TR2022013409A2 - Kudret nari (momordi̇ca charanti̇a) kaynakli egzozomlar - Google Patents

Abstract

Buluş, kudret narı (momordica charantia) bitkisinden egzozomların elde edilmesi ve yüksek biyo-uyumluluk, hücresel alım ve stabilite gibi özelliklere sahip olan bu bitkisel egzozomların, ciltte oluşan yaraları tedavi edici, hücre yenileyici ve anti-aging olarak kullanım amacıyla krem haline getirilmesi ile ilgilidir. Buluş, özellikle kudret narı (momordica charantia) bitkisinden elde edilen bitkisel egzozomların ciltte oluşan yara izlerinin, hiperpigmentasyon gibi yaşlılık lekelerinin, çatlaklar ve akne izlerinin tedavisinde, yüz ve göz çevresindeki kırışıklıkların azaltılmasında, cilt dokusunun iyileştirilmesinde, kollajen üretiminin artırılmasında, cilde daha sağlıklı ve genç bir görünüm kazandırmada ve hücre yenileyici ve anti-aging olarak kullanılmasıyla ilgilidir.

Description

TARIFNAME KUDRET NARI (MOMORDICA CHARANTIA) KAYNAKLI EGZOZOMLAR Teknik Alan Bulus, kudret nari (momordica charantia) bitkisinden egzozomlarin elde edilmesi ve krem formuna getirilmesi ile ilgilidir. Bulus, özellikle kudret nari (momordica charantia) bitkisinden elde edilen bitkisel egzozomlarin ciltte olusan yara izlerinin, hiperpigmentasyon gibi yaslilik lekelerinin, çatlaklar ve akne izlerinin tedavisinde, yüz ve göz çevresindeki kirisikliklarin azaltilmasinda, cilt dokusunun iyilestirilmesinde, kollajen üretiminin artirilmasinda, cilde daha saglikli ve genç bir görünüm kazandirmada ve hücre yenileyici ve anti-aging olarak kullanilmasiyla ilgilidir. Teknigin Bilinen Durumu Egzozomlar hücreler arasi uzak mesafede iletisim amaciyla kargo tasiyan nanoveziküller olup hücreler tarafindan salgilanan ekstrasellüler veziküllerin bilinen en küçük grubunu olustururlar. Boyutlari 30-150 nm araliginda degismektedir. Egzozomlar biyogenetik olarak türetildikleri için mimarileri, bilesenleri ve moleküler islenmeleri köken aldiklari hücrelerde meydana gelen süreçleri yansitirlar; bu yüzden egzozomlar köken aldiklari hücrelerdeki yararli maddeleri içerirler. Proteinler ve RNA'lar gibi çesitli sitozol bilesenleri, çift katli lipid bir tabaka ve membran proteinleri içerirler. Ayrica bünyelerinde miRNA, DNA, proteinler gibi kaynaklandigi hücrenin özelliklerini tasiyan materyaller içermektedirler. Belirli bir hücreden kaynaklanan egzozomlar membranlarinda bulunan proteinlerden dolayi dogal hedefleme potansiyeline sahiptirler. Egzozomlar hücreler arasi iletisimin merkezi aracilaridirlar. Küçük boyutlari nedeniyle DNA, RNA, proteinler ve lipitder dahil olmak üzere kapsüllenmis biyoaktif moleküllerin transferi yoluyla hücreden hücreye iletisimi kolaylastirirlar. Içerdikleri bu biyomoleküller sayesinde alici hücrelerde gen ifadelerini düzenleyerek immünregülasyon, hücre farklilasmasi, hücreler arasi haberlesme, hücre göçü vb. biyolojik aktivitelerde rol alirlar. Memeli hücrelerinden elde edilen egzozomlarin üretimlerinin zaman alici ve zahmetli olmasi, düsük üretim verimleri, yüksek kaliteli ve tek tip egzozom elde etmenin getirdigi zorluklar vb. nedenlerden dolayi klinik kullanimlari sinirlidir. Bitki kaynakli egzozomlar