CN106170302A - 含有使溶血磷脂受体活化的物质的药剂递送促进剂 - Google Patents

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Abstract

本发明提供：药剂递送促进剂，其含有使溶血磷脂受体活化的物质作为有效成分，用于促进伴有血管形成异常的疾病的治疗药向疾病部位的递送；伴有血管形成异常的疾病的治疗用药物组合物，其含有使溶血磷脂受体活化的物质作为有效成分；及伴有血管形成异常的疾病的治疗药的筛选方法，其特征在于，选择使疾病部位的血管内皮细胞中特异性表达的溶血磷脂受体活化的物质。

Description

含有使溶血磷脂受体活化的物质的药剂递送促进剂
技术领域
本发明涉及含有使溶血磷脂受体活化的物质的药剂递送促进剂、以及含有使溶血磷脂受体活化的物质的药物组合物。
背景技术
血管形成与肿瘤、糖尿病性视网膜病、老年性黄斑变性、风湿性关节炎等慢性炎症性疾病，感染症等急性炎症，血管畸形以及动脉硬化等多种疾病有关。血管形成与疾病形成有关时，该疾病被统称为血管病。在胎儿期，从完全没有血管的状态开始形成新血管。将该过程称为血管发生或脉管形成。与此相对地，将从现有的血管形成新血管的过程称为血管新生。血管新生与各种疾病的血管形成有关。
作为血管内皮生长因子而已知的VEGF(vascular endothelial growth factor)在从胎儿期起的生长期的生理性血管形成、疾病形成中的病理性血管形成等所有的血管形成中扮演主要角色。VEGF强烈诱导血管内皮细胞的增殖。此外，在血管形成初期，VEGF通过Src将与血管内皮细胞彼此粘附有关的VE-钙粘蛋白磷酸化，并诱导其的细胞内迁移，使血管内皮细胞间产生松弛。
正常血管的管腔通过血管内皮细胞和壁细胞的粘附从而在结构上是稳定的。血管内皮细胞间通过上述VE-钙粘蛋白以及claudin 5、整联蛋白、连接蛋白等各种粘附因子而紧密结合，从而简单地对物质、细胞进行控制，使其不会从血管内漏到血管外。此外，在血管内皮细胞和壁细胞之间形成有粘附带，通过血管内皮细胞和壁细胞之间的分子交换控制着血管通透性。此外，通常左侧和右侧的血管显示出平行的走行性。
另一方面，在肿瘤的血管中观察到各种异常。肿瘤内的血管的通透性亢进，观察到曲折、扩张，部分呈嚢状，血管分支也呈无序状态。血管内皮细胞本身也呈异常形态，内衬的壁细胞在肿瘤中心部也非常松散，与血管内皮细胞的粘附也弱，壁细胞的内衬在多个位置是缺损的。这样的异常大多是由肿瘤内的VEGF过度分泌而引起的。
血管新生抑制剂的主要靶标是VEGF或其受体，临床中正在使用VEGF的中和抗体、可溶性VEGF受体及多种VEGF受体的磷酸化抑制剂。在血管新生抑制剂开发之初，期待血管新生抑制剂抑制肿瘤内的血管形成、阻断氧和养分的供给、抑制肿瘤增大。其基于20世纪70年代J.Folkman博士提出的肿瘤血管新生概念(非专利文献1)。在使用小鼠的前临床试验中，在血管新生抑制剂单独使用时观察到显著的抗肿瘤效果，但在人类中，血管新生抑制剂单独使用时的抗肿瘤效果有限。已经明确了：与抗癌剂单独使用时相比，通过将血管新生抑制剂与抗癌剂组合使用，观察到抑制肿瘤增大的效果(非专利文献2)。
基于这样的认知，R.Jain博士提出：血管新生抑制剂与抗癌剂组合使用所产生的效果是血管新生抑制剂引起肿瘤血管的正常化而发挥的(非专利文献3)。即，在阻断由VEGF诱导的VEGF受体的细胞内信号时，血管内皮细胞彼此的解离被抑制，由于VEGF过量而加剧的血管通透性恢复正常。其结果是，从之前肿瘤组织内压和血管内压无差异的状态变成了血管内压高于肿瘤组织内压，抗癌剂从血管内向肿瘤内的通透性恢复，抗癌剂的效果显著提高。
因此，我们认为，改善肿瘤内的血管通透性、诱导药剂向肿瘤内递送的手段是有效的癌症治疗方法。另一方面，血管新生抑制剂显示出抑制血管内皮细胞的生存、诱导血管内皮细胞和与其相互作用的血管壁细胞的细胞凋亡、促进肿瘤内的缺血状态的作用。还报道了肿瘤内的低氧状态有可能诱导癌细胞的恶性化、促进癌症的浸润、转移。此外还报道了：血管新生抑制剂对正常组织的血管也有损伤，引起血压上升、肺出血、肾损伤等严重副作用。因此，期待开发出不使肿瘤血管退化、对正常血管无影响且使肿瘤血管的通透性正常化的药剂。此外，也需要开发对肿瘤以外的伴有血管异常的疾病也不影响正常血管、使疾病部的血管正常化的药剂。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1：Folkman J,et al:Isolation of a tumor factor responsiblefor angiogenesis.J Exp Med 133:275-288,1971
非专利文献2：Gerber HP,Ferrara N.Pharmacology and pharmacodynamics ofbevacizumab as monotherapy or in combination with cytotoxic therapy inpreclinical studies.Cancer Res 65；671-680,2005
非专利文献3：Jain RK:Normalization of tumor vasculature:An emergingconcept in antiangiogenic therapy.Science 307:58-62,2005
发明内容
发明所要解决的问题
本发明的课题在于，发现在实体癌等伴有血管形成异常的疾病中对正常血管无影响、使疾病部位的血管的通透性正常化的物质，并且提供该物质的新用途。
用于解决问题的方法
本发明为了解决上述课题而包含以下各发明。
[1]一种药剂递送促进剂，其特征在于，其为用于促进伴有血管形成异常的疾病的治疗药向疾病部位的递送的药剂递送促进剂，含有活化溶血磷脂受体的物质作为有效成分，与伴有血管形成异常的疾病的治疗药组合使用。
[2]根据上述[1]所述的药剂递送促进剂，其中，活化溶血磷脂受体的物质为溶血磷脂或其前体、或者它们的衍生物。
[3]根据上述[1]或[2]所述的药剂递送促进剂，其中，伴有血管形成异常的疾病为实体癌、老年性黄斑变性、风湿性关节炎、银屑病、硬皮病、系统性红斑狼疮、脉管炎综合征、血管白塞病、糖尿病性视网膜病、糖尿病性肾病、动脉硬化、慢性闭塞性动脉硬化、血栓闭塞性脉管炎、肺纤维化、脑梗塞、重症感染或心力衰竭。
[4]根据上述[3]所述的药剂递送促进剂，其中，伴有血管形成异常的疾病为实体癌。
[5]根据上述[1]～[4]中任一项所述的药剂递送促进剂，其中，溶血磷脂为选自溶血磷脂酸、溶血磷脂酰丝氨酸、溶血磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰乙醇胺、溶血磷脂酰肌醇、溶血磷脂酰甘油、鞘氨醇-1-磷酸、鞘氨醇磷酸胆碱和血小板活化因子(PAF)中的1种或2种以上。
[6]根据上述[5]所述的药剂递送促进剂，其中，溶血磷脂为溶血磷脂酸。
[7]一种伴有血管形成异常的疾病的治疗用药物组合物，其含有活化溶血磷脂受体的物质作为有效成分。
[8]根据上述[7]所述的药物组合物，其中，活化溶血磷脂受体的物质为溶血磷脂或其前体、或者它们的衍生物。
[9]根据上述[8]所述的药物组合物，其具有选自肿瘤增殖抑制作用、癌转移抑制作用、肿瘤免疫增强作用和抑制血管通透性亢进的作用中的1种以上作用。
[10]根据上述[8]或[9]所述的药物组合物，其特征在于，与用于治疗伴有血管形成异常的疾病的其它药剂组合使用。
[11]根据上述[10]所述的药物组合物，其中，用于治疗伴有血管形成异常的疾病的其它药剂为癌症治疗药。
[12]根据上述[10]或[11]所述的药物组合物，其用于促进所组合使用的其它药剂向伴有血管形成异常的疾病部位的递送。
[13]根据上述[7]～[12]中任一项所述的药物组合物，其中，伴有血管形成异常的疾病为实体癌、老年性黄斑变性、风湿性关节炎、银屑病、硬皮病、系统性红斑狼疮、脉管炎综合征、血管白塞病、糖尿病性视网膜病、糖尿病性肾病、动脉硬化、慢性闭塞性动脉硬化、血栓闭塞性脉管炎、肺纤维化、脑梗塞、重症感染或心力衰竭。
[14]根据上述[13]所述的药物组合物，其中，伴有血管形成异常的疾病为实体癌。
[15]根据上述[7]～[14]中任一项所述的药物组合物，其中，溶血磷脂为选自溶血磷脂酸、溶血磷脂酰丝氨酸、溶血磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰乙醇胺、溶血磷脂酰肌醇、溶血磷脂酰甘油、鞘氨醇-1-磷酸、鞘氨醇磷酸胆碱和血小板活化因子(PAF)中的1种或2种以上。
[16]根据上述[15]所述的药物组合物，其中，溶血磷脂为溶血磷脂酸。
