CN109750102A

CN109750102A - miR Let-7e和/或miR-20a在制备诊断慢加急肝衰竭的产品中的应用

Info

Publication number: CN109750102A
Application number: CN201910168189.8A
Authority: CN
Inventors: 黄俊琪; 邓小红; 唐秀鑫; 何晓顺; 辛晓萍; 刘平娟
Original assignee: First Affiliated Hospital of Sun Yat Sen University
Current assignee: First Affiliated Hospital of Sun Yat Sen University
Priority date: 2019-03-06
Filing date: 2019-03-06
Publication date: 2019-05-14

Abstract

本发明公开一种miR Let‑7e和/或miR‑20a在制备诊断慢加急肝衰竭的产品中的应用，属于生物医学技术领域。本发明首次发现了miRNA Let‑7e和/或miRNA‑20a表达水平与慢加急肝衰竭的发生发展相关，通过检测受试者miRNA Let‑7e和/或miRNA‑20a的表达水平，可以判断受试者是否患有慢加急肝衰竭或者判断受试者是否存在患有慢加急肝衰竭的风险，从而指导临床医师给受试者提供预防方案或者治疗方案。本发明简单、易于操作；能提高ACLF的检出率。

Description

miR Let-7e和/或miR-20a在制备诊断慢加急肝衰竭的产品中的应用

技术领域

本发明属于生物医学技术领域，具体涉及miRNA Let-7e和/或miRNA-20a 的新用途，尤其涉及miRNA Let-7e和/或miRNA-20a在制备诊断慢加急肝衰竭的产品中的应用。

背景技术

慢加急性肝衰竭(ACLF)是我国慢性肝病患者最危急的终末期肝病之一。在潜在的慢性病(如慢性乙型肝炎或乙型肝炎肝硬化等)基础上，通过诱因(炎症触发等细菌感染和严重酒精性肝炎占57％；尚未确认的机制占43％)的作用下迅速恶化，患者出现肝功能衰竭或多器官衰竭导致死亡率极高。即使李兰娟院士提出中国ACLF的诊断标准，但ACLF起病急，病情复杂，病死率高，且目前缺乏特异性治疗手段，因此探索ACLF临床标志物对患者进行及时干预就显得尤为重要。

MicroRNA(miRNA，miR)是一类大小为18-25nt的非编码单链RNA分子，它可通过结合到靶蛋白mRNA的3'-UTR抑制mRNA的翻译从而调节蛋白的表达。miRNA参与调控人类三分之一的基因的表达并影响人体的多种生物学过程如免疫细胞分化、免疫调节以及中枢神经系统功能调节等，已成为人类诸多疾病诊断和治疗的新方法。本课题组研究证明2型登革病毒感染后，PBMCs后会诱导多种miRNA的表达差异，其中高表达的有miR-4290、let-7e、miR-1290、 miR-33a等，低表达的有miR-106b、miR-20a、miR-30b等，登革病毒感染后let-7e 的表达显著升高。然而ACLF与2型登革热同样属于全身性炎症疾病，那么let-7e 及miR-20a是否在ACLF中也有相似的表达呢？

发明内容

为了突破临床慢加急性肝衰竭诊断标志物的局限，实现对ACLF的有效预警，挺高治愈率，本发明的目的在于提供一种miRNA Let-7e和/或miRNA-20a 在制备诊断慢加急肝衰竭的产品中的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

通过对miRNA Let-7e(Gene ID:406887)及miR-20a(Gene ID:406982)的深入研究，在原有的研究基础上通过实验筛选，开发出Let-7e及miR-20a的新用途。

本发明提供一种miRNA Let-7e和/或miRNA-20a在制备诊断慢加急肝衰竭的产品中的应用。

所述miRNA Let-7e的序列为：5′-UGAGGUAGGAGGUUGUAUAGUU-3′；

所述miRNA-20a的序列为：5′-UAAAGUGCUUAUAGUGCAGGUAG-3′。

所述的产品能够通过检测miRNA Let-7e和/或miRNA-20a的表达水平来诊断慢加急肝衰竭。

进一步的，所述的产品包括芯片或试剂盒。其中，所述芯片包括固相载体，以及固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括特异性地对应于上述所述的miRNA Let-7e和/或miRNA-20a的部分或全部序列；所述试剂盒包括用于检测上述所述的miRNA Let-7e和/或miRNA-20a的表达水平的试剂。

进一步的，所述的检测miRNA Let-7e和/或miRNA-20a的表达水平的试剂包括针对miRNA Let-7e和/或miRNA-20a的引物和/或探针。

进一步的，上面所述的寡核苷酸探针还可包括针对现有技术中已经报道的可用于诊断慢加急肝衰竭的miRNA的寡核苷酸探针。

进一步的，所述固相载体包括所述固相载体可采用基因芯片领域的各种常用材料，例如但不限于尼龙膜，经活性基团(如醛基、氨基等)修饰的玻片或硅片、未修饰的玻片、塑料片等。

