JP6573329B2 - リゾリン脂質受容体を活性化する物質を含有する薬剤送達促進剤 - Google Patents
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Description
[1]血管形成異常を伴う疾患の治療薬の疾患部位への送達を促進するための薬剤送達促進剤であって、リゾリン脂質受容体を活性化する物質を有効成分として含有し、血管形成異常を伴う疾患の治療薬と組み合わせて使用することを特徴とする薬剤送達促進剤。
[2]リゾリン脂質受容体を活性化する物質がリゾリン脂質もしくはその前駆体、またはそれらの誘導体である前記[1]に記載の薬剤送達促進剤。
[3]血管形成異常を伴う疾患が固形がん、加齢黄斑変性症、関節リウマチ、乾癬、強皮症、全身性エリテマトーデス、血管炎症候群、血管ベーチェット、糖尿病性網膜症、糖尿病性腎症、動脈硬化症、慢性閉塞性動脈硬化症、バージャー病、肺線維症、脳梗塞、重症感染症または心不全である前記[1]または[2]に記載の薬剤送達促進剤。
[4]血管形成異常を伴う疾患が固形がんである前記[3]に記載の薬剤送達促進剤。
[5]リゾリン脂質がリゾホスファチジン酸、リゾホスファチジルセリン、リゾホスファチジルコリン、リゾホスファチジルエタノールアミン、リゾホスファチジルイノシトール、リゾホスファチジルグリセロール、スフィンゴシン−1−リン酸、スフィンゴシルホスホリルコリンおよび血小板活性化因子(PAF)から選択される1種または2種以上である前記[1]〜[4]のいずれかに記載の薬剤送達促進剤。
[6]リゾリン脂質がリゾホスファチジン酸である前記[5]に記載の薬剤送達促進剤。
[7]リゾリン脂質受容体を活性化する物質を有効成分として含有する血管形成異常を伴う疾患の治療用医薬組成物。
[8]リゾリン脂質受容体を活性化する物質がリゾリン脂質もしくはその前駆体、またはそれらの誘導体である前記[7]に記載の医薬組成物。
[9]腫瘍増殖抑制作用、がん転移抑制作用、腫瘍免疫亢進作用および血管透過性亢進抑制作用から選択される1種以上の作用を有する前記[8]に記載の医薬組成物。
[10]血管形成異常を伴う疾患治療用の他の薬剤と組み合わせて使用することを特徴とする前記[8]または[9]に記載の医薬組成物。
[11]血管形成異常を伴う疾患治療用の他の薬剤が、がん治療薬である前記[10]に記載の医薬組成物。
[12]組み合わせて使用する他の薬剤の血管形成異常を伴う疾患部位への送達を促進するための前記[10]または[11]に記載の医薬組成物。
[13]血管形成異常を伴う疾患が固形がん、加齢黄斑変性症、関節リウマチ、乾癬、強皮症、全身性エリテマトーデス、血管炎症候群、血管ベーチェット、糖尿病性網膜症、糖尿病性腎症、動脈硬化症、慢性閉塞性動脈硬化症、バージャー病、肺線維症、脳梗塞、重症感染症または心不全である前記[7]〜[12]のいずれかに記載の医薬組成物。
[14]血管形成異常を伴う疾患が固形がんである前記[13]に記載の医薬組成物。
[15]リゾリン脂質がリゾホスファチジン酸、リゾホスファチジルセリン、リゾホスファチジルコリン、リゾホスファチジルエタノールアミン、リゾホスファチジルイノシトール、リゾホスファチジルグリセロール、スフィンゴシン−1−リン酸、スフィンゴシルホスホリルコリンおよび血小板活性化因子(PAF)から選択される1種または2種以上である前記[7]〜[14]のいずれかに記載の医薬組成物。
[16]リゾリン脂質がリゾホスファチジン酸である前記[15]に記載の医薬組成物。
[17]血管形成異常を伴う疾患の治療薬のスクリーニング方法であって、疾患部位の血管内皮細胞に特異的に発現しているリゾリン脂質受容体を活性化する物質を選択することを特徴とする方法。
本発明は、血管形成異常を伴う疾患の治療薬の疾患部位への送達を促進するための薬剤送達促進剤を提供する。本発明の薬剤送達促進剤は、リゾリン脂質受容体を活性化する物質を有効成分として含有し、血管形成異常を伴う疾患の治療薬と組み合わせて使用することを特徴とする。血管形成異常を伴う疾患部位では、血流が乏しいことに加え、血管透過性が過剰な亢進状態にあることが知られている。例えば固形がんでは、腫瘍間質圧を増加させ、腫瘍間質内と血管内の浸透圧の差がなくなり、血管内腔から腫瘍組織内への物質の移動が困難となっていることが知られている。本発明の薬剤送達促進剤は、血管形成異常を伴う疾患部位の異常血管を正常化し、血管透過性を正常化することができるので、組み合わせて使用する薬剤の疾患部位への送達効率を顕著に高めることができる。