[17]一种伴有血管形成异常的疾病的治疗药的筛选方法，其特征在于，选择使疾病部位的血管内皮细胞中特异性表达的溶血磷脂受体活化的物质。
发明效果
本发明的含有活化溶血磷脂受体的物质作为有效成分的药剂递送促进剂对正常血管没有影响、使伴有血管形成异常的疾病部位的血管的通透性正常化，因此能够促进所组合使用的药剂向伴有血管形成异常的疾病部位的递送，发挥如下效果：能够用少量的治疗药得到更好的治疗效果。本发明的含有活化溶血磷脂受体的物质作为有效成分的药物组合物能够单独用于伴有血管形成异常的疾病的治疗。特别是将本发明的药物组合物用于实体癌的治疗时，不会诱导癌细胞的恶性化，发挥能够抑制肿瘤的增殖、抑制癌细胞的转移、使肿瘤免疫增强的效果。
附图说明
图1为示出对LLC细胞荷瘤小鼠给药溶血磷脂酸(LPA)并评价肿瘤血管的结构变化的结果的图，(A)为示出通过共聚焦激光显微镜观察用抗CD31抗体对血管内皮细胞进行了免疫染色的肿瘤组织标本的结果的图，(B)为示出用AngioTool血管结构分析软件算出的各组的平均血管长度的图。
图2为示出对LLC细胞荷瘤小鼠给药鞘氨醇-1-磷酸(S1P)，为了评价肿瘤血管的结构变化而通过共聚焦激光显微镜观察用抗CD31抗体对血管内皮细胞进行了免疫染色的肿瘤组织标本的结果的图。
图3为示出对LLC细胞荷瘤小鼠给药溶血磷脂酸(LPA)并用扫描电子显微镜观察肿瘤血管内腔的结构变化的结果的图。
图4为示出对LLC细胞荷瘤小鼠给药溶血磷脂酸(LPA)及阿霉素并用共聚焦激光显微镜观察药剂从肿瘤血管向肿瘤组织递送的结果的图。
图5为示出对LLC细胞荷瘤小鼠给药溶血磷脂酸(LPA)及分子量不同的FITC标记葡聚糖(70kDa或2000kDa)并用共聚焦激光显微镜观察药剂从肿瘤血管向肿瘤组织递送的结果的图。
图6为示出研究LLC细胞荷瘤小鼠中的、溶血磷脂酸(LPA)及5-FU组合使用的效果的结果的图，(A)为示出各组的肿瘤体积的经时变化的图，(B)为示出各组的代表性的小鼠外观的图，(C)为示出从各组的代表性的小鼠摘除的肿瘤的图。
图7为示出研究B16-BL6细胞荷瘤小鼠中的、溶血磷脂酸(LPA)及5-FU组合使用的效果的结果的图，(A)为示出各组的肿瘤体积的经时变化的图，(B)为示出各组的代表性的小鼠的外观的图。
图8为示出研究colon26细胞荷瘤小鼠中的、溶血磷脂酸(LPA)及5-FU组合使用的效果的结果的图，示出各组的肿瘤体积的经时变化。
图9为示出研究colon26细胞荷瘤小鼠中的、溶血磷脂酸(LPA)及奥沙利铂组合使用的效果的结果的图，示出各组的肿瘤体积的经时变化。
图10为示出对LLC细胞荷瘤小鼠给药溶血磷脂酸(LPA)并观察肿瘤内的血管内皮细胞中的VE-钙粘蛋白的表达结果的图，(A)为示出通过共聚焦激光显微镜观察用抗VE-钙粘蛋白抗体对血管内皮细胞进行了免疫染色的肿瘤组织标本的结果的图，(B)为示出沿着(A)所示的倾斜白线部分获取Z轴堆叠图像、对VE-钙粘蛋白表达量(荧光强度)进行分析的结果的图。
图11为示出对培养内皮细胞添加LPA或LPA衍生物VPC31144S并分析内皮细胞彼此的粘附强度(屏障功能)的结果的图。
图12为示出对B16-BL6细胞荷瘤小鼠给药溶血磷脂酸(LPA)并计测从原发灶向肺转移的转移结节数的结果的图。
图13为示出用实时PCR分析从LLC细胞荷瘤小鼠回收的肿瘤组织的血管内皮细胞中的LPA受体(LPAR)1～6的表达量的结果的图。
图14为示出用实时PCR分析MS-1细胞(来自小鼠胰脏的血管内皮细胞株)中的LPA受体(LPAR)1～6的表达量的结果的图。
图15为示出将敲除了LPAR4的MS-1细胞和对照MS-1细胞培养至汇合，用抗VE-钙粘蛋白抗体进行免疫荧光染色并用共聚焦激光显微镜比较观察的结果的图。
图16为示出对下肢缺血模型小鼠给药溶血磷脂酸(LPA)，研究LPA对新生血管通透性亢进所致的浮肿的效果的结果的图。
图17为示出对老年性黄斑变性模型小鼠给药溶血磷脂酸(LPA)、研究抑制新生血管的通透性增强的效果的结果的图，上部为示出用抗CD31抗体对血管内皮细胞进行免疫染色并进行观察的结果的图，下部为示出观察FITC标记葡聚糖从新生血管漏出的结果的图。
具体实施方式
溶血磷脂为具有1个酰基的磷脂。溶血磷脂大致分为具有甘油骨架和具有鞘氨醇骨架的类型，通过各自所键合的极性基团和酰基的组合而存在多种分子种类。已知溶血磷脂是通过与特异性受体结合而显示出各种生物活性的脂质介质。但是，关于溶血磷脂在生物体内的生理功能，不明之处仍很多，对伴有血管形成异常的疾病的血管的作用则完全是未知的。
本发明人们对皮下移植了癌细胞而形成有肿瘤的小鼠给药作为溶血磷脂之一的溶血磷脂酸(LPA)，结果发现，在给药前确认为曲折、呈无秩序的分支的肿瘤血管变成了与正常组织同样的网状结构。关于肿瘤血管的内腔结构，发现在溶血磷脂酸给药前为异常结构，但给药后变成了平滑的结构。而且，关于肿瘤血管的通透性，发现溶血磷脂酸改善了过度亢进状态，诱导血管通透性正常化。即，本发明人们发现，溶血磷脂酸在实体癌等伴有血管形成异常的疾病中具有：诱导血管的网络构建、使其正常化而成为网状结构的作用，使血管内腔平滑的作用，使血管通透性正常化的作用。此外，本发明人们使用作为血栓闭塞性脉管炎及慢性闭塞性动脉硬化的疾病模型的下肢缺血模型小鼠、以及老年性黄斑变性模型小鼠进行实验，发现在除肿瘤血管以外的新生血管中，溶血磷脂酸也使血管通透性的亢进状态正常化，使病状得到改善。这些认知使我们发现，溶血磷脂酸具有使伴有血管形成异常的疾病中的异常血管正常化的作用。因此我们认为，溶血磷脂作为伴有血管形成异常的疾病的血管正常化剂的有效成分是有用的。
另一方面，对于LPA受体(LPAR)，目前为止发现了LPAR1～6这6种。在癌细胞中，LPAR1～3高表达，在体外培养中，癌细胞的增殖受到溶血磷脂酸的诱导。本发明人们用小鼠对在肿瘤组织的血管内皮细胞中表达的LPAR进行了分析，发现表达LPAR1、LPAR4及LPAR6。进一步发现，对于敲除了LPAR4的血管内皮细胞而言，细胞彼此的粘附变得异常。即，发现肿瘤血管的正常化至少是由LPAR4介导的。
因此，我们认为，若在不使癌细胞中高表达的LPAR1～3活化的情况下特异性地活化在肿瘤血管内皮细胞中特异性表达的LPAR，则能够在不担心癌细胞的增殖、运动能力的亢进的情况下治疗癌症。即，我们认为：能够特异性地活化LPAR4或LPAR6的受体激动剂与溶血磷脂同样地作为血管正常化剂的有效成分是有用的。进而，我们认为：目前对于LPA受体已鉴定出了LPA受体1～6，但包括尚未鉴定的受体在内，能够诱导血管正常化的LPA受体的激动剂作为血管正常化剂的有效成分是有用的。
〔药剂递送促进剂〕
本发明提供用于促进伴有血管形成异常的疾病的治疗药向疾病部位的递送的药剂递送促进剂。本发明的药剂递送促进剂的特征在于，含有活化溶血磷脂受体的物质作为有效成分，与伴有血管形成异常的疾病的治疗药组合使用。已知在伴有血管形成异常的疾病部位，血流不足且血管通透性处于过度亢进状态。例如已知：在实体癌中，肿瘤间质压增大、肿瘤间质内与血管内的渗透压之差消失，物质难以从血管内腔向肿瘤组织内移动。本发明的药剂递送促进剂由于能够使伴有血管形成异常的疾病部位的异常血管正常化，使血管通透性正常化，因此能够显著提高所组合使用的药剂向疾病部位的递送效率。
活化溶血磷脂受体的物质并非仅限于溶血磷脂，还可以适当使用溶血磷脂的衍生物、溶血磷脂的前体或它们的衍生物等作为有效成分。进而，也可以适当使用除这些以外的溶血磷脂受体激动剂(例如低分子化合物、核酸、肽、蛋白质、抗体等)作为有效成分。作为公知的溶血磷脂受体激动剂，可以列举例如Wong等的论文(Assay Drug DevTechnol.2010Aug；8(4):459-70.doi:10.1089/adt.2009.0261.)中记载的LPA4受体激动剂等。优选溶血磷脂或其前体、或者它们的衍生物。
作为本发明的药剂递送促进剂中使用的溶血磷脂，可以列举例如溶血磷脂酸(LPA)、溶血磷脂酰丝氨酸(LPS)、溶血磷脂酰胆碱(LPC)、溶血磷脂酰乙醇胺(LPE)、溶血磷脂酰肌醇(LPI)、溶血磷脂酰甘油(LPG)、鞘氨醇-1-磷酸(S1P)、鞘氨醇磷酸胆碱(SPC)、血小板活化因子(PAF)等，但不限于这些，本发明中也可以适当使用其它溶血磷脂。优选溶血磷脂酸、溶血磷脂酰胆碱、鞘氨醇-1-磷酸，更优选溶血磷脂酸。本发明的药剂递送促进剂中可以使用1种溶血磷脂，也可以将2种以上组合使用。对溶血磷脂的酰基没有特别限定，优选碳数为16～22且不饱和度为0～6的酰基。更优选碳数:不饱和度为16:1、18:1、18:2、18:3、20:1、20:2、20:3、20:4、20:5、22:1、22:2、22:3、22:4、22:5、22:6的酰基。此外，溶血磷脂可以为1-酰基型溶血磷脂及2-酰基型溶血磷脂中的任一种。优选1-酰基型溶血磷脂。