çok damarli cisimler tarafindan esas olarak hücreler arasinda iletisim kurmak ve patojen saldirisina karsi bagisikligi düzenlemek için salinan küçük veziküllerdir. Bitki kaynakli egzozomlar, memeli egzozomlarina benzer bir yapisal bilesime sahiptirler. Biyo- uyumluluklari ve ayarlanabilir yapilari nedeniyle biyolojik yüklerini (örnegin; nükleik asitler, biyoaktif lipidler, hücre yüzeyi proteinleri) aktarirlar ya da diger aktif bilesenler için de dagitim sisteminin önemli bir parçasi olarak görev alirlar. Homeostazin korunmasina yardimci olabilecek anti-kanser, anti melanojenik ve anti inflamatuar aktiviteler gibi potansiyel terapötik etkileri de bulunmaktadir. Bitki kaynakli egzozomlar hücre proliferasyonu, hücre ölümü, metabolizma ve bagisiklik tepkileri gibi çesitli fizyolojik ve patolojik süreçlerde gerekli olan küçük kodlamayan RNA'Iarin bir sinifi olan yüksek miktarda mikro RNA (miRNA) içerirler. Memeli sindirim sistemi tarafindan emilen bitki kaynakli egzozomlar ve bitki-memeli hücreleri arasindaki iletisime aracilik etme potansiyeline sahiptirler. Büyük ölçekli üretim, düsük toksisite, azaltilmis immünojeniklik, verimli hücresel alim, yüksek biyo-uyumluluk ve stabilite gibi avantajlara sahip olmalarindan dolayi hastaliklarin tedavisine yönelik önemli bir alternatif olarak görülmektedirler. Bu nedenle medikal tedavilerdeki potansiyel uygulamalari merak uyandirmakta ve bu alanda in-vitro ve in-vivo çalismalar yapilmaktadir. Cucurbitaceae familyasina ait olan kudret nari (momordica charantia), sigilli bir kabak veya salataliga benzeyen uzun meyveli çok yillik bir tirmanici olup, dünyanin çesitli yerlerinde yetisebilen tropik bir bitkidir. Olgunlastikça turuncu-sari renge dönüsen zümrüt yesili renkte olan meyvesi de dahil olmak üzere bitkinin bütün kisimlari aci bir tada sahiptir. Geleneksel tipta tedavi edici özellikleri ile yaygin olarak kullanilan kudret narinin, analjezik, antiviral, sitotoksik, hipoglisemik, antimutajenik, antidiyabetik, antilösemik, antibakteriyel, antioksidan, antiülser, antiinflamatuar, immünostimülan vb. tedavi edici özellikleri oldugu da bilinmektedir. Yaralar, çesitli nedenlerle gelisebilen, özellikle kronik olanlari bireyleri fiziksel ve psikososyal açidan olumsuz etkileyen ve yasam kalitesini düsüren rahatsizliklaridir. Yaralarin büyük bir kismi uygun tedavi yöntemleri ile herhangi bir sorun gelismeksizin iyilesirken, bazi yaralarin iyilesme süreci çesitli faktörlerin etkisiyle uzayabilmektedir. Yara iyilesmesi ve yara tedavisi, uzun yillardir çok tartisilan ve çalisilan konulardandir. Geleneksel tip uygulamalarinda yara tedavisinde kullanilan bitkilerden biri de kudret naridir. Literatürde kudret nari (momordica charantia) bitkisinin yara iyilesmesinde kullanabildigi yapilan in-vivo ve in-vitro çalismalarda ortaya konulmustur. In-vivo eksizyon modeli çalismasinda, Yeni Zelanda tavsanlarinin sirt bölgelerinde olusturduklari 7cm2llik açik yaralara 28. gün boyunca dekspanthenol, nitrofurazone ve zeytinyagi bazli kudret nari uygulanmis ve 28. günün sonunda tavsanlarin yara bölgelerinde inflamatuar hücre sayisinda azalma, orta yogunlukta kolajen lifleri ve yüksek yogunlukta damarlanma gözlemleyerek kudret narinin yara iyilesmesini hizlandirdigini rapor edilmistir. 