本発明は、リゾリン脂質受容体を活性化する物質を有効成分として含有する血管形成異常を伴う疾患の治療用医薬組成物を提供する。上記本発明の薬剤送達促進剤は、医薬品の形態で実施することが好ましい。本発明の医薬組成物は、単独で使用してもよいし、血管形成異常を伴う疾患治療用の他の薬剤と組み合わせて使用してもよい。リゾリン脂質受容体を活性化する物質はリゾリン脂質に限定されるものではなく、リゾリン脂質の誘導体、リゾリン脂質の前駆体またはそれらの誘導体等も有効成分として好適に用いることができる。さらに、これら以外のリゾリン脂質受容体アゴニスト(例えば、低分子化合物、核酸、ペプチド、蛋白質、抗体等)も有効成分として好適に用いることができる。公知のリゾリン脂質受容体アゴニストとしては、例えばWongらの論文(Assay Drug Dev Technol. 2010 Aug;8(4):459-70. doi: 10.1089/adt.2009.0261.)に記載のLPA4受容体アゴニストなどが挙げられる。好ましくは、リゾリン脂質もしくはその前駆体、またはそれらの誘導体である。
投与量は、投与対象、症状、投与ルートなどにより差異はあるが、経口投与の場合、一般的に例えば、体重約60kgのヒトにおいては、1日当たり約0.01〜1000mg、好ましくは約0.1〜100mg、より好ましくは約0.5〜500mgである。
非経口投与の合は、その1回投与量は患者の状態、症状、投与方法などによっても異なるが、例えば注射剤では、通常例えば体重1kg当たり約0.01〜100mg、好ましくは約0.01〜50mg、より好ましくは約0.01〜20mgを静脈に投与する。1日当たりの総投与量は、単一投与量であっても分割投与量であってもよい。
化学療法剤としては、特に限定されないが、例えばナイトロジェンマスタード、塩酸ナイトロジェンマスタード−N−オキシド、クロラムブチル、シクロフォスファミド、イホスファミド、チオテパ、カルボコン、トシル酸インプロスルファン、ブスルファン、塩酸ニムスチン、ミトブロニトール、メルファラン、ダカルバジン、ラニムスチン、リン酸エストラムスチンナトリウム、トリエチレンメラミン、カルムスチン、ロムスチン、ストレプトゾシン、ピポブロマン、エトグルシド、カルボプラチン、シスプラチン、ミボプラチン、ネダプラチン、オキサリプラチン、アルトレタミン、アンバムスチン、塩酸ジブロスピジウム、フォテムスチン、プレドニムスチン、プミテパ、リボムスチン、テモゾロミド、トレオスルファン、トロフォスファミド、ジノスタチンスチマラマー、アドゼレシン、システムスチン、ビゼレシン等のアルキル化剤;例えば、メルカプトプリン、6−メルカプトプリンリボシド、チオイノシン、メトトレキサート、ペメトレキセド、エノシタビン、シタラビン、シタラビンオクフォスファート、塩酸アンシタビン、5−FU系薬剤(例、フルオロウラシル、テガフール、UFT、ドキシフルリジン、カルモフール、ガロシタビン、エミテフール、カペシタビン等)、アミノプテリン、ネルザラビン、ロイコボリンカルシウム、タブロイド、ブトシン、フォリネイトカルシウム、レボフォリネイトカルシウム、クラドリビン、エミテフール、フルダラビン、ゲムシタビン、ヒドロキシカルバミド、ペントスタチン、ピリトレキシム、イドキシウリジン、ミトグアゾン、チアゾフリン、アンバムスチン、ベンダムスチン等の代謝拮抗剤;例えば、アクチノマイシンD、アクチノマイシンC、マイトマイシンC、クロモマイシンA3、塩酸ブレオマイシン、硫酸ブレオマイシン、硫酸ペプロマイシン、塩酸ダウノルビシン、塩酸ドキソルビシン、塩酸アクラルビシン、塩酸ピラルビシン、塩酸エピルビシン、ネオカルチノスタチン、ミスラマイシン、ザルコマイシン、カルチノフィリン、ミトタン、塩酸ゾルビシン、塩酸ミトキサントロン、塩酸イダルビシン等の抗がん性抗生物質;例えば、エトポシド、リン酸エトポシド、硫酸ビンブラスチン、硫酸ビンクリスチン、硫酸ビンデシン、テニポシド、パクリタキセル、ドセタクセル、ビノレルビン、イリノテカン、塩酸イリノテカン等の植物由来抗がん剤などが挙げられる。
本発明は、血管形成異常を伴う疾患の治療薬のスクリーニング方法を提供する。本発明のスクリーニング方法は、疾患部位の血管内皮細胞に特異的に発現しているリゾリン脂質受容体を活性化する物質(リゾリン脂質受容体アゴニスト)を選択することを特徴としている。
血管形成異常を伴う疾患の治療薬の疾患部位への送達を促進する方法であって、哺乳動物に対してリゾリン脂質もしくはその前駆体、またはそれらの誘導体の有効量を投与し、さらに血管形成異常を伴う疾患の治療薬の有効量を投与することを特徴とする薬剤送達促進方法。
哺乳動物に対してリゾリン脂質もしくはその前駆体、またはそれらの誘導体の有効量を投与し、さらに血管形成異常を伴う疾患の治療薬の有効量を投与することを特徴とする血管形成異常を伴う疾患の治療方法。
哺乳動物に対してリゾリン脂質もしくはその前駆体、またはそれらの誘導体の有効量を投与することを特徴とする固形がんの治療方法。
哺乳動物に対してリゾリン脂質もしくはその前駆体、またはそれらの誘導体の有効量を投与することを特徴とするがんの転移抑制方法。
血管形成異常を伴う疾患の治療薬の疾患部位への送達促進に使用するための、リゾリン脂質もしくはその前駆体、またはそれらの誘導体。