作为溶血磷脂的前体，可以列举例如磷脂酸、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油、鞘磷脂、鞘脂类等。本领域技术人员公知的是，这些磷脂在生物体内代谢而生成溶血磷脂(例如参照E.J.Goetzl,S.An,FASEB J.12,1589(1998)、Xie Y,Meier KE.Cell Signal.2004Sep；16(9):975-81)。
作为溶血磷脂的衍生物，可以列举为了提高血中稳定性而用聚乙二醇(PEG)衍生物修饰的溶血磷脂(PEG化溶血磷脂)、用聚甘油等水溶性聚合物修饰的溶血磷脂、用任意的取代基修饰的溶血磷脂等。作为溶血磷脂前体的衍生物，可以列举用PEG衍生物修饰的前体、用水溶性聚合物修饰的前体、用任意的取代基修饰的前体等。此外，溶血磷脂或其前体、或者它们的衍生物还可以形成盐，作为该盐，优选生理学上可接受的盐。作为生理学上可接受的盐，可以列举例如与盐酸、硫酸、磷酸、乳酸、酒石酸、马来酸、富马酸、草酸、苹果酸、柠檬酸、油酸、棕榈酸、硝酸、磷酸、三氟乙酸、甲磺酸、苯磺酸、对甲苯磺酸等酸的盐；与钠、钾、钙等碱金属或碱土金属的、或者铝的氢氧化物或碳酸盐的盐；与三乙胺、苄基胺、二乙醇胺、叔丁基胺、二环己基胺、精氨酸等的盐等。
本发明中使用的溶血磷脂或其前体、或者它们的衍生物可以通过例如(1)化学合成；(2)由生物样品纯化；(3)利用酶进行合成等公知方法得到。此外，可以购买市售品来使用。在化学合成的情况下，例如可以将Comprehensive Organic Transformations:A Guideto Functional Group Preparations,2nd Edition(Richard C.Larock,John Wiley&SonsInc,1999)中记载的方法等适当改良、组合使用而进行制造。在由生物样品纯化时，例如，可以将通过凝胶过滤等方法得到的级分供于硅胶柱色谱或反相柱色谱等纯化法而进行制造。在利用酶进行合成的情况下，可以使用例如髓过氧化物酶、氧化酶、12/15-脂肪氧合酶、P450代谢酶等。
对被有效成分活化的溶血磷脂受体没有特别限定，可以以公知的溶血磷脂受体及将来发现的溶血磷脂受体为对象。其中，优选在血管内皮细胞中表达的溶血磷脂受体，进一步优选在血管内皮细胞中特异性表达的溶血磷脂受体。例如，本发明人们发现LPAR4及LPAR6在小鼠肿瘤组织的血管内皮细胞特异性表达(参照实施例10)，确认特别优选以LPAR4为对象(参照实施例11)。因此，作为被有效成分活化的溶血磷脂受体，优选与小鼠的LPAR4及LPAR6对应的人LPAR。
伴有血管形成异常的疾病包括：患部形成有曲折的血管、具有呈无序状态的分支的血管的疾病、患部形成有具有异常的内腔结构的血管的疾病、患部形成有血管通透性亢进的血管的疾病。作为可通过本发明的药剂递送促进剂促进药剂递送的、伴有血管形成异常的疾病，可以列举例如实体癌、老年性黄斑变性、风湿性关节炎、银屑病、硬皮病、系统性红斑狼疮、脉管炎综合征、血管白塞病、糖尿病性视网膜病、糖尿病性肾病、动脉硬化、慢性闭塞性动脉硬化、血栓闭塞性脉管炎、肺纤维化、脑梗塞、重症感染、心力衰竭等，但不限于这些。
实体癌的内部形成有曲折的、具有呈无序状态的分支的血管，血管内腔结构异常，血管通透性过度亢进。对实体癌没有特别限定，可以列举例如肺癌、大肠癌、前列腺癌、乳癌、胰癌、食道癌、胃癌、肝癌、胆管癌、脾脏癌、肾癌、膀胱癌、子宮癌、卵巣癌、睾丸癌、甲状腺癌、脑肿瘤等。此外，癌变的血液细胞所形成的肿瘤也包含在实体癌中。老年性黄斑变性是形成通透性亢进的脉络膜新生血管的疾病。血液成分从脉络膜新生血管漏出，产生视网膜浮肿、视网膜下液，引起视觉功能损伤。风湿性关节炎是关节内的滑膜发生炎症、形成通透性亢进的新生血管的疾病。关节液蓄积在关节腔内，引起关节变形和疼痛。银屑病是在皮肤角质层中形成了曲折的异常结构的血管、伴有炎症和角质增厚的炎症性疾病。硬皮病是胶原病的一种，是在炎症诱导下形成通透性亢进的新生血管、皮肤总是处于炎症状态的疾病。系统性红斑狼疮、脉管炎综合征、血管白塞病也同样是在炎症诱导下形成通透性亢进的新生血管的疾病。糖尿病性视网膜病是持续的高血糖损伤了视网膜的毛细血管并使其变脆弱、形成部分变为瘤状的异常结构的血管的疾病。此外，在发生血栓、毛细血管堵塞时，会形成新血管，但该新生血管脆，通透性亢进，发生出血而导致失明。糖尿病性肾病是由于血糖值上升而损伤了肾小球的毛细血管、诱导形成通透性亢进的新生血管、肾小球的过滤功能丧失、重要的血清蛋白等进入尿中的疾病。动脉硬化是胆甾醇等在血管中蓄积、形成粥样硬化灶而使血管内腔变窄、导致血流减少的疾病。该粥样硬化灶中，异常结构的血管增生，加剧了硬化灶的增大。慢性闭塞性动脉硬化是由于四肢的大血管缓慢变狭窄而导致血流减少、呈低氧状态而诱导形成通透性亢进的新生血管、引起浮肿、炎症的疾病。血栓闭塞性脉管炎也被称为Burger's disease、特发性坏疽，原因尚不明确，是末梢动脉炎症诱导血管腔狭窄、引起血流障碍的疾病。受损的动脉内腔的内皮细胞由于周围的严重炎症而在动脉内膜形成异常形态、通透性亢进的新生血管。肺纤维化是由于间质性肺炎而使肺的炎症部位纤维化的疾病，在急性期，由于炎症细胞向肺间质的浸润而伴有通透性亢进的新生血管的增生。脑梗塞是由于脑血管塞栓而使血流降低、诱导神经细胞的细胞凋亡的疾病，是在因脑缺血而表达亢进的血管内皮生长因子(VEGF)等作用下，形成通透性亢进的新生血管且既有血管的通透性也亢进，从而诱导致命的脑浮肿的疾病。同样地，重症感染是由于炎症性细胞因子的表达亢进，形成通透性亢进的新生血管且既有的血管的通透性也亢进，从部分脏器～全身血管出血，产生致死性浮肿的疾病。同样地，心力衰竭是由于全身的血流降低状态而产生低氧状态，形成通透性亢进的新生血管，且既有的血管的通透性也亢进，引起胸水、肝充血、消化道浮肿、肺充血的疾病。
作为与本发明的药剂递送促进剂组合使用的治疗药，可以适当使用上述例示的各疾病的治疗药。具体而言，可以列举例如癌症治疗药、抗炎药、精神神经系统药剂、感官系统药剂、循环系统药剂、呼吸系统药剂、消化系统药剂、内分泌代谢系统药剂、肾脏·泌尿系统药剂、维生素·营养·输液·电解质制剂、血液用药·血液制剂、免疫抑制剂、镇痛药、抗过敏药、抗生素、抗菌剂、抗病毒药等。本发明中，将药剂递送促进剂和伴有血管形成异常的疾病的治疗药组合使用是指本发明的药剂递送促进剂的施用时期与上述治疗药的施用时期重叠，而不是必须同时给药。
〔药物组合物〕
本发明提供用于治疗伴有血管形成异常的疾病的药物组合物，其含有活化溶血磷脂受体的物质作为有效成分。上述本发明的药剂递送促进剂优选以药品方式来实施。本发明的药物组合物可以单独使用，也可以与用于治疗伴有血管形成异常的疾病的其它药剂组合使用。活化溶血磷脂受体的物质并非仅限于溶血磷脂，也可以适当使用溶血磷脂的衍生物、溶血磷脂的前体或它们的衍生物等作为有效成分。进而，还可以适当使用除这些以外的溶血磷脂受体激动剂(例如低分子化合物、核酸、肽、蛋白质、抗体等)作为有效成分。作为公知的溶血磷脂受体激动剂，可以列举例如Wong等的论文(Assay Drug DevTechnol.2010Aug；8(4):459-70.doi:10.1089/adt.2009.0261.)中记载的LPA4受体激动剂等。优选溶血磷脂或其前体、或者它们的衍生物。
本发明的药物组合物的有效成分、即活化溶血磷脂受体的物质具有选自肿瘤增殖抑制作用、癌转移抑制作用、肿瘤免疫增强作用及抑制血管通透性亢进的作用中的1种以上作用，因此本发明的药物组合物可以适合单独作为用于治疗伴有血管形成异常的疾病的药物组合物使用。此外，本发明的药物组合物具有使血管通透性正常化的作用，因此，在与用于治疗伴有血管形成异常的疾病的其它药剂组合使用时，可以促进其它药剂向疾病部位的递送。作为治疗对象的伴有血管形成异常的疾病如上所述，可以列举例如实体癌、老年性黄斑变性、风湿性关节炎、银屑病、硬皮病、系统性红斑狼疮、脉管炎综合征、血管白塞病、糖尿病性视网膜病、糖尿病性肾病、动脉硬化、慢性闭塞性动脉硬化、血栓闭塞性脉管炎、肺纤维化、脑梗塞、重症感染、心力衰竭等，但不限于这些。
本发明的药物组合物以活化溶血磷脂受体的物质为有效成分，可以按照作为药物制剂的制造方法而公知的方法(例如，日本药局方中记载的方法等)适当配合药学上可接受的载体或添加剂并制剂化。具体而言，可以列举例如片剂(包括糖衣片、膜包衣片、舌下片、口腔内崩解片、颊部含片等)、丸剂、散剂、颗粒剂、胶囊剂(包括软胶囊剂、硬胶囊剂)、锭剂、糖浆剂、液剂、乳剂、悬浮剂、控释制剂(例如速释制剂、缓释制剂、缓释性微胶囊剂等)、气雾剂、薄膜剂(例如口腔内崩解膜、口腔粘膜贴膜等)、注射剂(例如皮下注射、静脉内注射剂、肌内注射剂、腹膜内注射等)、点滴剂、透皮制剂、软膏剂、洗剂、贴剂、栓剂(例如直肠栓剂、阴道栓剂等)、颗粒剂、经鼻剂、经肺剂(吸入剂)、滴眼剂等经口剂或非经口剂。关于载体或添加剂的配合比例，可以基于药物领域中通常采用的范围适当设定。对可配合的载体或添加剂没有特别限制，可以列举例如水、生理盐水、其它水性溶剂、水性或油性基剂等各种载体；赋形剂、结合剂、pH调整剂、崩解剂、吸收促进剂、润滑剂、着色剂、矫味剂剂、香料等各种添加剂。
