(a)检测从对象获得的样品中表27中列出的选定组中miRNA的存在，和/或测量该样品中表27的选定组中列出的miRNA的水平；以及(b)基于步骤(a)中所测量miRNA的水平来分配评分以预测对象患有左心室射血分数降低性心力衰竭(HFREF)或左心室射血分数保留性心力衰竭(HFPEF)的可能性。在一个实例中，基于表27中列出的式计算评分。在一个实例中，当需要两种miRNA的生物标志物组时，该方法可以检测和测量表27中列为“2种miRNA的组”的miRNA的水平。在一些实例中，当需要三种miRNA的生物标志物组时，该方法可以检测和测量表27中列为“3种miRNA的组”的miRNA的水平。在一些实例中，当需要四种miRNA的生物标志物组时，该方法可以检测和测量表27中列为“4种miRNA的组”的miRNA的水平。在一些实例中，当需要5种miRNA的生物标志物组时，该方法可以检测和测量表27中列为“5种miRNA的组”的miRNA的水平。在一些实例中，当需要6种miRNA的生物标志物组时，该方法可以检测和测量表27中列为“6种miRNA的组”的miRNA的水平。在一些实例中，该方法可以与检测和测量其样品中NTproBNP的水平的附加步骤一起进行。
在一些实例中，为了分类HFREF和HFPEF亚型，预测评分(其对于每个对象是独有的)可以是指示心力衰竭对象患有HFPEF亚型心力衰竭的可能性的数值。在一些实例中，可以在式4中找到诊断的结果。如果值高于预设截止值，则心力衰竭对象将被诊断为(或被预测)患有HFPEF亚型心力衰竭。如果值低于预设截止值，则通过该检验，心力衰竭对象将被诊断为(或被预测)为患有HFREF亚型心力衰竭。
式4-
在一个实例中，本文所述的方法可以被实现为能够(或适于)执行本公开内容中所述的全部(或部分)步骤的装置。因此，在一个实例中，本公开内容提供了适于(或能够)适应于执行本文所述的方法的装置。
在另一方面，提供了一种在本文所述的任何方法中使用(或适于使用，或当使用时)的试剂盒。在一个实例中，试剂盒可包含用于确定以下基因的表达的试剂：表9中列出的至少一种基因、或表14中列出的至少一种基因、或表15中列出的至少一种基因、或表16中列出的至少两种基因、或表17中列出的至少两种基因、或表18中列出的至少两种基因、或表19中列出的至少两种基因、或表20中列出的至少一种基因、或表21中列出的至少一种基因、或表22中列出的至少一种基因、或表23中列出的至少一种基因、或表24中列出的至少一种基因、或表25中列出的至少一种基因。
在一些实例中，所述试剂可包含适于或能够确定以下基因的表达的探针、引物或引物组：表9中列出的至少一种基因、或表14中列出的至少一种基因、或表15中列出的至少一种基因、或表16中列出的至少两种基因、或表17中列出的至少两种基因、或表18中列出的至少两种基因、或表19中列出的至少两种基因、或表20中列出的至少一种基因、或表21中列出的至少一个基因、或表22中列出的至少一种基因、或表23中列出的至少一种基因、或表24中列出的至少一种基因、或表25中列出的至少一种基因。
在一些实例中，所述试剂盒还可包含用于确定脑钠尿肽(BNP)和/或N端脑钠尿肽激素原(NT-proBNP)的水平的试剂。
在一些实例中，本文所述的方法还可包括用至少一种用于治疗心力衰竭(或心力衰竭亚型)的治疗剂治疗被预测(或被诊断为)患有心力衰竭或心力衰竭亚型的对象的步骤。在一些实例中，所述方法还可包括已知用于缓解和/或减轻心力衰竭的症状的治疗。在一些实例中，本文所述的方法还可包括施用包括但不限于被证实改善心力衰竭预后的药物类(例如，ACEI/ARB、血管紧张素受体阻滞剂、环/噻嗪类利尿剂、β-阻滞剂、盐皮质激素类拮抗剂、阿司匹林或波立维、他汀类、地高辛、华法林、硝酸盐类、钙通道阻滞剂、螺内酯、贝特类、抗糖尿病剂、肼苯哒嗪、铁补充剂、抗凝剂、抗血小板剂等)。
本文中说明性描述的本发明可适当地在缺少本文中没有具体公开任意一个或更多个要素、限制的情况下实施。因此，例如，术语“包含”、“包括”、“含有”等应该被广义地理解而没有限制。另外，本文使用的术语和表述已经被用作描述性而不是限制性术语，并且在使用这样的术语和表述中没有意图排除所示出和描述的特征或者其部分的任何等同特征，但是认识到在要求保护的发明的范围内可以进行多种修改。因此，应理解的是，尽管通过一些优选实施例和可选特征具体公开了本发明，但是本领域技术人员可以采取本文公开的其中体现的本发明的修改和变化，并且这样的修改和变化是被认为在本发明的范围内。
已在本文中广泛且一般性地描述了本发明。落入上位公开内容中的每个较窄类别和下位分组也形成本发明的一部分。这包括本发明的具有从上位内容中移除任何主题而不管移除的材料在本文中是否具体说明的附带条件或负面限制的上位描述。
其他实施方案在以下权利要求书和非限制性实例内。另外，在根据马库什组描述本发明的特征或方面的情况下，本领域技术人员将认识到，本发明也由此根据马库什组的任何单独成员或成员亚组进行描述。
实验部分
方法
预分析(样品收集和miRNA提取)：将血浆样品在使用前冷冻储存在-80℃。使用公认的TRI试剂
按照制造商的方案分离来自200μl各血浆样品的总RNA。血浆含有微量的RNA。为了降低RNA的损失并监测提取效率，在分离之前向样品中添加合理设计的分离增强子剂(MS2)和加标对照RNA(MiRXESTM)。
RT-qPCR：将分离的总RNA和合成的RNA标准品与第二组加标对照RNA一起在优化的多重逆转录反应中转化为cDNA以检测抑制剂的存在并监测RT-qPCR效率。使用Improm II
逆转录酶按照制造商的说明进行逆转录。然后，使合成的cDNA进行多重增加步骤，并使用基于Sybr Green的单重qPCR测定(符合MIQE)(MiRXESTM)进行量化。使用Applied
ViiA 7 384实时PCR系统或
CFX384Touch实时PCR检测系统进行qPCR反应。图2总结了miRNA RT-qPCR测量工作流程的概况和细节。
数据处理：处理原始循环阈值(Ct)的值，并通过合成miRNA标准曲线的内插确定每个样品中靶miRNA的绝对拷贝数。通过加标对照RNA归一化在RNA分离和RT-qPCR过程期间引入的技术变化。为了分析单miRNA，通过在所有对照和患病样品中都稳定表达的一组已验证内源性参考miRNA进一步归一化生物学变化。
结果
I.研究参与者的特征
进行精心设计的临床研究(病例-对照研究)以确保生物标志物对慢性心力衰竭(HF)的准确鉴定。在该研究中使用总共338位来自新加坡群组的慢性心力衰竭患者(180例HFREF和158例HFPEF)，并与208位种族、性别和年龄匹配的非心力衰竭对象(作为对照组)进行比较。心力衰竭患者从新加坡心力衰竭结局与表型(Singapore Heart FailureOutcomes and Phenotypes，SHOP)研究招募[55]。如果患者具有急性代偿失调性心力衰竭(ADHF)的初始诊断或者在已知ADHF事件的6个月内去诊断管理心力衰竭，则将其纳入在内。通过正在进行的流行病学新加坡纵向老化研究(Singapore Longitudinal Ageing Study，SLAS)招募了没有明显冠状动脉疾病或心力衰竭病史的对照[56]。所有患者和对照都经历详细的临床检查(包括综合多普勒超声心动描记术)以确定临床心力衰竭的存在。采用由美国超声心动描记术学会(American Society of Echocardiography，ASE)指南推荐的圆盘双平面法评估LVEF。将患有已验证心力衰竭并且具有LVEF≥50％的患者归类为HFPEF，而具有LVEF≤40％的那些被归类为HFREF。排除40％至50％的HF患者。在患者已接受治疗(通常3至5天)、症状改善(其中心力衰竭的床旁身体症状消退)和被认为适合出院时有意地进行包括血浆样品的评估。这确保评估在经治疗或“慢性”期心力衰竭中的标志物性能。表2中提供了临床特征和人口统计学信息。所有的血浆样品在使用前都储存在-80℃。
表2.纳入研究中的对象的临床信息
根据制造商的说明(Roche Diagnostics GmbH,Mannheim,德国)在自动化Cobase411分析仪上通过电化学发光免疫测定(Elecsys proBNP II测定)在所有样品中测量血浆NT-proBNP。对照、HFREF和HFPEF组中分布的初步检查(图2，A至C)显示，所有组中的NT-proBNP水平都正偏斜(偏斜度/偏斜>2)。由于待应用的统计学方法需要不偏斜的分布(Student t分布或逻辑分布)，因此对NT-proBNP计算自然对数以生成偏度接近于零的新变量：ln_NT-proBNP(图2，D至F)。将ln_NT-proBNP用于涉及NT-proBNP的所有分析。
表3中总结了对象组群的特征。
表3.健康对象和心力衰竭对象的特征