30 adet erkek fare üzerinde yapilan bir baska çalismada, farelerde yara modeli olusturarak yara modeli olusturulan farelere 7-14 gün boyunca kudret narinin %1 lik jel ve krem formüllerini topikal olarak uygulamistir. 14. günün sonunda yara olusturulan farelerde yara kapanma yüzdelerinin kontrol grubuna kiyasla ciddi oranda arttigini rapor edilmistir. Bir baska çalismada ise kudret nari ve gotu kola (centella asiatica)'nin topikal olarak uygulamasinin tavsanlarda açik yara iyilesmesindeki etkileri arastirilmistir. Bu çalismada kudret nari ve gotu kola uygulamasinin, yara yataginin deri yüzeyine kadar olan bölgede granulasyon dokusu ile dolmasini hizlandirarak ortalama iyilesme süresini kisalttigi tespit edilmistir. Literatürdeki diger bir in-vitro çalismada kudret nari ekstraktinin fibroblast hücrelerinin hücre proIiferasyonunu arttirdigini rapor edilmistir. Ayni çalismada kudret nari ekstraktinin epitelyal ve endotelyal hücrelerde hücre proIiferasyonunu uyaran hepatosit büyüme faktörünün (HGF) ekspresyonunda belirgin bir sekilde artisa neden oldugu bildirilmistir. Kudret nari (momordica charantia) özütlerinin çesitli nedenlerden dolayi olusan cilt hasarinin tedavisinde kullanilabilecegi ve anti-aging özellige sahip oldugu literatürde yapilan çalismalarda gösterilmistir. Reaktif Oksijen Türleri (ROS), birçok cilt bozuklugunun patogenezinde ve kronolojik cilt yaslanmasinda önemli bir rol oynamaktadir. Momordica charantia bitkisinden elde edilen ekstraktlarin iyi bir dogal antioksidan kaynagi oldugu ve momordica charantia ekstraktlarinin ROS kaynakli cilt hasarlarini önleyebilecegi gösterilmistir. Fibroblast ve keratinosit hücreleri üzerinde yapilan bir çalismada momordica charantia bitkisinden elde edilen özütün oksidanlara karsi önemli bir sito-koruyucu etkisi oldugunu rapor edilmistir. Ayni çalismada momordica charantia bitkisi özütünün, HaCaT hücrelerini sodyum nitroprussidinin neden oldugu hasardan korudugu gösterilmistir. Farelerde yapilan diger bir in- vivo çalismada momordica charantialdan elde edilen bitki özütlerinin anti-oksidasyon özellik gösterdigi, serbest radikalleri temizleyip, serbest radikal zincir reaksiyonunu bloke ettigi ve yaslanma karsiti süreçlerde rol aldigi gösterilmistir. Momordica charantia bitkisi özütlerinin uzun süreli UV maruziyeti sonucu meydana gelen ve erken cilt yaslanmasina sebep olan asiri nitrik oksit üretiminin neden oldugu zararli etkileri engelleyebildigi gösterilmistir. Fibroblastlar en distaki cilt tabakasinin hemen altindaki cilt tabakasi olan dermiste bulunan, cildin onarilmasinda, yaralarin iyilestirilmesinde ve cilt sikiliginin korunmasinda önemli roller üstlenen hücrelerdir. Hücre disi matrisi sentezleyen ve stromayi üreten fibroblastlar, bag dokusunun en yaygin hücreleridir. Dermal fibroblastlar Endoplazmik Retikulum gibi organelleri kullanarak ayri hücre katmanlarini birlestiren bag dokusunu olustururlar. Fibroblastlar, dermis ve epidermis arasinda hücre disi matris olusturarak epidermisin epitel