作为可混合于片剂、胶囊剂等中的添加剂，可以使用例如明胶、玉米淀粉、黄蓍胶、阿拉伯胶之类的结合剂，结晶性纤维素之类的赋形剂，玉米淀粉、明胶、藻酸等之类的溶胀剂，硬脂酸镁之类的润滑剂，蔗糖、乳糖或糖精之类的甜味剂，薄荷油、白株树油(gaultheria adenothrix oil)或樱桃味之类的香味剂等。在单元剂型为胶囊时，上述类型的材料中还可以含有油脂之类的液状载体。用于注射的无菌组合物可以按照通常的制剂化步骤(例如将有效成分溶解或悬浮于注射用水、天然植物油等溶剂等)来制备。作为注射用的水性液，使用例如生理盐水、葡萄糖、含有其它辅助剂的等渗液(例如D-山梨醇、D-甘露醇、氯化钠等)等，还可以与合适的溶解助剂例如醇(乙醇等)、多元醇(丙二醇、聚乙二醇等)、非离子性表面活性剂(聚山梨酯80TM、HCO-50等)等组合使用。作为油性液，可以使用例如芝麻油、大豆油等，还可以与作为溶解助剂的苯甲酸苄酯、苄醇等组合使用。此外，还可以配合缓冲剂(例如磷酸盐缓冲液、乙酸钠缓冲液等)、抚慰剂(例如苯扎氯铵、盐酸普鲁卡因等)、稳定剂(例如人血清白蛋白、聚乙二醇等)、保存剂(例如苄醇、苯酚等)、抗氧化剂等。
作为本发明的药物组合物的有效成分的溶血磷脂或其前体是生物体中存在的成分，因此本发明的药物组合物对人和其它哺乳动物(例如大鼠、小鼠、兔、绵羊、猪、牛、猫、狗、猴等)毒性低，可以安全地给药。
就本发明的药物组合物而言，虽然会根据剂型、给药方法、载体等而有所不同，但在有效成分为溶血磷脂或其衍生物时，可以以相对于制剂总量通常为0.01～100％(w/w)、优选0.1～95％(w/w)的比例添加有效成分并按照常规方法来制造。
给药量根据给药对象、症状、给药途径等存在差异，在经口给药时，通常，例如对于体重为约60kg的人而言，每1天为约0.01～1000mg、优选约0.1～100mg、更优选约0.5～500mg。
非经口给药时，1次的给药量根据患者的状态、症状、给药方法等不同，例如，就注射剂而言，例如通常每1kg体重静脉给药约0.01～100mg、优选约0.01～50mg、更优选约0.01～20mg。每1天的总给药量可以是单次的给药量，也可以是分次给药量。
本发明的药物组合物优选与用于治疗伴有血管形成异常的疾病的其它药剂组合使用。对用于治疗伴有血管形成异常的疾病的其它药剂没有特别限定，可以适当使用例如在上述例示的伴有血管形成异常的疾病的治疗中一直使用的公知药剂。具体而言，可以列举例如癌症治疗药、抗炎药、精神神经系统药剂、感官系统药剂、循环系统药剂、呼吸系统药剂、消化系统药剂、内分泌代谢系统药剂、肾脏·泌尿系统药剂、维生素·营养·输液·电解质制剂、血液用药·血液制剂、免疫抑制剂、镇痛药、抗过敏药、抗生素、抗菌剂、抗病毒药等。其中，更优选与癌症治疗药组合用于实体癌的治疗、抑制转移。通过将本发明的药物组合物与其它药剂组合使用，能够促进其它药剂向伴有血管形成异常的疾病部位的递送，因此能够降低药剂的使用量。其结果是，能够减轻其它药剂所引起的副作用。此外，药剂使用量的降低也符合削减医疗费用等社会性需求。
对与本发明的药物组合物组合使用的癌症治疗药没有特别限定，例如优选为化学治疗剂、免疫治疗剂或激素治疗剂。这些癌症治疗药可以是脂质体制剂。此外，这些癌症治疗药也可以是核酸药、抗体药。
对化学治疗剂没有特别限定，可以列举例如氮芥、盐酸氮芥-N-氧化物、苯丁酸氮芥、环磷酰胺、异环磷酰胺、塞替派、卡波醌、甲苯磺酸英丙舒凡、白消安、盐酸尼莫司汀、二溴甘露醇、抗瘤氨酸、达卡巴嗪、雷莫司汀、雌莫司汀磷酸钠、三乙烯三聚氰胺、卡莫司汀、洛莫司汀、链佐星、哌泊溴烷、依托格鲁、卡铂、顺铂、米铂、奈达铂、奥沙利铂、六甲蜜胺、氨莫司汀、二溴螺氯铵、福莫司汀、泼尼莫司汀、嘌嘧替派、立复汀、替莫唑胺、苏消安、氯乙环磷酰胺、净司他丁斯酯、地址素、半胱胺亚硝脲、比折来新等烷化剂；例如巯基嘌呤、6-巯基嘌呤核苷、硫代肌苷、氨甲蝶呤、培美曲塞、依诺他滨、阿糖胞苷、阿糖胞苷十八烷基磷酸钠、安西他滨盐酸盐、5-FU系药剂(例如氟尿嘧啶、替加氟、UFT、去氧氟尿苷、卡莫氟、加洛他滨、乙嘧替氟、卡培他滨等)、甲氨喋呤、奈拉滨、甲胺四氢叶酸钙、Tabloid、甘氨硫嘌呤、亚叶酸钙、左亚叶酸钙、克拉屈滨、乙嘧替氟、氟达拉滨、吉西他滨、硫酸羟基脲、喷司他丁、吡曲克辛、碘苷、丙双脒腙、噻唑呋林、氨莫司汀、苯达莫司汀等代谢拮抗剂；例如放线菌素D、放线菌素C、丝裂霉素C、色霉素A3、博来霉素盐酸盐、硫酸博来霉素、硫酸派来霉素、柔红霉素盐酸盐、盐酸阿霉素、盐酸阿柔比星、盐酸吡柔比星、表柔比星盐酸盐、新制癌菌素、光辉霉素、肉瘤霉素、嗜癌素、米托坦、盐酸佐柔比星、盐酸米托蒽醌、伊达比星盐酸盐等抗肿瘤抗生素等；例如依托泊苷、磷酸依托泊苷、硫酸长春碱、硫酸长春新碱、长春地辛硫酸盐、替尼泊苷、紫杉醇、多西紫杉醇、长春瑞滨、伊立替康、伊立替康盐酸盐等来自植物的抗癌剂等。
对免疫治疗剂没有特别限定，可以列举例如溶链菌、云芝多糖、西佐糖、蘑菇多糖、乌苯美司、干扰素、白介素、巨噬细胞集落刺激因子、粒细胞集落刺激因子、红细胞生成素、淋巴毒素、BCG疫苗、短小棒状杆菌、左旋咪唑、多糖K、苯咪唑丙酸、伊匹单抗、尼鲁单抗、雷莫芦单抗、奥法木单抗、帕尼单抗、帕母单抗、obinutuzumab、曲妥单抗-Emutanshin、托珠单抗、贝伐单抗、曲妥单抗、西妥昔单抗(Siltuximab)、西妥昔单抗(Cetuximab)、英夫利昔单抗、如利妥昔单抗等。
对激素治疗剂没有特别限定，可以列举例如磷雌酚、己烯雌酚、泰舒、醋酸甲羟孕酮、醋酸甲地孕酮、醋酸氯地孕酮、醋酸环丙孕酮、达那唑、烯丙雌醇、孕三烯酮、甲帕霉素、雷洛昔芬、奥美昔芬、左美洛昔芬、抗雌激素(例如他莫昔芬柠檬酸盐、枸橼酸托瑞米芬等)、避孕药、环戊缩环硫雄烷、睾内酯(テストロラクトン)、氨鲁米特、LH-RH激动剂(例如戈舍瑞林乙酸酯、布舍瑞林、亮丙瑞林等)、屈洛昔芬、环硫雄醇、炔雌醇磺酸酯、芳香酶抑制剂(例如盐酸法倔唑、阿那曲唑、来曲唑、依西美坦、伏氯唑、福美坦等)、抗雄激素(例如氟他胺、比卡鲁胺、尼鲁米特等)、5α-还原酶抑制剂(例如非那雄胺、爱普列特等)、肾上腺皮质激素系药物(如地塞米松、泼尼松龙、倍他米松、曲安西龙等)、雄激素合成抑制剂(例如阿比特龙等)等。
在将本发明的药物组合物和用于治疗伴有血管形成异常的疾病的其它药剂组合使用时，既可以将它们同时给药于给药对象，也可以间隔时间差地给药于给药对象。本发明中“组合使用的”是指本发明的药剂递送促进剂的施用时期与上述治疗药的施用时期重叠，而不是必须同时给药。用于治疗伴有血管形成异常的疾病的其它药剂的给药量可以以临床上使用的给药量为基准并根据给药对象、给药对象的年龄及体重、症状、给药时间、剂形、给药方法、组合等适当选择。
〔筛选方法〕
本发明提供伴有血管形成异常的疾病的治疗药的筛选方法。本发明的筛选方法的特征在于，选择使疾病部位的血管内皮细胞中特异性表达的溶血磷脂受体活化的物质(溶血磷脂受体激动剂)。
作为溶血磷脂受体，可以列举例如溶血磷脂酸受体(LPAR)、溶血磷脂酰丝氨酸受体(LPSR)、溶血磷脂酰胆碱受体(LPCR)、溶血磷脂酰乙醇胺受体(LPER)、溶血磷脂酰肌醇受体(LPIR)、溶血磷脂酰甘油受体(LPGR)、鞘氨醇-1-磷酸受体(S1PR)、鞘氨醇磷酸胆碱受体(SPCR)、血小板活化因子受体(PAFR)等，但不限于这些。其中优选溶血磷脂酸受体(LPAR)。
对在疾病部位的血管内皮细胞中特异性表达的溶血磷脂受体没有特别限定，包括今后发现的溶血磷脂受体，只要是在疾病部位的血管内皮细胞中特异性表达的溶血磷脂受体则均可以优选作为本发明的筛选方法的靶标来使用。例如，本发明人们发现LPAR4及LPAR6在小鼠的肿瘤组织的血管内皮细胞中特异性表达(参照实施例10)，确认特别优选以LPAR4为靶标(参照实施例11)。因此，本发明的筛选方法优选使用与小鼠的LPAR4及LPAR6相对应的人LPAR。
本发明的筛选方法例如可以通过包含如下步骤的方法来实施：使受试物质和在伴有血管形成异常的疾病部位的血管内皮细胞中特异性表达的溶血磷脂受体接触的步骤、测定溶血磷脂受体的活化状态的步骤、和选择使溶血磷脂受体活化的受试物质的步骤。通过本发明的筛选方法选出的物质作为上述本发明的药剂递送促进剂的有效成分是有用的。此外，通过本发明的筛选方法选出的物质作为上述本发明的用于治疗伴有血管形成异常的疾病的药物组合物的有效成分是有用的。