血管形成異常を伴う疾患の治療に使用するための、リゾリン脂質もしくはその前駆体、またはそれらの誘導体。
固形がんの治療に使用するための、リゾリン脂質もしくはその前駆体、またはそれらの誘導体。
がんの転移抑制に使用するための、リゾリン脂質もしくはその前駆体、またはそれらの誘導体。
血管形成異常を伴う疾患の治療薬の疾患部位への送達を促進するための薬剤送達促進剤を製造するための、リゾリン脂質もしくはその前駆体、またはそれらの誘導体の使用。
血管形成異常を伴う疾患の治療薬を製造するための、リゾリン脂質もしくはその前駆体、またはそれらの誘導体の使用。
固形がんの治療薬を製造するための、リゾリン脂質もしくはその前駆体、またはそれらの誘導体の使用。
がんの転移抑制薬を製造するための、リゾリン脂質もしくはその前駆体、またはそれらの誘導体の使用。
マウスがん細胞株をマウス皮下に移植して腫瘍を形成させた後にLPAを投与し、LPAが血管に対してどのような構造的変化を誘導するかを観察した。
(1)実験方法
マウスがん細胞株としてLewis肺癌細胞株(以下、「LLC細胞」という。)を用いた。8週齢のC57BL/6NCrSlcマウス(♀、SLC社)の皮下に、LLC細胞(1×106個/100μL・PBS/匹)を注射した。
LPAには、18:1LPA(Avanti POLAR LIPIDS社)を使用した。50%エタノールを用いて10mMのLPAストック溶液を調製し、−30℃で保存した。使用時に解凍し、超音波洗浄機(エスエヌディ社)で1分間細分化した後、PBSで3mg/kg/100μLとなるように投与用LPA溶液を用時調製した。
結果を図1に示した。(A)は共焦点レーザー顕微鏡で標本を観察した写真であり、血管内皮細胞が緑色蛍光に染色され、写真では白く描出されている。(B)はAngioTool血管構造解析ソフトで算出した各群の平均血管長を示す図である。図1(A)に示したように、LPA投与前の腫瘍血管(control)は網目構造が疎で血管が不連続であったが、6時間後では血管の連結状態が観察されるようになり、12時間、24時間後では正常組織と同様に血管の網状構造が観察された。図1(B)に示したように、LPAの投与により一本一本の血管の長さが長くなっていることが数値として示された。この結果は、LPA投与後短時間で腫瘍血管のネットワーク構築が誘導されることを示している。したがって、LPAによる腫瘍血管のネットワーク構築は血管内皮細胞の増殖に基づくものとは考え難く、血管内皮細胞の伸長/接着/管腔形成に基づくものと考えられた。なお、結果を示していないが、がん細胞株としてLLC細胞以外のcolon26大腸がん細胞やB16メラノーマ細胞を用いた実験においても同様の結果が得られた。
LPA以外のリゾリン脂質であるS1Pを用いて、LPAと同様に腫瘍血管のネットワーク構築が誘導されるかどうかを観察した。
(1)実験方法
実施例1と同じ方法で8週齢のC57BL/6NCrSlcマウス(♀、SLC社)の皮下にLLC細胞を移植した。S1P(Avanti POLAR LIPIDS社)はPBSで10mMとなるように調製し、これをストック溶液として−30℃で保存した。使用時に解凍し、超音波洗浄機(エスエヌディ社)で1分間細分化した後、PBSで0.3mg/kg/100μLとなるように投与用S1P溶液を用時調製した。
結果を図2に示した。LPAを投与した場合と同様に、S1Pを投与した場合も腫瘍血管のネットワーク構築が誘導されることが明らかになった。この結果から、腫瘍血管のネットワーク構築を誘導して正常化させることができるのはLPAに限定されず、他のリゾリン脂質を用いても同じ効果を奏することが判明した。
(1)実験方法
実施例1と同じ方法で8週齢のC57BL/6NCrSlcマウス(♀、SLC社)の皮下にLLC細胞を移植した。また、実施例1と同じ方法で投与用のLPAを調製した。LLC細胞移植後9日目のマウス(腫瘍体積が60〜80mm3になった個体)を実験に供し、コントロール群とLPA群の2群に分けた(n=3)。群分け後、LPA(3mg/kg/100μL)またはPBS(100μL)を腹腔内投与した。LPAまたはPBS投与の24時間後に、ペントバルビタール(共立製薬株式会社)麻酔下で、マウスを潅流固定した。固定液には、2%ホルムアルデヒドおよび2.5%グルタールアルデヒドを含む0.1Mリン酸緩衝液(pH7.4)を用いた。還流固定後、腫瘍を摘出し、潅流に用いたものと同じ固定液に浸漬して4℃で一晩振盪した。さらに1%四酸化オスミウムおよび0.5%フェロシアンカリウムを含む0.1Mリン酸緩衝液(pH7.4)に浸漬して固定した。濃度上昇系列エタノールで脱水し、t−ブチルアルコールに置換して凍結乾燥を行った。凍結乾燥後、四酸化オスミウムを蒸着し、日立ハイテク製の走査型電子顕微鏡S−4800で、血管内腔面を観察した。
