KR102132914B1 - 광생체조절을 이용한 배아줄기세포의 귀 연계 조직으로의 분화 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 (a) 배아체를 형성하는 단계; 및 (b) 단계(a)에서 형성된 배아체를 수집하여 외배엽 분화 배지에서 배양하는 동안 광생체조절을 이용하여 귀 연계 조직으로 분화시키는 단계를 포함하는, 광생체조절을 이용한 배아줄기세포의 귀 연계 조직으로의 분화 방법을 제공한다.
본 발명의 배아줄기세포의 분화 방법은 ESC를 내이 유모세포와 유사한 세포로 효율적으로 분화시킬 수 있으므로 줄기세포 분화 분야에서 귀 연계 조직으로의 분화 방법으로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

광생체조절을 이용한 배아줄기세포의 귀 연계 조직으로의 분화 방법{Method of differentiation of embryonic stem cell toward otic lineage using photobiomodulation}

본 발명은 배아줄기세포의 귀 연계 조직으로의 분화 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 광생체조절을 이용한 배아줄기세포의 귀 연계 조직으로의 분화 방법에 관한 것이다.

광생체조절(Photobiomodulation, PBM)은 생체 외(in vitro) 및 생체 내(in vivo)에서 줄기세포의 다른 유형을 이동, 증식 및 분화하도록 자극한다. 그러나 배아줄기세포(embryonic stem cell, ESC)의 귀 연계 조직(otic lineage)으로의 분화에 대한 PBM의 영향에 대해서는 알려진 바가 거의 없다. 다른 표적 세포 유형과 비교하여 내이 유모세포(inner ear hair　cell, HC)의 복잡성으로 인해 ESC의 내이 유모세포(HCS)로의 시험관내 분화에 대하여 몇몇 보고만이 존재한다.

저출력레이저 치료법으로도 알려진 광생체조절(Photobiomodulation, PBM) 치료법은 반세기 이상 동안 존재해 왔지만, 그 세포 수준의 작용 메커니즘은 최근에야 밝혀지고 있다. PBM 치료법은 파장이 각각 600-700 및 780-1100 nm 인 적외선 또는 근적외선 영역(NIR), 및 1-500 mW의 출력 전력의 저전력 광원(레이저 또는 발광 다이오드 [LED])을 사용한다. PBM을 적용하면 광자 흡수가 미토콘드리아의 전자 전달 시스템에서, 특히 시토크롬 C 산화 효소(cytochrome c oxidase)에 의해 일어난다. 이것은 미토콘드리아 막 전위(mitochondrial membrane potential, MMP)를 증가시켜 ATP의 합성을 증가시키고 활성 산소 종(reactive oxygen species, ROS), Ca²⁺ 및 산화 질소(NO)의 농도를 증가시킨다. 이러한 세포의 산화 환원 상태의 변화는 세포가 증식에 비해 분화를 촉진하도록 만든다.

줄기세포 치료에서의 PBM 채택에 대한 최근의 진보는 줄기세포와 전구 세포(progenitor cell)가 빛에 양호하게 반응한다는 것을 보여 주었다. PBM은 여러 형태의 줄기세포를 자극하여 시험관 내에서 및 생체 내에서 이동, 증식 및 분화시킨다. 그러나 배아줄기세포(ESC)의 귀 연계 조직으로의 분화에 있어서의 PBM의 영향에 대해서는 알려진 바가 거의 없다.

다른 표적 세포 유형과 비교하여 HC의 복잡성으로 인해 ESC의 내이 유모세포(in vitro ear hair cell, HCS)로의 시험 관내 분화에 대하여 몇몇 보고된 바가 있다. 줄기세포의 HC로의 분화는 전신적 호르몬 및 외인성 생체 활성 분자의 단계적 발현(cascading expression)에 의해 조절되는 복잡한 생리학적 과정이다. ESC를 HC 유사 세포 또는 내이 오가노이드로 성공적으로 분화시킨 가장 유망한 결과에서는 배아 발달의 초기 단계와 유사한 화학적으로 정의된 조건을 사용하였다. 이 연구들에서는 분화개시된 ESC가 외배엽 분화에 이어서 비 신경 외배엽 이후 전기원판성(preplacodal) 외배엽으로의 유도를 거치는 것이 밝혀졌다. 자기-유도 오가노이드생성(Self-guided organogenesis)은 감각 상피 세포를 포함하는 오가노이드 소체로 귀 소포(otic vesicle)를 형성한다. 그러나 몇몇 연구만이 결과가 재현되었으며, 특히 생체 내 분화의 효능에 대해서는 의문의 여지가 남아 있다. 따라서, 분화 과정을 가속화하고 분화된 HC의 수율을 높이기 위하여 추가의 경제적이고 무해한 매개체를 찾는 것이 중요하다.

한국특허공개 제10-2018-0106113호 (201810월01일) 한국특허공개 제10-2016-0000029호 (201601월04일) 한국특허공개 제10-2017-0055497호 (201705월19일) 한국특허공개 제10-2016-0086933호 (201607월20일)

본 발명의 발명자들은 ESC를 내이 유모세포와 유사한 세포로 분화시키는 방법에 대하여 연구하던 중, PBM을 이용하고, 시험관내 분화에 대한 세포 밀도 및 배양 기술의 영향을 조절하여 분화 정도를 확인하고, 분화도를 높이기 위한 충분한 농도의 분자 인자 생산을 촉진하기 위하여 다양한 PBM 매개 변수를 검정하여, ESC를 내이 유모세포와 유사한 세포로 효율적으로 분화시킬 수 있다는 것을 발견하였다.

따라서, 본 발명은 광생체조절을 이용한 배아줄기세포의 귀 연계 조직으로의 분화 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 일 측면에 따라, (a) 배아체를 형성하는 단계; 및 (b) 단계(a)에서 형성된 배아체를 수집하여 외배엽 분화 배지에서 배양하는 동안 광생체조절을 이용하여 귀 연계 조직으로 분화시키는 단계를 포함하는 배아줄기세포의 분화 방법이 제공된다.

일 구현예에서, 단계(a)의 상기 배아체는 현적법 또는 단일층 세포 배양에 의해 형성될 수 있다.

일 구현예에서, 상기 현적법은 미분화된 배아줄기세포를 포함하는 유지 배지의 액적을 배양 접시의 뚜껑에 접종하여 12 ~ 36시간 동안 배양하는 것일 수 있다.

일 구현예에서, 상기 미분화된 배아줄기세포를 포함하는 유지 배지의 액적은 유지 배지 30 μL 당 세포 밀도 1 × 10⁵ ~ 6.8 × 10⁵ 세포/mL일 수 있다.

일 구현예에서, 단계(a)의 상기 단일층 세포 배양은 미분화된 배아줄기세포를 외배엽 분화 배지에서 12 ~ 36시간 동안 배양한 후, 마트리젤 함유 분화 배지에서 36 ~ 60시간 동안 배양하는 것일 수 있다.

일 구현예에서, 단계(b)의 상기 배양은 분화 2 일째에 비 신경 외배엽을 유도하고, 3 일째에 전기원판성(preplacodal) 외배엽을 유도한 후, 6 일째에 성숙 배지로 대체하여 18일까지 분화시키는 것일 수 있다.

일 구현예에서, 단계(b)의 상기 광생체조절은 분화 6 일부터 8 일까지 배양 세포에 발광 다이오드(LED)를 1 ~ 5회 조사하는 것일 수 있으며, 상기 발광 다이오드는 파장 470 ~ 740 nm일 수 있으며, 상기 발광 다이오드는 5 ~ 60 mW의 강도로 100 ~ 1000 초 동안 조사될 수 있다.

본 발명에서는 상이한 배양 기술과 PBM 매개 변수를 이용하여 ESC를 귀 오가노이드(otic organoid)로 분화시키는 최적 조건을 결정하였다. 현적법(Hanging drop technique) 또는 ESC 단일층(monolayer)을 이용하여 배아체(embryoid-body, EB)를 형성하고, 비-신경 외배엽 유도 후 전기원판성(preplacodal) 외배엽 유도에 의해 단계적으로 분화시켰다. 세포를 6-8 일에 470 nm, 630 nm 및 740 nm 파장의 LED로 하루 40 mW의 강도로 750 초 동안 직접 조사하고, 18 일까지 추가 성숙시키기 위하여 배양하였다. 형광(Epifluorescence, 마이오신VIIa, ROS 및 세포 내 칼슘 수준), RT-qPCR 및 RNA-시퀀싱을 수행하였다. EB 내에서 오가노이드 형성의 효율은 현적(hanging drop)의 세포 밀도에 의존된다. 630 nm 파장 LED를 사용하는 PBM은 ROS 과발현과 함께 내이 모세포 유사 세포(inner ear hair cell-like cell)의 분화를 더욱 향상시켰다. 전사체(transcriptome) 분석에 의해 귀 오가노이드 형성에 있어서의 PBM의 영향을 좌우하는 요인이 주로 신경 발달 관련 유전자 및 전구감각 세포(prosensory cell)의 유모세포로의 분화를 억제하는 HES5 유전자의 하향 조절임을 보여 주었다. 이러한 데이터는 내이 유모세포를 생성하기 위한 현재의 분화 프로토콜에 대한 정보를 제공한다.