本发明还包括以下的各发明。
一种药剂递送促进方法，其特征在于，其为促进伴有血管形成异常的疾病的治疗药向疾病部位的递送的方法，对哺乳动物给药有效量的溶血磷脂或其前体、或者它们的衍生物，进而给药有效量的伴有血管形成异常的疾病的治疗药。
一种伴有血管形成异常的疾病的治疗方法，其特征在于，对哺乳动物给药有效量的溶血磷脂或其前体、或者它们的衍生物，进而给药有效量的伴有血管形成异常的疾病的治疗药。
一种实体癌的治疗方法，其特征在于，对哺乳动物给药有效量的溶血磷脂或其前体、或者它们的衍生物。
一种抑制癌转移的方法，其特征在于，对哺乳动物给药有效量的溶血磷脂或其前体、或者它们的衍生物。
一种溶血磷脂或其前体、或者它们的衍生物，用于促进伴有血管形成异常的疾病的治疗药向疾病部位的递送。
一种溶血磷脂或其前体、或者它们的衍生物，用于伴有血管形成异常的疾病的治疗。
一种溶血磷脂或其前体、或者它们的衍生物，用于实体癌的治疗。
一种溶血磷脂或其前体、或者它们的衍生物，用于抑制癌转移。
溶血磷脂或其前体、或者它们的衍生物在制造药剂递送促进剂中的应用，所述药剂递送促进剂用于促进伴有血管形成异常的疾病的治疗药向疾病部位的递送。
溶血磷脂或其前体、或者它们的衍生物在制造伴有血管形成异常的疾病的治疗药中的应用。
溶血磷脂或其前体、或者它们的衍生物在制造实体癌的治疗药中的应用。
溶血磷脂或其前体、或者它们的衍生物在制造癌转移抑制药中的应用。
实施例
以下通过实施例更详细地说明本发明，但本发明不受这些实施例的限定。需要说明的是，只要没有特别声明，则％表示质量％。
〔实施例1：由溶血磷脂酸(以下称为“LPA”)的给药引起的肿瘤血管的结构变化〕
将小鼠癌细胞株移植到小鼠皮下使其形成肿瘤后给药LPA，观察LPA对血管诱导了何种结构变化。
(1)实验方法
使用Lewis肺癌细胞株(以下称为“LLC细胞”)作为小鼠癌细胞株。在8周龄的C57BL/6NCrSlc小鼠(♀、SLC公司)的皮下注射LLC细胞(1×106个/100μL·PBS/只)。
使用18:1LPA(Avanti POLAR LIPIDS公司)作为LPA。用50％乙醇制备10mM的LPA储备溶液，在-30℃下保存。使用时解冻，用超声波清洗机(SND公司)微细化(細分化)1分钟后，在使用时用PBS制备3mg/kg/100μL的给药用LPA溶液。
在LLC细胞移植后第9天，选择肿瘤体积(长径×短径×高度×0.5)达到60～80mm3的小鼠供于试验。设置对照组、LPA/6小时组、LPA/12小时组及LPA/24小时组这4组，每1组使用3只小鼠。分组后，对LPA组的小鼠以3mg/kg/100μL的用量腹腔内给药LPA。在LPA给药前(对照组)和LPA给药6、12、24小时后从小鼠摘除肿瘤。将摘除的肿瘤浸渍于4％多聚甲醛(PFA)/PBS，4℃振荡一晚进行固定。固定结束后，用冷PBS(4℃)洗涤肿瘤。洗涤进行6小时，每30分钟更换新的PBS。然后，将肿瘤浸渍于15％蔗糖/PBS，4℃振荡3小时。然后浸渍于30％蔗糖/PBS，4℃振荡3小时。然后，将肿瘤包埋于O.C.T.Compound(Tissue-Tek公司)，在-80℃冷冻3天以上。
将用O.C.T.Compound包埋的肿瘤在低温恒温器(LEICA公司)中切成厚度40μm的切片。将切片放在载玻片上，在干燥器中风干2小时。将切片的周围用LIQUID BLOCKER包围后，将载玻片设置在载玻片染色缸中，用PBS在室温下洗涤10分钟，从而将O.C.T.Compound洗去。用4％PFA/PBS在室温下固定10分钟后，用PBS在室温下洗涤10分钟。将封闭液(5％normal goat serum/1％BSA/2％skim milk/PBS)滴加到切片上，在室温下封闭20分钟。使用抗小鼠CD31抗体Purified Hamster Anti-PECAM-1(MILLIPORE公司：MAB1398Z)作为一抗，用封闭液稀释200倍后滴加到切片上，在4℃反应一晚。用含有Tween20的PBS(PBST)洗涤10分钟，进行5次该洗涤，进一步用PBS洗涤10分钟。使用Alexa Fluor 488Goat Anti-Hamster IgG(Jackson ImmunoResearch Labolatories公司)作为二抗，用封闭液稀释400倍后滴加到切片上遮光反应2小时。用PBST洗涤10分钟，进行5次该洗涤，滴加数滴Vectashild(Vector Laboratories Inc.公司)，用盖玻片密封。用共聚焦激光显微镜(LEICA公司)观察、拍照。此外，用AngioTool血管结构分析软件从拍摄的照片中测定1根血管的长度。
(2)结果
将结果示于图1。(A)为用共聚焦激光显微镜观察标本的照片，血管内皮细胞被染成绿色荧光，在照片中描绘为白色。(B)为表示用AngioTool血管结构分析软件算出的各组的平均血管长度的图。如图1的(A)所示，LPA给药前的肿瘤血管(对照)的网状结构稀疏、血管不连续，6小时后观察到血管连接的状态，12小时、24小时后观察到与正常组织同样的血管网状结构。如图1的(B)所示，将通过给药LPA从而各条血管的长度变长以数值形式来示出。该结果显示，LPA给药后，在短时间内诱导了肿瘤血管的网络构建。因此，难以认为由LPA引起的肿瘤血管的网络构建是基于血管内皮细胞的增殖的，我们认为是基于血管内皮细胞的伸长/粘附/管腔形成。需要说明的是，虽然未示出结果，但在使用LLC细胞以外的colon26大肠癌细胞、B16黑色素瘤细胞作为癌细胞株的实验中也得到了同样的结果。
〔实施例2：由鞘氨醇-1-磷酸(以下称为“S1P”)的给药引起的肿瘤血管的结构变化〕
使用LPA以外的溶血磷脂S1P，观察是否与LPA同样地诱导肿瘤血管的网络构建。
(1)实验方法
通过与实施例1同样的方法在8周龄的C57BL/6NCrSlc小鼠(♀、SLC公司)的皮下移植LLC细胞。将S1P(Avanti POLAR LIPIDS公司)用PBS制备为10mM，将其作为储备溶液，在-30℃下保存。使用时解冻，用超声波清洗机(SND公司)微细化1分钟后，在使用时用PBS制备0.3mg/kg/100μL的给药用S1P溶液。
将LLC细胞移植后第9天的小鼠(肿瘤体积达到、60～80mm3的个体)供于实验，分成对照组和S1P组这两组(n＝3)。从分组当天起，连续3天对S1P组的小鼠以0.3mg/kg/100μL的用量、每天1次尾静脉内给药S1P。对于对照组的小鼠，给药PBS(100μL)来代替S1P。最终给药24小时后，从小鼠摘除肿瘤，通过与实施例1同样的方法制作肿瘤血管的组织标本。用共聚焦激光显微镜(LEICA公司)观察、拍照。
(2)结果
将结果示于图2。明确了：与给药LPA时同样，在给药S1P时也诱导肿瘤血管的网络构建。由该结果明确了：能够诱导肿瘤血管的网络构建而使其正常化的物质不仅限于LPA，使用其它溶血磷脂也具有相同效果。
〔实施例3：LPA给药后的肿瘤血管内腔的结构变化〕
(1)实验方法
通过与实施例1同样的方法在8周龄的C57BL/6NCrSlc小鼠(♀、SLC公司)的皮下移植LLC细胞。此外，通过与实施例1同样的方法制备给药用LPA。将LLC细胞移植后第9天的小鼠(肿瘤体积达到60～80mm3的个体)供于实验，分成对照组和LPA组这2组(n＝3)。分组后，腹腔内给药LPA(3mg/kg/100μL)或PBS(100μL)。在给药LPA或PBS 24小时后，在戊巴比妥(共立制药株式会社)麻醉下，对小鼠进行灌流固定。使用含有2％甲醛及2.5％戊二醛的0.1M磷酸缓冲液(pH7.4)作为固定液。灌流固定后，摘除肿瘤，浸渍在与灌流中使用的液体相同的固定液中，在4℃振荡一晚。进一步浸渍在含有1％四氧化锇及0.5％铁氰化钾的0.1M磷酸缓冲液(pH7.4)中进行固定。用浓度逐级上升的乙醇脱水，置换为叔丁醇，进行冷冻干燥。冷冻干燥后，蒸镀四氧化锇，用日立高新技术公司制扫描电子显微镜S-4800观察血管内腔面。
(2)结果
将结果示于图3。由图3可以明确，在对照组的血管内腔面观察到丝状伪足伸长样的异常结构，LPA给药后的血管内腔则观察到非常平滑的结构。根据该结果可预测，通过给药LPA，改善了肿瘤内的血液循环。
〔实施例4：LPA给药后，药剂从肿瘤血管向肿瘤组织递送的改善〕
一直以来众所周知的是，肿瘤内的血流缺乏，而且血管通透性处于过度亢进状态。因此，最终使肿瘤间质压增大、肿瘤间质内与血管内的渗透压差消失，物质难以从血管内腔向肿瘤组织内移动。由于已经明确了LPA给药后，密集地构建了肿瘤内的血管网，血管内腔也变得平滑，因此预测LPA给药后的肿瘤血管的药剂通透性得到改善。因此，为了确认LPA给药后肿瘤中的药剂通透性，进行了以下实验。