hücrelerinin matrisi sabitlemesine izin verir, böylece epidermal hücrelerin cildin üst katmanini olusturmak için etkili bir sekilde bir araya gelmesine izin verirler. Fibroblastlar yasla birlikte zayiflarlar ve cilt yaslanmaya sürecine girer. Dermal fibroblastlar proliferasyon, migrasyon ve miyofibroblast farklilasmasi ve kasilmasi için dönüstürücü büyüme faktörü beta (TGF-ß) gibi sitokinlere yanit verme yetenegi yoluyla yara iyilesme süreci için kritik öneme sahiptirler. Yara bölgesi fibroblastlari olmadan hücre disi matrisi yeniIenememekte ve epidermis hücreleri yara bölgesi üzerinde çogalamamaktir. Bu nedenle, dermal fibroblastlar olmadan cilt yaralari düzgün sekilde onarilmaz. Fibroblastlar, fibrin pihtisini parçalamak, yara iyilesmesi ile iliskili diger hücreleri desteklemek için yeni ekstra hücresel matris (ECM) ve kollajen yapilari olusturmak ve yarayi kasmak gibi temel süreçlerde yer alan normal yara iyilesmesini desteklemede kritik öneme sahiplerdir. Fibroblastlar, kolajen ve elastin gibi yapisal proteinler ve hyaluronan ve glikoproteinler gibi glikozaminoglikanlar üretirler. Cildin onarilmasinda ve sikiliginin korunmasinda kritik bir rol oynayan fibroblastlar cilt lekelerinin onarilmasinda önemli roller üstlenirler. Cilt lekelerinin onarilmasi amaciyla bölündüklerinde kolajen üreterek lekelerin onarilmasina katki saglarlar. Kimyasal ve cerrahi tedaviler ve lazer, botox, dolgu gibi uygulamalar; ciltte olusan yara ve, yara izlerinin, hiperpigmentasyon gibi yaslilik lekelerinin, çatlaklar, akne izlerinin tedavisinde, yüz ve göz çevresindeki kirisikliklarin azaltilmasinda, cildin genel tonunu ve dokusunu iyilestirmede, kollajen üretimini artirilmasinda, cilde daha saglikli ve genç bir görünüm kazandirma ve cilt gevsekligi tedavisinde kullanilmaktadirlar. Ancak söz konusu tedavilerin kullanilmasiyla istenmeyen ve ciddi yan etkiler ortaya çikabilmektedir. Yan etkileri oldukça fazla olan diger tedavilerden farkli olarak kudret nari egzozom tedavisi, yukarida bahsedilen cilt rahatsizliklarinin dogal, non-invazif ve etkili bir sekilde tedavi edilmesine olanak saglayacakti r. Kudret narinin (momordica charantia) yara iyilesmesi üzerindeki etkileri ve anti-aging özelligi kudret nari özüt ve ekstraktlari kullanilarak yapilan çalismalarda arastirilmistir. Ancak kudret narinin egzozom düzeyinde kullanimlarina dair bir çalisma literatürde yer almamaktadir. Kudret narindan elde edilen egzozomlarin ciltte olusan yara ve yara izlerinin, hiperpigmentasyon gibi yaslilik lekelerinin, çatlaklar, akne izlerinin tedavisinde, yüz ve göz çevresindeki kirisikliklarin azaltilmasinda, cildin genel tonunu ve dokusunu iyilestirmede, kollajen üretimini artirilmasinda, cilde daha saglikli ve genç bir görünüm kazandirma ve cilt gevsekligi tedavisinde kullanimi ile ilgili bir patent de mevcut degildir. Kudret narinin (momordica charantia) yara iyilesmesi üzerindeki etkilerini arastirmak amaciyla yapilan in-vivo ve in-vitro çalismalara bakildiginda, kudret nari ekstraktlarinin topikal uygulamalari yer almaktadir. Ancak kudret narinin egzozom düzeyinde yara iyilesmesinde kullanimlarina dair bir çalisma