KR20240016207A - 클로렐라 배양액 유래의 엑소좀 및 이의 용도 - Google Patents
클로렐라 배양액 유래의 엑소좀 및 이의 용도 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 클로렐라 배양액 유래의 엑소좀 및 이의 용도에 관한 것으로서, 본 발명에 따른 클로렐라 배양액 유래의 엑소좀은 세포 독성이 없어 피부 적용에 안전하고, 상처 치유, 면역 조절, 피부 미백, 주름 개선 등의 효과가 우수한 바, 천연물 유래 기능성 화장품, 의약품, 의약외품, 건강기능식품 등으로 제공될 수 있다.
Description
본 발명은 클로렐라 배양액 유래의 엑소좀 및 이의 용도에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 클로렐라 배양액 유래의 엑소좀 및 이를 유효성분으로 포함하는 상처 치유용 조성물, 면역 조절용 조성물, 피부 미백용 조성물 및 주름 개선용 조성물에 관한 것이다.
최근 세포 분비물(secretome)에 세포의 행동(behavior)을 조절하는 다양한 생체활성인자가 포함되어 있다는 연구가 보고되고 있으며, 특히 세포 분비물 내에는 세포 간 신호전달 기능을 갖는 엑소좀(exosome)이 포함되어 있어, 그 성분과 기능에 대한 연구가 활발히 진행 중에 있다.
세포는 세포외 환경에 다양한 막(membrane) 유형의 소포체를 방출하는데, 통상 이러한 방출 소포체들을 세포외 소포체(Extracellular vesicles, EVs)라고 부르고 있다. 세포외 소포체는 세포막 유래 소포체, 엑토좀 (ectosomes), 쉐딩 소포체(shedding vesicles), 마이크로파티클(microparticles), 엑소좀 등으로 불려지기도 하며, 경우에 따라서는 엑소좀과는 구별되어 사용되기도 한다.
엑소좀은 세포막의 구조와 동일한 이중 인지질막을 갖는 수십 내지 수백 나노미터 크기의 소포체로서 내부에는 엑소좀 카고(cargo)라고 불리는 단백질, 핵산(mRNA, miRNA 등) 등이 포함되어 있다. 엑소좀 카고에는 광범위한 신호전달 요소들(signaling factors)이 포함되며, 이들 신호전달 요소들은 세포 타입에 특이적이고 분비세포의 환경에 따라 상이하게 조절되는 것으로 알려져 있다.
엑소좀은 세포가 분비하는 세포 간 신호전달 매개체로서 이를 통해 전달된 다양한 세포 신호는 표적 세포의 활성화, 성장, 이동, 분화, 탈분화, 사멸(apoptosis), 괴사(necrosis)를 포함한 세포 행동을 조절한다고 알려져 있다. 또한, 엑소좀은 유래된 세포의 성질 및 상태에 따라 특이적인 유전물질과 생체활성 인자들이 포함되어 있다.
한편, 세포의 아바타라고 불리는 엑소좀은 세포와 유사하게 성장인자와 같은 생체활성 인자들이 포함되어 있는데, 생체활성 인자들을 세포와 세포 간에 실어 나르는 전달체 역할, 즉, 세포와 세포 간의 교신 역할을 한다. 엑소좀은 줄기세포, 면역세포, 섬유아세포 및 암세포 등의 동물세포(특허문헌 1)로부터 방출될 뿐만 아니라 식물(특허문헌 2), 세균(특허문헌 3), 균류(fungi) 등 다양한 생물의 세포로부터도 방출되는 것으로 알려져 있다. 예를 들어, 엑소좀은 암세포, 면역세포, 중간엽 줄기세포 등의 배양액 외에도 식물세포 내지는 식물줄기세포 배양액으로부터도 분리될 수 있다.
그러나 녹조류(green algae)의 일종인 클로렐라부터 유래된 엑소좀의 분리, 정제 및 특성 분석에 대한 연구는 아직 알려져 있지 아니한 바, 상기 클로렐라 배양액 으로부터 유래되는 엑소좀에 대한 보다 면밀한 특성분석 및 기능에 대한 연구가 필요한 실정이다.
