KR20080032212A - 시트형 조성물 - Google Patents

Abstract

보존성 및 취급성이 우수한 동시에, 사용시에 높은 유연성을 가지는 양막을 포함하는 시트형 조성물을 제공한다. 트레할로스를 부가한 양막을 이용한다. 트레할로스의 부가에 의해 양막의 유연성이 향상되고, 동결 건조 처리에 따른 기저막 및 치밀층의 손상을 방지할 수 있다.

양막, 트레할로스, 동결, 시트, 이식, 재건, 유착

Description

시트형 조성물{SHEET-LIKE COMPOSITION}

본 발명은 양막(羊膜)을 이용한 시트형 조성물 및 그 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명의 시트형 조성물은, 예를 들면, 인공 조직(각막 상피 시트 등)을 제조하기 위한 배양 기질, 안구 표면이나 피부 등의 재건용 이식 재료 또는 유착 방지제로서 이용할 수 있다.

양막은 생체 적합성이 높고, 유연성이 높은 등과 같이 이식 재료로서 바람직한 특성을 구비하고 있기 때문에, 각막 상피의 재건을 비롯하여 각종 조직의 재건에 이용이 시도되고 있다(예를 들면, 특허 문헌 1∼4 참조). 양막의 이용 방법은 2가지로 대별된다. 즉, 양막을 직접 환부에 적용해서 조직의 재건을 도모하는 방법과, 양막을 세포 배양용 기질로서 이용하는 방법이다. 이들 모든 이용 방법에 있어서 양막의 유연성은 중요한 특성이다. 높은 유연성을 가지기 때문에 양막은 환부를 틈 없이 피복할 수 있으며, 또한 환부에 대한 양호한 접착 및 생착(生着)도 가능하며, 양호한 치료 효과를 발휘한다. 한편, 세포 배양용 기질로서 양막을 이용할 경우에 있어서는, 높은 유연성을 가짐으로써 양막 상에서의 양호한 세포 증식 및 정상적인 조직화(분화)를 가능하게 한다.

[특허 문헌 1] 특개 평 5-56987호 공보

[특허 문헌 2] 국제 공개 제03/043542 A1호 팜플렛

[특허 문헌 3] 국제 공개 제03/092762 A1호 팜플렛

[특허 문헌 4] 국제 공개 제2004/078225 A1호 팜플렛

[발명이 해결하고자 하는 과제]

양막은 포유 동물에 있어서 자궁과 태반의 최표층(最表層)을 덮는 막이며 분만시에 얻어진다. 따라서, 신선한 상태의 양막을 언제든지 입수하기는 곤란하며, 이후의 임상 응용을 고려하면, 장기간 보존이 가능하고, 취급성도 우수한 양막을 제공할 것이 요망된다. 따라서, 채취된 양막을 건조 상태로 하여 보존성 및 취급성을 향상시키는 시도가 행해지고 있다. 건조 처리함으로써 양막의 보존성 등이 특히 향상되지만, 구성 단백질의 변성 등이 발생하여, 습윤 상태로 되돌렸을 때의 유연성은 크게 저하된다. 유연성이 낮아지면, 틈이 없이 환부를 피복할 수 없을 경우도 발생하며, 환부에 대한 접착성이나 생착성(生着性)도 저하된다. 한편, 건조 처리를 거친 양막에서는 양막 상에서의 세포 증식율이 낮고, 중층화도 저해되며, 정상적인 조직화(분화)이 이루어지지 않는다. 이는 유연성의 저하에 따라서 양막 표면의 평탄성이 대폭 저하됨에 의한 것으로 생각된다.

본 발명은 상기 과제를 감안하여 행해진 것으로서, 그 주된 목적은 보존성 및 취급성이 우수한 동시에, 사용시에 높은 유연성을 가지는 양막을 포함하는 시트형 조성물을 제공하는 것이다.

[과제를 해결하기 위한 수단]

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명자들은 양막을 수식(修飾; modify)함으로써 유연성이 향상되는 것을 시험하였다. 그 결과, 이당류의 일종인 트레할로스(trehalose)로 처리한 양막에서는, 이후에 건조 처리되어도 습윤 상태로 되돌리면 유연성을 회복하며, 그 유연성은 미처리 양막(생 양막)과 동일한 수준인 것을 발견하였다. 즉, 양막의 유연성을 향상시키기 위하여 트레할로스 처리가 효과적인 것이 명확하였다.

또한, 트레할로스 처리를 거침으로써 양막의 투명도가 향상된다는 놀라운 현상도 확인되었다. 이러한 점에서, 가능한 높은 투명성이 요구되는 용도(예를 들면, 각막 재건)에 사용할 경우, 양막을 트레할로스 처리하는 것이 지극히 효과적인 것으로 밝혀졌다.

한편, 트레할로스 처리에 의해 양막의 인장 강도도 향상되고, 생 양막보다 강도가 높은 양막을 얻을 수 있었다. 이러한 점에서, 양막의 취급성의 향상이나 이식 후의 형태 유지에 있어서도 트레할로스 처리가 효과적인 것이 명확하였다.

게다가, 트레할로스 처리 후의 양막의 생체 적합성을 검증한 결과, 생 양막과 동일한 높은 생체 적합성을 확인하였다. 따라서, 트레할로스 처리가 생체 적합성에 영향을 미치지 않는 것이 확인되었다.

이상과 같은 발견 후, 양막의 세포 배양 기질로서의 기능에 미치는 트레할로스의 영향을 조사하였다. 구체적으로는, 트레할로스 처리 후의 양막 상에서 각막 상피 세포를 배양하고, 세포 증식율, 중층화 정도를 조사하였다. 그 결과, 양호한 세포 증식이 확인되는 동시에 5∼7층의 중층화가 이루어졌다. 이는 트레할로스 처리를 실시하지 않는 양막에서의 중층화(1∼2층)의 정도에 비하여 대폭 향상된 것이다. 이와 같이 양막을 세포 배양 기질로서 이용할 경우에 있어서도 트레할로스 처리가 효과적인 것으로 밝혀졌다.

이어서, 양막 상에 세포층이 형성된 시트를 동물의 안구 표면에 이식하고, 그 재건 효과를 검증하였다. 그 결과, 양호한 접착성 및 생착성을 나타내며, 손상 없이 안구 표면을 재건할 수 있으며, 높은 투명성도 유지하였다.

본 발명은 주로 상기 발견에 근거한 것이며, 본 발명은 아래의 시트형 조성물을 제공한다.

[1] 트레할로스를 부가한 양막을 포함하는 시트형 조성물.

[2] 동결 상태 또는 건조 상태인 것을 특징으로 하는 [1]에 기재된 시트형 조성물.

[3] 동결 건조 상태인 것을 특징으로 하는 [2]에 기재된 시트형 조성물.

[4] 상기 양막이 상피 세포층이 제거된 양막인 것을 특징으로 하는 [1]∼[3] 중 어느 하나에 기재된 시트형 조성물.

[5] 상기 양막은 기저막 성분인 콜라겐 IV, 콜라겐 VII, 및 라미닌 5가 미처리 양막과 동등한 강도로 검출되는 양막인 것을 특징으로 하는 [1]∼[4] 중 어느 하나에 기재된 시트형 조성물.

[6] 상기 양막이 인간 양막인 것을 특징으로 하는 [1]∼[5] 중 어느 하나에 기재된 시트형 조성물.

[7] 생체 유래 세포로부터 형성된 세포층이 상기 양막 상에 형성되어 있는 것을 특징으로 하는 [1]∼[6] 중 어느 하나에 기재된 시트형 조성물.

[8] 상기 세포층에 있어서 상기 생체 유래 세포가 중층화되어 있는 것을 특징으로 하는 [7]에 기재된 시트형 조성물.

[9] 상기 생체 유래 세포는 각막 상피, 결막 상피, 피부 표피, 모낭 상피, 구강 점막 상피, 홍채 색소 상피, 망막 색소 상피, 기도 점막 상피 또는 장관(腸管) 점막 유래의 세포인 것을 특징으로 하는 [7]에 기재된 시트형 조성물.

[10] 상기 세포층은 약 5∼7층으로 중층화된 세포로부터 구축되며, 각막 상피와 유사한 성질을 구비하는 것을 특징으로 하는 [7]에 기재된 시트형 조성물.

[11] 유착(癒着) 방지용 재료 또는 수술 침습(侵襲)에 의한 장기 또는 기관의 표면 조직 장해의 재건용 재료로서 사용되는 것을 특징으로 하는 [1]∼[6] 중 어느 하나에 기재된 시트형 조성물.

[12] 상기 양막의 융모막측 표면에 접착 성분이 부착되어 있는 것을 특징으로 하는 [1]∼[11] 중 어느 하나에 기재된 시트형 조성물.

[13] 상기 접착 성분이 피브리노겐(fibrinogen) 및 트롬빈(thrombin)인 것을 특징으로 하는 [12]에 기재된 시트형 조성물.

[14] 상기 접착 성분이 피브리노겐, 트롬빈 및 아프로티닌(aprotinin)인 것을 특징으로 하는 [12]에 기재된 시트형 조성물.