literatürde yer almamaktadir ve bu alanda herhangi bir patent mevcut degildir. Kudret nari bitkisinden elde edilen egzozomlarin yara iyilesmesinde ilk defa kullanilmasi ve yara iyilesmesindeki tedavi edici etkisinin bu perspektifte ele alinmasi, patentimizi kudret nari ekstraktlari ile yara tedavisine yönelik olarak yapilan diger çalisma ve patentlerden ayirmaktadir. Kudret narinin egzozom düzeyinde yara iyilesmesinde kullanimlarina dair bir çalisma veya patent mevcut degildir. Sonuç olarak yukarida anlatilan olumsuzluklardan dolayi ve mevcut çözümlerin konu hakkindaki yetersizligi nedeniyle ilgili teknik alanda bir gelistirme yapilmasi gerekli kilinmistir. Bulusun Kisa Açiklamasi Mevcut bulus, yukarida bahsedilen gereksinimleri karsilayan, tüm dezavantajlari ortadan kaldiran ve ilave avantajlar getiren kudret nari egzozomlarinin üretimi ile ilgilidir. Bulusun öncelikli amaci; kudret narindan bitkisel egzozomlarin elde edilmesi ve bu elde edilen egzozomlarin kullanilarak çesitli nedenlerle ciltte olusan yaralarin, yara izlerinin, hiperpigmentasyon gibi yaslilik lekelerinin ve çatlaklarin tedavisinin saglanmasidir. Bulusun diger bir amaci; kudret narindan elde edilen egzozomlarin kullanilarak hasar gören cilt dokusunu onarmak, kollajen üretimini arttirmak, cilde daha saglikli ve genç bir görünüm kazandirmaktir. Bulusun diger bir amaci, ciltte olan hasarlarin giderilmesinde kullanilan ve yan etkileri fazla olan diger tedavilerin yerine toksisitesi ve yan etkileri çok düsük olan dogal ürünlerin kullanilmasini saglamaktir. Yukarida anlatilan amaçlarin yerine getirilmesi için bulus, kudret nari (momordica charantia) bitkisinin egzozomlarin elde edilmesinde kullanimidir. Yukarida anlatilan amaçlarin yerine getirilmesi için bulus, kudret Nari bitkisinden elde edilen egzozomlarin; ciltte olusan yaralarin, yara izlerinin, hiperpigmentasyon gibi yaslilik lekelerinin ve çatlaklarin tedavisinde kullanimidir. Yukarida anlatilan amaçlarin yerine getirilmesi için bulus konusu bitkisel egzozomlarin, hasar gören cilt dokusunu onarmak, kollajen üretimini arttirmak ve cilde daha saglikli ve genç bir görünüm kazandirmak amaciyla kullanimidir. Yukarida anlatilan amaçlarin yerine getirilmesi için bulus konusu bitkisel egzozomlarin yüksek biyo-uyumluluk, cilt dokusundan kolay emilebilme ve düsük toksisite özellikleri ile hücre yenileyici ve anti-aging olarak kullanimidir Yukarida anlatilan amaçlarin yerine getirilmesi için bulus konusu bitkisel egzozomlarin farmasötik veya kozmetik olarak kullanilabilir bir krem formunda olmasidir. Bulusun yapisal ve karakteristik özellikleri ve tüm avantajlari asagida verilen sekiller ve bu sekillere atiflar yapilmak suretiyle yazilan detayli açiklama sayesinde daha net olarak anlasilacaktir ve bu nedenle degerlendirmenin de bu sekiller ve detayli açiklama göz önüne alinarak yapilmasi gerekmektedir. Sekillerin Açiklamasi Sekil-1: Kudret Nari Egzozomlarina ait SEM Görüntüsüdür. Sekil-2: Kudret Nari Egzozomlarina ait baska bir SEM Görüntüsüdür. Sekil-3: Kudret Nari Egzozom Çaplarin Dagilimini Gösteren Grafiktir. Sekil-4: Kudret Nari Egzozomlarinin Fibrolast