CN111394447A - 一种血浆小细胞外囊泡miR-431-5p的应用 - Google Patents
一种血浆小细胞外囊泡miR-431-5p的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及血浆小细胞外囊泡miR‑431‑5p在作为糖尿病视网膜病变诊断的标志物方面中的应用。本发明首次发现了miR‑431‑5p在血浆sEVs中的表达水平与糖尿病视网膜病变密切相关,通过检测糖尿病患者血浆sEVs中的miR‑431‑5p表达,可以更加准确快速地判断受试者是否具有糖尿病视网膜病变的风险,从而给临床医师提供预防或治疗方案,并且作为制备治疗糖尿病视网膜病变药物的靶点,为治疗糖尿病视网膜病变提供了新的治疗靶点和治疗途径,与传统的检测手段相比,分子生物标志物的诊断更及时,更特异,从而预测糖尿病患者的视网膜病变进程,早期干预及治疗,应用前景广阔。
Description
技术领域
本发明属于生物医学技术领域,尤其是一种血浆小细胞外囊泡miR-431-5p的应用。
背景技术
细胞外囊泡(extracellular vesicles,EVs)是一种由细胞释放的多种多样的纳米级囊泡。类似大小的囊泡可以根据其生物产生过程、大小以及生理特性等进行进一步分类,如微囊泡(microvesicles,MVs)和外泌体。MV来自于质膜的“出芽”,直接从细胞脱落,直径在100-1000nm不等。外泌体是直径在30-100nm之间的细胞外囊泡,在20世纪80年代末Johnstone RM等人在细胞外间隙发现了外泌体的存在。通过传统差速离心的方法可以分离到直径小于200nm的小粒径EV(small EV,sEV),其主要成分为exosomes。根据2018年发布的专家共识,由于难以直接证明传统差速离心方法分离的小粒径EV为纯化的外泌体,建议使用sEV的命名。由于几乎所有的真核细胞都能释放小细胞外囊泡,人们认为它可能因来源细胞的功能及其目前的状态(如转化、分化、刺激和应激)而发生很大的差异。因此,小细胞外囊泡及其生物活性物质可以提供一系列疾病的预后信息,如慢性疾病、心血管和肾脏疾病、神经退行性疾病、脂质代谢疾病和肿瘤。miRNA被sEVs包裹后更加稳定适合研究。
关于sEVs miRNA的研究已经出现在很多疾病中,如在包括系统性红斑狼疮在内的多种自身免疫性疾病中sEVs miRNA能通过TLR7促进患者浆细胞样树突状细胞分泌干扰素-α。在食管癌患者中小细胞外囊泡miR-21过表达能通过靶向PDCD4并激活其下游c-jun氨基末端激酶(JNK)信号通路,显著促进细胞的迁移和侵袭。在糖尿病相关疾病中,sEVs也显示出了它在发病过程中起到一定的作用。携带miR-320-3p等miRNAs的糖尿病心肌细胞sEVs在血管内皮细胞培养中显示出了调节血管生成的作用。循环sEVs miR-20b-5p能损伤人骨骼肌中胰岛素的功能,降低AKT相关蛋白的丰度和胰岛素刺激的糖原积累,从而可能与2型糖尿病的发病相关。但是在DR中能查询到的sEVs miRNA研究暂时仍很少。
通过检索,尚未发现与本发明专利申请相关的专利公开文献。
发明内容
本发明目的在于克服现有技术的不足之处,提供一种血浆小细胞外囊泡miR-431-5p的应用,本发明首次发现了miR-431-5p在血浆sEVs中的表达水平与糖尿病视网膜病变密切相关,通过检测糖尿病患者血浆sEVs中的miR-431-5p表达,可以更加准确快速地判断受试者是否具有糖尿病视网膜病变的风险,从而给临床医师提供预防或治疗方案,并且作为制备治疗糖尿病视网膜病变药物的靶点,为治疗糖尿病视网膜病变提供了新的治疗靶点和治疗途径,与传统的检测手段相比,分子生物标志物的诊断更及时,更特异,从而预测糖尿病患者的视网膜病变进程,早期干预及治疗,应用前景广阔。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是:
血浆小细胞外囊泡miR-431-5p在作为糖尿病视网膜病变诊断的标志物方面中的应用。
血浆小细胞外囊泡miR-431-5p在作为制备治疗糖尿病视网膜病变药物的靶点方面中的应用。
本发明取得的优点和积极效果为:
1、本发明首次发现了miR-431-5p在血浆sEVs中的表达水平与糖尿病视网膜病变密切相关,通过检测糖尿病患者血浆sEVs中的miR-431-5p表达,可以更加准确快速地判断受试者是否具有糖尿病视网膜病变的风险,从而给临床医师提供预防或治疗方案,并且作为制备治疗糖尿病视网膜病变药物的靶点,为治疗糖尿病视网膜病变提供了新的治疗靶点和治疗途径,与传统的检测手段相比,分子生物标志物的诊断更及时,更特异,从而预测糖尿病患者的视网膜病变进程,早期干预及治疗,应用前景广阔。
2、本发明拟通过miRNA芯片对DR患者血浆sEVs进行分析,找出其与正常人和DM无DR患者在miRNA上的差别,以期为DR的诊治提供新的思路。与健康对照患者的血浆sEVs相比,miR-431-5p在增殖性糖尿病视网膜病变患者血浆sEVs中差异表达,并且该差异表达的miRNA代表疾病的严重程度,该miRNA表达生物标记是诊断糖尿病视网膜病变的指征。
附图说明
图1为本发明中sEVs与mEVs的透射电镜照片;其中,A:sEVs,B:mEVs;
图2为本发明中sEVs与mEVs的Western blots结果图;
图3为本发明中miRNA的芯片结果图;其中,A为热图,B为鉴定的mi-RNA与sEV的mi-RNA库对比图;
图4为本发明中hsa-miR-431-5p的qRT-PCR验证结果图;其中,A为mi-RNA芯片结果,B为sEVs验证结果,C为血浆验证结果,D为mEV验证结果;
图5为本发明中hsa-miR-361-3p的qRT-PCR验证结果图;其中,A为mi-RNA芯片结果,B为sEVs验证结果,C为血浆验证结果,D为mEV验证结果;
图6为本发明中hsa-miR-431-5p在玻璃体液中的表达水平图;
图7为本发明中制造HRCECs的增殖模型时使用4-HNE刺激的确定浓度图;
图8为本发明中4-HNE刺激后HRCECs中hsa-miR-431-5p的表达水平图;
图9为本发明中hsa-miR-431-5p mimics和inhibitor的转染效果图;其中,A为mimics转染效果图,B为inhibitor转染效果图;
图10为本发明中hsa-miR-431-5p对HRCECs增殖的影响图。
具体实施方式
下面详细叙述本发明的实施例,需要说明的是,本实施例是叙述性的,不是限定性的,不能以此限定本发明的保护范围。
本发明中所使用的原料,如无特殊说明,均为常规的市售产品;本发明中所使用的方法,如无特殊说明,均为本领域的常规方法。
血浆小细胞外囊泡miR-431-5p在作为糖尿病视网膜病变诊断的标志物方面中的应用。
血浆小细胞外囊泡miR-431-5p在作为制备治疗糖尿病视网膜病变药物的靶点方面中的应用。
上述血浆小细胞外囊泡miR-431-5p的提取及检测方法,步骤可以如下:
(一)血浆的提取
每位患者取10ml全血至EDTA抗凝管,经1800g×10min、4℃离心分离出4ml左右血浆,取2ml用于下述方法的sEVs分离。
(二)血浆sEVs的提取
取1.5ml血浆经2000g×15min离心后抽取上清转移入超速离心管,10000g×30min离心后得到上清:将上清转移入新的超速离心管进行110,000g×120min,得到沉淀,将沉淀用PBS充分重悬,进行110,000g×120min离心,得到沉淀,将沉淀使用50ul PBS重悬后储存。
(三)检测血浆中的miR-431-5p
1.miRNA的提取
在sEVs中加入1ml miRNeasy血清/血浆试剂盒中的QIAzol,吹打后室温静置5min,(提取血浆sEVs时需要在此处添加30μl 1nM的cel-miR-39作为外参),加入200μl氯仿,剧烈震荡15s后室温静置3min,分层后4℃、12000g离心15min,吸取上层水相于另一个1.5ml EP管中,加入1.5倍体积的无水乙醇,上下颠倒,从其中吸取700μl至试剂盒提供的RNeasyMinElute离心柱中,8000g离心30s,取出后倒掉收集管内的液体,继续将液体加入离心柱然后离心直到所有液体都经过离心柱。之后向离心柱中加入700μl RWT清洗缓冲液,8000g离心30s,取出后倒掉收集管内的液体,再加入500μl RPE清洗缓冲液,8000g离心30s,取出后倒掉收集管内的液体,加入500μl DEPC水配制的80%乙醇,8000g离心2min。弃掉收集管换一个新的收集管,4℃12000g离心5min甩干离心柱中的乙醇,再换一个收集管,向离心柱中加入14μl DEPC水,4℃12000g离心1min。取出后丢弃离心柱,用Nano Drop测浓度。