結果を図3に示した。図3から明らかなように、コントロール群の血管内腔面には糸状仮足を伸ばしたような歪な構造が観察されたが、LPA投与後の血管内腔は非常に平滑な構造が観察された。この結果から、LPAを投与することにより腫瘍内の血液の循環が改善することが予想された。
従来から知られているように、腫瘍内は血流が乏しいことに加え、血管透過性が過剰な亢進状態にある。そのため、最終的に腫瘍間質圧を増加させ、腫瘍間質内と血管内の浸透圧の差がなくなり、血管内腔から腫瘍組織内への物質の移動が困難となっている。LPA投与後に腫瘍内の血管網が密に構築され、血管内腔も平滑になることが明らかになったため、LPA投与後の腫瘍血管では薬剤の透過性が改善していることが予想された。そこで、LPA投与後の腫瘍における薬剤の透過性を確認するために、以下の実験を行った。
実施例1と同じ方法で8週齢のC57BL/6NCrSlcマウス(♀、SLC社)の皮下にLLC細胞を移植した。また、実施例1と同じ方法で投与用のLPAを調製した。LLC細胞移植後11日目に、腫瘍体積が100〜120mm3になったマウスを選択し、コントロール群とLPA群の2群に分けた(n=3)。群分け後、LPA(3mg/kg/100μL)またはPBS(100μL)を腹腔内投与した。LPAまたはPBS投与の24時間後に、ペントバルビタール麻酔下で、ドキソルビシン(ドキソルビシン塩酸塩、日本化薬株式会社)を1.5mg/kgの用量でマウスに尾静脈内に投与した。ドキソルビシンは生理食塩水(大塚製薬株式会社)に溶解し、1.5mg/kgとなるように希釈した後、超音波洗浄機で1分間細分化を行ってから投与した。なお、ドキソルビシンは蛍光を発する抗癌剤であり、励起波長480nm、測定波長575nmで観察することが可能な化合物である。ドキソルビシン投与の20分後にマウスから腫瘍を摘出し、切片の厚さを20μmに変更した以外は実施例1と同じ方法で腫瘍の組織標本を作製した。共焦点レーザー顕微鏡(LEICA社)にて観察し、写真撮影を行った。
結果を図4に示した。図4中、矢印はドキソルビシンの赤色蛍光シグナルを示す。血管内皮細胞は、抗CD31抗体により緑色蛍光を発している。図4から明らかなように、コントロールではドキソルビシンの腫瘍内移行はほとんど観察されなかったが、LPAを投与後の腫瘍においては、ドキソルビシンが血管内から腫瘍深部に送達されていることが観察された。
リゾリン脂質投与による腫瘍血管の正常化により抗がん剤の送達性の改善が観察されたが、この薬剤送達に関して、低分子量、高分子量の違いに関わらず送達性が改善するのかどうかを、70kDaデキストランと2000kDaデキストランの2種類のデキストランを用いて解析した。
実施例1と同じ方法で8週齢のC57BL/6NCrSlcマウス(♀、SLC社)の皮下にLLC細胞を移植した。また、実施例1と同じ方法で投与用のLPAを調製した。LLC細胞移植後11日目に、腫瘍体積が100〜120mm3になったマウスを選択し、70kDaデキストラン投与のコントロール群とLPA群、および2000kDaデキストラン投与のコントロール群とLPA群の合計4群に分けた(n=3)。群分け後、LPA(3mg/kg/100μL)またはPBS(100μL)を腹腔内投与した。LPAまたはPBS投与の24時間後に、ペントバルビタール麻酔下で、各デキストランを尾静脈内に投与した。デキストラン(70kDaおよび2000kDa)は、FITC標識されたデキストラン(SIGMA社)を使用した。どちらのデキストランもPBSに溶解し、5mg/mLとなるように希釈して、その100μLを投与した。デキストラン投与の30分後にマウスから腫瘍を摘出し、実施例4と同じ方法で腫瘍の組織標本を作製した。共焦点レーザー顕微鏡(LEICA社)にて観察し、写真撮影を行った。
結果を図5に示した。70kDaデキストランおよび2000kDaデキストランのいずれも、コントロール群では腫瘍内移行がほとんど観察されなかったが、LPA投与群では腫瘍深部に送達されていることが観察された。この結果から、LPA投与によって腫瘍血管の透過性が正常化されることにより、低分子化合物に限らず、高分子化合物(例えば、核酸、抗体等)も、腫瘍深部に送達可能になると考えられる。
LPA投与により、抗がん剤を腫瘍深部まで効率よく送達するできることが示されたため、LPAと抗がん剤の併用によるがん治療を試みた。
(1)実験方法
実施例1と同じ方法で8週齢のC57BL/6NCrSlcマウスの皮下にLLC細胞を移植した。また、実施例1と同じ方法で投与用のLPAを調製した。抗癌剤として5−FU(協和発酵キリン社)を使用した。5−FUの調製には生理食塩水(大塚製薬株式会社)を用いた。LLC細胞移植後7日目に、腫瘍体積が30〜50mm3になったマウスを選択し、試験に供した。コントロール群、5−FU群、LPA群および5−FU/LPA群の4群を設けた(n=3)。群分け後、LPA(3mg/kg/100μL)または5−FU(100mg/kg/100μL)またはPBS(100μL)を腹腔内投与した。5−FU/LPA群にはLPAと5−FUの両方を腹腔内投与した。LPAまたはPBSは1日1回7日間連日投与した。5−FUは週1回、合計2回(移植後7日目と14日目)に投与した。投与開始後経時的に腫瘍サイズを測定した。腫瘍体積は、長径×短径×高さ×0.5で計算した。投与開始から2週間後のマウスをペントバルビタール麻酔下で、デジタルカメラで撮影した。また、腫瘍を摘出し、デジタルカメラで撮影した。