(1)实验方法
通过与实施例1同样的方法在8周龄的C57BL/6NCrSlc小鼠(♀、SLC公司)的皮下移植LLC细胞。此外，通过与实施例1同样的方法制备给药用的LPA。在LLC细胞移植后第11天，选择肿瘤体积达到100～120mm3的小鼠，分成对照组和LPA组这2组(n＝3)。分组后，腹腔内给药LPA(3mg/kg/100μL)或PBS(100μL)。在LPA或PBS给药24小时后，在戊巴比妥麻醉下，以1.5mg/kg的用量对小鼠尾静脉内给药阿霉素(阿霉素盐酸盐、日本化药株式会社)。将阿霉素溶解于生理盐水(大塚制药株式会社)，稀释为1.5mg/kg后，用超声波清洗机微细化1分钟，然后给药。需要说明的是，阿霉素是可发出荧光的抗癌剂，是能够以激发波长480nm、测定波长575nm来观察的化合物。阿霉素给药20分钟后，从小鼠摘除肿瘤，将切片的厚度变更为20μm，除此以外，通过与实施例1同样的方法制作肿瘤的组织标本。用共聚焦激光显微镜(LEICA公司)观察、拍照。
(2)结果
将结果示于图4。图4中，箭头表示阿霉素的红色荧光信号。血管内皮细胞由于抗CD31抗体而发出绿色荧光。由图4可明确，对照中几乎观察不到阿霉素的肿瘤内迁移，而在给药LPA后的肿瘤中，观察到阿霉素从血管内递送到肿瘤深处。
〔实施例5：由LPA引起的肿瘤血管的正常化与不同分子量的药剂递送的关系〕
已观察到通过给药溶血磷脂而使肿瘤血管正常化、从而改善了抗癌剂的递送性，对于该药剂递送，使用70kDa葡聚糖和2000kDa葡聚糖这2种葡聚糖，分析递送性的改善是否与低分子量、高分子量的差异无关。
(1)实验方法
通过与实施例1同样的方法在8周龄的C57BL/6NCrSlc小鼠(♀、SLC公司)的皮下移植LLC细胞。此外，通过与实施例1同样的方法制备给药用的LPA。在LLC细胞移植后第11天，选择肿瘤体积达到100～120mm3的小鼠，分成70kDa葡聚糖给药的对照组和LPA组、及2000kDa葡聚糖给药的对照组和LPA组共4组(n＝3)。分组后，腹腔内给药LPA(3mg/kg/100μL)或PBS(100μL)。在LPA或PBS给药24小时后，在戊巴比妥麻醉下尾静脉内给药各葡聚糖。葡聚糖(70kDa及2000kDa)使用的是FITC标记葡聚糖(SIGMA公司)。任一葡聚糖均溶解于PBS，稀释为5mg/mL，给药100μL。葡聚糖给药30分钟后，从小鼠摘除肿瘤，通过与实施例4相同的方法制作肿瘤的组织标本。用共聚焦激光显微镜(LEICA公司)观察、拍照。
(2)结果
将结果示于图5。在70kDa葡聚糖及2000kDa葡聚糖任一种中，对照组均几乎观察不到肿瘤内迁移，LPA给药组均观察到递送到肿瘤深处。根据该结果，我们认为：通过给药LPA，肿瘤血管的通透性得以正常化，从而不仅低分子化合物，连高分子化合物(例如核酸、抗体等)也能够递送到肿瘤深处。
〔实施例6：通过LPA和抗癌剂的组合使用治疗癌症的研究〕
已经表明通过给药LPA能够将抗癌剂高效率地递送到肿瘤深处，因此尝试通过LPA和抗癌剂的组合使用来治疗癌症。
6-1针对LLC细胞的、LPA和5-FU的组合使用效果
(1)实验方法
通过与实施例1同样的方法在8周龄的C57BL/6NCrSlc小鼠的皮下移植LLC细胞。此外，通过与实施例1同样的方法制备给药用的LPA。使用5-FU(协和发酵麒麟公司)作为抗癌剂。5-FU的制备中使用了生理盐水(大塚制药株式会社)。在LLC细胞移植后第7天，选择肿瘤体积达到30～50mm3的小鼠，供于试验。设置对照组、5-FU组、LPA组及5-FU/LPA组这4组(n＝3)。分组后，腹腔内给药LPA(3mg/kg/100μL)或5-FU(100mg/kg/100μL)或PBS(100μL)。对5-FU/LPA组腹腔内给药LPA和5-FU这两者。对于LPA或PBS，每天1次，连续给药7天。对于5-FU，每周1次，共给药2次(移植后第7天和第14天)。给药开始后经时测定肿瘤尺寸。肿瘤体积通过长径×短径×高度×0.5来计算。将从给药起2周后的小鼠在戊巴比妥麻醉下用数码相机拍照。此外，摘除肿瘤，数码相机拍照。
(2)结果
将结果示于图6。(A)为示出各组的肿瘤体积的经时变化的图，(B)为各组的代表性的小鼠的外观的照片，(C)为从各组的代表性的小鼠摘除的肿瘤的照片。由图6可明确，与5-FU单独给药时相比，5-FU和LPA的组合给药显著抑制了肿瘤的增大。LPA单独给药时，观察到肿瘤发红、血流增加。此外显示，即使在LPA单独给药时，与对照相比，也抑制了肿瘤的增大。
6-2针对黑色素瘤细胞的、LPA和5-FU的组合使用效果
(1)实验方法
使用来自小鼠黑色素瘤的细胞株B16-BL6细胞。在8周龄的C57BL/6NCrSlc小鼠的皮下注射B16-BL6细胞(1×106个/100μL·PBS/只)。在LLC细胞移植后第7天，选择肿瘤体积达到30～50mm3的小鼠，供于试验。此后的实验方法与上述6-1相同。
(2)实验结果
将结果示于图7。(A)为示出各组的肿瘤体积的经时变化的图，(B)为各组的代表性的小鼠的照片。由图7可明确，与5-FU单独给药时相比，5-FU和LPA的组合给药显著抑制了肿瘤的增大。此外显示，即使在LPA单独给药时，与对照相比，也抑制了肿瘤的增大。
6-3针对大肠癌细胞的、LPA和5-FU的组合使用效果
(1)实验方法
使用小鼠大肠癌细胞株colon26细胞。在8周龄的BALB/c小鼠(♀、SLC公司)的皮下注射colon26细胞(1×106个/100μL·PBS/只)。在LLC细胞移植后第7天，选择肿瘤体积达到30～50mm3的小鼠，供于试验。此后的实验方法与上述6-1相同。
(2)实验结果
将各组的肿瘤体积的经时变化结果示于图8。由图8可明确，与5-FU单独给药时相比，5-FU和LPA的组合给药显著抑制了肿瘤的增大。此外显示，截止移植后第17天为止，即使在LPA单独给药时，与对照相比，也抑制了肿瘤的增大。
6-4针对大肠癌细胞的、LPA和奥沙利铂的组合使用效果
(1)实验方法
除了使用奥沙利铂代替5-FU以外，通过与上述6-3相同的方法实施。奥沙利铂(コスモバイオ株式会社)的制备中使用了生理盐水(大塚制药株式会社)，腹腔内给药1.5mg/kg/100μL。
(2)结果
将各组的肿瘤体积的经时变化的结果示于图9。由图9可明确，与奥沙利铂单独给药时相比，奥沙利铂和LPA的组合给药显著抑制了肿瘤的增大。此外显示，截止至移植后第17天为止，与对照相比，LPA的单独给药抑制了肿瘤的增大。该结果显示，LPA和抗癌剂的组合使用效果并非仅限于使用5-FU作为抗癌剂的情况。
以上表明，LPA对肿瘤血管的效果对所有癌细胞形成的癌症组织均有效。
由于对来自任意细胞的肿瘤，LPA单独给药时均抑制了肿瘤的增大，因此我们认为：利用LPA保持肿瘤血管的通透性的结果是，使得攻击癌细胞而诱导细胞凋亡的自然杀伤细胞、CD8阳性T细胞等免疫细胞能够向肿瘤组织内浸润。此外还认为，还可能诱导有抗肿瘤活性的M1巨噬细胞的优势增加。即，表明通过给药LPA而改善肿瘤血管的血流，从而提高了肿瘤免疫效果。
〔实施例7：通过LPA给药进行的血管内皮细胞间粘附的诱导〕
实施例3中，LPA给药组中，肿瘤血管内腔面变成平滑、无间隙的状态，因此我们认为，LPA给药组中血管内皮细胞间的粘附有可能变牢固。因此，对LPA给药后的肿瘤血管中的、作为诱导血管内皮细胞的细胞间粘附的分子之一的VE-钙粘蛋白的表达进行了分析。
(1)实验方法
通过与实施例1同样的方法在8周龄的C57BL/6NCrSlc小鼠(♀、SLC公司)的皮下移植LLC细胞。此外，通过与实施例1同样的方法制备给药用的LPA。将LLC细胞移植后第9天的小鼠(肿瘤体积达到、60～80mm3的个体)供于实验，分成对照组和LPA组这2组(n＝3)。分组后，对LPA组的小鼠以3mg/kg/100μL的用量腹腔内给药LPA。对照组在分组后摘除肿瘤，LPA组在LPA给药24小时后摘除肿瘤。除改变了一抗及二抗以外，通过与实施例1同样的方法制作肿瘤的免疫染色组织标本。关于一抗，将抗小鼠VE-钙粘蛋白抗体Purified Goat anti-mouse VE-cadherin(BD pharmigen公司)用封闭液稀释200倍后使用。关于2次抗体，将Alexa Fluor 488Goat Anti-Rat IgG(Life technologies公司)用封闭液稀释400倍后使用。将制作的标本用共聚焦激光显微镜(LEICA公司)观察、拍照。此外，利用共聚焦激光显微镜获取Z轴堆叠图像，对VE-钙粘蛋白表达量(荧光强度)进行分析。
(2)结果
