CN112280846B - 一种苯致血液系统异常miRNA标志物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物技术学技术领域，尤其是一种苯致血液系统异常miRNA标志物及其应用，为了对预防血液系统异常检测标志物的补充，现提出如下方案，一种苯致血液系统异常miRNA标志物，所述miRNA标志物包括let‑7e‑5p，所述let‑7e‑5p的序列为：UGAGGUAGGAGGUUGUAUAGUU，一种苯致血液系统异常miRNA标志物的用途，包括用于制备检测血液系统异常的检测试剂。本发明首次发现外周血白细胞中let‑7e‑5p可作为预防苯暴露血液系统异常的生物标志物，并结合检测试剂应用于预防苯致血液系统异常的检测，有操作简便，伤害性小的特点，可以提高苯暴露致血液系统异常人群筛选的特异性和灵敏性。

Description

一种苯致血液系统异常miRNA标志物及其应用
技术领域
本发明涉及分子生物技术领域，尤其是一种苯致血液系统异常miRNA标志物及其应用。
背景技术
苯是一种常见的有机溶剂和化工原料，广泛应用于工业生产和日常生活中，苯会对于人类造血系统的损害,职业性苯暴露，无论是高剂量还是低剂量，都与全血细胞减少症、再生障碍性贫血和白血病的风险增加有关，苯所造成的血液系统的损伤严重且预后不理想，在苯暴露至苯中毒之间有个重要的关键节点：苯暴露致血液系统异常状态，若能提供一种与苯暴露人群的血液系统异常相关的特异性生物标志物，则对预防血液系统异常具有重要意义。本发明提出了一种苯致血液系统异常miRNA标志物及其应用。
发明内容
本发明的目的在于对预防血液系统异常检测标志物的补充，提供了苯暴露致血液系统异常的miRNA标志物及其检测方法，为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
一种苯致血液系统异常miRNA标志物，所述miRNA标志物包括let-7e-5p，所述let-7e-5p的序列为：UGAGGUAGGAGGUUGUAUAGUU。
一种苯致血液系统异常miRNA标志物的用途，包括用于制备预防检测血液系统异常的检测试剂。
进一步地，用所述检测试剂测定外周血白细胞中let-7e-5p的表达量，并与对照样本相比，被测外周血白细胞中let-7e-5p的表达量降低，显示血液系统损伤。
进一步地，所述检测试剂包括扩增let-7e-5p的第一正向引物和扩增内参U6的第二正向引物。
进一步地，所述第一正向引物的序列包括：GTTTGTGTTGGGGGTTTATTATT，所述第二正向引物的序列包括：CTCGCTTCGGCAGCAC。
一种苯致血液系统异常的检测试剂盒，包括第一正向引物和第二正向引物。
本发明的有益效果：
1、本发明首次提出外周血白细胞中let-7e-5p可作为预防苯暴露血液系统异常的生物标志物，并结合检测试剂应用于苯致血液系统异常的检测，有操作简便，伤害性小的特点，可以提高苯暴露致血液系统异常人群筛选的特异性和灵敏性；
2、let-7e-5p来自于外周血白细胞中，可以结合内暴露剂量指标(S-PMA)和氧化损伤指标(MDA)对苯暴露人群血液系统异常进行鉴别诊断，预防苯致造血损伤的进一步发生。
3、本发明对血液系统异常检测标志物进行了补充，提供了苯暴露致血液系统异常的miRNA标志物及其检测方法。
附图说明
图1为本发明中的let-7e-5p在苯暴露病例组和苯暴露健康组中的表达水平；
图2为本发明中的let-7e-5p表达量在病例进展中的变化；
图3为本发明在病例组和健康组中基于let-7e-5p表达量绘制ROC曲线；
图4为随着S-PMA的增加，苯暴露人群外周血中let-7e-5p表达量的变化；
图5为随着暴露年限的增加，苯暴露人群外周血中let-7e-5p表达量的变化。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
实施例一
血液样品均收集于江苏省重点职业病监测企业中的涉苯企业的苯暴露人群职业健康体检，取材时间为2018年～2019年，血液样品的使用都告知了样品来源本人并取得了江苏省疾病预防控制中心伦理委员会的批准，研究对象的入选标准：1)接苯工龄大于等于1年，2)每天工作时间不少于8小时，3)既往无肿瘤、肝炎等重大病史，4)近期无感染史。苯作业工人均在疾病预防控制中心进行专业性的血常规检查，收集白细胞(WBC)、中性粒细胞(NEUT)、血小板(PLT)等检查结果，其中，根据《GBZ68-2013职业性苯中毒诊断标准》以白细胞＜4×109/L、中性粒细胞＜2×109/L、血小板＜80×109/L任意一个指标异常即认为血常规检查异常。将血常规异常者作为病例组，血常规正常者作为健康组。我们将病例组和健康组的血液样品作为qRT-PCR检测let-7e-5p表达量的实验对象。