所述的芯片的制备可采用本领域已知的生物芯片的常规制造方法，例如，如果固相载体采用的是修饰玻片或硅片，探针的5′端含有氨基修饰的聚dT串，可将寡核苷酸探针配制成溶液，然后采用点样仪将其点在修饰玻片或硅片上，排列成预定的序列或阵列，然后通过放置过夜来固定，就可得到本发明的miRNA 芯片。

本发明的验证结果如下：

本发明使用qRT-PCR技术在12例正常对照及6例ACLF患者的PBMC中比较了let-7e和miR-20a这两个miRNA的表达水平，进一步利用这两个miRNA 在PBMC中的表达量生成ROC(Receiver Operating Characteristic)曲线，结果发现由Let-7e和miR-20a在PBMC中的表达量生成ROC曲线的AUC(Area Under Curve)分别为0.9697(95％可信区间(CI)为0.8958-1.044)和1(95％CI 为1-1)，说明let-7e与miR-20a在诊断ACLF时，具有较高的准确度，可作为潜在的诊断ACLF的标记物。

本发明的机理是：本发明主要通过qRT-PCR技术检测患者PBMC中let-7e 和miR-20a这两个miRNA的表达水平，从而预测患者ACLF的检出率。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)本发明首次发现了miRNA Let-7e和/或miRNA-20a表达水平与慢加急肝衰竭的发生发展相关，通过检测受试者miRNA Let-7e和/或miRNA-20a的表达水平，可以判断受试者是否患有慢加急肝衰竭或者判断受试者是否存在患有慢加急肝衰竭的风险，从而指导临床医师给受试者提供预防方案或者治疗方案。

(2)本发明简单、易于操作；能提高ACLF的检出率。

附图说明

图1是Let-7e在ACLF患者PBMC中的表达情况结果图。

图2是miR-20a在ACLF患者PBMC中的表达情况结果图。

图3是let-7e诊断ACLF的ROC曲线。

图4是miR-20a诊断ACLF的ROC曲线。

图5是let-7e及miR-20a诊断ACLF的ROC曲线。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1 Let-7e及mirna-20a作为慢加急肝衰竭诊断标志物的实验

1、收集符合条件的患者，取其外周血

取12例正常人对照及6例慢加急肝衰竭(ACLF)患者外周血2mL于EDTA (乙二胺四乙酸)抗凝管中，轻轻颠倒混匀4～6次，室温放置，并在2小时内完成血浆、PBMC(外周血单个核细胞)和血细胞分离工作。所有参加者均签署知情同意书，并通过院方伦理委员会讨论。

2、提取外周血单个核细胞

1)离心机预冷，使机内温度保持4℃、准备离心管并记录编号；

2)水平离心机，450g，4℃离心20min；

3)将上清分装到2mL管中，在吸取血浆的过程中不要吸到中间层的白细胞，下层血细胞备用(用于分离PBMC)；

4)给上述血样分离的下层血细胞，加入3倍体积的PBS(或生理盐水)，(如 2mL的血细胞加入6mL的PBS)，上下颠倒混匀，确保不明显细胞团块；

5)取3mL的ficoll加入到15mL离心管中，并小心吸取上述离心管中稀释的血细胞4mL沿管壁叠加于分层液面上，体积大于4mL的分多管进行。

6)室温下400g离心30min。

7)去掉上清液，小心吸取淋巴细胞层至另一个15mL离心管中，加入5倍以上体积的PBS，室温下450g离心10min；

8)倒掉上清液，沉淀即所需单个核细胞，沉淀加入1mL Trizol于-80℃保存。

3、RNA提取

a)Trizol裂解：将已加入Trizol溶液的样本室温解冻；

b)加入0.2体积(0.2mL/1mL Trizol)的氯仿，votex震荡15s，室温静置5min；

c)4℃，12000rpm离心15min，出现分层，小心吸取上层水相(水相体积约占Trizol体积的60％)到新的1.5mL离心管中；注意：小心不要吸到中间层白色物质。

d)加入与上清等体积的异丙醇，上下颠倒混匀，室温沉淀1h以上；

e)4℃，12000rpm离心30min，管底可见白色沉淀，去掉上清；

f)加75％的乙醇1mL轻弹管壁使沉淀飘浮，4℃12000rpm离心5min；

g)去掉上清后短暂离心，使用10μL枪吸干，将离心管盖打开干燥，待沉淀干燥至半透明状即加入20μL RNase-free H₂O溶解。

4、miRNA反转录

a)按下表建立反应体系：

试剂	加入量
		5×RTase Buffer	4μL
RTase Mix	4μL
		miDETECT A TrackUni-RT Primer(10M)	2μL
Poly(A)Tailing产物	10μL
		total	20μL