結果を図6に示した。(A)は各群の腫瘍体積の経時変化を示す図であり、(B)は各群の代表的なマウスの外観の写真であり、(C)は各群の代表的なマウスから摘出した腫瘍の写真である。図6から明らかなように、5−FUとLPAの併用投与は、5−FUの単独投与より腫瘍の増大を顕著に抑制した。LPAの単独投与では、腫瘍が赤みを帯びており、血流が増加していることが観察された。また、LPAの単独投与でも、コントロールと比較して腫瘍の増大を抑制することが示された。
(1)実験方法
マウスメラノーマ由来細胞株のB16−BL6細胞を用いた。8週齢のC57BL/6NCrSlcマウスの皮下に、B16−BL6細胞(1×106個/100μL・PBS/匹)を注射した。LLC細胞移植後7日目に、腫瘍体積が30〜50mm3になったマウスを選択し、試験に供した。以後の実験方法は、上記6−1と同じである。
結果を図7に示した。(A)は各群の腫瘍体積の経時変化を示す図であり、(B)は各群の代表的なマウスの写真である。図7から明らかなように、5−FUとLPAの併用投与は、5−FUの単独投与より腫瘍の増大を顕著に抑制した。また、LPAの単独投与でも、コントロールと比較して腫瘍の増大を抑制することが示された。
(1)実験方法
マウス大腸がん細胞株のcolon26細胞を用いた。8週齢のBALB/cマウス(♀、SLC社)の皮下に、colon26細胞(1×106個/100μL・PBS/匹)を注射した。LLC細胞移植後7日目に、腫瘍体積が30〜50mm3になったマウスを選択し、試験に供した。以後の実験方法は、上記6−1と同じである。
各群の腫瘍体積の経時変化の結果を図8に示した。図8から明らかなように、5−FUとLPAの併用投与は、5−FUの単独投与より腫瘍の増大を顕著に抑制した。また、移植後17日目までは、LPAの単独投与でもコントロールと比較して腫瘍の増大を抑制することが示された。
(1)実験方法
5−FUに代えてオキサリプラチンを用いた以外は、上記6−3と同じ方法で実施した。オキサリプラチン(コスモバイオ株式会社)の調製には生理食塩水(大塚製薬株式会社)を用い、1.5mg/kg/100μLを腹腔内投与した。
各群の腫瘍体積の経時変化の結果を図9に示した。図9から明らかなように、オキサリプラチンとLPAの併用投与は、オキサリプラチンの単独投与より腫瘍の増大を顕著に抑制した。また、移植後17日目までは、LPAの単独投与でもコントロールと比較して腫瘍の増大を抑制することが示された。この結果から、LPAと抗がん剤の併用効果は、抗がん剤として5−FUを用いた場合に限らないことが示された。
以上より、LPAの腫瘍血管に対する効果は、あらゆるがん細胞によるがん組織に有効であることが示唆された。
実施例3において、LPA投与群では腫瘍血管内腔面が平滑で隙間のない状態に変化していたことから、LPA投与群では血管内皮細胞間の接着が強固になっている可能性が考えられた。そこで、血管内皮細胞の細胞間接着を誘導する分子の1つである、LPA投与後の腫瘍血管におけるVE−カドヘリンの発現を解析した。
実施例1と同じ方法で8週齢のC57BL/6NCrSlcマウス(♀、SLC社)の皮下にLLC細胞を移植した。また、実施例1と同じ方法で投与用のLPAを調製した。LLC細胞移植後9日目のマウス(腫瘍体積が60〜80mm3になった個体)を実験に供し、コントロール群とLPA群の2群に分けた(n=3)。群分け後、LPA群のマウスにLPAを3mg/kg/100μLの用量で腹腔内投与した。コントロール群は群分け後に腫瘍を摘出し、LPA群はLPA投与の24時間後に腫瘍を摘出した。腫瘍の免疫染色組織標本は、1次抗体および2次抗体を変更した以外実施例1と同じ方法で作製した。1次抗体には、抗マウスVE−カドヘリン抗体であるPurified Goat anti−mouse VE−cadherin(BD pharmigen社)をブロッキング溶液で200倍希釈して用いた。2次抗体には、Alexa Fluor 488 Goat Anti−Rat IgG(Life technologies社)をブロッキング溶液で400倍希釈して用いた。作製した標本を共焦点レーザー顕微鏡(LEICA社)にて観察し、写真撮影を行った。また、共焦点レーザー顕微鏡にてZスタック画像を取得し、VE−カドヘリン発現量(蛍光強度)を解析した。