본 발명의 목적은 상처 치료, 면역 조절, 피부 노화 억제, 피부 미백 및 주름 개선 효과가 있는 클로렐라 배양액 유래의 신규 엑소좀을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 클로렐라 배양액 유래의 용도를 제공하는 것이다.
본 발명은 상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 클로렐라 배양액 유래의 엑소좀을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 클로렐라 배양액은 클로렐라의 배양을 완료한 배양액으로부터 분리 및 정제한 것일 수 있다.
본 발명은 상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 상기 클로렐라 배양액 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 상처 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명은 상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 상기 클로렐라 배양액 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 면역 조절용 조성물을 제공한다.
본 발명은 상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 상기 클로렐라 배양액 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 조성물을 제공한다.
본 발명은 상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 상기 클로렐라 배양액 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 주름 개선용 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 클로렐라 배양액 유래의 엑소좀은 세포 독성이 없어 피부 적용에 안전하고, 상처 치유, 면역 조절, 피부 미백, 주름 개선 등의 효과가 우수한 바, 천연물 유래 기능성 화장품, 의약품, 의약외품 등으로 제공될 수 있다.
도 1은 나노입자추적분석(NTA)을 통해, 클로렐라 배양액 유래 엑소좀을 시각적으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 나노입자추적분석(NTA)을 통해, 클로렐라 배양액 유래 엑소좀의 크기 분포를 나타낸 것이다.
도 3은 클로렐라 배양액 유래 엑소좀에서 1 mL의 단위 부피당의 단백질 함유량을 나타낸 것이다.
도 4a는 클로렐라 배양액 유래 엑소좀의 미백효과를 확인한 사진이며, 도 4b는 이 때 멜라닌 함량을 정량적으로 나타낸 그래프이다.
도 5는 클로렐라 배양액 유래 엑소좀의 처리 후, 상처 부위에서 섬유아세포의 상처재생을 나타내는 사진이다.
도 6는 클로렐라 배양액 유래 엑소좀 처리에 따라 RAW 264.7 대식세포에서 TNF-a, IL-1b 및 IL-6 유전자의 발현 정도를 비교하여 그래프로 나타낸 것이다.
도 7은 클로렐라 배양액 유래 엑소좀을 처리한 섬유아세포의 콜라겐 합성량을 나타낸 그래프다.
도 2는 나노입자추적분석(NTA)을 통해, 클로렐라 배양액 유래 엑소좀의 크기 분포를 나타낸 것이다.
도 3은 클로렐라 배양액 유래 엑소좀에서 1 mL의 단위 부피당의 단백질 함유량을 나타낸 것이다.
도 4a는 클로렐라 배양액 유래 엑소좀의 미백효과를 확인한 사진이며, 도 4b는 이 때 멜라닌 함량을 정량적으로 나타낸 그래프이다.
도 5는 클로렐라 배양액 유래 엑소좀의 처리 후, 상처 부위에서 섬유아세포의 상처재생을 나타내는 사진이다.
도 6는 클로렐라 배양액 유래 엑소좀 처리에 따라 RAW 264.7 대식세포에서 TNF-a, IL-1b 및 IL-6 유전자의 발현 정도를 비교하여 그래프로 나타낸 것이다.
도 7은 클로렐라 배양액 유래 엑소좀을 처리한 섬유아세포의 콜라겐 합성량을 나타낸 그래프다.
본 발명의 제1 구현예는 클로렐라 배양액 유래의 엑소좀에 관한 것이다.
본 발명에서, "엑소좀(exosome)"이란 여러 종류의 세포들로부터 분비되는 막 구조의 작은 대략 직경 30~150 ㎛ 소낭을 의미하며, 다낭체와 원형질막의 융합이 일어나 세포밖의 환경으로 방출되는 소낭을 의미한다.