2.RNA逆转录
按照下述的比例在200μl的EP管中加入试剂,其中RNA的体积根据RNA浓度不同而有所不同,RNA总量40ng,之后加RNase free water将总体积补充至10μl。混匀之后离心,放入PCR仪中设置程序:37℃加热1h,之后95℃加热5min,结束后将得到的cDNA迅速放置于冰上。
3.qRT-PCR
按照下述的比例配制每孔中的反应液体,SYBR Green Master与cDNA混合,上下游引物和水混合,cDNA不足的部分用RNeasy free water补足,混匀后加入384孔板中。注意避光。加样完成后贴上封板膜,4℃2000rpm离心3分钟,然后上机。程序设置为:第一步95℃15min,第二步94℃15s——55℃30s——70℃30s并循环40次,第三步95℃15s——55℃15s——95℃15s。sEVs使用U6作为内参,血浆使用cel-miR-39作为外参。miRNA的表达水平用2^-Δct来表示。各miRNA的引物序列见表1。
表1引物序列
更具体地,本发明相关的制备和检测如下:
1.材料和方法
1.1实验对象
本研究得到天津医科大学附属眼科医院伦理委员会的批准。天津医科大学附属眼科医院的所有患者均签署了知情同意书。对于miRNA芯片分析,以健康受试者的血浆为对照组(n=5),糖尿病无视网膜并发症(无临床DR的糖尿病)(n=5),非增殖性糖尿病视网膜病变(n=5)和糖尿病视网膜病变(n=5)。获得)作为实验组。招募了另一组个体,分组同上(n=20),用于从miRNA芯片分析中对特定miRNA候选物进行qRT-PCR验证。DM和糖尿病性视网膜病变的纳入标准为:(1)40-80岁,(2)2型糖尿病。排除标准为:(1)葡萄膜炎(2)其他有眼部并发症的代谢综合征(3)免疫系统疾病(4)视网膜血管阻塞。
1.2糖尿病视网膜病变分级
根据受试者眼底超广角照相结果或由眼底医生对散瞳后受试者眼底进行判断:
a.无明显视网膜病变(NDR):仅有糖尿病,眼底无异常改变;
b.非增殖期糖尿病视网膜病变(NPDR):微动脉瘤,视网膜内出血;静脉串珠样,微血管内微血管异常
c.增殖期糖尿病视网膜病变(PDR):出现1种或多种改变,包括新生血管形成、玻璃体积血或视网膜前出血。
1.3血浆及其细胞外囊泡的提取与保存
1.3.1血浆:自静脉取血10mL,使用EDTA抗凝管保存,1800g离心15分钟后取上清血浆,置于-80℃保存。
1.3.2mEVs:取2ml血浆经2000g×15min离心后抽取上清转移入15mL离心管,将体积补充至12mL,10000g×30min离心后得到沉淀为mEVs。
1.3.3sEVs:取2ml血浆经2000g×15min离心后抽取上清转移入超速离心管,80000g×30min离心后得到上清:将上清转移入新的超速离心管进行110,000g×120min,得到沉淀,使用1mLPBS重悬后,将体积补充至11.5mL,110,000g×120min离心,得到沉淀为sEVs。
1.4细胞外囊泡的鉴定
1.4.1透射电镜观察细胞外囊泡
取分装后的mEVs及sEVs,解冻后重悬于200μL PBS液中混匀,取10μL外泌体溶液和4%PFA按体积比1:1混合,滴在干净的塑料薄膜上形成液滴,然后将电镜碳网的正面扣在液滴上,放置20min,10μL磷钨酸负染90s,烤干碳网,使用HitacW-7500透射电子显微镜进行观察并拍照。
1.4.2 Western Blot结果显示特征蛋白
使用RIPA缓冲液从细胞外囊泡和细胞中提取蛋白质,将匀浆液于4℃以12000×g离心15分钟。上清液转移到另一个透明试管中,然后将来自样品的10μg蛋白质和加入5倍体积蛋白质上样缓冲液的细胞裂解液在95℃加热5分钟。将所有样品上样到SDS-PAGE凝胶中电泳,然后将进入凝胶的蛋白质转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。在室温下与质量分数5%牛奶一起孵育1小时后,将膜与一抗包括CD9,CD63,CD81或TNFAIP8(1:2000)在4℃孵育过夜,并用TBST冲洗3次(每次10分钟)。膜置于HRP偶联的二抗(abcam)中。最后,使用增强的化学发光(ECL)拍摄图像。