除包括年龄、种族和性别的人口统计学变量之外，还记录了包括LVEF、ln_NT-proBNP、体重指数(BMI)、心房颤动或心房扑动(AF)、高血压和糖尿病的HF关键性临床变量。HFPEF患者的平均LVEF(60.7±5.9)与健康对照对象(64.0±3.7)相似，而正如预期的那样并且按照患者选择和分配，HFREF患者明显具有较低的LVEF(25.9±7.7)。使用Student t检验进行数值变量的比较，使用卡方检验进行比较对照与HF(C相对于HF，表3)和HFPEF与HFREF(HFREF相对于HFPEF，表3)之间的分类变量的比较。一般来说，HF患者的年龄越大，与对照相比，高血压、AF和糖尿病的患病率越高。HFREF和HFPEF患者在性别、年龄、BMI、高血压和AF的分布方面存在差异。通过多变量逻辑回归将所有这些不同分布的变量均纳入发现用于HF检测或用于HF亚型分类的miRNA生物标志物的考虑之中。
与HFREF相比，Ln_NT-proBNP在HFPEF中较低，其中一些结果低于用于在非急性环境中诊断HF的ESC-促进NT-proBNP截止值(<125pg/ml)[57]。在HFPEF中，NT-proBNP测试性能的损失是明显的(图3，A)。通过ROC分析检测ln_NT-proBNP作为HF诊断的生物标志物的性能。在该研究中，总体上，ln_NT-proBNP对于HF诊断具有0.962AUC(ROC曲线下面积)。与HFPEF(AUC＝0.935)相比，其对于检测HFREF(AUC＝0.985)表现得更佳(图3，B至D)。对于分类HFREF和HFPEF亚型，ln_NT-proBNP显示出仅0.706的AUC(图3，C)。
II.MiRNA测量
血液中的循环无细胞miRNA来源于各种器官和血细胞[58]。因此，由心力衰竭引起的miRNA水平变化可能被由于其他刺激而可能从其他来源分泌的相同miRNA的存在而被部分掩藏。因此，确定在心力衰竭和对照组中发现的miRNA的表达水平差异可具有挑战性。另外，大多数无细胞miRNA在血液中的丰度非常低[59]。因此，从有限体积的血清/血浆中准确测量多个miRNA靶标是至关重要的并且非常具有挑战性。为了最有利于发现显著改变的miRNA表达并鉴定用于诊断心力衰竭的多变量miRNA生物标志物组，作为使用低灵敏度或半定量筛选方法(微阵列、测序)的替代，本研究的发明人选择用特别精心设计的工作流程进行基于qPCR的测定(图4)。
所有qPCR测定(由MiRXESTM,新加坡设计)对于miRNA靶标以单重复和对于合成RNA“加标”对照以至少四次重复进行至少两次。为了确保高通量qPCR研究的结果的准确性，本研究经过多次迭代设计并建立了用于发现循环生物标志物的稳健工作流程(参照“方法”和图4)。在该新工作流程中，使用设计的不同“加标”对照来监测和校正分离、逆转录、增加和qPCR过程中的技术变化。所有加标对照都是非天然的合成miRNA模拟物(长度为22至24个碱基间的小单链RNA)，其通过计算机被设计成与所有已知人miRNA具有出于意料低的相似性，由此使与测定中所使用引物的交叉杂交最小化。另外，miRNA测定通过计算机被有意地分成多个多重组以最小化非特异性扩增和引物-引物相互作用。使用合成miRNA构建用于在所有测量中内插绝对拷贝数的标准曲线，由此进一步校正技术变化。可以预测的是，通过这个高度稳健的工作流程和多个对照水平，该研究能够鉴定循环中miRNA的低表达水平，并且本研究的方法是高度可靠的且确保数据的可重复性。
基于高表达血浆miRNA的先验知识(数据未示出)选择了两百零三(203)个miRNA靶标进行本研究，并且使用高灵敏qPCR测定(由MiRXESTM,新加坡设计)定量测量所有546个血浆样品(HF和对照)中那些miRNA的表达水平。
在目前的实验设计中，从200μl血浆提取包括miRNA的总RNA。将提取的RNA逆转录并通过降落扩增来增加以增加cDNA的量而不改变总miRNA表达水平(图4)。然后，稀释增加的cDNA用于qPCR测量。基于稀释效应的简单计算揭示，在接近单重qPCR测定的检测极限(≤10拷贝/孔)的水平下将量化在血清中以≤500拷贝/ml的水平表达的miRNA。在这样的浓度下，由于技术限制(移液和qPCR反应中的误差)，测量将是一个重大挑战。因此，以≤500拷贝/ml的浓度表达的miRNA被排除在分析之外，并且被认为是不可检测到的。
发现所测定总miRNA中的约70％(n＝137)在所有样品中都高表达。在超过90％的样品中检测到这137种miRNA(表达水平≥500拷贝/ml；表4)。与已公开的数据(表1)相比，本研究的发明人检测到远远更多先前在心力衰竭中未报道的miRNA，突出了使用谨慎且控制良好的实验设计的重要性。
表4. 137种可靠检出的成熟miRNA的序列
III.MiRNA生物标志物
首先，检测所有测量的miRNA以获得仅在心力衰竭样品中可检测到但在对照样品中未检测到的靶标。心力衰竭患者中由心肌特异性分泌的miRNA是检测该疾病的理想生物标志物。由于血液循环系统中的miRNA已知由不同器官和/或细胞类型(包括心肌)所贡献，因此这些miRNA可能在正常和心力衰竭患者中的血浆已代表并不令人惊讶。然而，这些miRNA在血浆中的差异表达仍然可用作心力衰竭发展期间的有用生物标志物。
最初对所有546个样品中的所有检出血浆miRNA(137种，表4)的表达水平进行全局无监督分析(主成分分析，PCA)。选取本征值大于0.7的前15个主成分(PC)进行进一步分析，这总计占方差的85％(图5，A)。为了检测对照与心力衰竭之间的差异，计算AUC以在每个选定PC分类这两个组(图5，B)。发现多个PC具有显著高于0.5的AUC，并且第二PC甚至具有0.79的AUC，表明这两个群体之间的差异主要归因于miRNA表达谱的总体变化。由于对照与心力衰竭对象之间的差异在多个维度(PC)中发现，因此不可能基于单一miRNA来代表所有信息。因此，包含多种miRNA的多变量测定对于最佳分类是必要的。类似地，多个PC对于分类为两种心力衰竭亚型：HFREF或HFPEF中任一种(图5，C)的AUC显著高于0.5(包括第一PC(AUC＝0.6))，但是AUC小于用于心力衰竭检测的那些。因此，为了分类HFREF和HFPEF，还需要多变量分析来捕获多维度信息。
将两组对象(C和心力衰竭(HF))在由用于HF检测的两个主要判别性PC限定的空间上绘图，显示该两组分离定位(图6，A)。HFREF和HFPEF组的分离(图6，B)较不明显。全局分析揭示有可能miRNA谱来分离对照、HFREF和HFPEF对象。然而，仅使用一个或两个维度对于分类而言在统计学上不稳健。
鉴定生物标志物的关键步骤是直接比较在正常和疾病状态以及在疾病亚型之间每种miRNA的表达水平。使用Student t检验进行单变量比较以评估单独miRNA的组间差异的显著性，并使用多变量逻辑回归调整包括年龄、性别、BMI、AF、高血压和糖尿病的混淆因素。所有p值使用Bonferroni型多重比较程序针对错误发现率(FDR)估计进行校正[60]。p值低于0.01的miRNA在本研究中被认为是显著的。
然后，比较137种血浆miRNA的表达：A]在对照(健康)与心力衰竭(单独亚型或两种亚型分组在一起)之间，B]在两种心力衰竭亚型(即HFREF和HFPEF)之间。
A]鉴定在非HF对照对象与HF患者之间差异表达的miRNA
将来自在临床上确诊患有任一种心力衰竭亚型(HFREF或HFPEF)的患者的血浆分组在一起，并与来自健康的非心力衰竭捐献者的血浆进行比较。
最初使用单变量分析(Student t检验)进行比较，其中与对照相比，发现94种miRNA在心力衰竭患者中显著改变(FDR后p值<0.01)(图7，A)。进一步单独检测这两种亚型，分别发现与对照相比，82和94种miRNA在HFREF和HFPEF对象中显著改变(图7，A)。总之，通过单变量分析鉴定到101种独特的miRNA，其中75％(n＝76)对于这两种亚型都具有显著性(图7A)。
由于对照对象是从社区招募的，因此临床参数可能与心力衰竭患者不能很好地匹配，包括心力衰竭的三个风险因子：AF、高血压和糖尿病，其中对照对象中很少患有这样的病症。此外，在分析的群体之间年龄也略有不同。为了调整这些可能的混淆因子，进行多变量分析(逻辑回归)以检验通过单变量分析选择的miRNA的显著性。在多变量分析之后，101种miRNA中的总共有86种在测试群体之间仍然显著不同(图7，B)。为了与对照相比的所有心力衰竭的检测，在多变量分析中发现94种miRNA中的有75种(表5)是显著的(FDR后p值<0.01)，而对于与对照相比的HFREF检测，82种中的52种(表6)是显著的，对于与对照相比的HFPEF检测，94种中有68种(表7)是显著的(图7B)。在多变量分析之后，发现36种miRNA在对照组与两个心力衰竭亚型之间仍然显著不同，而16种仅在对照与HFREF亚型之间显著不同，32种仅在对照与HFPEF亚型之间显著不同(图7，B)。在多变量分析中，发现许多miRNA在对照与仅两种心力衰竭亚型之一之间存在差异，表明这两种亚型在miRNA表达方面的真正差异。