[15] 상기 양막의 융모막측 표면이 생체 흡수성 재료로 피복되어 있는 것을 특징으로 하는 [1]∼[14] 중 어느 하나에 기재된 시트형 조성물.

본 발명은 다른 태양으로서는 아래의 이식 방법을 제공한다.

[16] [1]∼[15] 중 어느 하나에 따른 시트형 조성물을 이식 재료로서 사용하는 이식 방법.

본 발명은 또 다른 태양으로서는 아래의 제조 방법을 제공한다.

[17] 하기 단계를 포함하는 시트형 조성물의 제조 방법:

(a) 양막을 조제하는 단계;

(b) 상기 양막에 트레할로스를 부가하는 단계.

[18] 하기 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 [17]에 기재된 제조 방법:

(c) 단계 b 후에 동결 처리 또는 건조 처리하는 단계.

[19] 하기 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 [18]에 기재된 제조 방법:

(d) 단계 c 후에 멸균 처리하는 단계.

[20] 상기 단계 a는 하기 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 [17]∼[19] 중 어느 하나에 기재된 제조 방법:

(a1) 양막으로부터 상피를 제거하는 단계.

[21] 상기 단계 a1은 하기 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 [20]에 기재된 제조 방법:

(1) 생체로부터 분리된 양막을 준비하는 단계,

(2) 상기 양막에 동결 융해 처리를 행하는 단계,

(3) 동결 융해 처리 후의 양막에 트립신 처리를 행하는 단계,

(4) 트립신 처리 후의 양막을 세정하는 단계.

[22] 상기 동결 융해 처리에 있어서, 동결 온도는 약 -20℃∼약 -80℃이며, 융해 온도는 약 4℃∼약 50℃인 것을 특징으로 하는 [21]에 기재된 제조 방법.

[23] 상기 동결 융해 처리를 2회 이상 반복하여 행하는 것을 특징으로 하는 [21] 또는 [22]에 기재된 제조 방법.

[24] 상기 트립신 농도는 약 0.01%(w/v)∼약 0.05%(w/v)의 트립신 용액을 사용하여 상기 트립신 처리를 행하는 것을 특징으로 하는 [20]∼[23] 중 어느 하나에 기재된 제조 방법.

[25] 상기 트립신 용액은 EDTA, NTA, DTPA, HEDTA, GLDA 및 이들 임의의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 킬레이트제를 약 0.1mM∼약 0.6mM 함유하는 것을 특징으로 하는 [24]에 기재된 제조 방법.

[26] 상기 양막 상피측에만 트립신 용액이 접촉하는 조건 하에서 상기 트립신 처리를 행하는 것을 특징으로 하는 [20]∼[25] 중 어느 하나에 기재된 제조 방법.

[27] 상기 단계 b 후에, 하기 단계가 행해지는 것을 특징으로 하는 [20]∼[26] 중 어느 하나에 기재된 제조 방법:

(A) 생체 유래 세포로부터 형성된 세포층을 상기 양막 상에 형성하는 단계.

도 1은 조직 재건용 재료로서의 시트형 조성물의 용도(주요한 적용 부위, 적용 방법의 예, 바람직한 양막의 형태, 주요한 목적)를 정리한 표이다.

도 2는 양막의 고정법을 설명하는 도면이다. (a)에서는 한 쌍의 프레임으로 양막을 협지하고, (b)에서는 프레임과 평판형 부재로 양막을 협지한다.

도 3은 트레할로스 처리·동결 건조 양막의 물성 평가 시험(두께)의 결과를 나타내는 그래프이다.

도 4는 트레할로스 처리·동결 건조 양막의 물성 평가 시험(투명도)의 결과를 나타내는 그래프이다.

도 5는 트레할로스 처리·동결 건조 양막의 물성 평가 시험(인장 강도)의 결과를 나타내는 그래프이다.

도 6은 트레할로스 처리·동결 건조 양막의 물성 평가 시험(유연성)의 결과를 나타내는 그래프이다.

도 7은 트레할로스 처리·동결 건조 양막의 생체 적합성 평가 시험의 결과를 나타내는 도면이다. 트레할로스 처리·동결 건조 양막을 집토끼의 각막 실질층 사이에 이식하고, 안구 표면의 상태를 관찰하였다. 좌측은 이식 직후의 안구 표면의 상태, 우측은 이식 후 1개월 후의 안구 표면의 상태이다.

도 8은 트레할로스 처리·동결 건조 양막의 생체 적합성 평가 시험의 결과를 나타내는 도면이다. 트레할로스 처리·동결 건조 양막을 집토끼의 각막 실질층 사이에 이식하고, 이식 후 1개월 시점에서, 이식부를 포함하는 각막의 일부를 적출하여 HE 염색에 제공하였다.

도 9는 트레할로스 처리·동결 건조 양막 상에 각막 상피 세포를 배양할 때의 기구 등의 상태를 모식적으로 나타낸 단면도이다. 배양 접시(11) 내에 배양 인 서트(culture insert; 12)가 정치 되고, 배양 접시(11) 저면에는 3T3 세포층(15)이 형성된다. 또한, 배양 인서트(12)의 저면 상에 양막(13)이 정치되며, 그 위에 각막 상피 세포(14)가 배양되는 상태를 나타낸다. 부호 16은 배지(培地)이다.

도 10은 트레할로스 처리·동결 건조 양막 상에 형성된 세포층을 나타내는 도면(HE 염색상; HE staining image)이다. 트레할로스 처리를 행하지 않고 동결 건조하여 얻어진 양막(미처리 동결 건조 양막)을 사용할 경우에 형성되는 세포층의 상태를 비교 대조하여 나타낸다.

도 11은 트레할로스 처리·동결 건조 양막 상에 세포층이 형성된 시트(배양 각막 상피 시트)의 HE 염색상 및 면역 염색상이다. 면역 염색상에 있어서 각 항체의 신호는 녹색이다. 세포핵은 적색으로 표시된다. 각막형 케라틴 3은 발현(+), 피부 각화형(角化型) 케라틴 10(-), 결막형 케라틴 13(-).

도 12는 트레할로스 처리·동결 건조 양막을 사용하여 제조된 배양 각막 상피 시트의 재건 효과를 나타내는 도면이다. 배양 각막 상피 시트 이식 후 2일째 및 14일째의 안구 표면의 상태(상단) 및 플루오레세인(fluorescein) 염색상(하단)을 나타낸다.

도 13은 이식 후 2주째의 배양 각막 상피 시트의 HE 염색상(상단 좌측), 및 각종 케라틴에 관한 면역 염색상(상단 우측, 하단)이다. 기호 **는 트레할로스 처리·동결 건조 양막(TH-AM)을 나타낸다.

도 14는 기저막 특이적 성분에 대한 항체, 및 치밀층 특이적 성분에 대한 항체를 사용하여 트레할로스 처리·동결 건조 양막을 면역 염색한 결과이다. 트레할 로스 처리·동결 건조 양막의 면역 염색상(C)을, 생 양막(A)의 면역 염색상과 트레할로스 처리를 하지 않고 동결 건조시킨 양막의 면역 염색상(B)과 비교하여 나타낸다. 1: 콜라겐 I의 염색상, 2: 콜라겐 III의 염색상, 3: 콜라겐 IV의 염색상, 4: 콜라겐 V의 염색상, 5: 콜라겐 VII의 염색상, 6: 라미닌 5의 염색상, 7: 피브로넥틴의 염색상.

도 15는 양막 상피의 제거 순서를 나타내는 흐름도이다.

도 16은 트립신 처리의 방법을 나타내는 도면이다. (a)에서는 프레임 고정된 양막의 상피측을 아래로 하여 트립신 용액에 침지한다. (b)에서는 프레임 내에 트립신 용액을 넣음으로써 양막의 상피측에 트립신을 작용시킨다.

도 17은 트립신 처리 양막, 생 양막(상피 있음), 수작업 처리(manually-treated) 양막의 HE 염색상이다.

도 18은 트립신 처리 양막의 면역 염색상이다.

도 19는 동일한 트립신 처리 양막의 면역 염색상이다.

도 20은 생 양막(상피 있음)의 면역 염색상이다.

도 21은 수작업 처리 양막의 면역 염색상이다.

도 22는 HE 염색 실험 및 면역 실험의 결과를 정리한 표이다.