상기 클로렐라(chlorella)는 민물에 자라는 클로렐라목(chlorellales) 클로렐라과에 속하는 담수조류로 연못, 늪, 논, 저수지, 어항 등에서 부유 생활을 한다. 플랑크톤성 단세포체로 선명한 녹색이며, 지름 10 μm 이하의 미소한 구형이나 난형세포이다. 1개의 핵과 1개의 엽록체를 가지며 편모가 없어 운동성이 없고 각 개체가 따로 떨어져 물속에 부유하여 생육한다.
또한, 상기 클로렐라는 광합성 암반응의 메커니즘을 밝히는 데 연구재료로 쓰였고, 현재 약 10여 종이 알려져 있다. 클로렐라의 광합성 속도는 고등식물의 수십 배로서, 일반 식물의 태양에너지 이용효율이 0,5-2 %인데 비해 3-10 %의 에너지 이용효율을 갖는다. 세포분열을 하지 않고 내생포자를 형성하며 번식하므로 증식속도가 매우 빠르고, 배양조건을 달리 하면 단백질 90 %, 탄수화물 37 %, 지방 80 %까지 함량을 증가시킬 수 있어 미래식품으로 주목되었으며, 산소와 식량의 동시 해결이 가능하므로 미국항공우주국(NASA)에서 우주인의 식품으로 검토되기도 하였다.
상기 클로렐라는 예를 들어, 클로렐라 불가리스(Chlorella vulgaris), 클로렐라 피레노이도사(Chlorella pyrenoidosa), 클로렐라 레귤라리스(Chlorella regularis), 클로렐라 사코로필라(Chlorella saccharophila), 클로렐라 소로키니아나(Chlorella sorokiniana), 클로렐라 프로토테코이드(Chlorella prototecoide) 등을 제한없이 포함하며, 당업자가 입수가능한 모든 것을 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 엑소좀은 상기 클로렐라의 배양을 완료한 배양액으로부터 분리 및 정제한 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 "배양액"은 상기 녹조류를 공지의 액체 배지 또는 고체 배지에서 배양시켜 수득한 산물을 의미하여, 세포가 포함되는 개념이다.
상기 분리(isolation) 및 정제(purification)는 상기 녹조류의 배양 중 또는 배양을 완료한 배양물의 원심분리 및 여과 등을 통하여 수행할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 원심분리 방법은 저속 원심분리(low-speed centrifugation), 고속 원심분리(high-speed centrifugation), 초원심분리(ultracentrifugation) 및 이들의 조합으로부터 선택될 수 있는데, 바람직하게는 초원심분리(ultracentrifugation)를 포함하는 것일 수 있다.
저속 원심분리는 6,000 rpm(6,000 xg) 이하의 속도를 낼 수 있고, 주로 세포나 핵 등과 같이 쉽게 침전되는 시료의 원심 분리에 이용되며, 고속 원심분리는 최고속도가 20,000-25,000 rpm(60,000 xg) 정도이고, 초원심분리는 최고속도가 40,000-80,000 rpm(600,000 xg) 정도인 원심분리법을 의미한다.
상기 여과는 접선흐름 여과법(tangential-flow filtration, TFF) 등을 통하여 수행할 수 있는데, 이는 용액이 여과 막의 직각 방향으로 흘러가며, 용액 내에 존재하는 작은 크기의 불순물을 걸러내고 큰 크기의 엑소좀을 분리하는 여과 방식이다. 종래 여과 방식보다 여과필터의 기공에 엑소좀의 흡착 혹은 막 기공의 막힘을 최소화할 수 있으며, 이에 따른 공정 스케일업(process scale-up) 및 cGMP(cosmetic good manufacturing procedure) 공정 응용에 용이하다.
상기 접선흐름여과는 한외여과를 수행할 수 있는 중공 섬유(Hollow fiber) TFF 및 막(membrane) TFF로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있으며, 바람직하게는 분자량 컷오프(Molecular weight cutoff; MWCO)가 100,000 Da 내지 500,000 Da인 TFF 필터를 사용하는 것일 수 있다.