表5.在对照与所有心力衰竭对象之间差异表达的miRNA
表6.在对照与REF对象之间差异表达的miRNA
表7.在对照与HFPEF对象之间差异表达的miRNA
先前已经报道了许多miRNA在HF中上调和下调(表1)。令人感兴趣的是，在本研究中发现差异表达的miRNA与这些报道显著不同。表5(C相对于心力衰竭(HF))、表6(C相对于HFREF)和表7(C相对于HFPEF)中列出了单变量和多变量分析中的显著miRNA，其中分别在三个比较中，37、25和33种miRNA被发现上调，38、27和35种miRNA被发现下调。通过qPCR验证的差异表达miRNA的数量(单变量分析中101种以及单变量分析和多变量分析二者中86种)明显高于先前报道的(表8，总共47个)。每种miRNA或来自这86种miRNA的组合可用作生物标志物或用作生物标志物组的组分(多变量指标测定)用于心力衰竭的诊断。
表8.本研究与先前公开的报道之间的比较
文献中总共已报道了47种不同的miRNA(表1)。Hsa-miR-210在心力衰竭患者中的变化方向方面具有相互矛盾的观察结果(表8)。在本研究中，其他46种报道的miRNA中有22种是不可测量的或低于检测限(表8中的N.A.)，留下24种miRNA用于比较。将结果(单变量分析中的FDR后p值<0.01)与24种报道的miRNA进行比较，在本研究中，仅这些先前报道的miRNA中仅4种(hsa-miR-423-5p、hsa-miR-30a-5p、hsa-miR-22-3p、hsa-miR-21-5)被发现一致地下调并且四种(hsa-miR-103a-3p、hsa-miR-30b-5p、hsa-miR-191-5和hsa-miR-150-5p)被发现一致地下调(表8)。令人感兴趣的是，在8种失调的miRNA中，变化方向与先前报道的相反，而其中七种保持不变(表8)。因此，先前报道在心力衰竭中差异调节的大多数miRNA可以在本研究中不能得到证实。相反，本研究鉴定到超过70种先前未报道的可能是HF检测的潜在生物标志物的新miRNA。
NT-proBNP/BNP是迄今研究最充分的心力衰竭生物标志物并且表现出最佳的临床性能。因此，本研究旨在检测这些显著调节的miRNA是否可以向NT-proBNP提供额外的信息。通过针对年龄、AF、高血压和糖尿病调整的逻辑回归测试NT-proBNP对miRNA检测心力衰竭的增强(p值，ln_BNP，表5至7)。使用经FDR校正后低于0.01的p值作为标准，发现55种miRNA(p值，ln_BNP，表7)具有与ln_NT-proBNP互补用于HFPEF检测而不用于HFREF的信息(p值，ln_BNP，表6)。与HFPEF(AUC＝0.935，图3E)相比，单独使用的NT-proBNP明显对HFREF检测具有更佳的诊断性能(AUC＝0.985，图3D)。在多变量测定中将这55种miRNA中的任意一种或多种与ln_NT-proBNP一起组合可以潜在地提高HFPEF的检测。
心力衰竭(两个亚型)中最上调(hsa-let-7d-3p，图8，A)和最下调(hsa-miR-454-3p，图8，B)的miRNA的AUC值分别为0.78和0.85。两种miRNA在先前均未被报道可用于检测心力衰竭。尽管单一miRNA的诊断力可能在临床上不可用，但是以多变量方式组合多种miRNA可以很好地提高心力衰竭诊断的性能。
B]鉴定在HFREF与HFPEF之间差异表达的miRNA
单变量分析(Student t检验)表明，HFREF与HFPEF对象之间40种miRNA显著改变(FDR后p值<0.01)，其中10种miRNA在HFPEF中比HFREF中具有更高的表达水平，30种miRNA在HFREF中比HFPEF中具有更高的表达水平(表9)。
预期两种心力衰竭亚型之间背景临床特征不同(表3)。与HFREF患者相比，HFPEF患者更常见于女性，BMI更高，年龄更大，并且更常患有AF或高血压。在针对这些特征调整的多变量分析(逻辑回归)之后，40种miRNA中只有18种保持显著(FDR后p值<0.01)(p值，逻辑回归，表9)。然而，由于这两种亚型之间的差异是由于疾病的自然发生和表征，而不是由研究的有偏倚样品选择引起，因此表9(单变量分析)中的所有40种miRNA均可用于分类心力衰竭亚型。
所有心力衰竭中最上调miRNA(hsa-miR-223-5p，图10，A)和最下调miRNA(hsa-miR-185-5p，图10，B)用于辨别心力衰竭与对照的AUC值仅是适中的：分别为0.68和0.69。这是首次报道使用来自血液(血浆/血清)的循环无细胞miRNA将心力衰竭患者分为两个临床上相关的亚型。在多变量指标测定中组合多种miRNA为亚型分类提供更多的诊断力。
在HFREF与HFPEF之间差异表达的大多数miRNA(在单变量分析中，40种中有38种；在多变量分析中，18种中有17种)也被发现不同于对照，反映了失调程度在两个心力衰竭亚型之间不同(图11)。为了进一步检测在单变量分析中发现在任一种HF亚型中以及在两个亚型之间改变的38种重叠miRNA(图9，A)，基于其在三个对象组(对照、HFREF和HFPEF)中的表达水平的关系将其分成6组(图11)。如果两组之间比较的p值(FDR)高于0.01，则关系被定义为相等(表示为“＝”)，而如果p值(FDR校正后)低于0.01，则关系由变化方向定义(表示为更高“>”或更低“<”)。
在大多数miRNA中发现从对照到HFREF到HFPEF的分级变化，其中21种miRNA逐渐降低(C>HFREF>HFPEF，图11)，5种miRNA逐渐增加(C<HFREF<HFPEF，图11)。此外，5种miRNA被发现仅在HFPEF亚型中更低(C＝HFREF>HFPEF，图11)，而2种被发现仅在HFPEF亚型中更高(C＝HFREF<HFPEF，图11)，而在HFREF与控制之间无差异。与对照相比，仅3种miRNA在HFREF亚型中比在HFPEF中具有更独特的水平(C<HFPEF<HFREF或C＝HFPEF>HFREF或C＝HFPEF<HFREF，图11)。与LVEF和NT-proBNP不同，与健康对照相比，HFPEF具有比HFREF亚型更独特的miRNA谱。这表明miRNA可以补充NT-proBNP以更好地辨别HFPEF。
所有可检测miRNA的分析揭示大量彼此正相关(Pearson相关系数>0.5，图12)正相关，尤其是在HF患者中改变并且在两种心力衰竭亚型之间不同的那些miRNA之间(miRNA在x轴表示为黑色，朝向x轴的右手侧，图12)。血浆中miRNA水平的变化归因于心力衰竭(HFREF和/或HFPEF)。这些观察结果表明，许多对miRNA在所有对象中相似地调节。因此，可以通过将一种或更多种特定miRNA替换成另外miRNA来组装miRNA组以系统地优化诊断性能。所有显著改变的miRNA对于开发用于心力衰竭检测或心力衰竭亚型分类的多变量指标诊断测定都是关键的。
IV.作为预后性标志物的血浆miRNA
根据心力衰竭患者在被招募到SHOP组群研究时的索引入院，在治疗3至5天后症状改善(其中HF的床旁身体症状消退)并且认为适合出院时对其采样。这确保本研究中标志物性能的评估与HF的亚急性或“慢性”期相关。本研究评估了循环miRNA对死亡率和心力衰竭再住院的预后性能。对327例心力衰竭患者(176例HFREF和151例HFPEF)随访2年(表10)，在此期间49例死亡(15％)。
表10.纳入预后研究中的对象的临床信息
在所有研究病例中，115位在随访期间由于心力衰竭而再次住院(表10)，49位死亡。将miRNA作为代偿失调性心力衰竭的观察(全因存活率)OS和无事件生存(EFS)二者(全因死亡和/或复发入院的综合)的潜在标志物(即预测物)进行评估。
向研究参与者开处方的抗心力衰竭药物治疗总结在表11中。比较HFREF和HFPEF的治疗，发现一半相关药物的开处方频率不同(图13)。值得注意的是，那些被证明可以改善HFREF预后的药物种类(ACEI/ARB、β阻滞剂和盐皮质激素类拮抗剂)相对于HFPEF患者更常开处方于HFREF患者。治疗是根据目前的临床实践，并且包括在分析预后性标志物的临床变量中。
表11.纳入预后研究中的对象的治疗
使用Cox比例危险(CoxPH)建模进行生存分析，并且在相同模型中单独(单变量分析)或同时(多变量分析)说明变量。为了在不同危险比(HR)之间具有更佳的比较，将所有正态分布变量(包括miRNA表达水平(log2标度))、临床变量(例如BMI、ln_NT-proBNP、LVEF、年龄)以及通过组合多个变量生成的多变量评分按比例调整为具有一个标准偏差。然后，使用危险比(HR)作为这些变量的预后力的指标。p值<0.05被认为是统计学显著的。根据分类变量的存在或不存在以及正态分布连续变量的中值上或中值下水平将患者分类为高风险和低风险。使用Kaplan-Meier图(KM图)通过对数秩检验用曲线间比较来说明不同风险组的随时间生存。还比较了750天的组间生存(OS750)和/或750天的EFS(EFS750)。