RT primer类型：(A)Oligo-dT(B)Random primer(C)Gene/miRNA specificprimer。

b)以上体系混匀，离心收集液体至管底，42℃60min，72℃10min；产物即为cDNA模板。

5、定量PCR

a)按下表建立反应体系：

试剂	加入量
		2×SYBR Green Surpermix	5μL
Forward primer(10μM)	0.4μL
		Reverse primer(10μM)	0.4μL
cDNA	1μL
		RNase-free H<sub>2</sub>O	3.2μL
Total	10μL

b)按如下程序进行PCR扩增

95℃10min，

*95℃10s，

60℃20s，

70℃10s，

读板，

返回*共进行40个循环；

制作熔解曲线：70℃至95℃之间，每0.5℃读板一次并停5s。

实验采用比较Ct值法检测样品基因的含量，具体计算公式如下：

相对表达量＝2^{-{〈﹙实验组目的基因Ct值﹚-﹙实验组内参基因Ct值﹚〉-〈﹙对照组目的基因Ct值﹚-﹙对照组内参基因Ct值﹚〉}}

其中对基因检测用U6做内参，本发明所用到的qRT-PCR引物为锐博生物科技有限公司，货号miRAN0002-1-100，名称miDETECT A Track U6Forward Primer、miRA0000075名称miDETECT A TrackTM hsa-miR-20a-5p Forward Primer和miRA0000066名称miDETECT ATrackTM hsa-let-7e-5p Forward Primer。

结果分析：

1、qRT-PCR技术检测let-7e在12例正常人对照及6例ACLF患者的PBMC 中的表达情况，结果如图1所示，let-7e在12例正常人对照及6例ACLF患者的PBMC中的表达情况差异显著，与正常人相比，在ACLF患者的PBMC中let-7e 的水平显著上调。

2、qRT-PCR技术检测miR-20a在12例正常人对照及6例ACLF患者的 PBMC中的表达情况，结果如图2所示，miR-20a在12例正常人对照及6例ACLF 患者的PBMC中的表达情况差异显著，与正常人相比，在ACLF患者的PBMC 中miR-20a的水平显著降低。

3、利用let-7e在PBMC中的表达量生成ROC曲线，结果如图3所示，发现由Let-7e的AUC为0.9697(95％可信区间(CI)为0.8958-1.044)，表明let-7e 在诊断ACLF时，具有较高的准确度，可作为潜在的诊断ACLF的标记物。

4、利用miR-20a在PBMC中的表达量生成ROC曲线，结果如图4所示，发现由miR-20a的AUC为1(95％CI为1-1)，表明miR-20a在诊断ACLF时，具有较高的准确度，可作为潜在的诊断ACLF的标记物。

总之，qRT-PCR技术在12例正常人对照及6例ACLF患者的PBMC中比较了let-7e和miR-20a这两个miRNA的表达水平，进一步利用这两个miRNA 在PBMC中的表达量生成ROC曲线，结果如图5所示，发现由Let-7e和miR-20a AUC分别为0.9697(95％可信区间(CI)为0.8958-1.044)和1(95％CI为1-1)，结果表明：let-7e与miR-20a诊断ACLF时，具有较高的准确度，可作为潜在的诊断ACLF的标记物。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 中山大学附属第一医院

<120> miR Let-7e和/或miR-20a在制备诊断慢加急肝衰竭的产品中的应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> miRNA Let-7e的序列

<400> 1

ugagguagga gguuguauag uu 22

<210> 2

<211> 23

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> miRNA-20a的序列

<400> 2

uaaagugcuu auagugcagg uag 23

Claims

1.miRNA Let-7e和/或miRNA-20a在制备诊断慢加急肝衰竭的产品中的应用，其特征在于：

所述miRNA Let-7e的序列为：5′-UGAGGUAGGAGGUUGUAUAGUU-3′；

所述miRNA-20a的序列为：5′-UAAAGUGCUUAUAGUGCAGGUAG-3′。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：

所述的产品包括芯片或试剂盒。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：

所述芯片包括固相载体，以及固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括特异性地对应于权利要求1所述的miRNA Let-7e和/或miRNA-20a的部分或全部序列。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：

所述试剂盒包括用于检测权利要求1所述的miRNA Let-7e和/或miRNA-20a的表达水平的试剂。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：

所述的检测miRNA Let-7e和/或miRNA-20a的表达水平的试剂包括针对miRNA Let-7e和/或miRNA-20a的引物和/或探针。