1.外周血采集及预处理
研究对象清晨空腹时静脉血约5ml，一半置于肝素钠静脉真空采血管中，另外一半放入不加抗凝剂的采血管中，另外用15mL离心管收集研究对象尿液10mL，充分摇匀后置于冰盒带回实验室。于-80℃冰箱储存备用。
2.尿液中S-PMA测定
将尿样于室温下解冻，进行3次萃取，合并3次萃取液于50℃氮气流下挥干，经甲醇溶解后，取100μL上清液分析。计算结果采用尿肌酐(Cr)校正，计量单位为μg·g-1(以Cr计)。回收率为85.6％～101％，4次测定结果的相对标准偏差为1.8％～4.2％。
3.血清MDA测定
将不加抗凝剂的静脉血以2500rpm离心10分钟以收集上层血清。将TBA的稀释剂，TBA的存储量和抗氧化剂按比例混合到0.2ml丙二醛(MDA)检测工作液中，添加到每个孔中并混合。离心后，将200μL上清液加入96孔板中。用分光光度计在λ＝532nm处测定MDA上清液样品的吸光度。使用标准MDA溶液曲线的回归方程计算MDA。
4.分离白细胞
置于抗凝管中的静脉血在室温下3700rpm离心10min后，管中细胞由上至下分为四层依次为：血浆层(最上层)、乳白色白细胞层、分离液层、红细胞层。用枪头小心吸走血浆层，向剩余溶液中加入1X红细胞裂解液10mL，充分混匀细胞，静置10分钟，3700rpm离心10min，弃上清后再加入1mL红细胞裂解液，充分混匀细胞，静置10分钟，3700rpm离心10min，弃上清后用PBS重复洗涤2次后离心所得沉淀即为所要的白细胞。在白细胞加入1mL Trizol用于提取RNA。可用于下一步实验。
5.RNA的提取
血液白细胞中RNA采用Trizol Reagent试剂提取，提取方法参照Trizol Reagent说明书流程进行。以Nanodrop OneC超微量紫外分光光度计进行检测，结果显示:吸光度(A)260/280在1.8-20之间，230/160大于2，说明所提取的RNA纯度较高。
poly(A)Tailing
反应条件是37℃，1h。
表1 poly(A)加尾反应体系
Figure BDA0002720542970000051
6.逆转录
反应条件42℃，1h，72℃，10min。
表2逆转录体系
Figure BDA0002720542970000061
7.实时荧光定量PCR
利用实时荧光定量PCR的方法对总RNA中的miRNA进行检测。采用miDETECT ATrackTM miRNA qPCR Primer进行RT-qPCR扩增，选用U6为内参，反应体系包括：miRNAForward Primer 0.5μL，Uni-Reverse Primer 0.5μL，2X SYBY Green Mix 10μL，cDNA 2μL，RNase-free water up to 10μL。反应条件为：在95℃反应3min，起到起始模板变性；在95℃反应15s，PCR循环中模板变性，然后60℃中反应45s起到退火的作用，共经历36次循环。
实时荧光定量PCR技术是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，Ct值系指每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值所经历的循环数。目的miRNA起始拷贝数越多，则Ct值越小，反之则越大。
8.结果分析
本研究中，采用SPSS 23.0软件进行统计分析，首先分析健康组和病例组人口学特征，分类变量采用双侧卡方检验，定量变量采用了双侧t检验进行比较，然后根据let-7e-5p表达水平绘制出ROC曲线，计算病例组和健康组的临界点、灵敏度、特异度。
8.1研究对象的人口学及临床资料描述