結果を図10に示した。(A)は共焦点レーザー顕微鏡で標本を観察した写真であり、VE−カドヘリンが緑色蛍光に染色され、写真では白く描出されている。(B)は(A)の写真の斜め白線部分に沿ってZスタック画像を取得し、VE−カドヘリン発現量(蛍光強度)を解析した結果を示すチャートである。(A)の下の写真から、LPA群ではVE−カドヘリンが細胞と細胞の接着面に集まっていることが観察された。一方、コントロール群では、VE−カドヘリンは細胞内に弱く発現していることが観察された。(B)のZスタックチャートを見ても、LPA投与群では、細胞膜部分の蛍光強度が高く、細胞膜にVE−カドヘリンが多く発現していることが示された。この結果から、LPAが血管内皮細胞同士の接着を担うVE−カドヘリンの細胞膜への移行を誘導して、血管内皮細胞同士を接着させることが明らかとなった。
LPAにより内皮細胞同士の接着性が高まり、血管内皮細胞のネットワークの改善や、血管からの透過性の改善が誘導されることが、上記実施例7で明らかになった。そこで、LPA誘導体であるVPC31144S(N-{(1S)-2-Hydroxy-1-[(Phosphonooxy) Methyl]Ethyl}(9Z) Octadec-9-enamide)によっても、内皮細胞同士の接着性が向上するかどうかを、内皮細胞同士の接着を電気信号で解析する方法を用いて解析した。
LPAおよびVPC31144Sのin vitroにおける血管内皮細胞同士の細胞接着をバリア機能として解析するために、リアルタイム細胞解析装置ECIS−Zθ(Applied Biophysic 社製)を使用した。
LPAおよびVPC31144SはAvanti POLAR LIPIDS社製を使用した。VPC31144SはLPAR4にアゴニスト作用を示すことが知られているLPA誘導体である。LPAおよびVPC31144Sは、それぞれ50%エタノールを用いて10mMのLPAストック溶液を調製し、−30℃で保存した。使用時に解凍し、超音波洗浄機(エスエヌディ社)で1分間細分化した後、無血清培地にBSAを0.1%加えた培地で10μMに調製した。
結果を図11に示した。図11のX軸は時間経過、Y軸は電気抵抗(Rb)を示す。Rbが高いほど、細胞間接着が強いことを示す。LPA添加により、コントロールに比べ電気信号が高まり、長期間にわたって内皮細胞同士のバリア機能が強くなることが示された。同様に、VPC31144を添加した場合も内皮細胞同士のバリア機能が強くなることが示された。さらに、VPC31144を添加した場合は、LPA添加と比較して、添加直後より強いバリア機能が発揮されることが明らかになった。この結果から、LPAに限らず、LPAR4にアゴニスト作用を有するLPA誘導体も、血管形成異常を伴う疾患に対する透過性の改善や血管網の正常化に有用であることが判明した。
これまでの報告から、腫瘍組織の低酸素状態はがん細胞そのものの悪性化を誘導し、がん細胞の転移浸潤を旺盛にする可能性が示唆されている。腫瘍内の血流が改善されれば、酸素分圧も腫瘍内で低下せず、がんの悪性化が抑制できる可能性が考えられる。さらに、上記したように内皮細胞同士が接着した状態で維持されることで、血管内へのがん細胞の移動侵入が困難になり、転移が抑制される可能性も考えられる。そこで、高転移能を有するメラノーマ細胞株(B16−BL6細胞)を用いて、LPAのがん転移に対する効果を検討した。
8週齢のC57BL/6NCrSlcマウス(♀、SLC社)の皮下に、B16−BL6細胞(1×106個/100μL・PBS/匹)を注射した。B16−BL6細胞移植後7日目に、腫瘍体積が30〜50mm3になったマウスを選択し、コントロール群とLPA群の2群に分けた(n=3)。群分け後、LPA(3mg/kg/100μL)またはPBS(100μL)を腹腔内投与した。LPAまたはPBSは移植後21日目まで1日1回連日投与した。B16−BL6細胞を移植後42日目に、マウスを安楽死させ肺を摘出した。実体顕微鏡(LEICA社)を用いて、摘出した肺の転移コロニー数を計測した。統計解析には、Student’s t−testを用いた。
結果を図12に示した。図12から明らかなように、LPA群はコントロール群と比較して、有意に肺への転移を抑制した(p<0.01)。この結果から、LPAによる腫瘍血流改善および血管内皮細胞の接着誘導は、がん細胞の悪性化および転移を抑制することが確認された。
(1)実験方法
実施例1と同じ方法で8週齢のC57BL/6NCrSlcマウス(♀、SLC社)の皮下にLLC細胞を移植し、腫瘍を形成させた。腫瘍を摘出し、CD45(血液マーカー)陰性、CD31(血管内皮細胞マーカー)陽性の血管内皮細胞をFACS Aria(BD Bioscience社)を用いて回収した。回収した血管内皮細胞(CD45−CD31+)から、RNAeasy kit(Qiagen社)を用いてトータルRNAを得た。次に、ExScript RT reagent Kit(タカラバイオ社)を用いて、トータルRNAからcDNAを合成し、得られたcDNAを用いて、LPA受容体(LPAR)1〜6のmRNAの発現量をリアルタイムPCR法によって解析した。対照として解糖系酵素であるGAPDH(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)のmRNAの発現量を測定した。リアルタイムPCRには、Stratagene M×300P(Stratagene社製)を用いた。