最初评估所有临床变量以预测总体生存(OS)。在单变量分析中，发现5个变量(年龄、高血压、ln_NT-proBNP、硝酸盐和肼苯哒嗪)与死亡风险正相关，并且发现两个变量(BMI和β阻滞剂)与死亡风险负相关(表12)。令人感兴趣的是，在HFREF与HFPEF患者之间，总体生存没有差异。由这些显著参数限定的对象组的KM图示于图14，A中，并且OS750示于图14，B中。所有参数都能够限定高风险组和低风险组，其中ln_NT-proBNP是最显著的(p值＝7.2E-07，HR＝2.36(95％CI：1.69-3.30))。基于ln_NT-proBNP的水平，低风险组的OS750为92.4％，高风险组的值仅为66.0％。在包括所有临床变量的多变量分析中，发现6个变量(性别、高血压、BMI、ln_NT-proBNP、β阻滞剂和华法林)是显著的。稍后将这6个变量与137种miRNA各自组合在CoxPH模型中用于鉴定用于总体生存的预后性miRNA标志物。
表12.观察生存的临床变量的分析
对无事件生存(EFS)进行类似的分析，并且在单变量分析中发现7个变量(AF、高血压、糖尿病、年龄、ln_NT-proBNP、硝酸盐类和肼苯哒嗪)与代偿失调性心力衰竭的复发入院风险正相关(表13)。由这些显著参数限定的对象组的KM图示于图15，A中，并和EFS750示于图15B，B中。再次，HFREF与HFPEF之间在无事件生存方面不存在差异，并且ln_NT-proBNP是无事件生存的最显著预测物(p值＝1.5E-09，HR＝1.79(95％CI：1.47-2.17))。中值下ln_NT-proBNP与65.1％的EFS750相关，中值上水平与仅34.1％的EFS750相关。通过多变量分析，只有两个变量：糖尿病和ln_NT-proBNP被发现是显著的。随后，将这些变量与137种miRNA各自组合用于鉴定无事件生存的预后性miRNA标志物。
表13.无事件生存(EFS)的临床变量的分析
为了鉴定用于预测总体生存的miRNA生物标志物，通过单变量CoxPH模型以及在包括6个另外预测性临床变量的多变量CoxPH模型中测试137种miRNA各自。总共，40种miRNA的p值小于0.05。三十七(37)个在单变量分析中是显著的，29个在多变量分析中是显著的(表14)。在单变量分析中发现显著的11种miRNA不能够提高临床参数的预测性能(多变量分析)，3种miRNA只有在与临床变量组合时才显著(图16，A)。除hsa-miR-374b-5p(p值＝0.25)之外，2种miRNA在单变量分析中具有小于0.1的p值(表14)。
在单变量(HR＝1.90(95％CI：1:36-2.65，p值＝0.00014))和多变量分析(HR＝1.79(95％CI：1.23-2.59，p值＝0.0028))中对死亡率具有最高危险比(HR)的miRNA是hsa-miR-503。对于单变量分析(HR＝0.52(95％CI：0.40-0.67，p值＝1.3E-7))和多变量分析(HR＝0.59(95％CI：0.45-0.78，p值＝0.00032))二者，Hsa-miR-150-5p具有最低的HR(即，表达水平与风险负相关)(表14)。图18，A中示出了两种miRNA的KM图。可以观察到两个风险组之间的良好分离。基于单一miRNA，高风险组和低风险组在OS750方面具有约21.3％(Hsa-miR-503)或17.8％(has-miR-150-5p)的差异(图18，B)。在添加6个临床变量下，组合评分提供更佳的风险预测，其中对于hsa-miR-503+6个临床变量，差异为25.3％，对于has-miR-150-5p+6个临床变量，差异为22.4％(图18，B)40种miRNA中的任意中或多种(表14)可用作慢性HF患者的死亡风险的与预后性标志物/组。
为了预测无事件生存，在单变量分析中发现13种miRNA是显著的(p值<0.05)，其中4种与治疗后代偿失调性心力衰竭的复发入院风险正相关，9种与之负相关(表15)。在其中在CoxPH模型中包括2个另外临床变量的多变量分析中发现miRNA对EFS预测均不具有显著性。然而，在单变量分析中与EFS最正相关的miRNA(hsa-miR-331-5p，HR＝1.27(95％CI:1.09-1.49,p值＝0.0025))和最负相关的miRNA(hsa-miR-30e-3p，HR＝0.80(95％CI:0.69-0.94,p值＝0.0070))在多变量分析中也具有一定的显著性是水平，其中p值分别为0.15和0.14(表15)。图19，A中示出了在具有和没有另外临床变量下由任一种miRNA限定的EFS的高风险和低风险组的KM图，并且图19，B中示出了其EFS750。基于单一miRNA(hsa-miR-331-5p或hsa-miR-30e-3p)，高风险组的EFS750为约40％，低风险组的EFS750为约60％，而在增加2个临床变量下，数值为33％和66％(图19，B)。13种miRNA中的任意一种或多种(表15)均可用作慢性HF患者的代偿失调性HF的复发入院风险的预后性标志物/组。
与总体生存(n＝43)相比，较少的miRNA被鉴定为对无事件生存具有预测性(n＝13)并且其中只有3个重叠(图16，B)。结果表明死亡和复发性代偿失调性心力衰竭的不同机制。值得注意的一个重要问题是本研究中无事件生存的定义涉及一个较不明确限定的临床变量-即住院，其可根据患者或临床医生因个例而偏倚。尽管如此，53种miRNA仍可以是慢性心力衰竭患者的有价值的预后性标志物。
然后，将53种预后性标志物与用于HF检测的101种标志物(图17，A)或用于心力衰竭亚型分类的40种标志物(图17B)进行比较。观察到一些重叠，但是一大部分的预后性标志物在另外两个列表中仍然没有发现，表明应使用或组合独立的miRNA组以形成用于预后的多变量指标测定。
V.用于HF检测的多变量生物标志物组
如上所述，与单一miRNA的使用相比，由多种miRNA的组合组成的组可能用于提供更佳的诊断力。
组装这样的多变量组的一个重要标准是包括来自每种心力衰竭亚型的特定列表中的至少一种miRNA，以确保覆盖所有心力衰竭亚组。然而，限定两种心力衰竭亚型的miRNA重叠(图7)。同时，发现大量心力衰竭相关或不相关miRNA是正相关的(图12)，这使得选择最佳的miRNA组合用于心力衰竭诊断具有挑战性。
鉴于任务的复杂性，本研究的发明人决定使用序列正向浮动搜索算法[53]来鉴定具有最高AUC的miRNA组。还使用现有技术线性支持向量机(用于构建变量组的得到充分利用和认可的建模工具)来帮助选择miRNA组合[54]。该模型根据考虑每个成员的表达水平及其加权系数的线性式生成评分。这些线性模型可以容易地应用于临床实践。
这样的过程成功的关键要求是高质量数据的可获得性。大量明确确定的临床样品中所有检出miRNA的定量数据不仅提高结果的准确性和精确度，而且还确保所鉴定生物标志物组用于使用qPCR进行进一步临床应用的一致性。
为确保结果的真实性，进行多次(>80次)保留验证(hold-out validation)(两折交叉验证(two fold cross validation))以在独立的验证样品组(每折的剩余一半样品)中基于发现组(每折的一半样品)测试所鉴定生物标志物组的性能。在大量临床样品(546份)的情况下，建模中数据过度拟合的问题被最小化，因为仅需从中选择137个候选特征，而在每折使用273个样品作为发现组并且样品与特征的比例大于2。在交叉验证过程期间，样品在亚型、性别和种族方面匹配。并且，进行过程以分别优化具有3、4、5、6、7、8、9或10种miRNA的生物标志物组。
表示结果(发现阶段和验证阶段二者中生物标志物组的AUC)的箱线图示于图20，A中。AUC值在不同发现组(盒大小<0.01)中相当接近，并且随着组中miRNA的数量递增，其接近统一(AUC＝1.0)。具有4种或更多种miRNA时，指示值扩散的验证阶段中盒的大小相当小(≤0.01AUC值)。如预测的，AUC值随每次搜索的验证组而减小(0.02至0.05AUC)。
结果的更定量表示示于图20，B中。尽管在生物标志物组中miRNA的数量增加时在发现阶段中AUC总是逐渐增加，但是当miRNA的数量大于8时，在验证阶段中AUC值为进一步显著改善。虽然6种miRNA与8种miRNA的生物标志物组之间的差异具有统计学显著性，但是AUC值的改善小于0.01。因此，AUC值约0.93的具有6种或更多种miRNA的生物标志物组应可用于检测心力衰竭。