[부호의 설명]

1, 2, 3: 프레임 4: 판형 부재 5: 트립신 용액

10, 13: 양막 11: 배양 접시

12: 배양 인서트(배양 삽입 용기) 14: 각막 상피 세포

15: 3T3 세포층 16: 배지

[발명을 실시하기 위한 최선의 형태]

본 발명의 제1 태양은 시트형 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 시트형 조성물에서는 그 주요 구성 성분으로서 양막이 사용된다. 양막이 가지는 높은 투명성 및 강인성으로 인하여, 투명성 및 강도가 우수한 시트형 조성물을 구성할 수 있다. 또한, 양막의 높은 생체 친화성 및 저면역원성으로 인하여, 생체 친화성이 더욱 우수한 동시에 면역원성이 낮은 시트형 조성물을 구성할 수 있다. 양막을 사용함으로써 더욱, 항염증 작용, 치료 흔적 형성의 억제, 신생 혈관 형성(angiogenesis)의 저해와 같은 작용을 추가적으로 기대할 수 있다. 양막을 사용하는 것은 본 발명의 시트형 조성물이 세포층을 포함할 경우에 있어서, 해당 세포층을 양호하게 형성시킨다는 점에서도 바람직하다. 즉, 후술하는 바와 같이, 세포층을 구비하는 시트형 조성물은, 양막을 기질(지지체)로서 그 위에 소정의 세포를 파종(seeding), 배양함으로써 형성하면, 양막은 그 위에 세포가 양호하게 접착 및 증식한다는 특성을 가지기 때문에, 양막을 사용하면 양호한 세포의 접착, 증식, 그리고 세포층의 형성이 가능해진다.

(양막의 유래)

"양막"이란, 포유 동물에 있어서 자궁과 태반의 최표층을 덮는 막이며, 콜라겐이 많은 실질 조직 상에 기저막, 상피층이 형성되어서 구성된다. 인간, 원숭이, 침팬지, 돼지, 말, 소 등의 양막을 이용할 수 있다. 이 중에서도 인간 양막을 이 용하는 것이 바람직하다. 면역원성이나 바이러스 감염을 포함하여, 안전성 면에서 유리하기 때문이다.

(트레할로스의 부가)

본 발명의 시트형 조성물에서는 트레할로스를 부가한 양막이 사용된다. 본 발명자들의 검토 결과, 트레할로스의 부가에 의해 양막의 유연성이 향상되고, 특히 동결 건조 상태로 할 경우의 유연성이 대폭 개선되는 것이 밝혀졌다. 또한, 후술하는 실시예에 나타낸 바와 같이, 트레할로스를 부가한 양막은 세포 배양용 기질로서 양호하게 기능하는 것이 밝혀졌다. 이러한 발견에 근거하여 구성된 본 발명의 시트형 조성물은 높은 유연성을 가지며, 한편 세포 배양용 기질로서 사용될 경우에는 양호한 세포 증식 및 중층화가 가능해진다.

여기에서, 양막 내부의 매트릭스 단백질이 약체화되면(weakening) 양막의 강도가 저하되고, 장해를 받기 쉬워진다. 또한, 수분을 내부에 견고하게 보유할 수 없고, 취약해져서 탄력도 소실된다. 트레할로스는 매트릭스 단백 내의 결합이 풀어진 부분에 작용하여 단백질간의 결합을 강화하고, 이에 의해 양막 내부의 수분 유지 기능이 정상이 되어서, 양막 본래의 습기, 완전성(integrity), 탄력이 유지되는 것으로 예상된다. 트레할로스를 부가함으로써, 동결 건조 처리에 따른 양막 내부의 매트릭스 단백이 연해져서, 특히 물에서 팽윤되어 약체화되는 것을 효율적으로 방지할 수 있는 것으로 생각된다.

트레할로스(물질명, 일반명)는 α-D-Glucopyranosyl(1,1)-α-D-Glucopyranoside로 표시되는 화합물이다.

양막에 대한 트레할로스의 부가는 예를 들면, 트레할로스 용액으로 양막을 처리함으로써 행할 수 있다. 트레할로스의 부가 방법의 상세한 설명은 후술한다.

또한, 본 발명의 일 형태는 트레할로스가 부가된 양막만으로부터 실질적으로 구성된다.

(양막의 상태)

본 발명의 일 형태에서는, 상피 세포층이 제거된 양막이 사용된다. 상피 세포층이 제거된 양막에서는 상피 세포에 기인하는 면역 거부 등의 문제가 전혀 없고, 안전성이 극히 높아진다. 또한, 상피가 제거된 양막에서는 그 위에 세포가 더욱 양호하게 접착 및 증식하기 때문에, 보다 단시간에 높은 품질의 세포 시트를 구축할 수 있다고 하는 제조상의 장점도 얻어진다.

본 발명의 시트형 조성물에 양막 상피층의 세포가 포함되어 있지 않음을 조사함으로써 상피층을 제거한 양막인지를 확인할 수 있다.

한편, 상피층을 잔존시킨 양막을 이용하여 본 발명의 시트형 조성물을 구축할 수도 있다. 양막의 상피층을 잔존시킴으로써, 제조 단계에서 γ선 처리 등 충분한 멸균 처리를 행할 수 있고, 안전성의 향상을 도모할 수 있다.

(재구축한 양막의 사용)

재구축한 양막을 이용하여 본 발명의 시트형 조성물을 구성할 수도 있다. 구체적으로는 예를 들면, 균질기(homogenizer), 초음파, 효소 처리에 의해 일단 분해하고, 다시 막형상으로 재구축한 양막을 이용할 수 있다. 처리 방법은 균질기를 이용하는 것이 바람직하다. 기저막이 미소한 구조체를 비교적 높게 보유하는 것으 로 기대되기 때문이다. 균질화 처리의 조건(회전수)은 예를 들면 3000rpm∼50000rpm, 바람직하게는 10000rpm∼40000rpm, 더욱 바람직하게는 약 30000rpm이다.

(두께)

양막을 사용함으로써 본 발명의 시트형 조성물은 대단히 얇은 시트형으로 구성될 수 있다. 본 발명의 시트형 조성물은 예를 들면 10㎛∼500㎛의 두께로 조제된다. 이와 같이 대단히 얇은 시트형이기 때문에 범용성이 증가한다. 융모막측 치밀층의 일부(예를 들면, 10㎛∼30㎛ 정도)를 제거한 양막을 이용하여 본 발명의 시트형 조성물이 구축될 수도 있고, 생체 흡수성의 소재를 코팅함으로써 예를 들면 100㎛∼500㎛ 정도의 두께로 할 수도 있다.

(접착 성분의 사용)

본 발명의 일 형태에서는, 양막의 표면에 피브리노겐 및 트롬빈(이하, 이들을 함께 "접착 성분"이라 지칭함)이 부착되어 있다. 이에 의해, 본 발명의 시트형 조성물을 이식할 경우, 우선 트롬빈에 의해 피브리노겐이 특이적으로 가수분해되어서 피브린이 생성되고, 이어서 피브린이 중합되어 안정적인 피브린 덩어리가 되어 접착 작용을 발휘한다. 이와 같이 접착성을 높이면, 시트형 조성물을 환부에 적용할 경우, 봉합이 없이도 충분한 접착력을 얻을 수 있으며, 이에 의해 수술의 간편화를 도모할 수 있다. 또한, 본 명세서에 있어서, 상피를 가지는 동시에 접착 성분이 부착된 양막을 "접착 성분 부착·상피가 있는 양막"이라 지칭하고, 상피를 가지지 않는 동시에 접착 성분이 부착된 양막을 "접착 성분 부착·상피가 없는 양막"이라 지칭할 경우도 있다.

피브리노겐 및 트롬빈은 본 발명의 시트형 조성물의 용도에 따라서 양막의 일면 또는 양면에 부착되어 있다. 일면 부착의 경우에는, 양막에 있어서의 상피의 유무에 관계없이, 양막의 융모막측 표면(즉, 상피측과 반대측 표면)이 부착면이 된다. 따라서, 이러한 구성의 시트형 조성물을 사용할 경우에는, 양막의 상피가 존재했던 측을 위로 하여 적용 부위에 이식된다. 또한, 유착 방지를 목적으로 한 시트형 조성물의 경우에 있어서도, 양막의 일면에 접착 성분을 부착하게 된다. 생체 접착제를 목적으로 하여 생체 내에 이식될 경우는 양막의 양면에 접착 성분을 부착하는 것이 적당하다.

후술하는 바와 같이 이러한 형태의 시트형 조성물은 사용 목적 등을 고려하여 적절한 상태(예를 들면, 건조 상태 또는 습윤 상태)에 양막 표면에 피브리노겐 및 트롬빈을 부착하는 공정을 거쳐서 조제된다. 따라서, 그 제조 과정에 있어서 및/또는 그 최종 상태에 따라서, 사용될 때까지의 사이에 일부의 피브리노겐으로부터 피브린이 생성될 것이 예상된다. 따라서, 본 발명의 시트형 조성물에는, 이러한 원인에 의해 생성된 피브린 또는 피브린 덩어리가 부착되어 있는 것도 포함된다.

피브리노겐 및 트롬빈의 유래는 특별히 한정되지 않는다. 예를 들면, 인간, 원숭이, 침팬지, 소, 말, 양, 돼지 등의 혈액을 재료로 하여 피브리노겐 및 트롬빈을 조제할 수 있다. 또한, 피브리노겐 및 트롬빈으로서, 배양 세포(예를 들면 CHO 세포나 COS 세포)를 이용하여 얻어진 재조합체(recombinant)를 사용할 수도 있다. 인간 유래(특히, 인간 유래의 재조합체)의 피브리노겐 및 트롬빈을 사용하는 것이 바람직하다. 면역원성을 포함시키고, 안전성의 면에서 유리하기 때문이다. 또한, 안정적인 품질의 것을 사용할 수 있다는 점 및 감염의 문제를 고려하면, 재조합체를 이용하는 것이 특히 바람직하다.