도 1은 단일층(monolayer) 배양과 현적법 배양 기술 간의 EB의 직경 비교 결과로서, 다양한 배양 기술로 얻어진 EB의 형태를 사진으로서 보여 주며, 현적법에 의해 형성된 EB(B)가 단일층 배양에 의해 형성된 EB(A)보다 더 큰 것으로 나타났다. (C)는 현적법으로 EB를 생성하는 과정을 나타낸다. EB의 평균 직경은 0과 6 분화시 측정하였으며, 통계적으로 큰 EB의 직경은 0 일 대비 6 일에 확인하였다(D). 현적법에 의한 EB는 각 시점에서 단일층에 의한 EB보다 통계적으로 더 큰 것으로 나타났으며, 눈금자는 250 μm이고, * p <0.05, ** p <0.01 및 *** p <0.001이다.
도 2는 상이한 세포 밀도를 갖는 오가노이드의 수를 나타내는 그래프로서, 분화 과정 이후 형성된 오가노이드의 수는 세포 밀도의 상이함에 따라 다양한 것으로 나타났다. 상이한 세포 밀도를 갖는 이러한 오가노이드의 형태(검은색 화살표)가(A)에 나타나 있고, 오가노이드의 최대 수는 4.0 x 10⁵의 밀도에서 관찰되었다. 1.0 x 10⁵의 밀도와 비교하여 4.0 x 10⁵의 밀도에서 통계적으로 큰 오가노이드 수가 관찰되었다(B). 눈금자는 750 μm이고, NS는 유의하지 않음을 의미하며, * p <0.05, ** p <0.01 및 *** p <0.001이다.
도 3은 오가노이드에서 마이오신VIIa 양성 세포의 관찰 결과(절개 후 장착)로서, 분화 18 일에 조직을 고정시켜 형광(epifluorescence) 분석용으로 제조하였다. 사진(A)는 조직 분석 시점에서의 오가노이드를 나타내고, 사진(A)의 점선 내의 조직을 절개하여 오가노이드의 내부 표면을 노출시킨 다음, 내부 표면을 슬라이드 글래스 위에 장착하였다. 조직의 형광 분석에서 오가노이드 내부의 마이오신 VIIa 양성 세포(청색)와 Sox2 양성 세포(적색)를 낮은 배율(B) 및 높은 배율(C)에서 관찰할 수 있고, 각 사진의 눈금자는 크기가 다르며 각각의 사진마다 크기가 표시되어 있다.
도 4는 오가노이드에서 마이오신VIIa 양성 세포의 관찰 결과(절편 사진)로서, 분화 18 일에 조직을 고정시켜 형광 분석용으로 제조하였다. 사진(A)는 조직 분석 시점에서의 오가노이드를 나타내고, 전체 오가노이드를 틀에 장착하고 동결절단(cryocut)을 수행하였다. 사진(A)의 갈색 직사각형 내의 조직은 사진(B)와(C)에서 확대되어 나타나 있고, 조직의 형광 분석에서 오가노이드 내부에 마이오신 VIIa 양성 세포(적색, 핵은 DAPI로 염색됨)가 관찰되었다(B). 보다 높은 배율에서, 상기 세포들에서 GFP와 마이오신 VIIa의 발현이 확인되었다(C). 각 사진의 눈금자는 크기가 다르며 각각의 사진마다 크기가 표시되어 있다.
도 5는 실시간 중합 효소 연쇄 반응(RT PCR)을 이용한 마이오신 VIIa, Oct4 및 Sox2의 검출 결과로서, RT-PCR 검사를 통해 줄기세포 마커의 DNA 발현을 관찰하였다. HEI-OC1 세포(회색, 청각 세포주)와 분화된(흑색, 18 일) 오가노이드 모두에서 유지군(maintenance, 분화 과정 이전, 흰색)과 비교하여 마이오신 VIIa DNA 발현의 비율이 통계적으로 높게 관찰되었다(A). 다른 2개 세포 조건에 비해 유지군에서 Oct4 DNA 발현의 통계적으로 더 높은 비율로 관찰되었다(B). HE1-OC1 세포에 비해 유지군 줄기세포에서 Sox2 DNA 발현이 유의하게 높았다(C). * p <0.05, ** p <0.01 및 *** p <0.001.
도 6은 마우스 ESC의 오가노이드로의 분화에 대한 630 nm LED의 영향을 나타낸 결과이다.(A)는 분화 14 일 시점의 배아체(EB)를 보여주고 있다. 대조군과 비교하여, 630 nm LED 노출된 EB는 돌출된 오가노이드 유사 구조의 수가 더 많았다. 630 nm LED 노출된 EB에서 통계적으로 유의하게 더 많은 수의 오가노이드 유사 돌출부(protrusion)가 관찰되었다(B). 마이오신 VIIa로 염색한 18 일 분화 단계에서의 대조군(C) 및 630 nm LED 노출(D) EB의 형광 사진이 나타나 있다. 대조군에 비해 630 nm LED 노출군에서 마이오신 VIIa(적색)가 상대적으로 높게 발현된 것이 관찰되었다. RT-qPCR에 의한 마이오신 VIIa DNA 발현의 증가(E) 및 Oct4 DNA 발현의 감소(F)는 LED 처리 없는 분화군과 비교하여 630 nm LED EB군에서 나타났다. 형광 현미경을 사용하여 ROS의 강도와 세포 내 칼슘 발현을 정량화하였다.(H)는 LED 처리하지 않은 EB의 사진이고,(I)는 630nm LED 처리한 EB의 사진이며, 모두 ROS 발현이 녹색으로 나타나 있다. 630 nm LED 처리 EB(I)가 LED 처리하지 않은 EB에 비하여 ROS의 강도가 상대적으로 높은 것으로 나타났다. 세포 내 칼슘 수준은 630 nm LED 군에서 유의한 상승을 보이지 않았으나(K), 세포 내 ROS 수준은 630 nm 조사된 EB군에서만 유의하게 높은 것으로 나타났다(J). CTCT는 보정된 총 세포 형광을 의미하고, 검은 색 눈금자는 500 μm를 나타내며, 흰색 눈금자는 100 μm를 나타낸다. * p <0.05, ** p <0.01 및 *** p <0.001.
도 7은 ES 세포 EB의 분화 결과로서, 배양하는 21 일 동안 현미경(brightfield)을 사용하여 얻은 EB의 사진이다. 2 일에서 5 일 사이의 공초점 현미경 사진은 기초 상피의 형성을 나타내는 라미닌(laminin) 양성 세포를 나타낸다. D6-D10 동안, Pax8 양성 세포는 신경 외배엽을 나타내지만 Ecad 양성 세포는 귀 소포(otic vesicle)의 감각 상피를 함유한 비-신경 외배엽을 나타낸다.
도 8은 유전자 발현 프로파일에 대한 생물정보학적(Bioinformatic) 분석이다.(A)는 내이 유모세포(inner ear hair cell) 유사 세포의 2개 군(대조군 및 630 nm 처리군)에서의 총 발현 유전자의 요약이다. 벤 다이어그램에 발현된 2개 군의 EB에서 얻은 별개 및 공통된 유전자의 수가 표시되어 있다. 2개 군 모두에서 총 19,474 개의 유전자가 공통적으로 발현되었다.(B)는 유전자 발현 수준의 비교 다이어그램이다. 대조군 및 630 nm 처리군에서 발현된 유전자에 대한 FPKM 값의 분포가 회색 및 청색 곡선으로 각각 나타나 있다. FPKM의 평균, 중간 값 및 모드(mode) 값은 각각 녹색, 하늘색, 분홍색 선으로 표시되어 있고, 분포 밀도는 두 샘플에서 비슷하였다.
도 9는 PBM 조사에 의해 영향받는 EB의 전사체(transcriptome) 분석 결과로서,(A)는 대조군과 630 nm 군 간의 비교에서 상향 조절 및 하향 조절된 DEG 수(log₂ FPKM ≥ 1, P-값 <0.05)의 벤 다이어그램이다. 겹치는 영역은 유의하지 않은 유전자의 수를 나타낸다.(B)는 샘플 간 102 DEG의 유전자 발현 프로파일이다. 색상의 강도는 log₁₀ FPKM 값에 따라 보정된 유전자 발현 수준을 나타낸다.(C)는 PBM 조사에 영향받은 EB의 유전자 온톨로지(Gene Ontology, GO) 증폭 분석 및 102 DEG의 발현 프로파일이다. 유전자 기능 분류는 DAVID 기능 주석 자원을 사용하여 수행하였다. 왼쪽과 오른쪽의 X축은 유의 수준(-log₁₀(p-value)으로 기록됨) 및 해당 GO 항목에 각각 맵핑되는 유전자의 수를 나타낸다. Y 축은 관련된 기능적 GO 항목(생물학적 과정은 적색, 세포 성분은 녹색, 분자 기능은 하늘색)을 나타낸다. 음영 처리된 막대 및 전체 막대 그래프는 각각 상향- 및 하향-조절된 DEG가 있는 GO 분석 결과를 나타낸다.(D)는 5 개의 관련 GO 항목(자극에 대한 반응, 신호 전달, 단백질 대사 과정, 유전자 발현 및 신경계 발달)과 연관된 DEG의 유전자 발현 프로파일이다. 색상의 강도는 log₂ FPKM 값에 따라 보정된 유전자 발현 수준을 나타낸다. 상향 및 하향 조절된 유전자는 각각 적색 및 청색 글자로 표시되어 있다.
도 10은 모든 발현된 유전자(22,215)의 계층적 클러스터링 분석 및 DEG의 통계적 비교 결과로서,(A) 및(B)는 대조군 및 630 nm 처리군 간의 쌍별 비교(pairwise comparison)에 의해 수행된 FPKM 화산형, 산란 및 MA 플롯이다. 상기 통계 분석에서 적색과 청색 점은 통계적으로 유의한 상향- 및 하향-조절 DEG를 나타낸다. 검정 점들의 중앙선은 표본 사이의 평균 발현 값에서 차이가 없음을 나타낸다. 하향 조절 DEG의 수가 PBM-조사 EB에서의 상향 조절 DEG보다 큰 것으로 나타났다.
도 11은 DEG에 기초한 단백질-단백질 상호 작용 네트워크로서, 43 개의 확인된 단백질 중 25 개를 포함하는 네트워크는 STRING[다양한 증거에 기반한 기능성 단백질 연합 네트워크 분석]에 의해 매핑되었다. 각 증거는 범례에 표시된 것과 같이 다른 색상의 선으로 표시되어 있다. 증거 관점에서 노드와 가장자리는 유전자와 노드 간의 상호 작용을 의미한다. 도시된 바와 같이, 상기 네트워크에서 대부분의 단백질은 서로 밀접하게 관련되어 있는 것으로 밝혀졌다.
도 12는 유모세포 감각 시스템과 관련된 기준 유전자(reference gene)의 유전자 발현 프로파일이다. Amigo2 데이터베이스로부터 얻어진 청각 수용체 및 유모세포 분화 관련 유전자의 유전자 발현 프로파일링을 수행하였다. 히트맵(heatmap)을 생성하기 위하여 Log₂-변환 FPKM 값을 사용하였다. 도면에 나타난 바와 같이, 유모세포 감각 시스템 관련 유전자는 전사 발현과 유사한 패턴을 나타냈다.