将结果示于图10。(A)为用共聚焦激光显微镜观察标本的照片，VE-钙粘蛋白被染成绿色荧光，在照片中描绘为白色。(B)为示出沿着(A)的照片的倾斜白线部分获取Z轴堆叠图像、对VE-钙粘蛋白表达量(荧光强度)进行分析的结果的图。由(A)中的下方的照片观察到：在LPA组中，VE-钙粘蛋白聚集在细胞与细胞的粘附面。另一方面观察到：在对照组中，VE-钙粘蛋白在细胞内的表达弱。观察(B)的Z轴堆叠图，也显示：在LPA给药组中，细胞膜部分的荧光强度高，细胞膜中大量表达VE-钙粘蛋白。根据该结果可明确：LPA诱导了负责血管内皮细胞彼此粘附的VE-钙粘蛋白向细胞膜的迁移，使血管内皮细胞彼此粘附。
〔实施例8：由LPA衍生物诱导的血管内皮细胞间粘附]
上述实施例7中已经明确了：通过LPA，内皮细胞彼此的粘附性提高，诱导了血管内皮细胞的网络的改善以及血管通透性的改善。因此，使用利用电信号进行分析的方法，对能否通过LPA衍生物VPC31144S(N-{(1S)-2-Hydroxy-1-[(Phosphonooxy)Methyl]Ethyl}(9Z)Octadec-9-enamide)提高内皮细胞彼此的粘附性进行了分析。
(1)实验方法
为了以屏障功能形式来分析LPA及VPC31144S的离体时的血管内皮细胞彼此的细胞粘附，使用实时细胞分析装置ECIS-Zθ(Applied Biophysic公司制)。
LPA及VPC31144S使用Avanti POLAR LIPIDS公司制品。VPC31144S是已知对LPAR4显示激动作用的LPA衍生物。将LPA及VPC31144S分别用50％乙醇制备10mM的LPA储备溶液，在-30℃下保存。使用时解冻，用超声波清洗机(SND公司)微细化1分钟后，用在无血清培养基中加入了0.1％的BSA的培养基制备成10μM。
使用来自小鼠胰脏的血管内皮细胞株(MS-1)作为细胞。用含有5％FBS的DMEM(Sigma)制备细胞悬浮液，以1×105个/400μL/孔的量播种在上述装置专用的带电极孔板(8W10E+、8孔)，在培养箱中培养一晚而达到汇合状态。更换为含有0.1％BSA的无血清培养基并孵育4小时后，更换为含有10μM LPA或VPC31144S的培养基(含有0.1％BSA的无血清培养基)。对照中更换为含有0.1％BSA的无血清培养基。更换培养基后，对作为细胞间隙的电阻指标的Rb进行实时分析，对屏障功能进行评价。
(2)结果
将结果示于图11。图11的X轴表示时间经过、Y轴表示电阻(Rb)。Rb越高则表示细胞间粘附越强。通过添加LPA，与对照相比，电信号变强，表示内皮细胞彼此的屏障功能在长时期内变强。同样也示出：添加VPC31144时，内皮细胞彼此的屏障功能变强。进一步明确了：与添加LPA相比，添加VPC31144时，刚添加后即发挥强屏障功能。根据该结果可明确：不仅LPA，对LPAR4有激动作用的LPA衍生物在伴有血管形成异常的疾病中的通透性改善、血管网的正常化中也是有用的。
〔实施例9：通过LPA给药抑制癌症从原发灶转移的研究〕
迄今为止的报道表明：肿瘤组织的低氧状态可能诱导癌细胞本身的恶性化、使癌细胞的转移浸润更活跃。我们认为，若能改善肿瘤内的血流，则能够在不使肿瘤内氧分压降低的条件下抑制癌症的恶性化。进一步地，我们还认为：通过如上所述地维持内皮细胞彼此的粘附状态，癌细胞向血管内的移动侵入变得困难，也能够抑制转移。因此，使用具有高转移能力的黑色素瘤细胞株(B16-BL6细胞)研究了LPA对癌转移的效果。
(1)实验方法
在8周龄的C57BL/6NCrSlc小鼠(♀、SLC公司)的皮下注射B16-BL6细胞(1×106个/100μL·PBS/只)。在B16-BL6细胞移植后第7天，选择肿瘤体积达到30～50mm3的小鼠，分为对照组和LPA组共2组(n＝3)。分组后，腹腔内给药LPA(3mg/kg/100μL)或PBS(100μL)。关于LPA或PBS，每天1次连续给药至移植后第21天。在B16-BL6细胞移植后第42天，对小鼠实施安乐死，摘除肺。用实体显微镜(LEICA公司)计测摘除的肺中的转移结节数。使用Student’st-test进行统计分析。
(2)结果
将结果示于图12。由图12可明确，与对照组相比，LPA组显著抑制了肺转移(p＜0.01)。根据该结果可确认：由LPA带来的肿瘤血流改善及血管内皮细胞的粘附诱导抑制了癌细胞的恶性化及转移。
〔实施例10：肿瘤组织的血管内皮细胞中的LPA受体的表达分析〕
(1)实验方法
通过与实施例1同样的方法在8周龄的C57BL/6NCrSlc小鼠(♀、SLC公司)的皮下移植LLC细胞，使其形成肿瘤。摘除肿瘤，用FACS Aria(BD Bioscience公司)回收CD45(血液标志)阴性、CD31(血管内皮细胞标志)阳性的血管内皮细胞。用RNAeasy kit(Qiagen公司)由回收的血管内皮细胞(CD45-CD31+)得到总RNA。然后，用ExScript RT reagent Kit(宝生物公司)由总RNA合成cDNA，使用所得到的cDNA通过实时PCR法分析LPA受体(LPAR)1～6的mRNA的表达量。作为对照，测定糖酵解酶中的GAPDH(Glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase)的mRNA表达量。实时PCR使用了Stratagene M×300P(Stratagene公司制)。
实时PCR中使用的引物如下。
LPAR1
5'-CCGCTTCCATTTCCCTATTT-3'(序列编号1)
5'-AAAACCGTGATGTGCCTCTC-3'(序列编号2)
LPAR2
5'-CCATCAAAGGCTGGTTCCT-3'(序列编号3)
5'-TCCAAGTCACAGAGGCAGTG-3'(序列编号4)
LPAR3
5'-TTCCACTTTCCCTTCTACTACCTG-3'(序列编号5)
5'-TCCACAGCAATAACCAGCAA-3'(序列编号6)
LPAR4
5'-GCCCTCTCTGATTTGCTTTT-3'(序列编号7)
5'-TCCTCCTGGTCCTGATGGTA-3'(序列编号8)
LPAR5
5'-AGCGATGAACTGTGGAAGG-3'(序列编号9)
5'-GCAGGAAGATGATGAGATTGG-3'(序列编号10)
LPAR6
5'-TGTGCCCTACAACATCAACC-3'(序列编号11)
5'-TCACTTCTTCTAACCGACCAG-3'(序列编号12)
GAPDH
5'-AACTTTGGCATTGTGGAAGG-3'(序列编号13)
5'-GGATGCAGGGATGATGTTCT-3'(序列编号14)
(2)结果
将结果示于图13。各LPA受体的表达量以相对于GAPDH的表达量的相对值来表示。由图13可明确，肿瘤组织的血管内皮细胞中表达LPAR1、LPAR4及LPAR6，LPAR2、LPAR3及LPAR5的表达量在检测限以下。
〔实施例11：血管内皮细胞株中的LPA受体的表达分析及LPAR4的功能分析〕
(1)LPA受体的表达分析
通过与实施例9相同的方法，从MS-1细胞(来自小鼠胰脏的血管内皮细胞株)回收总RNA，通过实时PCR法对LPA受体(LPAR)1～6的mRNA表达量进行分析。
将结果示于图14。各LPA受体的表达量以相对于GAPDH的表达量的相对值来表示。由图14可明确，MS-1细胞中表达LPAR4及LPAR6，LPAR1、LPAR2、LPAR3及LPAR5的表达量在检测限以下。
(2)LPAR4的功能分析
用lipofectamine2000(invitrogen公司)将LPAR4特异性siRNA(siRNA ID:s95367、life Technologies公司)导入MS-1细胞，敲除LPAR4。将导入了对照siRNA的MS-1细胞作为对照细胞。将对照细胞和LPAR4敲除细胞分别以2.5×105个/2mL播种到包被有I型胶原的玻底培养皿(Iwaki公司)，培养3天至细胞汇合为止。将细胞用PBS洗涤1分钟×3次后，将封闭液(5％normal goat serum/1％BSA/2％skim milk/PBS)滴加到培养皿中，在室温下封闭30分钟。使用Purified Goat anti-mouse VE-cadherin(BD pharmigen公司)作为一抗，在4℃反应一晚。用含有Triton X-100的PBS(PBST)洗涤10分钟，进行3次该洗涤，然后与二抗Alexa Fluor 488goat anti-rat IgG(Molecular Probes公司)在遮光、室温下反应1小时。此后的操作全部在遮光、室温下进行。用PBST洗涤10分钟，进行3次该洗涤后，用TOPRO-3(life Technologies公司)进行核染色，用PBS洗涤10分钟，进行2次该洗涤，滴加数滴Vectashield(Vector Laboratories Inc.公司)，盖上盖玻片，用共聚焦激光显微镜观察及拍摄。