본 발명의 제2 구현예는 상기 클로렐라 배양액 유래의 엑소좀의 용도로서, 상기 클로렐라 배양액 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 상처 치료용 조성물, 면역 조절용 조성물, 피부노화 개선용 조성물, 피부 미백용 조성물 및 주름 개선용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서, 용어 "유효성분"은 상기 클로렐라 배양액 유래의 엑소좀의 효능 또는 활성을 달성하는데 충분한 양을 포함하는 것을 의미한다. 본 발명의 한 구체예에서, 본 발명의 조성물 내에서 상기 클로렐라 배양액 유래의 엑소좀은 예를 들어, 0.001 mg/kg 이상, 바람직하게는 0.1 mg/kg 이상, 보다 바람직하게는 10 mg/kg 이상, 보다 더 바람직하게는 100 mg/kg 이상, 보다 더욱 더 바람직하게는 250 mg/kg 이상, 가장 바람직하게는 1 g/kg 이상 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 클로렐라 배양액 유래의 엑소좀은 천연물 유래로서 인체에 부작용이 없으므로, 본 발명의 조성물 내에 포함되는 클로렐라 배양액 유래의 엑소좀의 양적 상한은 당업자가 적절한 범위 내에서 선택하여 실시할 수 있다.
본 발명에서, 용어 "상처 또는 창상(wound)"은 생체가 손상된 상태를 의미하며, 생체 내부 또는 외부 표면을 이루는 조직, 예를 들면 피부, 근육, 신경조직, 뼈, 연조직, 내부기관 또는 혈관조직이 분단 또는 파괴 된 병리학적 상태를 포괄한다. 본 발명을 한정하지 않는 예시로서 상처 또는 창상은 찰과상(abrasion), 열상 (laceration), 자상, 절상, 결출상(avulsion), 욕창, 와창, 방사선 조사에 의한 조직의 파괴, 관통상 (penetrated wound), 총상(gun shot wound), 화상, 동상, 수술상, 성형수술 후 봉합 부위, 화학적 창상 등을 포함하며 개체의 어떠한 부분에 대한 손상이 포함될 수 있다.
본 발명에서, 용어 "치료(treatment)"는 병적 상태 또는 장애를 감소 또는 방지하기 위한 치료적(therapeutic), 예방적(prophylactic) 또는 방지적(preventive) 조치 모두를 의미하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, 용어 "면역 조절"은 상기 클로렐라 배양액 유래의 엑소좀을 이용하여 면역 반응을 증가 또는 억제하는 것을 의미하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, 용어 "피부 미백"은 피부를 아름답고 희게 하는 것으로서, 멜라닌 생성을 억제하기 위한 것을 포함한다.
본 발명의 상기 클로렐라 배양액 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 상처 치료용 조성물, 면역 조절용 조성물, 피부 미백용 조성물 및 주름 개선용 조성물은 화장료 조성물 또는 약학적 조성물일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 화장료 조성물은 화장수, 영양로션, 영양크림, 수분크림, 마사지크림, 에센스, 페이스트, 마스크팩, 패치, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 클렌저, 오일, 파운데이션, 메이크업 베이스, 왁스 및 스프레이로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 이상의 제형일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 화장료 조성물은, 예를 들면 용액, 겔, 고체 또는 반죽 무수 생성물, 수상에 유상을 분산시켜 얻은 에멀젼, 현탁액, 마이크로에멀젼, 마이크로캡슐, 미세과립구 또는 이온형(리포좀), 비이온형의 소낭 분산제의 형태, 크림, 스킨, 로션, 오일, 파우더, 연고, 스프레이 또는 콘실 스틱의 형태로 제공될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 화장료 조성물은 본 발명의 상기 클로렐라 배양액 유래의 엑소좀 에 추가로 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제 및 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온봉쇄제 및 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염 료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 지질 소낭 또는 화장품에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 화장품 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 함유할 수 있는데, 이들 보조제는 화장품학 분야에서 일반적으로 사용되는 양으로 포함될 수 있다.