LPAR1
5'- CCGCTTCCATTTCCCTATTT -3'(配列番号1)
5'- AAAACCGTGATGTGCCTCTC -3'(配列番号2)
LPAR2
5'- CCATCAAAGGCTGGTTCCT -3'(配列番号3)
5'- TCCAAGTCACAGAGGCAGTG -3'(配列番号4)
LPAR3
5'- TTCCACTTTCCCTTCTACTACCTG -3'(配列番号5)
5'- TCCACAGCAATAACCAGCAA -3'(配列番号6)
LPAR4
5'- GCCCTCTCTGATTTGCTTTT -3'(配列番号7)
5'- TCCTCCTGGTCCTGATGGTA -3'(配列番号8)
LPAR5
5'- AGCGATGAACTGTGGAAGG -3'(配列番号9)
5'- GCAGGAAGATGATGAGATTGG -3'(配列番号10)
LPAR6
5'- TGTGCCCTACAACATCAACC-3'(配列番号11)
5'- TCACTTCTTCTAACCGACCAG -3'(配列番号12)
GAPDH
5'- AACTTTGGCATTGTGGAAGG -3'(配列番号13)
5'- GGATGCAGGGATGATGTTCT -3'(配列番号14)
結果を図13に示した。各LPA受容体の発現量は、GAPDHの発現量に対する相対値で示した。図13から明らかなように、腫瘍組織の血管内皮細胞では、LPAR1、LPAR4およびLPAR6が発現しており、LPAR2、LPAR3およびLPAR5の発現量は検出限界以下であった。
(1)LPA受容体の発現解析
実施例9と同じ方法で、MS−1細胞(マウス膵臓由来血管内皮細胞株)から、トータルRNAを回収し、LPA受容体(LPAR)1〜6のmRNAの発現量をリアルタイムPCR法によって解析した。
結果を図14に示した。各LPA受容体の発現量は、GAPDHの発現量に対する相対値で示した。図14から明らかなように、MS−1細胞では、LPAR4およびLPAR6が発現しており、LPAR1、LPAR2、LPAR3およびLPAR5の発現量は検出限界以下であった。
LPAR4特異的siRNA(siRNA ID: s95367、life Technologies社)を、lipofectamine2000(invitrogen社)を用いてMS−1細胞に導入し、LPAR4をノックダウンした。コントロールsiRNAを導入したMS−1細胞をコントロール細胞とした。コントロール細胞とLPAR4ノックダウン細胞を、それぞれコラーゲンタイプIをコーティングしたガラスボトムディッシュ(Iwaki社)に2.5×105個/2mLで播種し、細胞がコンフルエントになるまで3日間培養した。細胞をPBSで1分間×3回洗浄した後、ブロッキング溶液(5% normal goat serum/1%BSA/2%skim milk/PBS)をディッシュ上に滴下し、室温で30分間ブロッキングを行った。1次抗体にはPurified Goat anti−mouse VE−cadherin(BD pharmigen社)を用い、4℃で一晩反応させた。Triton X−100含有PBS(PBST)で10分の洗浄を3回行った後、二次抗体Alexa Fluor 488 goat anti−rat IgG(Molecular Probes社)を遮光して室温で1時間反応させた。以降の操作は、すべて遮光下室温で行った。PBSTで10分間の洗浄を3回行った後、TOPRO−3(life Technologies社)で核染色を行い、PBSで10分間の洗浄を2回行い、Vectashield(Vector Laboratories Inc.社)を数滴落としてカバーガラスを載せ、共焦点レーザー顕微鏡で観察および撮影した。
血管透過性亢進により病態の悪化が観察されるのは腫瘍だけでなく、炎症性疾患や糖尿病性網膜症や加齢黄斑変性症等においても、新生血管の透過性亢進による病態の悪化が観察される。そこで、LPAが腫瘍血管のみならず、他の疾患モデルにおいても新生血管の血管透過性亢進の抑制に効果があるかどうかを解析した。
下肢の虚血モデルは、バージャー病や慢性閉塞性動脈硬化症の病態モデルとして利用されている。すなわち、マウス下肢の血管を切除すると、その血管支配領域に虚血が生じ、さらに手術手技により炎症がもたらされた結果、血管新生が誘導され、新生血管の透過性亢進に起因して下肢の筋肉部位に浮腫が生じる。LPAにこのような炎症や虚血による新生血管の透過性亢進を抑制する効果があるかどうかを検討した。