Hücreleri Hücre Canliliklari Üzerindeki Etkisini Gösteren Grafiktir. Bulusun Detayli Açiklamasi Bu detayli açiklamada bulus konusu kudret nari (momordica charantia) bitkisinden elde edilen bitkisel egzozomlar sadece konunun daha iyi anlasilmasina yönelik olarak ve hiçbir sinirlayici etki olusturmayacak sekilde açiklanmaktadir. Bulus, kudret Nari (Momordica Charantia) bitkisinden egzozomlarin elde edilmesiyle ve elde edilen egzozomlarin ciltte olusan yaralarin tedavi edilmesi, hasar gören cilt dokusunu onarilmasi ve cilde saglikli bir görünüm kazandirilmasi amaciyla kullanimi ile ilgilidir. Bulus konusu, yaralarin vücutta yarattigi tahribati azaltan, semptomlari minimuma indiren yaralarin ve tedavisini saglayan kudret nari (momordica charantia) bitkisi kaynakli egzozomlardir. Kudret nari bitkisinden elde edilen egzozomlarin izolasyonu için 'Düsük pH Bazli Metot, kullanilmistir. Bulus konusu kudret nari (momordica charantia) bitkisinden elde edilen egzozomlarin üretim yöntemi asagidaki islem basamaklarini içermektedir: i. Bitki ekstraktlarinin demlenip, karistirilmasi ile ekstrakt solüsyonlarinin elde edilmesi, ii. Elde edilen solüsyonlarin asamali bir sekilde farkli 9 degerleri ve sürelerde santrifüj edilmesi, iii. Birinci santrifüj islemi sonrasi elde edilen süpernatantlarin alinarak peletlerin uzaklastirilmasi, iv. Alinan süpernatantlarin pH*i 4,25 olarak ayarlanip, %101uk (w/v) PEG (Polietilen glikol) eklenmesi ve bir gece süresince +4 "Cide in kübe edilmesi, v. +4"Clde bir gecelik inkübasyonun ardindan örneklerin santrifüj edilmesi ve santrifüj sonrasi elde edilen peletlerin distile su içerisinde çözülmesi, vi. Egzozom peletleri içeren solüsyonlarin por çapi 10 kDa olan diyaliz membranlari kullanilarak bir gece boyunca diyalize edilmesi ve PEGlin uzaklastirilmasinin saglanmasi Bulusun tercih edilen bir uygulamasina göre; söz konusu üretim yönteminin (ii) islem basamaginda uygulanan diferansiyel santrifüj asamalari sirasiyla asagidaki gibidir: a. Örneklerin 2000xg*de yaklasik 10 dakika santrifüj edilmesi ve süpernatantlarin elde edilmesi, b. Elde edilen süpernatantlarin 6000xg*de 20 dakika boyunca santrifüj edilmesi ve süpernatantlarin elde edilmesi, c. Elde edilen süpernatantlarin 10.000xg*de 40 dakika boyunca santrifüj edilmesi ve süpernatantlarin elde edilmesi, d. pH degerleri pH: 4,25lye sabitlenen ve % 10 (w/v) oraninda PEG eklenerek bir gece boyunca +4"Clde inkübe edilen süpernatantlarin 8.00 Oxglde 30 dakika boyunca santrifüj edilmesi Bulus konusu bitkisel egzozomlarin özellikleri ve etkileri Tablo 1 de verilmektedir. Tablo 1 Egzozomlarin özellikleri Özellik Etkisi Küçük boyut Cilt dokusundan kolayca emilebilme Yara iyilesmesi tedavisi Yara iyilesmesi tedavisinde kimyasal maddeler ve yan etkileri fazla olan tedaviler yerine toksisitesi ve yan etkileri çok düsük olan dogal ürünlerin kullanilmasi Asagida bulusla ilgili yapilan deneysel çalismalar ayrintili olarak açiklanmistir: Düsük pH Bazli Metodu ile Egzozom Izolasyonu Kudret nari bitkisi 3 dakika süresince distiIe suda tercihen mikser iIe karistiriIdi. Elde edilen sivi karisim 200 um por çapina sahip olan nyIon