为了检测多变量生物标志物组的组成，本研究计算了在含有6至10种miRNA的所有组中miRNA的出现，其中排除具有前10％和后10％AUC的组。这么做是为了避免由于拟合来自交叉验证分析中由随机化过程生成的亚群的不准确数据而计数错误发现生物标志物。排除小于2％的组中选自的这些miRNA，在发现过程中共选择了51种miRNA(表16)，其中这些中42种的miRNA的表达也发现在HF显著改变(表5至7)。包括的另外9种虽然在心力衰竭中未改变但是发现显著改善AUC值，因为39％的组包括来自该列表的这些miRNA中的至少一种和在35％组中共出现的最频繁选择miRNA(hsa-miR-10b-5p)。如果没有对所有miRNA靶标进行直接的定量测量，则这些miRNA将不会在高通量筛选研究(微阵列、测序)中选择，并且将被排除用于进一步的qPCR验证。
当比较用于多变量组的选择miRNA和作为诊断性标志物的单一miRNA的身份时，其不一定是相同的。例如，最上调的(hsa-let-7d-3p)miRNA不在列表中，而上最调的(hsa-miR-454-3p)仅在24.2％的组中使用。因此，仅仅组合被鉴定形成最佳生物标志物组的最佳单miRNA是不可能的，而提供互补信息的miRNA组提供最佳结果。
所有这些miRNA均不是随机选择的，因为其中7种存在于超过30％的组中，但是也难以发现对良好生物标志物关键的miRNA，因为两种最频繁选择的miRNA hsa-miR-551b-3p和hsa-miR-24-3p分别仅见于59.7％和57.3％的组中。如所讨论的，许多这些miRNA是相关联的(图11)，其可以在生物标志物中相互替代或替换。总之，应使用具有来自频繁选择的列表(表16)的至少6种miRNA的生物标志物组来检测心力衰竭。
为了比较miRNA生物标志物与NT-proBNP，选择一个六种miRNA生物标志物的组的来计算所有对象的组合miRNA评分，将其针对来自相同对象的NT-proBNP水平作图(图21，A)。总体上，本研究的发明人观察到正相关，其中miRNA评分与ln_NT-proBNP之间的Pearson相关系数为0.61(p值＝8.2E-56)。应用建议的NT-proBNP截止值(125pg/mL，虚线)，35个健康对象被错误分类为心力衰竭患者(假阳性，FP，NT-proBNP>125)，23位心力衰竭患者的NT-proBNP水平低于截止值(假阴性，FN)。可以预测，大多数假阴性(FN)是HFPEF对象(n＝20)。选择与NT-proBNP有关的假阳性(FP)和假阴性(FN)对象，并将结果与miRNA评分作图(图21，B)。基于单独的图，大多数假阳性(FP)和假阴性(FN)对象可以通过以0作为截止值的miRNA评分被正确地重新分类(虚线)。结果验证了miRNA生物标志物携带与NT-proBNP不同的信息的假设。下一步是探索包含miRNA和NT-proBNP二者的多变量生物标志物组。
进行相同的生物标志物鉴定过程(多次两折交叉验证)，其中将NT-proBNP预先固定为预测变量之一并将ln_NT-proBNP水平与miRNA表达水平(log2标度)用于使用支持向量机建立分类器。由于当使用超过8种miRNA来预测心力衰竭时，AUC不显著增加(图20)，因此进行该过程以优化具有2、3、4、5、6、7或8种miRNA的生物标志物组(与NT-proBNP一起)。
建立在发现阶段的分类器随着miRNA的数量增加接近完美的分离(AUC＝1.00)。性能在验证阶段稍有下降(图22，A)。尽管如此，在验证阶段中含有NT-proBNP的组的AUC(平均AUC>0.96)总是高于那些仅包括miRNA的生物标志物组(平均AUC<0.94)。定量结果(图22，B)显示，当miRNA的数量大于4时，在验证阶段中AUC值没有进一步显著改善，并且在4种与5种miRNA生物标志物的组之间仅有微小的增加(0.001AUC)。因此，当与NT-proBNP组合时，可以使用提供约0.98的AUC值具有四种或更多种miRNA的生物标志物组用于心力衰竭检测。通过组合miRNA和NT-proBNP，分类效率相对于NT-proBNP显著提高(AUC＝0.962，图22，B)。
排除具有前10％和后10％AUC的组，检测含有3至8种miRNA的多变量生物标志物组的组成(表17)。在发现过程中共选择49种miRNA，其中14种的流行度高于10％(表17)。其中四十二(42)种也携带NT-proBNP的附加信息(在逻辑回归中FDR后p值低于0.01)。同样，46％的组除NT-proBNP之外还包括发现不显著的13种miRNA中的至少一种。
虽然超过一半的显著miRNA(表17，显著列表)在搜索仅有miRNA的生物标志物组(表16，显著列表)时也被频繁选择(图23，A)，但是流行度的排名是不同的。当搜索基于miRNA的生物标志物组时，甚至没有选择与NT-proBNP联合的一些高度选择miRNA(hsa-miR-17-5p(11.6％)和hsa-miR-25-3p(11.0％))。此外，在不显著列表(表16和表17，不显著列表)之间只有两种miRNA重叠(图23，B)。总之，证据表明，与用于构建仅有miRNA的生物标志物组的列表相比，不同的miRNA列表应与NT-proBNP一起使用。
VI.用于HF亚型分类的多变量生物标志物组
进行下一步尝试以鉴定用于辨别HFREF与HFPEF的多变量生物标志物组。再次，使用关于338位心力衰竭患者的137种miRNA的所有定量数据。由于样品尺寸的限制，进行多次(>50)四折交叉验证，其中将所有对象随机分为四组，并使用三组(发现组)构建分类器以进而预测最后一组(验证组)。通过这种方式，在发现阶段使用253至254名对象，从而与选用于最小化过度拟合的候选特征数量(137)类似，确保每个亚组(HFREF或HFPEF)的相同尺寸。再次进行该过程以单独优化3、4、5、6、7、8、9或10种miRNA的生物标志物组以及2、3、4、5、6、7或8种miRNA加NT-proBNP的生物标志物组。
定量结果显示，当仅有miRNA的生物标志物组含有超过5种miRNA时，AUC值没有进一步改善(图24，A)。miRNA生物标志物组可实现优于NT-proBNP(AUC＝0.706)的约0.76AUC。计数所有6至10种miRNA的组(不包括前10％和后10％AUC)，频繁选择46种miRNA(在2％的组中)，其中22种被发现在比较HFREF与HFPEF的t检验中是显著的，而24种则不显著(表18)。由于有两种miRNA在超过80％的组中存在(hsa-miR-30a-5p(94.6％)和hsa-miR-181a-2-3p(83.7％)，表18)，用于心力衰竭亚型分类的组的多样性低于用于心力衰竭检测的那些组。
与仅有miRNA的组相比，由miRNA和NT-proBNP二者组成的生物标志物组需要更少的miRNA，因为超过包含4种miRNA，AUC值未改善(图24，B)。与仅有miRNA的组相比，甚至可以实现更明确的分类(AUC约0.82)。再者，miRNA和NT-proBNP可以携带用于心力衰竭亚型分类的互补信息。检测5至8种miRNA加NT-proBNP的组的组成，31种miRNA被频繁选择(在>2％的组中)，其中14种在与ln_NT-proBNP的逻辑回归发现是显著的，而17种则不是(表19)。两种不同的miRNA在超过80％的组中被发现：hsa-miR-199b-5p(91.5％)和hsa-miR-191-5p(74.9％)。尽管对于仅有miRNA和miRNA加NT-proBNP的组最频繁选择的不显著miRNA是相同的(hsa-miR-199b-5p)，但是在剩余的显著与不显著列表之间在成份(identity)和排名方面可发现显著差异。
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<221> misc_feature
<223> hsa-miR-33a-5p
<400> 64
gugcauugua guugcauugc a 21
<210> 65
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人
<220>
<221> misc_feature
<223> hsa-miR-423-5p
<400> 65
ugaggggcag agagcgagac uuu 23
<210> 66
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人
<220>
<221> misc_feature
<223> hsa-miR-124-5p
<400> 66
cguguucaca gcggaccuug au 22
<210> 67
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人
<220>
<221> misc_feature
<223> hsa-miR-532-5p
<400> 67
caugccuuga guguaggacc gu 22