본 발명의 시트형 조성물을 이식받는 환자(수용자)의 혈액에서 유래하는 피브리노겐 및 트롬빈을 사용하는 것이 특히 바람직하다. 이들 접착 성분에 기인하는 면역 거부 반응이 야기될 우려가 없기 때문이다.

또한, 피브리노겐 및 트롬빈의 유래는 반드시 동일하지 않아도 된다. 일례를 제시하면, 인간 혈액 유래의 피브리노겐과, 소 혈액 유래의 트롬빈을 조합하여 사용할 수 있다.

피브리노겐 및 트롬빈의 부착량은 특별히 한정되지 않는다. 예를 들면, 피브리노겐의 부착량을 양막 1cm²당 0.1mg∼50mg의 범위로 설정할 수 있다. 마찬가지로, 트롬빈의 부착량을 양막 1cm²당 0.5㎛g∼10mg의 범위로 설정할 수 있다.

피브리노겐 및 트롬빈의 부착량의 설정시에는 접착력이 우선적으로 고려된다. 즉, 기대되는 접착량이 얻어지도록 이들 성분의 부착량을 설정할 필요가 있다. 한편, 피브리노겐이나 트롬빈의 부착량이 지나치게 많을 경우에는, 사용하는 피브리노겐의 유래에 따라서도 상이하지만, 면역 반응이나 신생 혈관 생성이 쉽게 야기된다는 문제가 있다.

여기에서, 예를 들면 안구 표면의 재건에 적용되는 시트형 조성물로 할 경우 등, 이식 후에 이들 성분에 의한 신생 혈관 생성이 문제가 될 경우에는, 신생 혈관 생성의 야기를 가능한 억제하기 위하여, 이들 성분의 부착량을 적게 하는 것이 바람직하다. 이들 성분의 부착량을 가능한 범위에서 적게 설정함으로써, 이식 후의 신생 혈관 생성이 억제되어 높은 치료 효과를 기대할 수 있다. 본 발명자들의 검토의 결과, 양막과 조합하여 사용할 경우, 피브리노겐의 부착량이 양막 1cm²당 약 0.5mg 이상일 경우에, 안구 표면에 대한 양호한 접착력이 얻어지는 것으로 밝혀졌다. 트롬빈에 대해서는 그 부착량을 양막 1cm²당 약 1㎍으로 할 경우에도 안구 표면에 대한 양호한 접착력이 얻어지는 것으로 밝혀졌다. 이러한 발견에 근거하여, 피브리노겐의 부착량의 바람직한 범위로서 양막 1cm²당 0.5∼20mg, 더욱 바람직한 범위로서 양막 1cm²당 0.5mg∼10mg, 더더욱 바람직한 범위로서 양막 1cm²당 0.5mg∼6mg(구체적으로는 예를 들면, 약 0.5mg, 약 1mg, 약 2mg)을 들 수 있다. 마찬가지로 트롬빈의 부착량의 바람직한 범위로서 양막 1cm²당 1㎍∼1mg, 더욱 바람직한 범위로서 양막 1cm²당 5㎍∼200㎍, 더더욱 바람직한 범위로서 양막 1cm²당 10㎍∼100㎍(구체적으로는 예를 들면, 약 10㎍, 약 20㎍, 약 30㎍)을 들 수 있다.

본 발명의 일 형태에서는, 피브리노겐 및 트롬빈 이외에도 아프로티닌이 양막 표면에 부착되어 있다. 아프로티닌은 트롬빈의 작용에 의해 형성된 피브린 덩어리가 플라스민(plasmin) 의해 용해되는 것을 억제한다. 따라서, 아프로티닌을 병용함으로써 피브린 덩어리의 분해를 억제하고, 접착력의 유지 또는 증강을 도모 할 수 있다.

아프로티닌의 유래는 특별히 한정되지 않는다. 예를 들면, 소, 말, 양, 돼지, 원숭이, 침팬지 등의 이자(pancreas) 유래의 아프로티닌을 사용할 수 있다. 또한, 배양 세포(예를 들면 CHO 세포나 COS 세포)를 이용하여 얻어진 재조합체의 아프로티닌을 사용할 수도 있다. 안정적인 품질의 것을 사용할 수 있는 점 및 감염의 문제를 고려하면, 재조합체를 이용하는 것이 바람직하다.

아프로티닌을 사용할 경우, 그 부착량은 특별히 한정되지 않는다. 예를 들면, 아프로티닌의 부착량을 양막 1cm²당 0.1KIU∼200KIU의 범위로 설정할 수 있다. 상술한 피브리노겐의 부착량의 검토에 따라서, 아프로티닌의 부착량도 변화시켜서 접착력에 대한 영향을 조사한 결과, 양막과 조합하여 사용할 경우, 아프로티닌 량을 1KIU∼2KIU의 범위로 설정할 경우일지라도 안구 표면에 대한 충분한 접착력이 얻어지는 것이 밝혀졌다. 이러한 발견에 근거하여, 아프로티닌의 부착량의 바람직한 범위로서 양막 1cm²당 1KIU∼100KIU, 더욱 바람직한 범위로서 양막 1cm²당 1KIU∼20KIU, 더더욱 바람직한 범위로서 양막 1cm²당 1KIU∼10KIU(구체적으로는 예를 들면, 약 1KIU, 약 2KIU, 약 3KIU)를 들 수 있다. 아프로티닌 량이 지나치게 많으면, 제조 비용이 상승되는 것은 물론, 아프로티닌 자체의 면역원성 등에 기인하는 부작용의 우려가 커진다. 한편, 아프로티닌 량이 지나치게 적을 경우에는, 피브린 덩어리의 분해를 억제하는 아프로티닌의 작용이 충분히 발휘되지 않을 우려가 있다.

또한, 각종 용도에 있어서 피브린 덩어리가 접착제로서 이용되고 있지만, 이러한 용도에서는 아프로티닌을 병용하는 것이 일반적이다. 본 발명자들의 검토 결과, 양막과 조합하면 아프로티닌을 사용하지 않더라도 생체에 대한 충분한 접착력이 얻어지는 것이 밝혀졌다. 아프로티닌을 사용하지 않아도 된다는 것은, 구성이 간단화되어 제조상 및 비용면에서 유리할 뿐만 아니라 아프로티닌 자체의 면역원성 등에 기인하는 부작용을 고려할 필요가 없다는 것을 의미한다.

(생체 흡수성 재료에 의한 보강)

양막의 융모막측을 생체 흡수성 재료로 피복함으로써 본 발명의 시트형 조성물의 강도를 높일 수 있다. 이러한 목적으로 사용되는 생체 흡수성 재료로서, 양막에 비하여 조기에 분해·흡수되는 재료를 채용하는 것이 바람직하다. 예를 들면, 폴리글락틴 910, 젤라틴, 콜라겐, 폴리락트산 등을 생체 흡수성 재료로서 사용하는 것이 바람직하다. 보강에 사용되는 생체 흡수성 재료의 형태는 특별히 한정되지 않는다. 예를 들면, 메시형이나 시트형으로 형성한 생체 흡수성 재료로 양막융모막측을 피복함으로써 양막을 보강한다. 양막의 상태는 보강을 행하는 과정에서는 습윤 상태, 건조 상태 중 어떠한 것이라도 상관없다. 단, 제품의 최종 형태는 양막이 건조 상태인 것으로 하는 방법이 바람직하다. 건조 상태로 하면 조작성 및 보존성이 우수하기 때문이다. 또한, 본 명세서에 있어서, 보강이 행해진 양막을 "하이브리드 양막"이라 지칭한다.

(세포층)

본 발명의 시트형 조성물의 일 형태에서는, 양막 상에 세포층을 구비할 수 있다. 이 형태에 있어서 접착 성분을 병용할 경우에는, 세포층이 형성되지 않은 측의 양막 표면에 접착 성분(피브리노겐 등)이 부착된다.

이 형태에서는 통상적으로 상피가 제거된 양막이 사용된다. 그리고, 상피가 존재했던 측에 세포층이 형성된다. 여기에서의 세포층은 생체 유래 세포로부터 구성된다. 세포층을 구성하는 세포의 유래는 특별히 한정되지 않는다. 예를 들면, 각막 상피, 결막 상피, 피부 표피, 모낭 상피, 구강 점막 상피, 홍채 색소 상피, 망막 색소 상피, 기도 점막 상피 또는 장관 점막 상피 유래의 세포에 의해 세포층이 구성된다. 서로 상이한 2종 이상의 세포에 의해 세포층이 구성될 수도 있다. 이렇게 유래가 상이한 2종 이상의 세포를 포함하여 구성되는 것을 본 명세서에서는 "하이브리드화"라고도 지칭한다. 하이브리드화된 세포층에 있어서의 세포의 함유 형태(하이브리드화의 상태)는 특별히 한정되지 않으며, 예를 들면, 각 세포가 산재될 수도 있고, 어느 하나의 세포(또는 복수 종류의 세포)가 일정하게 통합되어 존재할 수도 있다. 또한, 각 세포의 함유율이 세포층 전체적으로 균일하지 않을 수도 있다. 세포층은 1층이거나 다층(중층화된 상태)일 수도 있다.