mesh filtreden geçirilerek falcon tüplere 10000 gida 40 dakika olarak seri santrifüj islemine tabi tutuldular. Seri santrifüj isleminin ardindan elde edilen süpernatantIar alindi ve pHilari 4,251de sabitIenerek %10 oraninda (w/v) PEG (Polietilen glikol) eklendi. PEG eklenmis süpernatantIar bir gece boyunca + 4"C sicaklikta inkübe ediIdiIer. Inkübasyonun ardindan elde edilen süpernatantIar 8000 gide 30 dakika boyunca santrifüj ediIdiIer. Santrifüj sonrasi elde edilen peIetIer distiIe suda çözüIdüIer. Çözülen peIetIer + 4C*de por çapi 10 kDa olan diya Iiz membraninda bir gece boyunca diyaIiz ediIdiIer ve egzozomIar elde edildi. Nanopartikül Izleme Analizi (NTA) - Egzozom Partikül Sayisinin Belirlenmesi ve Boyut Analizi NTA, Brownian hareketine dayali olarak, çözeltideki nanopartiküIIerin karakteristik hareketini ölçmeye dayanir. Bir lazerle saçilan isik sonrasi aydinlatmayi yakalayarak çözeltideki partiküller hakkindaki bilgileri belirler ve veziküIIerin konsantrasyonlarini ve boyutlarini belirlemek için Stokes-Einstein denkIemini ve hücre hacmi bilgisini kuIIanir. Düsük pH Bazli ve 1:10000 oraninda ddH20 kuIIaniIarak seyreItiIdi. Seyreltilen örnekler içerisindeki egzozomIarin boyut ve konsantrasyonlari NTA cihazi ile analiz edildi. Taramali Elektron Mikroskobu (SEM) Analizi ve Egzozom Çap Dagilimlarinin Belirlenmesi Taramali elektron mikroskobu (SEM), odaklanmis bir elektron demeti ile numune yüzeyini tarayarak görüntü elde eden bir elektron mikroskobu türüdür. Kudret nari bitkisinden elde edilen egzozomlar çaplarinin dagiliminin belirlenmesi için SEM ile analiz edildi. Kisaca; elde edilen egzozomlar PBS (Fosfat Tampon Çözeltisi) solüsyonu ile yikandi ve %2,5 glutaraldehit solüsyonu ile sabitlendi. Ardindan tekrar PBS ile yikandilar ve glutaraldehit çikarildi. %30'dan ve oda sicakliginda kurutulup uygun büyütme ile farkli pozisyonlarda yüksek çözünürlükle fotograflandilar. Elde edilen görüntülerdeki egzozom çaplarinin dagilimi Image J programi kullanilarak ölçüldüler. Kudret Nari Egzozomlarina ait SEM Görüntüleri sekil 1 ve sekil 2 de gösterilmektedir. Kudret nari egzozom çaplarinin dagilimi sekil 3 de verilmektedir. Bikinkoninik Asit Analizi (BCA) - Egzozom Miktarlarinin Belirlenmesi BCA Assay Kit prosedürüne göre standartlar eppendorf tüplerde hazirlandi. Hazirlanan standartlar ve kudret nari bitkisinden elde edilen egzozom örnekleri 96*lik well plate kuyucuklara her bir kuyucuga 20 uL olacak sekilde eklendi. Ardindan, her bir kuyucuga karisimi eklenip pipetaj yapildi. Örnekler 30 dakika boyunca 37"C ve %5,IIk CO 2," ortamda, 10 dakika boyunca da oda sicakliginda inkübe edildiler. Standart ve örneklerin abzorbans degerleri 570 nm dalga boyunda Mikroplaka Okuyucu kullanilarak ölçüldü. Elde edilen abzorbans degerlerine göre standart egri çizdirildi ve her bir örnek için intact egzozom protein miktari hesaplandi. Fibrolast Hücre Kültürü ve WST-1 Hücre Canliligi Testi Hücreler DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's medium) ile birlikte %10 fetal sigir serumu (Invitrogen), 2mM glutamine, 100 unite/ml penisilin ve 100 mg/ml streptomisin kullanilan besi canliligi %0,4 tripan mavisi boyasi ile hemositometre cihazi kullanilarak belirlendi. Çalismalara baslamadan önce canli hücre orani (Canli hücre orani (%) = Boya almamis hücrelerin sayisi/toplam hücre sayisi x 100) olarak tespit edildi ve hücre canliliginin %95 oldugu degerlerde çalismalara baslandi. Fibrolast hücreleri 96th kuyucuklu plakalarda 24 saat boyunca 5-50 ug/ml konsantrasyonundaki kudret nari egzozomlari ile inkübe edildiler. 