1.5 miRNA芯片
每组取5例患者的血浆提取外泌体,将5个外泌体混合为一个样本,首先对样品的总RNA进行定量,这一步使用的是NanoDrop 2000分光光度计。接下来RNA的完整性由Agilent Bioanalyzer 2100检测。之后的步骤按芯片检测的标准流程进行,即对样本进行标记、芯片的杂交以及洗脱。首先要对总RNA进行去磷酸化处理,变性,再用Cyanine-3-CTP(Cy3)标记。标记以后对RNA进行纯化接着再与芯片杂交,最后进行的步骤是洗脱。最终原始图像的获得是通过Agilent Scanner G2505C来进行扫描的。
1.6细胞培养
人视网膜微血管内皮细胞(HRCEC)从angiopromie公司购买,将其在内皮细胞基本培养基(ECM)中与体积分数5%胎牛血清,体积分数1%青霉素-链霉素和内皮细胞生长补充剂(ECGS)一起培养。将细胞在37℃和体积分数5%的二氧化碳中孵育。每2-3天更换一次培养基。取第三至第六代细胞进行实验。
1.7 CCK-8试剂盒检测细胞增殖
在96孔板中接种细胞后放在37℃细胞培养箱中培养,之后在每孔中加10%的CCK-8溶液,注意不要产生气泡,避光放入细胞培养箱中培养3h,取出用酶标仪测每孔在450nm的吸光度。
1.8选择4-羟基壬烯醛刺激的最佳浓度
按照1.6中的方法接种细胞,按每孔1000个细胞将HRCECs接种于96孔板中,放入细胞培养箱中过夜。将细胞分为6组,分别加入0、5、10、20、50、100μmol/L的4-羟基壬烯醛(4-hydroxynonenal,4-HNE),在细胞培养箱中培养24h后用CCK-8试剂盒测定各组细胞的增殖能力。
1.9细胞总RNA的提取
取一个长满的6孔板,每孔中加入1ml Trizol反复吹打5min,直到细胞脱落并且液体变粘稠说明有核酸释放出来,室温静置5min后加入200μl氯仿,剧烈震荡15s,静置3min后在4℃下12000rpm离心15min,小心吸取上层水相至另一1.5ml EP管中,注意不要吸到中间层,之后加入等体积的异丙醇,上下颠倒后在4℃冰箱中静置30min,取出后4℃12000rpm离心10min,可以看到管底有白色沉淀,吸去上层液体注意不要吸走沉淀,加入1ml DEPC水配制的体积分数75%乙醇,4℃7500g离心5min,尽量吸干液体,在通风橱中晾干,加入DEPC水溶解RNA。
1.10逆转录
按照下述的比例在200μl的EP管中加入试剂,其中RNA的体积根据RNA浓度不同而有所不同,RNA总量40ng,之后加DEPC水将总体积补充至10μl。混匀之后离心,放入PCR仪中设置程序:37℃加热1h,之后95℃加热5min,结束后将得到的cDNA迅速放置于冰上。
1.11 qRT-PCR
按照下述的比例配制每孔中的反应液体,SYBR Green Master与cDNA混合,上下游引物和水混合,cDNA不足的部分用RNeasy free water补足,混匀后加入384孔板中。注意避光。加样完成后贴上封板膜,4℃2000rpm离心3分钟,然后上机。程序设置为:第一步95℃15min,第二步94℃15s——55℃30s——70℃30s并循环40次,第三步95℃15s——55℃15s——95℃15s。外泌体和MV使用U6作为内参,血浆使用cel-miR-39作为外参。miRNA的表达水平用2^-Δct来表示。
1.12 hsa-miR-431-5p mimics和inhibitor的转染
在96孔板中按2000个/孔的密度接种HRCECs,接种时培养基中不要加双抗,细胞培养箱中培养过夜。在2个EP管中分别加入5μl Opti-MEM培养基,再向第一管中加入0.15μl的Lipofectamine 3000试剂,第二管中加入0.15μl的negative control/miRNAmimics/inhibitor control/miRNAinhibitor,将两管液体混合,室温孵育5min,之后将10μl的混合液加入一个孔中。配液时一般需要算出所有孔加液的总量,混合后逐个孔添加,而不要每个孔单独配液避免误差。其它的negative control、inhibitor control和miRNAinhibitor也用同样的方法转染入细胞,但inhibitor control和miRNAinhibitor需要加入比miRNAmimics多一倍的量。