<210> 68
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人
<220>
<221> misc_feature
<223> hsa-miR-200b-3p
<400> 68
uaauacugcc ugguaaugau ga 22
<210> 69
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人
<220>
<221> misc_feature
<223> hsa-miR-222-3p
<400> 69
agcuacaucu ggcuacuggg u 21
<210> 70
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人
<220>
<221> misc_feature
<223> hsa-miR-199a-3p
<400> 70
acaguagucu gcacauuggu ua 22
<210> 71
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人
<220>
<221> misc_feature
<223> hsa-miR-451a
<400> 71
aaaccguuac cauuacugag uu 22
<210> 72
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人
<220>
<221> misc_feature
<223> hsa-miR-1226-3p
<400> 72
ucaccagccc uguguucccu ag 22
<210> 73
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人
<220>
<221> misc_feature
<223> hsa-miR-127-3p
<400> 73
ucggauccgu cugagcuugg cu 22
<210> 74
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人
<220>
<221> misc_feature
<223> hsa-miR-374b-5p
<400> 74
auauaauaca accugcuaag ug 22
<210> 75
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<212> RNA
<213> 智人
<220>
<221> misc_feature
<223> hsa-miR-4732-3p
<400> 75
gcccugaccu guccuguucu g 21
<210> 76
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人
<220>
<221> misc_feature
<223> hsa-miR-487b
<400> 76
aaucguacag ggucauccac uu 22
<210> 77
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人
<220>
<221> misc_feature
<223> hsa-miR-551b-3p
<400> 77
gcgacccaua cuugguuuca g 21
<210> 78
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人
<220>
<221> misc_feature
<223> hsa-miR-23c
<400> 78
aucacauugc cagugauuac cc 22
<210> 79
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人
<220>
<221> misc_feature
<223> hsa-miR-183-5p
<400> 79
uauggcacug guagaauuca cu 22
<210> 80
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人
<220>
<221> misc_feature
<223> hsa-miR-29c-3p
<400> 80
uagcaccauu ugaaaucggu ua 22
<210> 81
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人
<220>
<221> misc_feature
<223> hsa-miR-425-3p
<400> 81
aucgggaaug ucguguccgc cc 22
<210> 82
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人
<220>
<221> misc_feature
<223> hsa-miR-484
<400> 82
ucaggcucag uccccucccg au 22
<210> 83
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人
<220>
<221> misc_feature
<223> hsa-miR-485-3p
<400> 83
gucauacacg gcucuccucu cu 22
<210> 84
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人
<220>
<221> misc_feature
<223> hsa-miR-93-5p
<400> 84
caaagugcug uucgugcagg uag 23
<210> 85
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人
<220>
<221> misc_feature
<223> hsa-miR-92a-3p
<400> 85
uauugcacuu gucccggccu gu 22
<210> 86
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人
<220>
<221> misc_feature
<223> hsa-miR-140-5p
<400> 86
cagugguuuu acccuauggu ag 22
<210> 87
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人
<220>
<221> misc_feature
<223> hsa-miR-15a-5p
<400> 87
uagcagcaca uaaugguuug ug 22
<210> 88
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人
<220>
<221> misc_feature
<223> hsa-miR-10b-5p
<400> 88
uacccuguag aaccgaauuu gug 23
<210> 89
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人
<220>
<221> misc_feature
<223> hsa-miR-130b-3p
<400> 89
cagugcaaug augaaagggc au 22
<210> 90
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人
<220>
<221> misc_feature
<223> hsa-miR-24-3p
<400> 90
uggcucaguu cagcaggaac ag 22
<210> 91
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人
<220>
<221> misc_feature
<223> hsa-miR-133b
<400> 91
uuuggucccc uucaaccagc ua 22
<210> 92
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人
<220>
<221> misc_feature
<223> hsa-miR-186-5p
<400> 92
caaagaauuc uccuuuuggg cu 22
<210> 93
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人
<220>
<221> misc_feature
<223> hsa-miR-193a-5p