24 saatlik inkübasyonun ardindan hücrelerin hücre canliliklari WST-1 testi ile analiz edildi. Inkübasyonlarin ardindan her bir kuyucuga 10 ultlik WST-1 stok çözeltisi eklendi ve hücreler 37C ve %5*Iik C302," ortamda 2 saat boyunca inkübe edildiler. Inkübasyonun ardindan her bir kuyucugun abzorbans degeri 450 nm dalga boyunda Mikroplaka Okuyucu kullanilarak ölçüldü ve hücre canliliklari hesaplandi. Deneysel çalismalarin sonuclari asagida aciklanmistir: 10-25 ug/ml konsantrasyonlarindaki kudret nari (momordica charantia) egzozomu uygulanan fibroblast hücrelerinin hücre canliliklarinin egzozom uygulanmayan kontrol grubu fibroblast hücrelerinin hücre canliliklarina kiyasla istatiksel olarak anlamli bir sekilde arttigi görüldü (p<0.05). Kudret nari bitkisinden elde edilen egzozomlar saglikli fibroblast hücrelerinde hücre proliferasyonlarini anlamli bir sekilde arttirmistir. (Sekil 4) Bu sonuçlar kudret narindan elde edilen egzozomlarin; ciltte olusan yara ve, yara izlerinin tedavisinde hiperpigmentasyon gibi yaslilik IekeIerinin tedavisinde çatlaklar, akne izlerinin tedavisinde cilt dokusunun iyilestirilmesinde kollajen üretimini artirilmasinda hücre yenileyici ve anti-aging olarak kullanilabilecegini göstermektedir. Kudret narindan elde edilen egzozomlar, küçük boyutlari nedeniyle cilt dokusundan çok daha fazla emiIebiIme potansiyeline sahiplerdir. Bu özellikleri nedeniyle kudret nari egzozonIari özüt ve ekstraktlar gibi büyük boyutlu yapilardan çok daha fazla biyolojik etkinlik gösterme potansiyeline sahiplerdir. Kudret narindan elde edilen bulus konusu egzozomlar ciltte olusan yara ve yara izlerinin tedavisinde, hiperpigmentasyon gibi yaslilik IekeIerinin tedavisinde, çatlaklar ve akne izlerinin tedavisinde, cilt dokusunun iyilestirilmesinde, kollajen üretiminin arttirilmasinda kudret narindan ekstraktlarindan çok daha etkili oIacakIardir. TR TR

Claims (1)

1.ISTEMLER Kudret nari (momordica charantia) bitkisinin egzozomlarin elde edilmesinde kullanimi. Kudret Nari bitkisinden elde edilen egzozomlarin; ciltte olusan yaralarin, yara izlerinin, hiperpigmentasyon gibi yaslilik lekelerinin ve çatlaklarin tedavisinde kullanimi. Istem 2lye uygun bitkisel egzozomlar olup, özelligi; hasar gören cilt dokusunu onarmak, kollajen üretimini arttirmak ve cilde daha saglikli ve genç bir görünüm kazandirmak amaciyla kullanimidir. Istem 2lye uygun bitkisel egzozomlar olup, özelligi; yüksek biyo-uyumluluk, cilt dokusundan kolay emilebilme ve düsük toksisite özellikleri ile hücre yenileyici ve anti- aging olarak kullanimidir . Yukaridaki istemlere uygun bitkisel egzozomlar olup, özelligi; farmasötik veya kozmetik olarak kullanilabilir bir krem formunda olmasidir. TR TR