본 발명은 (a) 배아체를 형성하는 단계; 및 (b) 단계(a)에서 형성된 배아체를 수집하여 외배엽 분화 배지에서 배양하는 동안 광생체조절을 이용하여 귀 연계 조직으로 분화시키는 단계를 포함하는 배아줄기세포의 분화 방법을 제공한다.

본 발명의 분화 방법은 배아체를 형성하는 단계[즉, 단계(a)]를 포함한다. 단계(a)에서는 미분화된 배아줄기세포로부터 배아체를 형성하는 단계이다. 배아체는 현적법(Hanging drop technique) 또는 단일층(monolayer) 세포 배양을 이용하여 형성할 수 있다.

상기 현적법은 미분화된 배아줄기세포를 포함하는 유지 배지의 액적을 배양 접시의 뚜껑에 다양한 세포 밀도, 예를 들어, 유지 배지 30 μL 당 1 × 10⁵ ~ 6.8 × 10⁵ 세포/mL(1 × 10⁵, 2 × 10⁵, 4 × 10⁵ 및 6.8 × 10⁵ 세포/mL)로 접종하여 12 ~ 36시간 동안 배양하여 수행될 수 있다.

상기 단일층 세포 배양은 미분화된 배아줄기세포를 외배엽 분화 배지에서 12 ~ 36시간 동안 배양한 후, 마트리젤 함유 분화 배지에서 36 ~ 60시간 동안 배양함으로써 수행될 수 있다.

본 발명의 분화 방법은 단계(a)에서 형성된 배아체를 수집하여 외배엽 분화 배지에서 배양하는 동안 광생체조절을 이용하여 귀 연계 조직으로 분화시키는 단계[즉, 단계(b)]를 포함한다. 단계(b)에서는 배아체로부터 귀 연계 조직으로 분화시키는 단계이며, 이 때 광생체조절을 이용하여 분화 효율을 극대화시킬 수 있다.

일 구현예에서, 단계(b)의 배양은 분화 2 일째에 비 신경 외배엽을 유도하고, 3 일째에 전기원판성(preplacodal) 외배엽을 유도한 후, 6 일째에 성숙 배지로 대체하여 18일까지 분화시킴으로써 수행될 수 있다.

단계(b)에서 사용되는 광생체조절은 분화 6 일부터 8 일까지 배양 세포에 발광 다이오드(LED)를 1 ~ 5회 조사하는 것일 수 있으며, 상기 발광 다이오드는 파장 470 ~ 740 nm일 수 있으며, 상기 발광 다이오드는 5 ~ 60 mW의 강도로 100 ~ 1000 초 동안 조사될 수 있다.

현적법을 사용하여 생성된 EB의 직경은 단일층 배양 기술을 사용하여 생성된 EB의 직경에 비하여 통계적으로 유의하게 증가되었다. 또한, LED를 사용하는 PBM에 의해 내이 모세포 유사 세포(inner ear hair cell-like cell)로의 분화가 더욱 향상되었으며, 특히, 오가노이드 형성의 가장 높은 비율은 4 × 10⁵ 세포/mL의 ESC 밀도에서 관찰되었다.

이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이에 제한되는 것은 아니다.

<실시예>

1. 시약 및 방법

1-1. 세포 및 세포 배양

강화된 녹색 형광 단백질(enhanced green fluorescence protein, eGFP)을 발현하는 미분화 마우스 ESC를 Hosup Shim 교수(단국대 학교, 천안)로부터 제공받아 사용하였다. 세포를 피더 세포가 없는 젤라틴 코팅 판에서 배양하였고, 15 %(v/v) 열-활성화된 우태아혈청(heat-activated fetal bovine serum, FBS; ATCC, Manassas, VA, USA), 0.1 mM β-머캅토에탄올(Gibco, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), 0.1 mM 글루타맥스(Glutamax, Gibco), 0.1 mM ES 적격의 비-필수 아미노산(NEAA; Welgene, Daegu, Korea), 1 % 페니실린-스트렙토마이신(PS; ATCC), 1000 U/mL 백혈병 억제 인자(Millipore, Merck, Burlington, MA, USA), 0.033 % CHIR99021(Tocris Bioscience, Bristol, UK) 및 0.125 % PD035901(Tocris Bioscience)가 보충된 고 포도당 둘베코 변형 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle's Medium, DMEM; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)로 구성된 ESC 배지로 37 ℃, 5 % CO₂ 가습 조건에서 배양하였다.

1.5 % 녹아웃 혈청 대체물(Gibco), 0.1mM β-머캅토 에탄올, 1mM 나트륨 피루베이트(Stem Cell Technologies, Vancouver, BC, CAN), 0.1mM NEAA, 및 1 % PS가 보충된 GMEM 배지(Glasgow Minimum Essential Medium, Gibco)를 사용하여 외배엽 분화를 개시하였다. 1 % N₂ 보충제(Gibco), 1 % 글루타맥스 및 0.1 % 노르모신(Normocin, InvivoGen, San Diego, CA, USA)이 보충된 DMEM/F12(Sigma-Aldrich) 배지를 성숙 배지로 사용하였다.

1-2. 배아체 형성

배아체(EB)는 단일층 세포 배양 또는 현적법(Hanging drop technique)을 사용하여 생성하였다. 단일층 배양을 위하여, 미분화된 ESC를 0.25 % 트립신/에틸렌 디아민테트라아세트산(TE; ATCC)으로 분리하고, 96-웰 U자형 플레이트(Nalge Nunc International, Roskilde, Denmark)에 9,000 세포/mL의 밀도로 접종하여, 37 ℃의 외배엽 분화 배지에서 24 시간 동안 5 % CO₂를 함유한 가습 배양기에서 배양하였다. 배양 플레이트에서 배지 절반을 제거한 후, 2 % 마트리젤(Matrigel, vol/vol; BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA)을 함유하는 분화 배지를 동일한 양으로 첨가하고 동일한 조건 하에서 48 시간 동안 배양하였다. 현적법(Hanging drop technique)을 위하여, ESC를 TE로 분리시킨 후, 유지 배지 30 μL 당 다양한 세포 밀도(1 × 10⁵, 2 × 10⁵, 4 × 10⁵ 및 6.8 × 10⁵ 세포/mL)의 액적을 배양 접시의 뚜껑에 접종하고, 상기 기재된 단일층 배양과 동일한 조건 하에서 48 시간 동안 배양하였다. 생성된 EB를 수집하고, 인산-완충 식염수(PBS)로 세척하여, 24-웰 플레이트에 도말한 다음, 37 ℃의 외배엽 분화 배지에서 5 % CO₂를 함유하는 가습된 배양기에서 배양하였다.

1-3. 내이 유사 구조로의 분화

선행문헌(Koehler KR, Hashino E.Nature protocols. 2014;9:1229-44.)에 기재된 방법에 따라 ESC를 내이 유사 오가노이드로 분화시켰다. 요약하면, 분화 2 일째에 배양된 세포에 10 ng/mL 재조합 BMP4(Stemgent, Beltsville, MD, USA)와 1 μM SB431542(Stemgent)를 첨가하여 비 신경 외배엽을 유도하였다. 3 일째에, 25 ng/mL FGF-2(Peprotech, Rocky Hill, NJ, USA)와 1 μM LDN-193189(Stemgent)를 첨가하여 전기원판성(preplacodal) 외배엽을 유도하였다. 세포를 2 일 동안 배양하고, 6 일째에 배지를 1 % 마트리겔을 함유하는 성숙 배지로 대체하였다. 18 일까지 격일로 배지의 절반을 마트리겔 없는 성숙 배지로 대체하였다. 분화 과정은 도 1에 나타나 있다.