본 발명의 상기 화장료 조성물에 있어서, 통상적으로 함유되는 화장료 조성물에 본 발명의 상기 클로렐라 배양액 유래의 엑소좀이 0.1 내지 50 중량%, 바람직하게는 1 내지 10 중량%의 양으로 첨가될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 클로렐라 배양액 유래의 엑소좀을 피부 외용제로 사용하는 경우, 추가로 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제 및 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비 이온형 유화제, 충전제, 금속이온봉쇄제 및 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 지질 소낭 또는 피부용 외용제에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 피부 과학 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 함유할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 성분들은 피부 과학 분야에서 일반적으로 사용되는 양으로 도입될 수 있다.
본 발명의 상기 화장료 조성물은 단독 또는 중복하여 사용하거나, 본 발명 이외의 다른 화장료 조성물과 중복하여 사용할 수 있다. 또한 본 발명에 따른 화장료 조성물은 통상적인 사용방법에 따라 사용될 수 있으며, 사용자의 피부 상태 또는 취향에 따라 그 사용 횟수를 달리할 수 있다.
본 발명의 상기 약학적 조성물은 상기 유효 성분 이외에 약학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 보조제를 사용하여 제조될 수 있으며, 상기 보조제로는 부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제 또는 향미제 등을 사용할 수 있다.
상기 약학적 조성물의 제제 형태는 과립제, 산제, 정제, 피복정, 캡슐제, 좌제, 액제, 시럽, 즙, 현탁제, 유제, 점적제 또는 주사 가능한 액제 등이 될 수 있다. 예를 들어, 정제 또는 캡슐제의 형태로의 제제화를 위해, 유효 성분은 에탄올, 글리세롤, 물 등과 같은 경구, 무독성의 약학적으로 허용 가능한 불활성 담체와 결합될 수 있다. 또한, 원하거나 필요한 경우, 적합한 결합제, 윤활제, 붕해제 및 발색제 또한 혼합물로 포함될 수 있다. 적합한 결합제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 젤라틴, 글루코스 또는 베타-락토오스와 같은 천연 당, 옥수수 감미제, 아카시아, 트래커캔스 또는 소듐올레이트와 같은 천연 및 합성 검, 소듐 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 벤조에이트, 소듐 아세테이트, 소듐 클로라이드 등을 포함한다. 붕해제는 이에 제한되는 것 은 아니나, 녹말, 메틸 셀룰로스, 아가, 벤토니트, 잔탄 검 등을 포함한다.
액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용 가능한 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다.
상기 약학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등으로 투여할 수 있으며, 바람직하게는 경구 투여이다.
상기 약학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 약학적 조성물의 1일 투여량은 0.001-10 g/㎏일 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 상기 돌외추출물-금속나노입자 복합체의 1일 투여량은, 5 내지 500 mg/kg일 수 있으며, 바람직하게는 10 내지 250 mg/kg일 수 있고, 더욱 바람직하게는 10 내지 150 mg/kg일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 15 내지 150 mg/kg일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 15 내지 100 mg/kg일 수 있고, 가장 바람직하게는 15 내지 50 mg/kg일 수 있다.
상기 약학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써, 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명하지만, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예> 클로렐라 유래의 엑소좀
1. 추출 방법
클로렐라 배양액으로부터 클로렐라 엑소좀을 반복 원심분리를 이용하여 추출하였다. 구체적으로는, 클로렐라가 포함된 배양액을 3000 xg로 30분간 원심분리 후 상층액을 획득하고 이 과정을 두 번 더 반복하였다. 이 때, 상기 클로렐라의 배양은 대한민국 등록특허공보 제10-0193748호에 개시된 바에 따라 클로렐라 종균 배양하였다.
상기 얻어진 상층액을 1.2 μm 필터로 여과하여 불순물 중 필터의 기공 크기보다 큰 입자를 제거해 주었다. 여과액을 다시 0.45 μm 필터로 여과하여 세포 잔해물이나 노폐물 등의 불순물을 제거해 주었다.