<400> 93
ugggucuuug cgggcgagau ga 22
<210> 94
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人
<220>
<221> misc_feature
<223> hsa-miR-23a-5p
<400> 94
gggguuccug gggaugggau uu 22
<210> 95
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人
<220>
<221> misc_feature
<223> hsa-miR-454-3p
<400> 95
uagugcaaua uugcuuauag ggu 23
<210> 96
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人
<220>
<221> misc_feature
<223> hsa-miR-501-5p
<400> 96
aauccuuugu cccuggguga ga 22
<210> 97
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人
<220>
<221> misc_feature
<223> hsa-miR-18b-5p
<400> 97
uaaggugcau cuagugcagu uag 23
<210> 98
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人
<220>
<221> misc_feature
<223> hsa-miR-223-5p
<400> 98
cguguauuug acaagcugag uu 22
<210> 99
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人
<220>
<221> misc_feature
<223> hsa-miR-30c-5p
<400> 99
uguaaacauc cuacacucuc agc 23
<210> 100
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人
<220>
<221> misc_feature
<223> hsa-miR-26a-5p
<400> 100
uucaaguaau ccaggauagg cu 22
<210> 101
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人
<220>
<221> misc_feature
<223> hsa-miR-146a-5p
<400> 101
ugagaacuga auuccauggg uu 22
<210> 102
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人
<220>
<221> misc_feature
<223> hsa-miR-452-5p
<400> 102
aacuguuugc agaggaaacu ga 22
<210> 103
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人
<220>
<221> misc_feature
<223> hsa-miR-148a-3p
<400> 103
ucagugcacu acagaacuuu gu 22
<210> 104
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人
<220>
<221> misc_feature
<223> hsa-miR-194-5p
<400> 104
uguaacagca acuccaugug ga 22
<210> 105
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人
<220>
<221> misc_feature
<223> hsa-miR-29c-5p
<400> 105
ugaccgauuu cuccuggugu uc 22
<210> 106
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人
<220>
<221> misc_feature
<223> hsa-miR-196b-5p
<400> 106
uagguaguuu ccuguuguug gg 22
<210> 107
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人
<220>
<221> misc_feature
<223> hsa-miR-345-5p
<400> 107
gcugacuccu aguccagggc uc 22
<210> 108
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人
<220>
<221> misc_feature
<223> hsa-miR-503
<400> 108
uagcagcggg aacaguucug cag 23
<210> 109
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人
<220>
<221> misc_feature
<223> hsa-miR-627
<400> 109
gugagucucu aagaaaagag ga 22
<210> 110
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人
<220>
<221> misc_feature
<223> hsa-let-7d-3p
<400> 110
cuauacgacc ugcugccuuu cu 22
<210> 111
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人
<220>
<221> misc_feature
<223> hsa-miR-30a-5p
<400> 111
uguaaacauc cucgacugga ag 22
<210> 112
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人
<220>
<221> misc_feature
<223> hsa-miR-654-3p
<400> 112
uaugucugcu gaccaucacc uu 22
<210> 113
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人
<220>
<221> misc_feature
<223> hsa-miR-598
<400> 113
uacgucaucg uugucaucgu ca 22
<210> 114
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人
<220>
<221> misc_feature
<223> hsa-miR-671-3p
<400> 114
uccgguucuc agggcuccac c 21
<210> 115
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人
<220>
<221> misc_feature
<223> hsa-miR-132-3p
<400> 115
uaacagucua cagccauggu cg 22
<210> 116
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人
<220>
<221> misc_feature
<223> hsa-miR-142-5p
<400> 116
cauaaaguag aaagcacuac u 21
<210> 117
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人
<220>
<221> misc_feature
<223> hsa-let-7b-5p
<400> 117
ugagguagua gguugugugg uu 22
<210> 118
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人
<220>
<221> misc_feature
<223> hsa-miR-17-5p
<400> 118
caaagugcuu acagugcagg uag 23
<210> 119
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人