1-4. LED 조사

PBM은 성숙 과정에서 파장 470, 630, 740 nm 인 LED(Wontech Co., Daejeon, Korea)를 사용하여 세포에 조사하였다. 표적 세포를 40 mW의 강도로 750 s(전체 에너지 밀도 = 30 J/cm²/day)로 직접 조사하였다. 광 조사는 6 일부터 8 일까지 3 회 수행하였다. LED의 파워는 SOLO 2 레이저 파워 미터(Newport Corporation, Irvine, CA, USA) 및 XLP12-1S-H2-DO 검출기 헤드(Newport Corporation)로 빈 플레이트의 바닥에서 셀 앞에서 측정하였다.

1-5. EB 형태학적 분석

상이한 배양 기술을 이용하여 형성된 EB의 크기와 형태학적 특성을 현미경(brightfield microscopy, CKX53, Olympus, Tokyo, Japan)으로 관찰하였다. EB를 촬영하고 분화 2 일 및 6 일째에 직경을 측정하였다. 또한, 단일층 및 현적법을 사용하여 얻은 EB의 평균 직경을 분화 2 일 및 6 일에 비교하였다. 또한, EB에서의 오가노이드 형성의 연속 분화 및 GFP 발현은 7 일에서 18 일까지의 성숙 단계에서 형광으로 관찰하였다.

1-6. 형광(epifluorescence) 분석

이미징용 EB를 준비하기 위하여 동결절편(cryosection)을 만들었다. 요약하면, EB를 4 ℃에서 밤새 PBS 중의 4 % 파라포름 알데히드로 고정시키고, 차가운 PBS로 10 분 동안 3 회 세척하였다. 각 30 분 동안 10, 20 및 30 %(wt/vol) 수크로오스-PBS 용액에서 항온 처리하여 세포를 동결 보존하고 냉동주형(cyromold)으로 옮겼다. 수크로오스 용액을 광학 절단 온도 화합물(optical cutting temperature compound, Tissue-Tek, Torrence, CA, USA)로 대체하였다. 샘플을 드라이 아이스로 급속 냉동하여 블록을 만들고 저온 유지 장치 마이크로톰(Leica, Wetzlar, Germany)을 사용하여 5-μm 슬라이스로 절단하였다. 절편 샘플을 슬라이드에 장착하고 이미징을 위하여 염색하였다.

장착 후, 실온(RT)에서 10 분 동안 PBS 중의 0.25 % Triton X-100(Sigma-Aldrich)으로 세포를 투과시키고, 비특이적 결합을 방지하기 위하여 10 % 정상 염소 혈청(NGS; Vector Laboratories, Burlington , ON, Canada) 및 0.1 % Triton X-100으로 블록킹시켰다. 오가노이드 내 마이오신 VIIa 양성 세포를 확인하기 위하여 세포를 4 ℃에서 하룻밤 동안 3 % NGS와 0.1 % Triton X-100을 포함하는 PBS 중의 마이오신 VIIa 1차 항체(1:200, rabbit polyclonal; Millipore)와 함께 배양하였다. 세포를 각각 5 분 동안 PBS로 3 회 세척 한 다음, 1 시간 동안 Alexa Fluor 568(1:1000, Abcam, Cambridge, UK) 접합된 항-토끼 2차 항체와 함께 배양하였다. 핵은 4', 6-디아미디노-2-페닐인돌(4', 6-diamidino-2-phenylindole)로 가시화시켰다. Pax-8, 라미닌(laminin) 및 E-카데린(E-cadherin)에 대한 항체를 사용하여 중간 분화 과정을 확인하였다.

절개된 오가노이드의 경우 돌출된 오가노이드를 가진 EB를 선택하여 염색하였다. 장착하기 전에, 오가노이드는 해부 현미경 하에서 미세 바늘을 사용하여 절개하였다. 상피 조직은 오가노이드를 평평하게 하기 위하여 퍼졌으며 관찰을 위하여 슬라이드 위에 올려 놓았다. 대표적인 사진은 공초점 현미경(Olympus)을 사용하여 얻었다.

1-7.RT-qPCR

내이 유사 구조 유전자의 발현을 분석하기 위하여 GeneAll Hybrid-R^TM(GeneAll Biotechnology, Songpa-gu, Korea)을 이용하여 제조사의 지시에 따라 총 RNA를 분리하였다. 순방향 및 역방향 프라이머(Oligomer, Bioneer, Daejeon, Korea)를 사용하여 cDNA를 합성하였다: myosin VIIa(5'-CACCAAGGGAGATTGTGGCC-3 ', 5'-CCTTGGACACCATGACACGG-3'), Oct4(5'-GCCTTGCAGCTCAGCCTTAA-3 ', 5'-AAGCCAGGAATGGAAGCAGC-3'), Sox2(5'-CACCCCTAGCCAACTTGCTG-3 ', 5'-CTTTGTTCTCCTCACCCGGC-3') 및 GAPDH(5'-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3 ', 5'-TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA-3').

AB Applied Biosystem-7500 실시간 PCR 시스템(Life TechnologiesTM, Carlsbad, CA, USA)으로 RT-qPCR을 이용하여 유전자 발현을 평가하였다.

1-7. ROS 생산

ROS 및 세포 내 칼슘 이온의 생성을 공초점 현미경으로 평가하였다. 세 번째 LED 조사 직후, 상술한 바와 같이 EB를 형광 분석을 위하여 준비하였다. 투과 및 블록킹 후, 절편된 샘플을 20 μM의 2 ', 7'- 디클로로디하이드로 플루오레세인 디아세테이트(H₂DCF-DA; Invitrogen)로 15 분 동안 실온에서 염색하고 PBS로 2 회 세척하였다. H₂DCF-DA는 세포 내 과산화물에 의해 높은 형광성의 디클로로플루오레세인으로 전환되는 비형광 화합물이다. Calcium Green-1 AM(Molecular Probes, Eugene, OR, USA)을 사용하여 세포 내 에스테라아제 가수분해에 의해 세포질에 포획된 칼슘 이온을 검출하였다. 샘플을 4 μM Calcium Green-1 AM으로 5 % CO₂, 33 ℃에서 1 시간 동안 염색하였다. 각 염색 과정의 대표적 사진은 동등한 사진 현상 조건의 조합 하에 488 nm 방출 공초점 현미경(올림푸스)를 사용하여 얻었다. 샘플의 보정된 총 세포 형광은 ImageJ 1.43u(NIH, Bethesda, MD, USA)를 사용하여 측정하였다.

1-8. RNA 시퀀싱 분석용 시료 준비 및 라이브러리 제작

PBM이 EB의 내이 유사 오가노이드로의 분화에 미치는 영향을 RNA 시퀀싱(RNA-Seq)을 사용하여 추가로 분석하였다. 유의한 결과를 보이는 630 nm에서 조사된 EB 를 사용하여 대조군과 비교하였다. 단일 EB에서 충분한 RNA를 얻을 수 없기 때문에 각 조건에 대해 5 개의 EB를 합하여(pooling) 수행하였다. 제조자의 지시에 따라 TRIzol 시약(Invitrogen)을 사용하여 합쳐진 샘플로부터 RNA를 추출하였다. 순도를 높이고 DNA 오염을 피하기 위하여 DNase I(Qiagen, Hilden, Germany)의 존재 하에서 RNeasy Mini Kit를 사용하여 RNA를 정제하였다. RNA의 품질은 Agilent Bioanalyzer 2100 시스템(Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)을 사용하여 28S/18S 비율과 RNA 무결성 수(RNA integrity number, RIN)를 사용하여 검증하였다. 대조군과 630 nm 조사 EB의 풀 샘플에서 추출한 모든 RNA는 RIN>8.1이었다. RNA-Seq cDNA 라이브러리를 제작하기 전에 2 μg의 RNA를 사용하여 mRNA를 oligo-dT 자기 비드로 농축하였다. 이중 가닥 cDNA는 SuperScript III 역전사 효소(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)로 즉시 합성하였다. 그 다음 TruSeq RNA 샘플 준비 키트(Illumina, San Diego, CA, USA)를 사용하여 합성 cDNA 샘플을 최종 수선(end-repair), 폴리-아데닐레이션(poly-adenylation) 및 5 '및 3' 어댑터 라이게이션(adaptor ligation)을 순차적으로 수행하였다. 수행 처리된 cDNA 단편을 PCR에 의해 라이브러리 농축시켰다. 그 다음, 적절한 크기의 단편을 BluePippin 2 % 아가로오스 겔 카세트(Sage Science, Inc., Beverly, MA, USA) 상에 분리하였고; 최종 라이브러리 크기는 400-500 bp였다. 얻어진 모든 cDNA 라이브러리는 Illumina Hiseq2500 시퀀서에서 쌍-말단(paired-end) 시퀀싱 모드를 사용하여 시퀀싱하였다.