1.13细胞划痕实验
将HRCECs消化后接种于6孔板上,细胞融合度达到75%-80%时分别转染negativecontrol、hsa-miR-431-5p mimics、inhibitor control和hsa-miR-431-5p inhibitor,6h后吸去含转染试剂的培养基并用1ml枪头在每孔细胞中央以相同的力度划一道线,之后用PBS缓冲液清洗2-3次洗去脱落的细胞,镜下拍照并保存,记录拍照的地方以保证之后拍照都是同一个地方,24h后再次拍照保存。图片用image J软件分析计算划痕的面积,根据平均间隙面积(average gap,AG)百分比对数据进行量化,0h时的间隙面积被认为是100%AG。
2.结果
2.1细胞外囊泡鉴定结果
透射电镜照片示sEVs与mEVs尺寸形态不同(图1:A:sEVs B:mEVs,标尺=200nm)。外泌体有重要表面标记蛋白CD9和CD63,是鉴定外泌体的必备方法。Western blots结果显示提取的sEVs这两种标记蛋白都有显影,而作为对照的细胞则没有这两种标记蛋白的表达(图2),再次证明了本发明提取的样本中确实包含外泌体。
2.2 miRNA芯片结果
通过miRNA芯片检测到589个差异miRNA(图3A),其中与ExoCarta数据库重合的有273个,其他316个未在数据库中找到(图3B)。由于本发明的主要目的是从外泌体miRNA的角度探究PDR的发病机制,所以主要挑选的miRNA是在control组和DM组中表达水平相近,而在PDR中表达水平变化明显的miRNA进行下一步的qRT-PCR验证。经过筛选,发现hsa-miR-431-5p和hsa-miR-361-3p符合上述条件。因此,在之后的实验中决定对hsa-miR-431-5p和hsa-miR-361-3p这2个miRNA进行qRT-PCR验证。
2.3 qRT-PCR验证结果
用qRT-PCR检测由芯片结果筛选出的hsa-miR-431-5p、hsa-miR-361-3p在sEVs、全血浆以及mEVs中的表达水平,结果显示在sEVs中PDR组的miR-431-5p相对于control组和DM组明显升高(图4A)且差异有统计学意义(P<0.05),与芯片结果一致。但是在血浆和mEVs中,control、DM和PDR三组之间却没有很大差别(图4),这也说明了sEVs与血浆、mEVs中的miRNA组成有所不同,三者不可互相替代,而sEVs由于其生物学特性可能更加能代表机体的疾病状态。而hsa-miR-361-3p则在sEVs、全血浆和mEVs中都没有明显的变化趋势(图5),没有表现出与miRNA芯片一致的变化。
2.4 hsa-miR-431-5p在玻璃体液中的表达水平
发现在PDR患者血浆sEVs中hsa-miR-431-5p的表达水平明显高于control与DM组的患者之后,想到可以在玻璃体液中同时验证hsa-miR-431-5p的表达。选取了12例黄斑裂孔的患者作为对照组与12例PDR患者作对照,通过qRT-PCR检测玻璃体液中的hsa-miR-431-5p表达水平,发现在PDR患者的玻璃体液中hsa-miR-431-5p的表达水平明显下降(图6),差异有统计学意义(P<0.05)。
2.5 4-HNE刺激的最佳浓度
首先制造HRCECs的增殖模型需要确定使用4-HNE刺激的浓度,选择了0、5、10、20、50、100μmol/L的4-HNE来分别刺激HRCECs,得到的CCK-8检测结果各组的吸光度分别为0.6792±0.03,0.7939±0.07,0.8269±0.09,0.7746±0.09,0.3144±0.01,0.3064±0.01,浓度为10μmol/L的4-HNE对HRCECs的促进增殖作用最强(图7),差异有统计学意义(P<0.05)。当4-HNE的浓度高于50μmol/L后反而会对细胞增殖有抑制作用。因此后续实验将采取10μmol/L的4-HNE刺激HRCECs。
2.6 4-HNE刺激后HRCECs中hsa-miR-431-5p的表达水平