하이브리드화된 세포층이 구비된 경우에 있어서의 세포층을 구성하는 세포의 종류를, 각막 상피의 재건용으로서 본 발명의 시트형 조성물이 구축될 경우를 예로 하여 아래에 상술한다.

하이브리드화된 세포층에는 2종류 이상의 세포가 함유된다. 여기에서, 설명의 편의상, 세포층에 포함되는 세포종의 하나를 제1 세포라 하고, 이와 종류가 상이한 세포종을 제2 세포라 한다. 우선, 제1 세포로서 자기 세포(autologous cell) 를 이용한다. 본 명세서에 있어서 "자기"란, 본 발명의 시트형 조성물을 적용하는 대상, 즉 이식을 받는 자(수용자)를 지칭한다. 한편, 이러한 "자기" 이외의 사람을 "타인"이라 지칭한다. 후술하는 제2 세포와 하이브리드화시킬 경우에 각막 상피의 점막 상피층이 형성 가능하다면, 제1 세포의 종류는 특별히 한정되지 않는다. 제1 세포의 예로서는, 구강 점막 상피, 결막 상피, 비강 점막 상피 등의 점막 상피에서 유래하는 세포, 또는 이러한 점막 상피를 구축 가능한 미분화 세포(즉, 점막 상피의 줄기 세포)에서 유래하는 세포를 들 수 있다. 여기에서 "유래하는 또는 유래의"란, 출발 재료를 특별히 지정할 목적으로 사용된다. 따라서, 예를 들면, 구강 점막 상피에서 유래한(또는 유래의) 세포라고 하면, 구강 점막 상피 세포를 출발 재료로 하여 얻어진 세포를 의미한다. 또한, 본 발명에 있어서 "점막 상피를 구축 가능한 미분화 세포"란, 해당 점막 상피를 구성하는 세포로의 분화능을 가지는 세포를 지칭한다. 예를 들면, 구강 점막 상피를 구축 가능한 미분화 세포라고 하면, 구강 점막 상피 세포로 분화될 수 있는 세포를 말한다. 미분화 세포의 구체예로서는, 구강 점막 상피나 결막 상피 등 특정한 조직을 구성하는 세포의 전구 세포(precursor cell) 또는 줄기 세포, 또는 더욱 분화도가 낮은 상피계 줄기 세포 등을 들 수 있다.

하이브리드화된 세포층이 상이한 2종 이상의 제1 세포를 포함할 수도 있다. 예를 들면, 구강 점막 상피에서 유래하는 세포와, 결막 상피에서 유래하는 세포를 포함한 상태로 세포층이 구축될 수도 있다.

본 발명에 있어서의 "구강 점막 상피"에는, 구강내 연점막 상피부, 입술부, 구개부, 볼부(buccal part) 등이 포함된다. 구강 점막 상피 특이적인 케라틴 4, 또는 케라틴 13이 발현되고 있다는 지표를 통하여, 구강 점막 상피에서 유래하는 세포인 것으로 확인할 수 있다. 또는, 케라틴 3의 발현을 지표로 할 수도 있다. 이러한 케라틴 3은 각막 특이적 케라틴의 일종으로 알려져 있지만, 구강 점막 상피에 있어서도 발현되는 것이 확인되어 있다. 또한, 이 각막 특이적 케라틴인 케라틴 3이 발현된다는 점에서, 구강 점막 상피 세포를 각막 상피 이식용 조성물을 제조하는 재료로서 이용하는 것이 바람직하다고 할 수 있다.

한편, 구강 점막 상피 세포 특이적인 유전자의 발현을 조사함으로써도, 이것이 구강 점막 상피 유래인 것을 확인할 수 있다.

또한, 구강 점막 상피 이외의 조직에서 유래하는 세포의 경우도 동일하게, 해당 조직에 특이적인 마커(marker) 또는 유전자의 발현을 조사함으로써 그 유래를 확인할 수 있다.

제2 세포의 구체예로서는, 각막 상피, 결막 상피, 또는 양막 상피에서 유래하는 세포를 들 수 있다. 이 중에서도, 제2 세포가 각막 상피 또는 결막 상피에서 유래하는 세포인 것이 바람직하다. 안구 표면 조직에서 유래하는 세포에 의해 구축된 세포층에서는, 각막 상피에 더욱 가까운 특성을 구비할 수 있기 때문이다. 제2 세포가 각막 상피에서 유래하는 세포인 것이 특히 바람직하다. 각막 상피에 더욱 유사한 특성의 세포층이 되기 때문이다.

제2 세포는 자기 세포 또는 타인 세포 중 어떠한 것일 수도 있다. 자기 세포에 의해 구축된 세포층이라면 면역 거부의 문제가 없거나 또는 작은 세포층이 된 다. 타인 세포에 의해 구축된 세포층이라면 원재료가 되는 세포의 입수가 용이하기 때문에, 그 제조에 있어서 유리한 세포층이 된다. 본 발명에 있어서의 세포층은 상이한 2종 이상의 제2 세포를 포함할 수도 있다. 예를 들면, 각막 상피에서 유래하는 세포와, 결막 상피에서 유래하는 세포를 포함한 상태로 세포층이 구축될 수도 있다.

본 발명의 시트형 조성물에 있어서의 세포층이 각막 상피에서 유래하는 세포를 포함하는 것은, 예를 들면, 각막 상피 특이적인 케라틴 3 또는 케라틴 12가 발현되고 있는 것을 지표로 하여 확인할 수 있다. 또는, 케라틴 4가 발현되고 있는 것을 지표로 할 수도 있다.

또한, 각막 상피 이외의 조직에서 유래하는 세포의 경우도 마찬가지로, 해당조직에 특이적인 마커 또는 유전자의 발현을 조사함으로써 그 유래를 확인할 수 있다.

본 발명의 시트형 조성물은 지지체로서 양막을 사용함으로써 대단히 얇은 상태로 구축할 수 있다. 본 발명의 시트형 조성물을 세포층을 포함하지 않을 경우에는, 예를 들면 10㎛∼100㎛의 두께, 세포층을 포함할 경우에는 예를 들면 20㎛∼200㎛의 두께로 조제할 수 있다. 이와 같이 대단히 얇은 것도 본 발명의 큰 특징의 하나이다. 이러한 특징을 구비함으로써 각종 용도에 적용이 가능해진다. 특히, 높은 투명성을 이용하여 안구 표면의 재건 등에 적용할 수 있다.

(시트형 조성물의 상태)

본 발명의 시트형 조성물의 상태는 특별히 한정되지 않으며, 습윤 상태(예를 들면 용액에 침지된 상태), 동결 상태, 또는 건조 상태(반건조 상태를 포함함)로 제공된다. 동결 상태 또는 건조 상태로 하면 취급이 용이하고 보존성도 우수하다. 건조 상태로 하면 상온(예를 들면, 약 10℃∼약 35℃) 등에서도 보존할 수 있다. 즉, 사용 전에 냉동 또는 냉장 환경 하에서 관리할 필요가 없으므로, 취급(보존, 운반 등)이 용이하다. 단, 건조 상태일지라도 필요에 따라서 냉동 또는 냉장 보존할 수도 있다.

특히, 동결 건조 상태로 하면 취급의 면에서 우수할 뿐만 아니라, 적용할 경우에 환부에 양호하게 접착(환부 표면에 침윤되어 접착력을 발휘함)되므로 적용 후의 봉합이 기본적으로 불필요해진다(단, 환부에의 접착을 더욱 확실하게 하기 위해서, 봉합 처리할 수도 있음). 봉합이 불필요해지면 환자 및 의사의 부담이 대폭 경감된다.

바람직하게는, 상피층을 가지는 동결 상태, 상피층을 가지는 건조 상태(동결 건조 상태), 상피층을 가지지 않는 습윤 상태, 상피층을 가지지 않는 동결 상태, 또는 상피층을 가지지 않는 건조 상태(동결 건조 상태)의 양막을 이용하여 본 발명의 시트형 조성물이 구축된다. 또한, 본 명세서에 있어서, 상피층을 가지는 동결 상태의 양막을 "동결 보존·상피가 있는 양막"이라 지칭하고, 상피층을 가지는 동결 건조 상태의 양막을 "동건·상피를 가진 양막"이라 지칭하고, 상피층을 가지지 않는 동결 상태의 양막을 "동결 보존·상피가 없는 양막"이라 지칭하고, 상피층을 가지지 않는 동결 건조 상태의 양막을 "동건·상피가 없는 양막"이라 지칭한다.

건조 상태의 시트형 조성물로서는 그 취급이 용이하며, 구체적으로는 상온 (예를 들면, 약 10℃∼약 35℃) 등에서도 보존할 수 있다. 즉, 사용 전에 냉동 또는 냉장 환경 하에서 관리할 필요가 없어서 그 취급(보존, 운반 등)이 용이해진다.