상기 얻어진 여과액을 다시 0.22 μm 필터로 여과하여 크기가 작은 불순물을 제거해 주었다. 이렇게 추출된 클로렐라 유래의 엑소좀은 실험에 사용하기 전까지 -70℃ 이하로 냉동 보관하였다.
2. 동결건조
클로렐라 배양액의 동결건조를 위해 트레할로오스 및 만니톨을 포함하는 동결건조 보호제를 준비하였다. 본 실시예에서는 동결건조 보호제를 클로렐라 배양액에 첨가하였으나, 주사용수, 생리적 식염수, 탈이온수에 동결건조 보호제를 첨가하여 준비할 수도 있다.
본 실시예에서는 클로렐라 배양액 내의 트레할로오스 및 만니톨 농도를 0.5 중량%가 되도록 하였으나, 트레할로오스 및 만니톨의 농도는 0.5~5 중량%가 되도록 준비할 수도 있다.
트레할로오스 및 만니톨을 포함하는 동결건조 보호제를 처리하여 클로렐라 배양액을 -70 ℃ 이하에서 냉동보관 혹은 액체질소에 동결한 뒤 동결건조를 진행한 결과, 황갈색의 가루를 얻을 수 있었다. 본 실시예에서는 20 mL의 클로렐라 배양액에서 0.1~1.0 g의 동결건조 결과물을 얻을 수 있었다.
3. 엑소좀의 특성 평가
클로렐라 배양액 유래 엑소좀은 다음과 같은 방법을 통하여 엑소좀 특성 평가를 진행하였다. 엑소좀의 단위 부피당 입자 수 및 입자 크기 분포를 확인하기 위해 나노입자추적분석(NTA)을 사용하였다. 엑소좀 내 단백질 함량을 확인하기 위해 Thermo Scientific™ 사의 Micro BCA™ Protein Assay Kit를 사용하였다. 시료는 상기 분리한 직후의 클로렐라 배양액 유래 엑소좀을 사용하였다.
나노입자추적분석(NTA)을 통해, 50 ~ 200 nm 크기의 클로렐라 배양액 유래 엑소좀을 시각적으로 확인하였으며, 1 mL의 단위부피당 엑소좀 농도가 1 × 10^9 ~ 1 × 10^11 개임을 확인하였다(도 1). 또한 클로렐라 배양액 유래 엑소좀의 평균 크기가 201 nm, 중앙값 144 nm임를 확인하였다(도 2).
Thermo Scientific™ 사의 Micro BCA™ Protein Assay Kit를 통해 엑소좀 내 단백질 함량을 수회 측정하였으며, 구체적으로 5 kDa molecular cut off를 가지는 원심분리 필터를 이용하여 클로렐라 배양액 유래 엑소좀을 살균 인산염 완충액으로 탈염화하여 시료를 준비하였다. 클로렐라 배양액 유래 엑소좀에서 1 mL의 단위 부피당 100~1000 μg/mL의 단백질을 함유하고 있음을 확인하였다(도 3).
4. 엑소좀의 피부 미백 효과
상기 냉동 보관된 클로렐라 유래의 엑소좀을 이용하여 피부 미백 효과를 평가하였다.
멜라닌세포 B16F0를 5.0 × 10^4 cells/wall의 농도로 배양 후 진행하였다. 이후 DPBS로 수세 후 클로렐라 배양액 엑소좀이 첨가 혹은 미첨가된 DMEM 배지(10 % FBS와 α-MSH 포함)로 교체하고 72 시간 배양 후 세포를 수득하였다. 이후, 멜라닌 추출을 위해 1 N NaOH + 10 % DMSO 용액을 웰(well)당 200 μL씩 첨가하여 60 ℃에서 세포를 1 시간 용해시킨 후 마이크로플레이트 판독기로 405 nm에서 멜라닌 흡광도를 측정하였다. 이에 대한 결과를 도 4a 및 4b에 나타내었고 멜라닌 함량 억제 분석 결과 클로렐라 유래 엑소좀은 대조군에 비해서 우수한 미백 효과를 나타냄을 확인하였다.