1-9. 전사체 및 차별적으로 발현된 유전자 분석

시퀀싱 리드 매핑(sequencing read mapping)을 하기 전에 FAST-QC를 사용하여 후속 분석에서 오류를 유발할 수 있는 낮은 품질의 원시 데이터(raw read)를 필터링하였다. 구체적으로, 필터된 리드의 양 말단에서 스킵된 베이스 10 % 초과 포함 리드(read), 20 % 미만의 품질 평가 점수를 갖는 염기를 40 % 초과로 포함하는 시퀀싱 리드, 20 미만의 평균 품질 평가 점수를 갖는 리드 및 20 미만의 품질 평가 점수를 갖는 시퀀스를 매핑 품질을 향상시키기 위하여 폐기하였다. 필터링 후, 원시 데이터(raw read)를 TopHat 소프트웨어 v.2.1.0 장착 Ensembl 릴리스 77을 사용하여 마우스(Mus musculus) 게놈과 함께 정렬하였다. 유일하게 매핑된 판독(read) 쌍만을 차별적으로 발현된 유전자(differentially expressed gene, DEG) 분석에 사용하였다. DEG를 확인하기 위하여, 백만 단편 당 킬로베이스 엑손 당 단편(fragments per kilobase of exon per million fragment, FPKM)으로 유전자 발현을 측정하였고, 발현 수준은 CUFFLINKS 소프트웨어 v.2.2.1을 사용하여 계산하였다. 두 샘플 간의 DEG는 CUFFLINK 파이프 라인에서 CUFFDIFF를 사용하여 결정하였다. 대조군과 630 nm 처리군을 비교하기 위하여 log₂ 배수-변화(fold-change, FC) ≥ 1 및 p <0.05 인 DEG를 조사하였다. 유전자 온톨로지(Gene Ontology, GO)와 농축 분석은 데이터베이스[Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery(DAVID) v6.8(https://david.ncifcrf.gov/)]fmf 사용하여 수행하였다. GO 농축 분석 작업 흐름은 하기 기준을 따랐다. 먼저, DEG 분석으로 확인된 다중 유전자 목록을 입력 유전자로 사용하였다. 둘째, GO 주석에 대한 3 가지 주요 기능(세포 성분[cellular component, CC], 분자 기능[molecular function, MF], 생물학적 과정[biological process, BP])이 추출되었다. 셋째, 필터링을 위한 기본 매개변수(최소 중복 2, 농축 인자 1.5, p <0.05)로 기능성 농축 분석을 수행하였다. 또한, DEG의 클러스터링 분석은 log₂FPKM 값에 기초하여 수행되었고 히트 맵(heat map)은 Pheatmap 소프트웨어(v1.0.8, http://cran.r-project.org/web/packages/pheatmap/index.html에서 이용 가능)를 사용하여 계층적 클러스터링 방법(완전한) 기능으로 생성하였다. 단백질-단백질 상호 작용을 조사하기 위하여 오픈 소스 생물정보학 도구인 STRING(Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes/Proteins)을 다음과 같은 매개변수로 사용하였다: 생물체, mus musculus; 신뢰도(점수), 0.40; 및 상호작용자, 없음/질의 단백질 단독. 관심 GO 항목과 관련된 유전자는 AmiGO 2 데이터베이스(http://amigo.geneontology.org/amigo)에서 검색하여 얻었다.

1-10. 통계 분석

실험 및 대조 시료의 모든 데이터는 평균±표준편차로 표시하였다. 모든 데이터는 GraphPad Prism(GraphPad Software, La Jolla, CA, USA) 또는 SPSS(IBM SPSS Statistics, Armonk, NY, USA) 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 데이터가 매개변수적인지(parametric) 또는 비-매개변수적인지(non-parametric)를 결정하기 위하여 Kolmogorov-Smirnov 검정을 수행하였다. 군 간의 유의한 차이는 매개변수적 분포를 갖는 데이터에 대하여는 t-검정 및 비매개변수적 분포에 대하여는 Mann-Whitney U 검정을 사용하여 통계적으로 분석하였다. 귀무 가설을 기각하기 위하여 검정력 분석의 평가는 유형 II 오류의 확률(베타 값)을 결정하여 평가하였다. p <0.05는 통계적으로 유의한 것으로 간주하였고 * p <0.05, ** p <0.01 및 *** p <0.001로 정의하였다.

2. 결과

2-1. EB 형성 및 배양 기술

EB의 형성은 ESC를 오가노이드로 분화시키는 기본 단계이다. 배양 기술이 EB 형성에 영향을 미칠 수 있는지 여부를 시험하기 위하여 마트리젤(세포 부착 분자)을 사용하는 단일층 배양 기술과 현적법을 비교하였다. 현적법은 세포 배양 접시의 뚜껑에 세포 배양 배지와 세포 방울을 적재하여 중력을 이용하여 세포 클러스터를 생성한다(도 1). 각 배양 기술을 이용하여 생성된 EB의 직경을 비교하였다. 배양 기술의 효과를 비교하기 위하여 비슷한 밀도의 ESC를 사용하였다.

단일층 배양 기술을 사용하면 하나의 배양 접시에서 여러 개의 EB가 생성되고(도 1A), 현적법을 사용하면 매달린 방울에 의해 단지 1개의 EB가 생성되지만(도 1B), 단일층 배양 기술에 의해 생성된 각 EB의 크기는 현적법을 사용하여 생성된 것보다 작았다. EB 직경의 차이는 분화 0 일과 6 일에 정량하였다. 현적법을 사용하여 생성된 EB의 직경에 있어서 통계적으로 유의한 증가는 단일층 배양 기술을 사용하여 생성된 것과 비교하여 두 시점 모두에서 관찰되었다(양측 Mann-Whitney 검정: day 0, n = 9, p = 0.0004, U = 0.0, power = 1.0, β-value = 0.0; day 6, n = 6-9, p = 0.0017, U = 0.0, power = 1.0, β-value = 0.0). 현적법을 사용하여 배양된 EB는 두 시점 사이에 크기가 증가했지만, 단일층 배양에서 EB 크기는 유의한 증가가 관찰되지 않았다. 또한, 단일층 배양 기술을 사용하여 생성된 대부분의 EB는 전체 분화 과정 동안 유지되지 않았다.

2-2. 세포 밀도에 따른 조직 형성의 EB 크기와 비율

다음으로, 세포 밀도가 EB의 크기 및 성공적인 오가노이드 생성의 속도에 영향을 미치는지 평가하기 위하여 현적법을 사용하였다. ESC를 4 가지 다른 세포 농도(1, 2, 4, 6.8 × 10⁵ cells/mL)에서 성장시켰고, EB 직경은 2 및 6 일 분화 시점에 측정하였다. 두 시점 모두에서 EB의 직경은 세포 밀도가 높을수록 더 컸다.

2 일째에, 1 x 10⁵ 세포/mL와 비교하여 세포 밀도가 2, 4, 및 6.8 × 10⁵ 세포/mL인 경우 EB 직경이 통계적으로 유의하게 증가하였다(양측 Mann-Whitney U 검정, n = 5: 2 Х 10⁵, p = 0.0117, U = 0.0, power = 0.985, β-value = 0.015; 4 Х 10⁵, p = 0.0114, U = 0.0, power = 1.0, β-value = 0.0; 6.8 Х 10⁵, p = 0.0117, U = 0.0, power = 1.0, β-value = 0.0). 또한, 2 × 10⁵ cells/mL에 비해 배양 밀도가 4 및 6.8 × 10⁵ cells/mL인 경우에도 EB 직경이 통계적으로 유의하게 증가하였다(양측 Mann-Whitney U 검정, n = 5: 4 Х 10⁵, p = 0.0114, U = 0.0, power = 0.909, β-value = 0.091; 6.8 Х 10⁵, p = 0.0117, U = 0.0, power = 0.994, β-value = 0.006). 마지막으로, 4 × 10⁵ cells/mL에 비해 6.8 × 10⁵ cells/mL의 배양 밀도에서 EB 직경이 통계적으로 유의하게 증가하였다(양측 Mann-Whitney U 검정, n = 5: p = 0.0333, U = 0.0, power = 0.731, β-value = 0.269).

6 일째에, 세포 밀도가 4 및 6.8 x 10⁵ cells/mL인 경우 1 x 10⁵ cells/mL에 비해(양측 Mann-Whitney U 검정, n = 5: 4 Х 10⁵, p = 0.0144, U = 0.5, power = 0.992, β-value = 0.008; 6.8 x 10⁵, p = 0.0117, U = 0.0, power = 1.0, β-value = 0.0) 및 2 x 10⁵ cells/mL에 비해(양측 Mann-Whitney U 검정, n = 5: 4 Х 10⁵, p = 0.0192, U = 0.5, power = 0.914, β-value = 0.086; 6.8 Х 10⁵, p = 0.0114, U = 0.0, power = 1.0, β-value = 0.0) EB 직경이 통계적으로 유의하게 증가하였다.

4 × 10⁵ 세포/mL와 비교하여 세포 밀도 6.8 × 10⁵ cells/mL인 경우에 EB 직경이 통계적으로 유의하게 증가하였다(양측 Mann-Whitney U 검정, n = 5: p = 0.0109, U = 0.0, power = 1.0, β-value = 0.0).