한편, 건조 상태이므로, 그 사용에 영향을 미치지 않고 효과적으로 멸균 처리할 수도 있다. 또한, 건조 상태이기 때문에 시간 경과에 따른 열화는 지극히 적고, 장기간에 걸쳐서 그 품질을 높은 상태로 유지할 수 있다.

본 발명의 시트형 조성물이 기대되는 기능(예를 들면, 세포층을 형성하기 위한 기질로서의 기능이나, 조직 재건재로서의 기능 등)을 발휘하기 위해서는 기저막의 구조의 유지가 중요한 것으로 생각된다. 여기에서 본 발명이 바람직한 일 태양에서는, 기저막 성분(콜라겐 IV(α1, α2, 및 α5), 콜라겐 VII, 라미닌 5)이 잔존하는 양막이 사용되는 것을 특징으로 한다. 기저막 성분이 잔존하고 있는지의 여부는, 해당 성분을 검출 대상으로 하는 면역 염색을 행함으로써 검정(檢定)할 수 있다. 본 발명의 일 태양에서는 이들 성분 중 적어도 하나, 바람직하게는 복수, 또한 모두가 검출된다. 또한, 미처리 양막(즉, 생체로부터 분리한 후, 동결 등의 처리를 행하지 않은 양막)을 대상으로 하여 검출할 경우의 강도와 큰 차이 없는 강도(바람직하게는 거의 동등한 강도)로 이들 성분이 검출되는 것이 바람직하다.

한편, 치밀층 성분(콜라겐 I, III, V, 피브로넥틴)도 잔존하는 양막을 사용하는 것이 바람직하다. 치밀층 성분의 잔존 상태는 상기 기저막 성분의 경우와 동일하게 면역 염색에 의해 검정할 수 있다.

양막에 트레할로스를 부가함으로써, 동결 건조 처리될 경우일지라도 기저막 및 치밀층의 구조가 고도로 유지된다.

(제공 형태)

본 발명의 시트형 조성물은 예를 들면, 유리나 플라스틱 등의 용기에 수납된 상태, 또는 투명 필름이나 차광 시트 등을 이용하여 포장된 상태로 제공된다.

바람직하게는 본 발명의 시트형 조성물은 실질적으로 산소와 접촉이 없는 상태로 포장되어서 제공된다. 이러한 형태이면 산소에 의한 품질의 열화가 없고, 장기간에 걸쳐서 높은 품질을 유지할 수 있다. "실질적으로 산소와 접촉이 없는 상태"로서는, 예를 들면, 용기 내를 진공으로 한 상태나 용기 내에 질소를 충전한(질소 치환) 상태, 또는 필름이나 시트 등으로 밀봉 포장한 상태를 들 수 있다. 또한, 본 발명의 시트형 조성물은 통상적으로 사전에 멸균 처리가 행해져 있다.

(용도)

본 발명의 시트형 조성물은 조직 재건용 이식 재료, 유착 방지제 등으로서 사용된다. 본 발명의 시트형 조성물의 적용 영역으로서 안과 영역, 소화기 외과 영역, 산부인과 영역, 피부과 영역을 들 수 있다.

본 발명의 시트형 조성물의 적용예(적용 부위, 적용 방법 등)를 본 발명의 시트형 조성물이 세포층을 구비하지 않을 경우(A)와, 세포층을 구비할 경우(B)로 나누어서 기재한다.

A. 세포층을 구비하지 않는 시트형 조성물의 적용예

세포층을 구비하지 않는 시트형 조성물은 공막(sclera)이나 각막의 재건(익상편(pterygium)이나 각막 상피 손상 등에 대한 치료)), 피부(표피) 궤양이나 열상(熱傷)시의 피복 등에 적용될 수 있다. 또한, 조직 재건용 재료로서도 이용된 다. 여기에서의 "조직 재건용 재료"란, 생체 조직의 재건(재생)에 사용되는 재료를 지칭한다. 세포층을 구비하지 않는 시트형 조성물은, 수술 침습에 의한 장기 또는 기관의 표면 조직 장해의 재건을 목적으로 하는 치료에 있어서 바람직하게 사용된다. 본 발명의 시트형 조성물은 통상적인 치유 과정에 있어서 유착이 생기는 표면 조직을 재건하기 위한 재료로서 특히 바람직하다. 여기에서의 용어 "조직 재건"은 전형적으로는 표면 조직의 손상부를 정상 상태로 회복시키는 것을 의미하지만, 어떤 장기 또는 기관 등의 표면 조직의 재유착을 방지함으로써 해당 장기 등을 정상 상태로 회복시키는 것(예를 들면, 난관의 유착 박리 후의 재유착을 방지하고, 정상 상태로 회복시키는 것)도 포함하는 용어로서 사용된다.

본 발명의 재건 대상이 되는 조직이 적절한 예는 복부, 흉부, 또는 골반 내의 장기 또는 기관(위, 대장, 소장, 맹장, 십이지장, 심장, 폐, 난관, 직장, 간장, 난소, 자궁 등)의 표면 조직, 또는 복강, 흉강, 골반강, 구강, 비강, 이강, 또는 인후강의 표면 조직, 또는 눈 조직이다. 따라서, 본 발명의 시트형 조성물은 소화기 외과, 산부인과, 흉부 외과, 구강 외과, 이비인후 외과, 및 눈 외과(ophthalmic surgery)의 분야에서 이용될 수 있다. 본 발명의 시트형 조성물은 특히 복부, 흉부, 또는 골반 내의 장기 또는 기관의 표면 조직, 또는 복강, 흉강, 또는 표면 조직을 재건하기 위한 재료로서 바람직하다. 단, 이들 영역 이외일지라도 외과적 수술이 수반되는 영역에 있어서 본 발명은 폭넓게 적용될 수 있다. 이하, 본 발명의 시트형 조성물의 적용 부위, 적용 방법 등을 상세하게 기재한다.

조직 재건용 재료로서 사용할 경우, 본 발명의 시트형 조성물의 용도는 적용 방법과 적용 목적을 기준으로 아래의 3종류로 대별할 수 있다.

(1) 조직 재건용 재료를 피복(적용 방법)·조직 재건(적용 목적)형

장기 표면, 복막 표면 등에 조직 재건용 재료를 첩포(貼布)하고, 상해 조직 표면을 재건하기 위한 사용 방법(사용 방법)이다. 해당 용도의 구체예는 아래의 1-1, 1-4, 1-5, 1-6이다.

(2) 조직 재건용 재료를 피복(적용 방법)·유착 방지(적용 목적)형

장기 표면, 복막 표면 등에 양막을 첩포하고, 주변 조직과의 유착 형성을 억제하기 위한 사용 방법(사용 방법)이다. 해당 용도의 구체예는 아래의 2-1, 3-1, 3-2, 3-3이다.

(3) 조직 재건용 재료를 유치(indwelling)(적용 방법)·유착 방지(적용 목적)형

유착이 고도로 형성되는 부위에 양막을 유치함으로써 유착의 형성을 억제하는 사용 방법(사용 방법)이다. 해당 용도의 구체예는 아래의 1-2, 1-3, 2-2이다. 종래의 유착 방지제의 대부분은 이 사용 형태를 취한다. 예를 들면 유착 방지제로서 현재 사용되고 있는 세프라필름(Seprafilm)은 아래의 1-2와 같은 사용 형태이다. 단, 하기 1-3, 2-2의 사용 형태에서는 세프라필름을 사용할 수 없다.

이하, 조직 재건용 재료로서의 시트형 조성물의 용도의 구체예를 나타낸다(도 1 참조).