10μmol/L的4-HNE刺激后HRCECs中hsa-miR-431-5p的表达水平明显升高(图8),差异有统计学意义(P<0.05)。说明hsa-miR-431-5p在细胞增殖时升高,这一结果与PDR中血浆外泌体hsa-miR-431-5p升高的结果具有一致性。
2.7 hsa-miR-431-5p mimics和inhibitor的转染效果
在利用hsa-miR-431-5p mimics和inhibitor研究hsa-miR-431-5p对HRCECs的影响之前,首先要确定使用lipofectamine 3000转染hsa-miR-431-5p mimics或inhibitor与negative control相比确实能够升高或降低HRCECs中hsa-miR-431-5p的表达。qRT-PCR的结果显示与N.C组相比,转染hsa-miR-431-5p mimics组细胞表达hsa-miR-431-5p的水平确实有所升高(图9A),且差异有统计学意义(P<0.05)。而与inhibitor control组相比,转染hsa-miR-431-5p组的细胞hsa-miR-431-5p的表达水平降低(图9B),差异有统计学意义(P<0.05)。
2.8 hsa-miR-431-5p对HRCECs增殖的影响
确定4-HNE刺激HRCECs制造增殖模型后hsa-miR-431-5p表达会升高后,希望继续研究hsa-miR-431-5p对HRCECs的影响。CCK-8结果显示,加入hsa-miR-431-5p mimics可以促进HRCECs的增殖,且具有统计学意义(P<0.05),相反加入hsa-miR-431-5p inhibitor抑制HRCECs的增殖,差异同样有统计学意义(P<0.05)(图10)。
尽管为说明目的公开了本发明的实施例,但是本领域的技术人员可以理解:在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内,各种替换、变化和修改都是可能的,因此,本发明的范围不局限于实施例所公开的内容。
序列表
<110> 天津医科大学眼科医院
<120> 一种血浆小细胞外囊泡miR-431-5p的应用
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 17
<212> DNA
<213> U6正向引物(Unknown)
<400> 1
ctcgcttcgg cagcaca 17
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> U6反向引物(Unknown)
<400> 2
aacgcttcac gaatttgcgt 20
<210> 3
<211> 30
<212> DNA
<213> cel-miR-39正向引物(Unknown)
<400> 3
acactccagc tgggtcaccg ggtgtaaatc 30
<210> 4
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<212> DNA
<213> cel-miR-39反向引物(Unknown)
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ctcaactggt gtcgtggagt cggcaattca gttgagcaag ctga 44
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<211> 29
<212> DNA
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<212> DNA
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<400> 6
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Claims (2)
1.血浆小细胞外囊泡miR-431-5p在作为糖尿病视网膜病变诊断的标志物方面中的应用。
2.血浆小细胞外囊泡miR-431-5p在作为制备治疗糖尿病视网膜病变药物的靶点方面中的应用。
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