EB 직경과 ESC 밀도 사이의 상관 관계와는 대조적으로, 오가노이드 형성 속도는 세포 밀도가 증가함에 따라 증가하지 않았다. 오가노이드 형성의 가장 높은 비율은 4 × 10⁵ 세포/mL의 ESC 밀도에서 관찰되었다(도 2A). 오가노이드의 수는 동일한 수의 EB 군 중에서(n = 24) 계산되었다. 1 × 10⁵ cells/mL에 비해 세포 밀도가 4 × 10⁵ cells/mL인 경우에 오가노이드 수가 유의하게 증가한 것으로 관찰되었다(양측 Mann-Whitney U 검정, n = 7: p = 0.0020, U = 0.0, power = 1.0, β-value = 0.0) (도 2A). ESC의 밀도가 높아짐에 따라 EB 크기가 증가했지만, 오가노이드를 생성하기 위한 최적의 세포 밀도는 4 x 10⁵ cells/mL였다.

2-3. 형광을 이용한 마이오신 VIIa 양성 세포로의 분화의 평가

상기 방법 항목에 기재된 프로토콜을 사용하여, 4.0 × 10⁵ mESC를 현적법을 사용하여 18 일 동안 분화시켰다. 고정한 후, 오가노이드를 절개하고(도 3)과 동결절단(cryocut)을 이용하여 절편화하였다(도 4). 오가노이드로 추정되는, EB의 돌출된 낭종성 유사 영역이 관찰되었다(도 3 및 도 4A). 배율이 낮을수록 이러한 부위는 마이오신 VIIa 양성 세포로 둘러싸인 무세포 영역으로 나타났으며, 이는 mESC로부터 분화된 HC 유사 세포였다(도 3 및 도 4B). 더 높은 배율에서, 몇몇 세포가 GFP로 공-염색되었으며(도 4C), 이는 mESC에서 유래된 것임을 나타낸다. 분화된 지지 세포-유사 세포로 추정되는 Sox2-양성 세포는 더 높은 배율에서 마이오신 VIIa-양성 세포에 인접하여 관찰되었다(도 3C).

2-4. qRT-PCR을 이용한 마이오신 VIIa 양성 세포로의 분화 평가

표본을 qRT-PCR로 분석하여 여러 마커의 발현을 확인하였다. HC 유사 세포로의 분화를 예측하기 위하여 마이오신 VIIa를 사용하였으며, Oct4는 다능성 마커로 사용하였다. Sox2는 다능성 및 지지 세포로의 분화를 검출하기 위해 사용하였다. 마이오신 VIIa를 검출하기 위하여, 유지 단계의 ESC를 음성 대조군으로 사용하였고, HEI-OC1 세포를 양성 대조군으로 사용하였다. 음성 대조군 세포와 비교하여 분화된 표본과 HEI-OC1 세포에서 마이오신 VIIa 발현이 통계적으로 유의하게 증가하였다(양측 Mann-Whitney U 검정; HEI-OC1 대 유지 세포, , n = 12, p = 0.0166, U = 30.0, power = 0.961, β-value = 0.039; 분화된 세포 대 유지 세포, n = 12-18, p <0.0001, U = 0.0, power = 1.0, β-value = 0.0)(도 5A). 이로써 mESC의 내이 세포-유사 분화를 확인할 수 있다.

Oct4를 검출하기 위하여, 유지 단계의 ESC를 양성 대조군으로 사용하였고, HEI-OC1 세포를 음성 대조군으로 사용하였다. HEI-OC1 및 분화된 세포와 비교하여 유지 세포에서 Oct4 발현이 통계적으로 유의하게 증가하였다(양측 Mann-Whitney U 검정: HEI-OC1 대 유지 세포: n = 12, p < 0.0001, U = 0.0, power = 0.999, β-value = 0.001, 분화된 세포 대 유지 세포: n = 12-18, p = 0.0118, U = 48.0, power = 0.993, β-value = 0.007)(도 5B). 이로써 유지 세포의 다능성(pluripotency)과 분화된 세포의 다능성(pluripotency)의 상실을 확인할 수 있다.

Sox2 검출을 위하여, Sox2 발현이 형광을 이용하여 확인되지 않았기 때문에 HEI-OC1 세포를 음성 대조군으로 사용하였다. HEI-OC1에 비해 유지 세포에서 Sox2 발현이 통계적으로 유의하게 증가하였다(양측 Mann-Whitney U 검정: HEI-OC1 대 유지 세포, n = 6-10, p = 0.0002, U = 0.0, power = 0.999, β-value = 0.001; 분화된 세포 대 유지 세포, n = 6-18, p = 0.1717, U = 33.0, power = 0.186, β-value = 0.814) (도 5C). 이로써 유지 세포의 다능성을 확인할 수 있다. 분화된 세포에서의 Sox2 발현은 군 간에 통계적으로 유의한 차이가 없어서 뚜렷하지 않았고, 이는 분화된 지지 세포에 의한 Sox2의 발현에 의한 것으로 추정된다.

2-5. 오가노이드로의 마우스 ESC 분화에 미치는 LED 조사의 영향

LED 조사는 성숙 단계에서 수행되었고 오가노이드 형성 속도를 평가하였다. 470, 630 및 740nm의 3개 LED 파장이 사용되었다. 오가노이드 형성 속도에 있어서 대조군에 비해 470 nm 조사된 EB에서 통계적으로 유의한 감소가 관찰되었다(양측 Mann-Whitney U 검정: n = 6, p = 0.0022, U = 0.0, power = 0.950, β-value = 0.050). 상기 파장에서 더 이상의 평가는 수행하지 않았다.

630 nm 조사된 EB에서 통계적으로 유의하게 증가된 오가노이드 형성 속도가 관찰되었다(양측 Mann-Whitney U 검정: n = 6: p = 0.0050, U = 0.0, power = 1.0, β-value = 0.0) (도 6A 및 B). 형광 분석에서 대조군인 LED 조사 없이 분화된 오가노이드(도 6C)와 비교하여 630 nm LED 조사된 오가노이드(도 6D)에서 증가된 마이오신 VIIa 발현이 관찰되었다. 다음으로, LED 조사없이 분화된 세포를 대조군으로 사용하여 qRT-PCR을 사용하여 마이오신 VIIa 및 Oct4의 유전자 발현을 평가하였다. 각 표본에 대해 기준선(분화 전)으로부터 배수 증가를 계산하였다. 대조군과 비교하여 630 nm에서의 조사군에서 마이오신 VIIa 발현이 유의하게 증가하였고(양측 Mann-Whitney U 검정: n = 10-18, p = 0.0414, U = 47.0, power = 0.786, β-value = 0.214) (도 6e), Oct4 발현이 유의하게 감소된 것으로(양측 Mann-Whitney U 검정: n = 9-19, p = 0.0010, U = 12.0, power = 0.997, β-value = 0.003)(도 6F) 관찰되었다.

다음으로, EB에서 ROS 및 세포 내 칼슘 농도에 대한 PBM의 영향을 형광 분광계를 이용하여 측정하였다(도 6H 및 I). 대조군과 비교하여, ROS 수준에서는 유의한 증가가 관찰되었지만(양측 Mann-Whitney U 검정: p = 0.0012, U = 0.0) (도 6J), 세포 내 칼슘 수준에서는 유의한 증가가 관찰되지 않았다.

2-6. 630 nm에서 조사한 내이 HC 유사 세포에서 DEG를 확인하기 위한 전사체(transcriptome) 시퀀싱 분석

PBM에 대한 EB의 전사 반응을 전체적으로 알아보기 위하여, 대조군 EB 및 630 nm에서 조사된 EB에서 비교 RNA-Seq 분석을 수행하였다. Illumina HiSeq2500을 사용하여, 리드 길이 100 bp인, 평균 56.9 백만 개의 원시 데이터(리드, read)가 생성되었다. 원시 데이터의 96.8 % 이상을 차지하는 최소 5.51 Gb의 정돈된 데이터를 추가 분석을 위하여 준비하였다. 모든 필터링된 서열 리드를 마우스 기준 게놈(GRCm38)에 매핑하였다. 평균 84.7 % 이상의 리드 쌍이 마우스 게놈에 고유하게 매핑되었다(표 1). Ensembl 데이터베이스(릴리스 77)를 사용한 유전자 주석 처리 후, 20,958 및 20,731 발현 유전자가 대조군 및 630 nm 조사 EB에서 각각 검출되었다. 이들 중 19,474 개의 유전자가 두 군에서 발현되었지만, 1,484 개와 1,257 개의 유전자는 각각 대조군과 630 nm 파장 처리군에서 고유하게 발현되었다. 따라서 적어도 하나의 EB에서 22,215 개의 발현 유전자가 식별되었다(도 8A). 두 군 모두에서 발현된 유전자는 균일한 발현 수준을 나타내어, 샘플 준비 및 데이터 생산에 아무 문제가 없음을 시사하였다(도 8B).

상이한 세포 상태에서 상이하게 발현된 모든 유전자를 스크리닝하기 위하여, 유전자 발현의 정량적 비교를 수행하였다. 설정된 기준(log₂FC ≥ 1 및 p <0.05)에 따라 대조군과 630 nm 군 간에 쌍별 비교가 이루어졌다. 대조군 및 630 nm 군의 비교에서 총 155 DEG(43 상향-조절, 112 하향-조절)가 검출되었다(도 9). 유전자 발현의 유사성에 기초하여, 예측된 전사물(transcript)을 제외하고 식별된 DEG를 사용하여 계층적 클러스터링 분석을 수행하였다. 155 DEG의 발현 패턴에 의해 630 nm에서 조사된 EB에서 대조군에 비하여 현저한 차이를 나타내는 것이 밝혀졌다(도 9 및 도 10).