6週齢のC57BL/6NCrSlcマウス(♀、SLC社)を用いた。ペントバルビタール(共立製薬株式会社)麻酔下で、右下肢の鼠径部の皮膚を切開し、大腿静脈起始部を結紮した後、伏在動静脈末端を結紮し、さらにその他の分枝を剥離して本枝とともに切除した。切除後、皮膚切開部を滅菌済縫合糸(夏目制作所)で縫合し、麻酔から覚醒するまで37℃恒温器上に静置した。覚醒後、LPA群(n=3)にはLPA(3mg/kg/100μL)を、コントロール群(n=3)にはPBS(100μL)を、それぞれ腹腔内投与した。投与は3日連続で1日1回、合計3回行った。最終投与の24時間後に、大腿周囲の長さを測定した。
結果を図16に示した。LPA投与群ではコントロール群に比べ大腿周囲の長さが顕著に短くなり、浮腫が抑制されていることが判明した。
滲出性加齢黄斑変性は、脈絡膜新生血管を原因とする眼疾患であり先進国の失明原因第1位を占める。脈絡膜新生血管は、健常な血管と異なり血管透過性が亢進しており、血液成分が漏出するため網膜浮腫や網膜下液が生じて視機能障害を引き起こす。現在、脈絡膜新生血管の発生や増殖に関与するVEGFを阻害する薬剤が臨床応用されているが、未だに視機能を完全に回復させる治療法はなく、さらなる有効な治療法の開発が望まれている。そこで、LPAがこの脈絡膜新生血管の透過性亢進を抑制し得るかどうかを検討した。
8週齢のC57BL/6NCrSlcマウス(♀、SLC社)を用いた。ペントバルビタール(共立製薬株式会社)麻酔下でトロピカミド(参天製薬製)を点眼して散瞳し、細隙灯顕微鏡でマウス眼底を観察しながら眼底視神経乳頭周囲の網膜に両眼4か所ずつレーザーを照射し(Ultima 2000 SE)脈絡膜新生血管を誘発した。レーザー照射条件は、150mW、0.05秒、75μmとした。LPA群(n=3)にはLPA(3mg/kg/100μL)を、レーザー照射後5日目と6日目に腹腔内投与し、コントロール群(n=3)にはPBS(100μL)を、レーザー照射後5日目と6日目に腹腔内投与した。レーザー照射後7日目(LPA初回投与後48時間目)に、ペントバルビタール麻酔下でFITC標識70kDaデキストラン(SIGMA社)を尾静脈内に投与した。デキストランはPBSに溶解し、5mg/mLとなるように希釈して、その50μLを投与した。デキストラン投与の10分後に眼球を回収した。回収した眼球を4%パラホルムアルデヒド(PFA)/PBSに2時間浸漬した後、眼球から角膜、水晶体、網膜を取り除き、脈絡膜フラットマウントを作製した。その後、4℃のPBSを用いて洗浄した。30分毎に新しいPBSに交換しながら6時間洗浄を行った。続いて、ブロッキング溶液(5% normal goat serum/1%BSA/2%skim milk/PBS)を加えて室温で2時間ブロッキングを行った。1次抗体には、抗マウスCD31抗体であるPurified Hamster Anti−PECAM−1(MILLIPORE社:MAB1398Z)を用い、ブロッキング溶液で200倍希釈して切片上に滴下し、4℃で一晩反応させた。PBSTで30分間の洗浄を6回行い、さらにPBSで30分間洗浄を行った。2次抗体には、Alexa Fluor 488 Goat Anti−Hamster IgG(Jackson ImmunoResearch Labolatories社)を用い、ブロッキング溶液で400倍希釈して切片に滴下し、6時間遮光で反応させた。PBSTで30分間の洗浄を6回行い、Vectashildを数滴落とし、カバーガラスで封入した。共焦点レーザー顕微鏡にて観察し、写真撮影を行った。
結果を図17に示した。上段(CD31)は血管内皮細胞を抗CD31抗体で免疫染色した組織標本を観察した写真であり、血管内皮細胞が緑色蛍光に染色され、写真では白く描出されている。下段(Dextran)は新生血管から漏出したデキストランの蛍光を観察した写真である。上段に示したように、脈絡膜新生血管の大きさに関してLPA群とコントロール群との間に有意差は求められなかった。一方、下段に示したように、デキストランの漏出に関しては、LPA群は顕著にデキストランの漏出が抑制されており、LPAは血管透過性亢進を抑制する作用を有することが明らかとなった。この結果から、LPAは加齢黄斑変性症における血管透過性を抑制して病態を改善する効果を有することが判明した。
Claims (1)
- 固形がん(ただし、膵臓がんを除く)、加齢黄斑変性症、慢性閉塞性動脈硬化症およびバージャー病から選択される血管形成異常を伴う疾患の治療薬のスクリーニング方法であって、
被験物質と血管形成異常を伴う疾患部位の血管内皮細胞に特異的に発現しているリゾホスファチジン酸受容体とをヒトの生体内以外で接触させる工程と、リゾホスファチジン酸受容体の活性化状態を測定する工程と、リゾホスファチジン酸受容体を活性化させる被験物質を選択する工程と、を含むことを特徴とする方法。
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