1. 소화기 외과 영역에서의 적용

1-1. 장해 장기의 재건, 유착 방지 용도에의 적용법

각종 외과 수술을 행한 경우에는 조작 과정에서 장기가 미소하게 손상된다. 상해 영역은 장막(漿膜) 구조를 상실하여 수술 후 조기에 이 구조가 재건되지 않으면, 장기 사이에서 유착이 형성되는 원인이 되고, 근본적인 기능이 손상될 경우도 있으므로 사정이 좋지 않다. 양막의 조직 재건능, 유착 방지능을 살려서 이러한 문제를 해결할 수 있다. 구체적으로는 조직 재건용 재료로 상해 장기 표면을 덮어 조직 재건 및 유착 방지를 도모한다. 이러한 목적에 있어서는, 동결 보존·상피가 있는 양막, 동결 보존·상피가 없는 양막, 동건·상피가 있는 양막, 접착 성분 부착·상피가 없는 양막 등으로 구축된 조직 재건용 재료를 바람직하게 사용할 수 있다. 취급이 간편하기 때문에 건조 상태의 양막(예를 들면, 동건·상피가 있는 양막, 동건·상피가 없는 양막)으로 구축된 조직 재건용 재료가 바람직하지만, 심장 등 담체에 유연성이 필요한 영역에서는 동결 보존 상태의 양막(예를 들면, 동결 보존·상피가 있는 양막, 동결 보존·상피가 없는 양막)으로 구축된 조직 재건용 재료를 선택할 수도 있다. 적용 방법은 외과 수술이 종료된 단계에서 장기의 상해 영역에 양막 기저막이 복강측을 향하도록 조직 재건용 재료로 직접 피복한다. 이어서, 필요에 따라서 고정한다. 고정에는 바이크릴(vicryl) 등의 봉합사를 이용할 수 있다. 건조 상태의 양막으로 구축된 조직 재건용 재료를 사용할 경우, 높은 결합력을 기대할 수 있으므로, 봉합 등의 고정 처리를 생략할 수 있다. 접착 성분을 사용하여 구축된 조직 재건용 재료를 사용할 경우에도 동일하게 높은 결합력을 기대할 수 있다. 이와 같이, 봉합 등의 고정 처리를 별도로 행하지 않고, 적용 부위에 조직 재건용 재료를 고정할 수 있는 것이 바람직하다. 봉합 등을 행할 경우에 는 조작이 번거로워지고, 염증이 야기되어 유착 형성이 촉진될 가능성이 있기 때문이다. 특히, 동결 보존·상피가 있는 양막으로 구축된 조직 재건용 재료를 이용하면, 적용 부위에 대하여 높은 결합력을 발휘할 수 있는 동시에, 접착 성분에 의한 이물(異物) 반응이 야기되는 문제가 없으므로 특히 바람직하다고 할 수 있다.

이러한 조작에 의해, 수술 후 조기에 장막 구조의 재건을 기대할 수 있고, 장해 장기의 재건·유착 방지가 달성된다.

1-2. 상해 장기-상처 사이의 유착 방지 용도에의 적용법

각종 외과 수술을 행한 후에는 복강 내 장기와 상처 사이에서 유착이 형성될 수 있다. 복강 내 장기가 상처와 유착을 일으키면 장기가 물리적으로 고정되고, 장기의 운동성이 약해져서 내강이 폐쇄되어 마비성 장폐쇄의 원인이 된다. 양막의 유착 방지능을 살려서 이러한 문제를 해결할 수 있다. 이러한 목적에 있어서는, 동결 보존·상피가 있는 양막, 동결 보존·상피가 없는 양막, 동건·상피가 있는 양막, 보강된 하이브리드 양막 등으로 구축된 조직 재건용 재료를 사용할 수 있다. 잔주름이 생성되지 않는 충분한 강도가 요구되기 때문에, 건조 상태의 양막으로 구축된 조직 재건용 재료를 사용하는 것이 바람직하고, 건조 상태의 양막이면서 동시에 보강된 하이브리드 양막으로 구축된 조직 재건용 재료를 사용하는 것이 더욱 바람직하다. 적용 방법은 예를 들면 다음과 같다. 외과 수술이 종료된 단계에서 상처 바로 아래에 조직 재건용 재료를 삽입하고, 그대로 유치한다. 이때, 양막의 기저막측이 복강측, 융모막측이 복벽측이 되도록 조직 재건용 재료를 적용한다. 적용 후, 봉합 등에 의해 고정할 수도 있지만, 고정하지 않고 유치하는 편이 바람직 하다.

이상의 조작에 의해 수술 후의 장기와 상처 사이에서의 유착 방지를 달성할 수 있다.

1-3. 골반저 유착 방지에의 적용

골반 내에는 직장, 자궁 등, 장기 표면의 일부가 복막으로 덮여있지 않은 복강 외 장기가 존재한다. 이러한 복강 외 장기를 수술한 경우에는, 골반 내에 복막이 존재하지 않는 영역이 생기고, 골반저에 소장이 닿아서 골반벽과 소장이 유착을 형성할 수 있다. 일단 유착이 형성되면 박리가 곤란할 경우가 많다. 따라서, 예방적인 조치가 중요하다. 양막의 장막 재건능을 이용하여 골반저 유착을 예방할 수 있다. 이러한 목적에 있어서는, 동결 보존·상피가 있는 양막, 동결 보존·상피가 없는 양막, 동건·상피가 있는 양막, 보강된 하이브리드 양막 등으로 구축된 조직 재건용 재료를 바람직하게 사용할 수 있다. 조직 재건용 재료에 요구되는 성질은 1-2와 동일하다. 적용 방법은 예를 들면 다음과 같다. 외과 수술이 종료된 단계에서 골반저에 조직 재건용 재료를 삽입하고, 가볍게 복막에 눌러서 피복시킨다. 이때, 양막의 기저막측이 복강측, 융모막측이 복막측이 되도록 조직 재건용 재료를 적용한다. 적용 후, 봉합 등에 의해 고정할 수도 있지만, 고정하지 않고 피복하는 것이 바람직하다.

이상의 조작에 의해 수술 후의 골반저에서의 유착 방지를 달성할 수 있다.

1-4. 벽측 복막의 재건 용도에의 적용법

벽측 복막은 복수회의 수술을 행할 경우나 복벽 반흔 탈장(incisional hernia) 등의 복막 질환에 의해 손상된다. 손상 복벽의 보충용 담체로서 양막을 사용할 수 있다. 이러한 목적에 있어서는, 동결 보존·상피가 있는 양막, 동결 보존·상피가 없는 양막, 동건·상피가 있는 양막, 접착 성분 부착·상피가 없는 양막 등으로 구축된 조직 재건용 재료를 바람직하게 사용할 수 있다. 복막의 손상이 광범위하고, 심한 경우에는 강도를 위하여 동결 보존·상피가 있는 양막으로 구축된 조직 재건용 재료를 사용하는 것이 바람직하다. 적용은 외과 수술이 종료된 단계에 행해진다. 우선 복벽 손상 영역에 조직 재건용 재료를 놓고 덮어 숨긴다. 양막의 기저막측이 복강측이 되도록 조직 재건용 재료로 복벽 손상 영역을 피복한다. 이어서, 봉합사 등을 이용하여 조직 재건용 재료를 고정할 수도 있다. 접착 성분이 부착된 양막으로 구축된 조직 재건용 재료를 이용할 경우, 접착 성분에 의해 고정될 수도 있다.

이상의 조작에 의해 복벽의 재건을 기대할 수 있다.

1-5. 복막 파종성 전이 억제에의 적용

복막 파종은 위암, 대장암, 난소암이 진행되고, 암 세포가 조직으로부터 유리되어 흉수나 복수를 통하여 체강에 전이를 일으키는 병증의 예이다. 복막 파종을 수반하는 암의 예후는 지극히 나쁘고, 전이를 억제하는 방법이 바람직하지만, 현시점에서 효과적인 방법은 알려져 있지 않다. 양막의 성질을 살리고, 전이를 억제할 수 있는 가능성이 있다. 암 세포가 높은 빈도로 전이를 일으키는 부위로서 배측 위간막(dorsal mesogastrium), 횡격막, 장간막 등이 알려져 있다. 이들의 밀키 스폿(milky spot)을 미리 조직 재건용 재료로 피복하여 배리어를 형성함으로써 전이를 억제할 수 있다. 이러한 목적에 있어서는, 동결 보존·상피가 있는 양막, 동결 보존·상피가 없는 양막, 동건·상피가 있는 양막, 접착 성분 부착·상피가 없는 양막 등으로 구축된 조직 재건용 재료를 사용할 수 있지만, 취급이 간편하므로 동건·상피가 있는 양막으로 구축된 조직 재건용 재료를 사용하는 것이 바람직하다. 적용 방법으로서는 예를 들면, 조직을 감싸도록 조직 재건용 재료로 적용 부위를 피복한다. 또한, 일부분으로 다음의 앞 부분을 충당하여 봉합하거나, 양막에 부착된 접착 성분에 의해 조직 재건용 재료를 적용 부위에 고정할 수도 있다. 조직 재건용 재료의 적용 시기는 암이 진행되어 전이가 일어난 후일 수도 있고, 파종이 일어나지 않은 단계일 수도 있다(예비적인 사용).

1-6. 재발 유착 방지에의 적용

개복 수술을 행한 후에 장끼리 또는 장과 복벽이 유착을 일으켜서 꺽여서 휘고, 통과 장해가 초래되어 기능 부전에 의하여 장폐쇄가 일어난다. 유착 해제술을 시행해도 유착 조직, 특히 고도로 염증을 일으켜서 반흔화된 조직에 있어서는 장막 손상이 일어나기 때문에 수술 후에 재유착을 초래할 경우가 많다. 양막을 이용하여 수술 후의 유착 재발을 방지하고, 장막 손상부의 수복, 보강을 도모할 수 있다. 이러한 목적에 있어서는, 동결 보존·상피가 있는 양막, 동결 보존·상피가 없는 양막, 동건·상피가 있는 양막, 접착 성분 부착·상피가 없는 양막 등으로 구축된 조직 재건용 재료를 사용할 수 있다. 취급이 간편하기 때문에 동건·상피가 있는 양막으로 구축된 조직 재건용 재료를 사용하는 것이 바람직하다. 적용 방법으로서는 예를 들면, 개복 후에 유착을 물리적으로 박리한 단계에서 조직 재건용 재료로 장을 통형으로 감싼다. 이때, 양막의 기저막측이 복강측이 되도록 조직 재건용 재료를 적용한다. 이어서, 통상적으로는 고정을 행하지만, 바이크릴 등의 봉합사를 이용하여 장기와 양막을 봉합할 수도 있고, 양막을 서로 봉합할 수도 있고(양막이 관형이 됨), 또는 봉합하지 않고 유치할 수도 있다. 접착 성분을 부착한 양막으로 구축된 조직 재건용 재료를 사용할 경우, 해당 접착 성분에 의해 고정될 수도 있다. 봉합 등의 고정 처리를 별도로 행하지 않고, 적용 부위에 대한 조직 재건용 재료의 고정이 달성되는 것이 바람직하다. 봉합 등을 행할 경우에는 조작이 번거로워지고, 염증이 야기되어 유착 형성이 촉진될 가능성이 있기 때문이다. 특히, 건조 상태의 양막으로 구축된 조직 재건용 재료를 이용하면, 적용 부위에 대하여 높은 결합력을 발휘할 수 있는 동시에, 접착 성분에 의한 이물 반응이 야기될 문제가 없으므로 특히 바람직하다고 할 수 있다.