2-7. DEG의 GO 농축 분석

PBM 군에서 43개 상향 조절된 유전자 및 112개 하향 조절된 유전자의 기능을 체계적으로 분류하기 위하여, DAVID 기능 주석 도구 v6.8(https://david.ncifcrf.gov/)을 사용하여 GO 농축 분석을 수행하였다. 155 DEG 중 55개가 42 GO 항목(term)(28 BP, 3 CC, 11 MF)과 유의하게 관련이 있었다(도 9 및 표 2). PBM 군에서 상향 조절된 9개 DEG만이 12개 유의한 GO 항목(8 BP, 1 CC, 3 MF)에 관련되어 있었었다. 46개의 하향 조절 DEG는 20 BP, 2 CC 및 8 MF 카테고리에 관여하였다. 전사 조절 및 DNA 템플릿(GO:0006355)은 보다 많은 수의 DEG와 연관되어 있고, RNA 중합 효소 II 프로모터(GO:0006366)로부터의 전사는 EGR1, FOS, NMI 및 FOSB의 4개 유전자로 유의하게 농축되었다(표 2). 내이 HC 발달과 관련이 있을 수 있는 주요 생물학적 과정과 DEG를 추가적으로 연구하기 위하여, 유의성있는 GO 항목들은 5개의 주요 GO 카테고리로 재분류하였다: "자극에 대한 반응(GO:0050896)", "신호전달(GO:0023052)" , "단백질 대사 과정(GO:0019538)", "유전자 발현(GO:0010467)" 및 "신경계 발달(GO:0007399)”. 총괄하여, 26 DEG가 RNA 중합 효소 II 프로모터로부터의 전사, 유전자 발현의 양성 조절, RNA 중합 효소 II 프로모터로부터의 전사의 음성 조절, 전사의 양성 조절, DNA 템플레이팅, 전사 조절, DNA 템플릿 GO:0006355 및 자이모겐(zymogen) 활성화 GO:0031638 등의 유전자 발현 과정에 관여하였다. 도 9에 나타난 바와 같이, 12개 신경계 발달 과정, 9개 자극에 대한 반응, 8개의 신호전달 및 8개 단백질 대사 과정 관련 유전자가 농축되었다. PBM에 의해 크게 변화된 생물학적 과정에 관련된 155 도의 55 DEG에 초점이 맞추어졌다. 선택된 GO 항목과 관련된 대부분의 DEG가 하향 조절되었다. 단지 8개의 유전자만이 630 nm에서 조사된 EB에서 상향 조절되었다. 유전자 발현 조절 및 신경계 발달 관련 유전자가 PBM 군에서 유의성있는 발현 변화를 나타내었다(도 9C).

STRING 시스템을 사용하여 얻은 예측 결과를 토대로 네트워크 분석을 수행하여 5개 주요 GO 카테고리에 포함된 43 DEG 간의 단백질-단백질 상호 작용을 예측하였다(도 11). 이 중 25개의 단백질이 모여(클러스터) 있었다. 특히, FBJ 골육종 종양유전자(FBJ osteosarcoma oncogene, FOS), FBJ 골육종 종양유전자 B(FOSb) 및 초기 성장 반응 1(EGR-1)은 상기 네트워크의 중심(hub)에 위치하여 다른 단백질과 상호 작용하였다. 이 유전자는 상기 네트워크에서 유일하게 상향 조절된 유전자였다. 지지 세포가 HC로 전이분화(transdifferentiation)되는 동안에 억제되는 핵심 유전자인 Hes5(Hairy and enhancer of split 5)는 하향 조절된 유전자 중 하나이다(도 9D). 대조군과 630 nm 레이저 군을 비교하는 것 외에도 HC 감각 시스템과 관련된 유전자를 평가하였고, 마이오신 VIIa를 포함한 대부분의 유전자가 상향 조절되었다(도 12).

3. 토론

본 발명에서는 현적법을 사용하여 ESC의 3차원(3D) 배양체를 생성하고, EB의 내이 HC 유사 세포로의 분화를 향상시키기 위하여 LED를 이용하여 PBM을 적용하였다. ESC의 분화가 성공적으로 진행되었는지 여부는 내이 세포와 관련된 몇몇 마커의 발현으로 평가하였다. 유사하게, 630 nm의 PBM은 ESC의 마이오신 VIIa 양성 세포로의 분화를 강화시켰다. 유전자 발현에 대한 추가 연구로 귀 오가노이드 형성 중에 PBM의 치료 효과를 담당하는 요인의 존재가 밝혀졌다.

현재, 줄기세포 및 유도된 다능성 줄기세포를 귀 연계 조직으로 분화시키기 위하여, 공-배양된 비활성화 피더 세포 또는 외인성 조직과의 2차원(2D) 단일층 배양 또는 EB를 형성하기 위한 부유 세포 응집체의 3D 배양과 같은 여러 방법이 시도되고 있다. 3D 배양의 주요 이점은 배아줄기세포가 배아에서와 같이 자기-구성(self-organize) 할 수 있다는 것이다. 대조적으로, 2D 배양의 세포는 배양 판에 부착하여 평평한 형태로 자라도록 제한된다.

세포가 고밀도에 도달하면, ESC의 2D 배양물은 일반적으로 전체 배양 판을 덮는 평평한 형태 대신에 다수의 세포 응집체를 생성한다. 그러나, EB와 유사한 세포 응집체는 크기가 상당히 작고(도 1A), 동일한 크기를 유지하면서 분화하는 동안 분해되기 시작한다.

본 발명은 귀 오가노이드의 3D 회전타원체(spheroid)를 형성하기 위하여 현적법을 사용한 최초의 연구이다. 현적법은 지지체가 없는 시스템으로서, 합성 물질이나 중력을 제외한 외력이 없이 EB를 형성할 수 있도록 하였다. 현적법은 이전에 다른 세포 유형과 세포주의 기관형 배양(organotypic culture)을 형성하는데 사용되었다. 3차원 회전 타원체의 형성은 일반적으로 상이한 세포 유형에 따라 다양하다. 본 발명의 결과에 따르면, 초기 세포 밀도가 매달린 방울에 의한 EB 형성에도 영향을 미친다. 세포 접종 밀도가 높으면 직경이 더 빠르게 증가하는 현저히 큰 EB가 생성된다. 그러나, 높은 세포 밀도는 오가노이드 형성의 속도에 영향을 미치지 않았다. 높은 ESC 밀도로 EB 크기는 증가하였지만, 본 발명에서 밝혀진 오가노이드를 생성하기 위한 최적 밀도는 4 × 10⁵ cells/mL였다.

분화하는 동안 EB에서의 유전자 발현을 조사한 결과, 다능성 마커 Oct4의 발현이 감소하고 동시에 HC 마커인 마이오신VIIa(myosin VIIa)의 발현이 증가하는 것으로 나타났다. 이것은 ESC가 HC 유사 특성을 갖는 세포로 분화하고 있음을 시사한다. 또한, 형광 분석에 의해 오가노이드의 낭종성 유사(cavity-like) 구조를 둘러싸고 있는 세포에서 마이오신 VIIa의 발현은 발달 중인 배아에서 귀 소포의 발달을 반영한다는 것을 보여 주었다. 본 발명에서와 같이, 빠른 재응집 프로토콜에 따른 EB 유사 응집체의 동일한 무-혈청 부유 배양을 사용한 다른 연구에서는 한정된 수의 마이오신 VIIa 양성 세포만이 다중 HC 마커를 발현하는 것으로 나타났다. 또한, HC 감각 체계와 관련된 유전자의 50 % 이상의 상향 조절(도 12)은 귀 연계 조직으로의 분화 가능성을 뒷받침한다.

상기의 명확한 결과와는 달리, Sox2 발현의 PCR 평가는 모호한 결과를 나타냈다. Sox2는 줄기세포에 대한 다능성 마커이며 발달중인 쥐의 달팽이관(cochlea)의 양성 상피(prosensory epithelia)에서 고도로 상향 조절되는 것으로 보고되고 있다. 또한, Sox2는 완전히 분화된 단계에서는 중간 수준으로 발현되며 지지 세포 마커로 작용할 수 있다. 데이터를 올바르게 해석하기 위하여 Oct4 발현도 고려되었다. 세포가 Sox2와 Oct4 모두를 높은 수준으로 발현시켰다면 세포는 여전히 분화되지 않은 상태에 있다는 것을 나타낼 수 있으며, 이는 다능성(pluripotency)을 의미한다. 그러나, 세포가 높은 Sox2 수준을 나타내지만 낮은 Oct4 수준을 나타내면 세포가 분화되었음을 시사한다. 따라서, Sox2 양성 세포는 ESC에서 유래한 분화된 줄기세포 유사 세포인 것으로 추정된다. 분화된 오가노이드에서 줄기세포 유사 세포를 검출하는 형광 분석을 사용하는 추가 연구가 필요할 것이다.