将结果示于图15。将对照细胞(左)培养至汇合时，一边呈铺路石状地与横向的细胞接触一边增殖；而LPAR4敲除细胞(右)虽然在增殖细胞数方面看不到差异，但细胞彼此的粘附变得异常。细胞的形态也不是如对照细胞那样的纺锤形，而是膨涨了的形态。此外明确了，在所到之处，可观察到VE-钙粘蛋白在细胞膜-细胞膜间的缺损(图15右图中白色圆形所包围的部分)，形成了细胞间隙。
〔实施例12：LPA对形成血管通透性亢进的新生血管的疾病的作用〕
由于血管通透性亢进一步观察到疾病恶化的疾病不仅仅是肿瘤，在炎症性疾病、糖尿病性视网膜病、老年性黄斑变性等中也观察到由新生血管的通透性亢进而引起的疾病恶化。因此，LPA是否不仅对肿瘤血管有效，在其它疾病模型中也有新生血管的血管通透性亢进抑制效果呢，我们对此进行了研究。
12-1下肢缺血模型
下肢缺血模型被作为血栓闭塞性脉管炎、慢性闭塞性动脉硬化的疾病模型而使用。即，在将小鼠下肢血管切除时，其血管支配区域发生缺血，进一步通过手术手段引发炎症，结果诱导了血管新生，由于新生血管的通透性亢进，在下肢肌肉部位产生浮肿。就LPA对这样的炎症、缺血所致的新生血管的通透性亢进是否具有抑制效果进行了研究。
(1)实验方法
使用6周龄的C57BL/6NCrSlc小鼠(♀、SLC公司)。在戊巴比妥(共立制药株式会社)麻醉下，将右下肢的鼠蹊部的皮肤切开，将大腿静脉起始部结扎后，将隐动脉隐静脉末端结扎，进一步将其它分枝剥离并与主干一起切除。切除后，将皮肤切开部用灭菌灭菌缝合线(夏目制作所)缝合，从麻醉起静置在37℃恒温器上直至觉醒。觉醒后，对LPA组(n＝3)腹腔内给药LPA(3mg/kg/100μL)，对对照组(n＝3)腹腔内给药PBS(100μL)。给药连续进行3天，每天1次，总计进行3次。最终给药24小时后，测定大腿围的长度。
(2)结果
将结果示于图16。与对照组相比，LPA给药组的大腿围的长度显著变短，可知浮肿受到抑制。
12-2老年性黄斑变性模型
渗出性老年性黄斑变性是起因于脉络膜新生血管的眼病，在发达国家的失明原因中占第1位。脉络膜新生血管与健康血管不同，其血管通透性亢进，血液成分漏出，因此产生视网膜浮肿、视网膜下液，引起视觉功能损伤。现在，临床中应用阻断与脉络膜新生血管的产生、增加有关的VEGF的药剂，还不存在使视觉功能完全恢复的治疗法，期望开发出更加有效的治疗法。因此，就LPA是否能够抑制该脉络膜新生血管的通透性亢进进行了研究。
(1)实验方法
使用8周龄的C57BL/6NCrSlc小鼠(♀、SLC公司)。在戊巴比妥(共立制药株式会社)麻醉下用托品酰胺(参天制药制)滴眼而散瞳，在裂隙灯显微镜下一边观察小鼠眼底一边对两眼的眼底视神经乳头周围的视网膜的4个位置照射激光(Ultima 2000SE)，诱发脉络膜新生血管。激光照射条件设为150mW、0.05秒、75μm。对于LPA组(n＝3)，在激光照射后第5天和第6天腹腔内给药LPA(3mg/kg/100μL)，对于对照组(n＝3)，在激光照射后第5天和第6天腹腔内给药PBS(100μL)。在激光照射后第7天(初次给药LPA后第48小时)，在戊巴比妥麻醉下尾静脉内给药FITC标记70kDa葡聚糖(SIGMA公司)。将葡聚糖溶解于PBS并稀释为5mg/mL，给药50μL。在给药葡聚糖10分钟后，回收眼球。将回收的眼球在4％多聚甲醛(PFA)/PBS中浸渍2小时后，从眼球除去角膜、晶状体、视网膜，制作脉络膜铺片(Flatmount)。然后，用4℃的PBS洗涤。每隔30分钟更换新的PBS从而进行6小时洗涤。然后，加入封闭液(5％normal goatserum/1％BSA/2％skim milk/PBS)，在室温下封闭2小时。关于一抗，使用抗小鼠CD31抗体Purified Hamster Anti-PECAM-1(MILLIPORE公司：MAB1398Z)，用封闭液稀释200倍后滴加到切片上，在4℃反应一晚。用PBST洗涤30分钟，进行6次该洗涤，再用PBS洗涤30分钟。关于二抗，使用Alexa Fluor 488Goat Anti-Hamster IgG(Jackson ImmunoResearchLabolatories公司)，用封闭液稀释400倍后滴加到切片上，遮光反应6小时。用PBST洗涤30分钟，进行6次该洗涤，滴加数滴Vectashild，用盖玻片密封。用共聚焦激光显微镜观察、拍照。
(2)结果
将结果示于图17。上部(CD31)为观察将血管内皮细胞用抗CD31抗体免疫染色的组织标本的照片，血管内皮细胞被染成绿色荧光，照片中描绘为白色。下部(Dextran)为观察从新生血管漏出的葡聚糖的荧光的照片。如上部所示，关于脉络膜新生血管的大小，在LPA组和对照组之间没有显著性差异。另一方面，如下部所示，关于葡聚糖的漏出，LPA组显著抑制了葡聚糖的漏出，明确了LPA具有抑制血管通透性亢进的作用。根据该结果可明确：LPA抑制老年性黄斑变性中的血管通透性，具有改善疾病的效果。
需要说明的是，本发明不受上述各实施方式及实施例限定，可以在权利要求所示的范围内进行各种变更，将分别在不同实施方式中公开的技术特征适当组合而得到的实施方式也包含在本发明的技术范围内。此外，本说明书中记载的学术文献及专利文献全部通过参考方式援引到本说明书中。

Claims (17)

1.一种药剂递送促进剂，用于促进伴有血管形成异常的疾病的治疗药向疾病部位的递送，所述药剂递送促进剂的特征在于，含有使溶血磷脂受体活化的物质作为有效成分，与伴有血管形成异常的疾病的治疗药组合使用。
2.根据权利要求1所述的药剂递送促进剂，其中，使溶血磷脂受体活化的物质为溶血磷脂或其前体、或者它们的衍生物。
3.根据权利要求1或2所述的药剂递送促进剂，其中，伴有血管形成异常的疾病为实体癌、老年性黄斑变性、风湿性关节炎、银屑病、硬皮病、系统性红斑狼疮、脉管炎综合征、血管白塞病、糖尿病性视网膜病、糖尿病性肾病、动脉硬化、慢性闭塞性动脉硬化、血栓闭塞性脉管炎、肺纤维化、脑梗塞、重症感染或心力衰竭。
4.根据权利要求3所述的药剂递送促进剂，其中，伴有血管形成异常的疾病为实体癌、老年性黄斑变性、慢性闭塞性动脉硬化或血栓闭塞性脉管炎。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的药剂递送促进剂，其中，溶血磷脂为选自溶血磷脂酸、溶血磷脂酰丝氨酸、溶血磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰乙醇胺、溶血磷脂酰肌醇、溶血磷脂酰甘油、鞘氨醇-1-磷酸、鞘氨醇磷酸胆碱和血小板活化因子(PAF)中的1种或2种以上。
6.根据权利要求5所述的药剂递送促进剂，其中，溶血磷脂为溶血磷脂酸。
7.一种用于治疗伴有血管形成异常的疾病的药物组合物，其含有使溶血磷脂受体活化的物质作为有效成分。
8.根据权利要求7所述的药物组合物，其中，使溶血磷脂受体活化的物质为溶血磷脂或其前体、或者它们的衍生物。
9.根据权利要求8所述的药物组合物，其具有选自肿瘤增殖抑制作用、癌转移抑制作用、肿瘤免疫增强作用和抑制血管通透性亢进的作用中的1种以上作用。
10.根据权利要求8或9所述的药物组合物，其特征在于，与用于治疗伴有血管形成异常的疾病的其它药剂组合使用。
11.根据权利要求10所述的药物组合物，其中，用于治疗伴有血管形成异常的疾病的其它药剂为癌症治疗药。
12.根据权利要求10或11所述的药物组合物，其用于促进所组合使用的其它药剂向伴有血管形成异常的疾病部位的递送。
13.根据权利要求7～12中任一项所述的药物组合物，其中，伴有血管形成异常的疾病为实体癌、老年性黄斑变性、风湿性关节炎、银屑病、硬皮病、系统性红斑狼疮、脉管炎综合征、血管白塞病、糖尿病性视网膜病、糖尿病性肾病、动脉硬化、慢性闭塞性动脉硬化、血栓闭塞性脉管炎、肺纤维化、脑梗塞、重症感染或心力衰竭。
14.根据权利要求13所述的药物组合物，其中，伴有血管形成异常的疾病为实体癌、老年性黄斑变性、慢性闭塞性动脉硬化或血栓闭塞性脉管炎。
15.根据权利要求7～14中任一项所述的药物组合物，其中，溶血磷脂为选自溶血磷脂酸、溶血磷脂酰丝氨酸、溶血磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰乙醇胺、溶血磷脂酰肌醇、溶血磷脂酰甘油、鞘氨醇-1-磷酸、鞘氨醇磷酸胆碱和血小板活化因子(PAF)中的1种或2种以上。
16.根据权利要求15所述的药物组合物，其中，溶血磷脂为溶血磷脂酸。
17.一种伴有血管形成异常的疾病的治疗药的筛选方法，其特征在于，选择使疾病部位的血管内皮细胞中特异性表达的溶血磷脂受体活化的物质。
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