<220>
<221> misc_feature
<223> hsa-miR-185-5p
<400> 119
uggagagaaa ggcaguuccu ga 22
<210> 120
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人
<220>
<221> misc_feature
<223> hsa-miR-486-5p
<400> 120
uccuguacug agcugccccg ag 22
<210> 121
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人
<220>
<221> misc_feature
<223> hsa-miR-99b-5p
<400> 121
cacccguaga accgaccuug cg 22
<210> 122
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人
<220>
<221> misc_feature
<223> hsa-miR-128
<400> 122
ucacagugaa ccggucucuu u 21
<210> 123
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人
<220>
<221> misc_feature
<223> hsa-miR-16-5p
<400> 123
uagcagcacg uaaauauugg cg 22
<210> 124
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人
<220>
<221> misc_feature
<223> hsa-miR-32-5p
<400> 124
uauugcacau uacuaaguug ca 22
<210> 125
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人
<220>
<221> misc_feature
<223> hsa-miR-382-5p
<400> 125
gaaguuguuc gugguggauu cg 22
<210> 126
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人
<220>
<221> misc_feature
<223> hsa-miR-532-3p
<400> 126
ccucccacac ccaaggcuug ca 22
<210> 127
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人
<220>
<221> misc_feature
<223> hsa-miR-181a-2-3p
<400> 127
accacugacc guugacugua cc 22
<210> 128
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人
<220>
<221> misc_feature
<223> hsa-miR-139-5p
<400> 128
ucuacagugc acgugucucc ag 22
<210> 129
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人
<220>
<221> misc_feature
<223> hsa-miR-21-5p
<400> 129
uagcuuauca gacugauguu ga 22
<210> 130
<211> 17
<212> RNA
<213> 智人
<220>
<221> misc_feature
<223> hsa-miR-1280
<400> 130
ucccaccgcu gccaccc 17
<210> 131
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人
<220>
<221> misc_feature
<223> hsa-miR-331-5p
<400> 131
cuagguaugg ucccagggau cc 22
<210> 132
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人
<220>
<221> misc_feature
<223> hsa-miR-150-5p
<400> 132
ucucccaacc cuuguaccag ug 22
<210> 133
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人
<220>
<221> misc_feature
<223> hsa-miR-101-3p
<400> 133
uacaguacug ugauaacuga a 21
<210> 134
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人
<220>
<221> misc_feature
<223> hsa-miR-200c-3p
<400> 134
uaauacugcc ggguaaugau gga 23
<210> 135
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人
<220>
<221> misc_feature
<223> hsa-miR-205-5p
<400> 135
uccuucauuc caccggaguc ug 22
<210> 136
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人
<220>
<221> misc_feature
<223> hsa-miR-505-3p
<400> 136
cgucaacacu ugcugguuuc cu 22
<210> 137
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人
<220>
<221> misc_feature
<223> hsa-miR-136-5p
<400> 137
acuccauuug uuuugaugau gga 23
Claims (8)
1.用于测量从对象获得的体液样品中至少一种miRNA的水平的试剂在制备用于确定所述对象是否患有心力衰竭或处于发生心力衰竭的风险之中的方法的诊断剂中的用途，所述方法包括以下步骤：
a)测量从所述对象获得的体液样品中至少hsa-miR-454-3p的水平；以及
b)确定其与对照相比是否不同，
其中所述hsa-miR-454-3p的水平降低指示所述对象患有心力衰竭或处于发生心力衰竭的风险之中。
2.根据权利要求1所述的用途，其中所述方法进一步包括测量从所述对象获得的体液样品中至少hsa-miR-24-3p和hsa-miR-551b-3p的水平，其中hsa-miR-24-3p的水平提高指示所述对象患有心力衰竭或处于发生心力衰竭的风险之中，并且其中hsa-miR-551b-3p的水平降低指示所述对象患有心力衰竭或处于发生心力衰竭的风险之中。
3.用于测量从对象获得的体液样品中至少一种miRNA的水平的试剂在制备用于确定所述对象是否患有心力衰竭或处于发生心力衰竭的风险之中的方法的诊断剂中的用途，所述方法包括以下步骤：
(a)测量从所述对象获得的体液样品中至少hsa-miR-454-3p、hsa-miR-24-3p和hsa-miR-551b-3p的水平；以及
(b)使用基于步骤(a)中所测量的所述miRNA的水平的评分来预测所述对象发生或患有心力衰竭的可能性。
4.根据权利要求2或3所述的用途，其中hsa-miR-454-3p的水平降低指示所述对象患有心力衰竭或处于发生心力衰竭的风险之中，其中hsa-miR-24-3p的水平提高指示所述对象患有心力衰竭或处于发生心力衰竭的风险之中，并且其中hsa-miR-551b-3p的水平降低指示所述对象患有心力衰竭或处于发生心力衰竭的风险之中。
5.根据前述权利要求任一项所述的用途，其中步骤(a)还包括测量从所述对象获得的体液样品中的表16或表23中列出的至少一种另外的miRNA的水平。
6.根据权利要求1、2或4所述的用途，其中所述对照是从非心力衰竭对象(正常)获得的样品。
7.根据前述权利要求中任一项所述的用途，其中所述对象是亚洲种族的对象。
8.用于根据前述权利要求中任一项中所限定的方法的试剂盒，所述试剂盒包含用于确定或测量权利要求1-7中任一项的所述miRNA的表达水平的试剂。
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