줄기세포의 레이저에 대한 명백한 민감성과 관련하여, 다수 연구에서 여러 출처의 줄기세포를 PBM을 사용하여 분화시키는 방법이 연구되었다. 이전 연구에서는 주로 적색(630 nm) 및 근적외선(810 nm)의 PBM을 사용한 다양한 줄기세포의 분화를 보고하였다. 간엽성(Mesenchymal) 줄기세포는 붉은 빛을 가하면 골 형성 계통으로 분화하였다. 유사한 결과가 인간 지방 줄기세포에 근적외선 빛을 사용한 연구에서 관찰되었다. 시토크롬 c 산화효소(Cytochrome c oxidase, CCO)는 억제성 NO를 치환하는 것으로 추정되는 메커니즘을 통해 적색 및 근적외광(NIR)에 쉽게 반응하고, 이에 따른 증가된 CCO 활성이 MMP를 증가시키고, 따라서 미토콘드리아가 더 많은 ATP를 생성하게 한다. 줄기세포 분화를 촉진시키는 적색과 NIR 빛의 영향은, 빛 노출에 의해 발생되는 증가된 미토콘드리아 수치와 활동으로 인해 대사 작용이 산화적 인산화로 전환되기 때문인 것으로 보인다.

PBM에 의한 내이 HC 유사 세포의 DEG를 확인하기 위하여 전사체(transcriptome) 시퀀싱 분석을 수행한 결과, 내이 HC 전이분화(transdifferentiation)의 억제제인 Hes5(Hairy and enhancer of split 5)를 포함하여, 신경계 발달 과정과 관련된 대부분의 유전자는 PBM 군에서 하향조절되었다. HES5는 Atoh1의 프로모터 영역에 직접 결합함으로써 Atoh1 발현을 억제하여, HC보다 지지 세포의 분화를 돕는다. LED 조사가 신경 외배엽 및 비신경 외배엽이 분열하는 시점과 일치하기 때문에, 신경계 발달 과정의 하향 조절이 PBM의 일정으로 직접 추적될 수 있다. 신경 발달의 하향 조절은 이러한 EB가 비신경 외배엽 분화를 선호한다는 것을 의미하며, 이는 결국 내이 분화를 유도할 수 있다. 반면, FOS, FOSb, EGR-1과 같은 전사 조절 인자로서 중요한 역할을 하는 유전자는 PBM으로 상향 조절되었다. 관련하여 이전 연구에서 PBM 전처리가 FOS와 EGR-1의 발현을 조절한다는 보고가 있다. Jun 단백질 계열의 구성체와 이량체화할 수 있는 Fos 단백질은 전사 인자 복합 활성 인자 1(AP-1)의 필수 서브 유닛이다. AP-1과 핵 인자-κB[nuclear factor(NF)-κB]와 같은 전사 인자의 조절/활성화는 PBM-유도된 ROS에 의해 유발될 수 있다. 따라서 식별된 DEG 사이의 물리적 상관 관계를 기반으로 한 단백질-단백질 네트워크 분석은 전사체와 단백질 상호작용체(protein interactome) 사이에 잠재적으로 유사한 기능 네트워크를 보여 주었고, 이에 따라 PBM-조사된 EB에서 유전자 조절을 설명하는 중심 네트워크가 제안될 수 있다.

RNA-Seq 분석은 또한 헨레(Henle) 루프 상세단계와 관련된 유전자가 하향 조절되었음을 나타내었다. 이는 달팽이관과 신장 사이의 발달 및 기능적 유사점으로 설명될 수 있다.

달팽이관 HC 및 지지 세포와 유사하게 신장에는 네프론(nephron)과 헨레(Henle) 루프가 있는데, 이들은 다른 기능을 갖고 있지만 제한된 수의 동일한 전구세포에서 유래한다. 그러므로 다른 세포 유형을 이루기 위하여서는 다른 하나가 부정적으로 조절되어야 한다. GATA 결합 단백질 3 발현은 PAX2와 PAX8에 의해 신장 도관(nephric duct)에서 유도되며, 이는 또한 달팽이관 세포의 상세구조에서 초기 역할을 한다. 헨레 루프와 줄기세포가 관련되어있는 동안 네프론과 HC 분화가 관련될 수 있다. 유사하게, 겐타마이신(gentamicin)과 시스플라틴(cisplatin)과 같은 많은 이 독성 약물도 신 독성을 일으킨다.

PBM에 의해 영향을 받는 다른 생물학적 과정에는 HC 분화를 촉진시키는 Wnt 신호전달의 증가가 포함된다. 증가된 ATP 생산에 의해 개신된 유비퀴틸레이션(ubiquitylation)의 결과일 수 있는 억제된 단백질 분해는 또한 ESC를 특정 계통으로 분화하도록 한다. 레티노산 반응 및 아세틸콜린 수용체 신호전달 경로의 음성 조절은 ESC의 신경계 분화를 억제한다. 한편, PBM은 외배엽, 중배엽 및 내배엽의 3개 명확 배엽 형성에 결정적인 낭배형성(gastrulation)을 억제하는 것으로 나타났다. EB를 삼중점(tridivide point) 이후에 조사하였으므로, PBM은 분화 과정의 상기 중요한 단계를 억제하지 않았지만, 삼중점 단계 동안 또는 그 이전에 EB에 대하여 PBM를 사용하는 것은 피해야 한다.

PBM에 의한 귀 연계 조직으로의 분화에 대한 ESC의 촉진 현상의 또 다른 가능한 기작은 TRPV1-관련 경로이다. TRPV1은 옵신-관련 신호전달 경로를 통해 특정 파장에서 빛에 반응하는 캡사이신 수용체이다. TRPV1 채널을 활성화시킴으로써 세포 내 칼슘과 ROS 수준이 증가하는 반면 ATP 수준은 감소되어 분화가 촉진된다. 이것은 조골세포 분화와 함께 이전 연구에서 보고되었고, 본 발명에서는 달팽이관 HC에서 발생하였다. 다른 연구에서는 분화 과정에서 ROS, 열 충격, 감마선 조사에 의한 스트레스에 대한 역할을 제안한다. 같은 조건에서 이러한 경로를 비교하는 더 많은 연구가 정확한 메커니즘을 확인하는 데 필요하다.

4. 요약

결론적으로, 본 발명은 현적법을 사용하여 EB가 ESC로부터 생성되었고 내이 HC-유사 세포로의 분화가 LED의 PBM에 의해 강화되었음을 보여 주었다. 또한, 유전자 발현 연구에 의해 귀 오가노이드 형성에 PBM이 미치는 영향을 강화시키는 요인이 확인되었다. 이러한 결과는 HC의 재생을 위한 임상 요법을 확인하는 데는 미흡하지만, 질병 모델링에 관한 중요한 정보를 제공하고 내이 HC를 생성하기 위한 분화 방법을 제공한다.

Claims (9)

1. (a) 배아줄기세포(embryonic stem cell, ESC)로부터 배아체를 형성하는 단계; 및
   (b) 단계(a)에서 형성된 배아체를 수집하여 외배엽 분화 배지에서 배양하는 동안 파장 470 ~ 740 nm 의 빛을 조사하는 광생체조절을 이용하여 마이오신 VIIa 양성 세포로 분화시키는 단계
   를 포함하는 배아줄기세포의 분화 방법.
2. 제1항에 있어서, 단계(a)의 상기 배아체가 현적법 또는 단일층 세포 배양에 의해 형성되는 것을 특징으로 하는 배아줄기세포의 분화 방법.
3. 제2항에 있어서, 상기 현적법이 미분화된 배아줄기세포를 포함하는 유지 배지의 액적을 배양 접시의 뚜껑에 접종하여 12 ~ 36시간 동안 배양하는 것을 특징으로 하는 배아줄기세포의 분화 방법.
4. 제3항에 있어서, 상기 미분화된 배아줄기세포를 포함하는 유지 배지의 액적이 유지 배지 30 μL 당 세포 밀도 1 × 10⁵ ~ 6.8 × 10⁵ 세포/mL인 것을 특징으로 하는 배아줄기세포의 분화 방법.
5. 제2항에 있어서, 단계(a)의 상기 단일층 세포 배양이 미분화된 배아줄기세포를 외배엽 분화 배지에서 12 ~ 36시간 동안 배양한 후, 마트리젤 함유 분화 배지에서 36 ~ 60시간 동안 배양하는 것을 특징으로 하는 배아줄기세포의 분화 방법.
6. 제1항에 있어서, 단계(b)의 상기 배양이 분화 2 일째에 비 신경 외배엽을 유도하고, 3 일째에 전기원판성(preplacodal) 외배엽을 유도한 후, 6 일째에 성숙 배지로 대체하여 18일까지 분화시키는 것을 특징으로 하는 배아줄기세포의 분화 방법.
7. 제1항에 있어서, 단계(b)의 상기 광생체조절이 분화 6 일부터 8 일까지 배양 세포에 발광 다이오드(LED)를 1 ~ 5회 조사하는 것을 특징으로 하는 배아줄기세포의 분화 방법.
8. 삭제
9. 제7항에 있어서, 상기 발광 다이오드가 5 ~ 60 mW의 강도로 100 ~ 1000 초 동안 조사되는 것을 특징으로 하는 배아줄기세포의 분화 방법.

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