如表3所示，苯暴露健康组共121人，工人平均年龄40.29±9.63岁，工人苯暴露时间12.10±10.30年，工人BMI 24.06±2.92kg/m2；苯暴露病例组共16人，工人平均年龄40.38±11.20岁，工人苯暴露时间13.19±12.53年，工人BMI 22.64±2.99kg/m2；病例组与健康组在年龄、吸烟情况、饮酒情况、苯暴露时间和BMI方面进行比较，差异无统计学意义(P＞0.05)，这些因素在病例组与健康组之间的分布是均衡可比。其中病例组和健康组在性别方面统计学差异(P＜0.05)，另外在内暴露剂量指标(S-PMA)，氧化损伤指标(MDA)和血常规指标(WBC和NEUT)，病例组与健康组之间的差别有统计学意义(P＜0.01)。
表3研究对象的人口学特征及血液学指标
Figure BDA0002720542970000071
Figure BDA0002720542970000081
表4在病例进展中相关指标的变化
Figure BDA0002720542970000082
8.2 let-7e-5p在病例组和健康组中的表达量
本研究中，如图1、图2所示，let-7e-5p在病例组和健康组中的表达量存在显著差异(P＝0.001)，病例组外周血白细胞中let-7e-5p的相对表达量显著低于健康组，并且let-7e-5p降低发生在血液系统异常之前，人外周血白细胞中let-7e-5p可作为苯暴露血液系统异常的标志物。
8.3苯暴露人群外周血白细胞中let-7e-5p基因表达量水平对筛选苯致血液系统异常高危人群的检验效率
如图3所示，根据let-7e-5p的数值绘制ROC曲线，计算病例组和健康组的临界点、灵敏度、特异度。结果显示外周血白细胞中let-7e-5p为0.78可作为高危人群筛选的最佳临界点，约登指数为0.436，敏感性为68.6％，特异性为75％，具有较高的精准度。
8.4苯暴露人群指标变化与let-7e-5p的相关性
如图4、图5所示，横断面调查发现，S-PMA和苯暴露人群外周血中let-7e-5p表达量存在相关性，随着S-PMA的增加，外周血中let-7e-5p的表达量逐渐下降，但是苯暴露时间的增加和苯暴露人群外周血中let-7e-5p表达量不存在相关性。
实施例2：
苯致血液系统异常的检测试剂盒包括：实施例1所述的苯致血液系统异常高危人群筛选的let-7e-5p的定量扩增引物(GTTTGTGTTGGGGGTTTATTATT)和内参U6的正向引物(CTCGCTTCGGCAGCAC)，各引物均为100μM，10μL，还包括PCR技术常用的试剂，如Trizol、氯仿、ddH2O、RT Master Mix(for Real Time)，具体组成为：10mLTrizo l、10mL氯仿、10mLddH2O、1mL RT Master Mix(for Real Time)；
通过测定离体样本(外周血白细胞)中let-7e-5p的表达量，并与对照样本(健康状态下的外周血白细胞中let-7e-5p的表达量)相比，被测外周血白细胞中let-7e-5p的表达量降低，反映出血液系统损伤，再结合内暴露剂量指标(S-PMA)的增高和氧化损伤指标(MDA)的增高，可以鉴别苯暴露人群血液系统异常，对苯暴露高危人群进行筛分，预防苯致血液系统损伤的进一步发生。
综上所述，本发明首次提出外周血白细胞中let-7e-5p可作为预防苯暴露血液系统异常的生物标志物，并结合检测试剂应用于预防苯致血液系统异常的检测，有操作简便，伤害性小的特点，可以提高苯暴露致血液系统异常人群筛选的特异性和灵敏性，对血液系统异常检测标志物进行了补充，提供了苯暴露致血液系统异常的miRNA标志物及其检测方法。
本发明的描述中，需要理解的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.检测let-7e-5p的 引物在制备检测苯致血液系统异常试剂中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，包括用所述检测试剂测定外周血白细胞中let-7e-5p的表达量，并与对照样本相比，被测外周血白细胞中let-7e-5p的表达量降低，显示血液系统损伤。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述检测试剂包括扩增let-7e-5p的第一正向引物和扩增内参U6的第二正向引物。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述第一正向引物的序列包括：GTTTGTGTTGGGGGTTTATTATT，所述第二正向引物的序列包括：CTCGCTTCGGCAGCAC。
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