5. 엑소좀의 상처 치료 효과
상기 냉동 보관된 클로렐라 유래의 엑소좀을 이용하여 상처 치료 효과를 평가하였다. 피부 섬유아세포를 5.0 × 10^4 cells/well의 농도로 72 시간 배양 시키고 일정한 거리 간격으로 상처(scratch)를 만든 뒤, 상처 부분에 상기 실시예 1에서 얻어진 클로렐라 유래 엑소좀 첨가 혹은 미첨가된 10 % FBS를 포함한 배양액에서 24 시간 배양 후, 세포 이동 정도를 확인하여 그 결과를 도 5에 나타내었다. 도 5에서 보이는 바와 같이, 엑소좀을 처리하지 않은 경우보다 엑소좀을 처리한 경우 많은 세포가 상처 부위로 이동함을 시각적으로 확인할 수 있다.
6. 엑소좀의 면역조절 효과
상기 냉동 보관된 클로렐라 유래의 엑소좀을 이용하여 면역조절 효과를 평가하였다.
쥐 유래의 대식세포인 RAW 264.7 세포에 LPS(Lipopolysaccharide)를 6 시간 처리하여 염증을 유도한 뒤, 상기 클로렐라 유래 배양액 유래 엑소좀을 처리하고 RT-PCR을 이용하여 염증 관련 사이토카인인 TNF-a, IL-1b, IL-6 유전자의 발현 정도를 비교하였다. 도 6에서 보이는 바와 같이, LPS로 처리한 군에서 TNF-a, IL-1b 및 IL-6 유전자의 발현이 증가되었으나, 클로렐라 유래 엑소좀을 처리한 경우 이들 유전자의 발현이 현저히 감소한 것을 확인할 수 있다.
7. 엑소좀의 콜라겐 합성 효과
클로렐라 유래 엑소좀의 피부 노화 억제제로서의 유효성을 확인하기 위하여 콜라겐 합성을 인간유래의 섬유아세포 (HDF, Human Dermal Fibroblast)를 이용하여 확인하였다.
구체적으로 인간 섬유아세포를 1 × 10^5 개의 농도로 24 시간 배양하였다. 이 후 혈청(serum)이 포함되지 않은 DMEM 배지로 교체하고 상기 실시예 1과 같은 방법으로 제조한 클로렐라 유래 엑소좀과 대조군 배양액 (세포없이 같은 조건에서 배양된 serum-free DMEM media)을 첨가하여 24 시간 동안 배양한 후, 상층액을 프로콜레간 타입 원 단백질 합성 키트 (Procollagen type I protein synthesis kit)를 이용하여 콜라겐 함량을 분석하였으며, 그 결과를 도 7에 나타내었다.
도 7에 나타낸 바와 같이, 클로렐라 유래 엑소좀 처리군에서 콜라겐의 합성양이 대조군보다 더 높게 측정됨을 확인하였다. 즉, 피부탄력, 피부재생 및 피부 주름개선에 도움을 주는 콜라겐 합성에 클로렐라 유래 엑소좀이 우수한 것을 확인할 수 있었다.
이상으로 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시예일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다.
따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다. 본 발명의 단순한 변형 내지 변경은 이 분야의 통상의 지식을 가진 자에 의하여 용이하게 이용될 수 있으며, 이러한 변형이나 변경은 모두 본 발명의 영역에 포함되는 것으로 볼 수 있다.
Claims (6)
- 클로렐라 배양액 유래의 엑소좀.
- 제1항에 있어서, 상기 클로렐라 배양액은 클로렐라의 배양을 완료한 배양액으로부터 분리 및 정제한 것을 특징으로 하는 클로렐라 배양액 유래의 엑소좀.
- 제1항 또는 제2항의 클로렐라 배양액 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 상처 치료용 조성물.
- 제1항 또는 제2항의 클로렐라 배양액 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 면역 조절용 조성물.
- 제1항 또는 제2항의 클로렐라 배양액 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 조성물.
- 제1항 또는 제2항의 클로렐라 배양액 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 주름 개선용 조성물.
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