이상의 조작에 의해 유착의 재발을 예방할 수 있고, 수술 후 조기에 장막 구조의 재건을 기대할 수 있다.

2. 산부인과 영역에서의 적용

2-1. 난관 폐쇄에의 적용

난관이 복막 등에 유착을 일으키면 난관이 막혀서 난자가 통과할 수 없어져서, 불임의 원인이 된다. 양막을 이용하여 난관의 유착을 방지할 수 있다. 이러한 목적에 있어서의 조직 재건용 재료의 적용 방법은 예를 들면 다음과 같다. 유착되어 있는 부분을 박리하고, 통상적인 난관채 형성술(fimbrioplasty)을 행한다. 수술 후 폐복 전에 난관의 영역을 조직 재건용 재료로 피복한다. 이러한 목적에 있어서는, 동결 보존·상피가 있는 양막, 동결 보존·상피가 없는 양막, 동건·상피가 있는 양막, 접착 성분 부착·상피가 없는 양막 등으로 구축된 조직 재건용 재료를 사용할 수 있지만, 취급이 간편하므로 동건·상피가 있는 양막으로 구축된 조직 재건용 재료를 사용하는 것이 바람직하다. 적용 방법으로서는 예를 들면, 조직을 감싸도록 조직 재건용 재료로 적용 부위를 피복한다. 또한, 일부분으로 다음의 앞부분을 충당하도록 봉합하거나, 양막에 부착된 접착 성분에 의해 조직 재건용 재료를 적용 부위에 고정할 수도 있다.

2-2. 골반저 유착 방지에의 적용

골반 내의 자궁은 복강 외 장기이며, 장기 표면의 약 50%는 복막으로 덮여 있지 않다. 따라서, 자궁 적출 수술을 행하면 복막 손상 부위가 생기고, 골반저와 소장과의 유착이 형성되는 원인이 된다. 양막을 이용하여 골반저의 유착을 방지할 수 있다. 이러한 목적에 있어서는 사용되는 조직 재건용 재료의 형태, 적용 방법은 1-3과 동일하다.

3. 안과 영역에서의 적용

3-1. 녹내장 수술에의 적용

녹내장은 시신경이 손상되어 시야가 좁아져서 시력이 떨어지는 질환이다. 녹내장의 치료에서는 선유(線維) 주대(柱帶) 절제(travecula)에 의해 새로운 방수(房水) 배출계(auieous homour discharge system)를 형성하는 수술이 행해지지만, 수술 후에 강막과 결막이 유착되어 치료 효과를 기대할 수 없는 경우가 있었다. 이러한 문제에 대하여 양막의 사용이 효과적인 것으로 생각된다. 구체적으로는, 통상적인 선유 주대 절제를 행한 후, 결막 아래에 조직 재건용 재료를 삽입한다. 이러한 목적에 있어서는, 동결 보존·상피가 있는 양막, 동결 보존·상피가 없는 양막, 동건·상피가 있는 양막, 접착 성분 부착·상피가 없는 양막 등으로 구축된 양막을 사용할 수 있지만, 취급이 간편하므로 동건·상피가 있는 양막으로 구축된 조직 재건용 재료를 사용하는 것이 바람직하다. 적용 후, 조직 재건용 재료를 적용 부위에 봉합 등으로 고정할 수도 있다.

3-2. 검구 유착(symblepharon)에의 적용

검구 유착은 눈꺼풀 결막으로부터 안구에 걸쳐서 반흔화되고, 눈꺼풀과 안구가 유착을 일으키는 질환이다. 검구 유착이 일어날 경우에는 안구 표면이 광범위하게 장해를 받는 경우가 많고, 유착된 조직을 박리한 후에 재발할 경우가 많다. 양막을 이용하여 검구 유착을 억제할 수 있을 것으로 생각된다. 구체적인 적용 방법으로서는 예를 들면, 눈꺼풀과 안구간의 유착을 박리한 후에 반흔화된 결막 조직을 박리하고, 강막을 노출시켜서, 조직 재건용 재료로 피복한다. 이러한 목적에 있어서는, 동결 보존·상피가 있는 양막, 동결 보존·상피가 없는 양막, 동건·상피가 있는 양막, 접착 성분 부착·상피가 없는 양막 등으로 구축된 조직 재건용 재료를 사용할 수 있지만, 취급이 간편한 등의 이유로, 접착 성분 부착·상피가 없는 양막에서 구축된 조직 재건용 재료를 사용하는 것이 바람직하다. 해당 조직 재건용 재료를 사용할 경우, 적용 부위에 대한 고정은 주로 접착 성분에 의해 달성된다. 조직 재건용 재료로 피복하는 부위는 눈꺼풀측일 수도 있고, 강막일 수도 있다.

3-3. 재발 익상편에의 적용

익상편은 결막 조직이 이상 증식을 일으키고, 증식 조직이 각막에 유착되어 난시나 시력 저하를 일으키는 질환이다. 해당 질환에 대하여 양막이 효과적인 것으로 생각된다. 구체적인 적용 방법으로서는 예를 들면, 익상편 조직을 박리하여 강막을 노출한 후에 조직 재건용 재료로 피복한다. 이러한 목적에 있어서는, 동결 보존·상피가 있는 양막, 동결 보존·상피가 없는 양막, 동건·상피가 있는 양막, 접착 성분 부착·상피가 없는 양막 등으로 구축된 조직 재건용 재료를 사용할 수 있지만, 취급이 간편한 것 등의 이유로, 접착 성분 부착·상피가 없는 양막으로 구축된 조직 재건용 재료를 사용하는 것이 바람직하다. 해당 조직 재건용 재료를 사용할 경우, 적용 부위에 대한 고정은 주로 접착 성분에 의해 달성된다.

B. 세포층을 구비하는 시트형 조성물의 적용예

세포층을 구비하는 시트형 조성물은 각막이나 망막의 재건(스티븐존슨 증후군, 열화학 외상, 눈류 천포창, 망막 박리, 노화성 황반 변성증, 녹내장, 망막 색소 변성증 등에 대한 치료), 표피-당뇨병성 궤양(표피), 표피 수포증, 또는 열상의 치료 등에 적용될 수 있다.

(시트형 조성물의 제조 방법)

본 발명의 다른 태양은 시트형 조성물의 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명의 제조 방법은 아래 단계를 포함한다. 즉, (a) 양막을 조제하는 단계와, (b) 상기 양막에 트레할로스를 부가하는 단계이다.

1. 양막의 조제: 단계(a)

"양막"이란 포유 동물에 있어서 자궁과 태반의 최표층을 덮는 막이며, 콜라겐이 많은 실질 조직상에 기저막, 상피층이 형성되어서 구성된다. 양막으로서 인간 양막을 사용하는 것이 바람직하다. 인간 양막은, 예를 들면 분만시에 후산(後産)으로서 얻어지는 인간 태아막, 태반 등으로부터 채취할 수 있다. 구체적으로는, 분만 직후에 얻어지는 인간 태아막, 태반 및 제대(탯줄)로 형성되는 일체물을 처리, 정제함으로써 인간 양막을 조제할 수 있다. 처리, 정제 방법은 특개 평 5-56987호에 기재된 방법 등의 공지된 방법을 채용할 수 있다. 즉, 분만시에 얻어지는 태아막으로부터 양막을 박리하고, 초음파 세정 등의 물리적 처리 및 효소 처리 등에 의해 잔존 조직을 제거하고, 적절한 세정 공정을 거쳐서 인간 양막을 조제할 수 있다.

이렇게 조제한 인간 양막은 사용시까지 동결하여 보존할 수 있다. 인간 양막의 동결은, 예를 들면 -80℃, DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium)과 글리세롤을 부피비로 등량 혼합한 액 중에서 행할 수 있다. 동결 보존함으로써 조작성이 향상되는 것은 물론 항원성 저하도 기대할 수 있다.

양막을 그대로 이용할 수도 있지만, 양막으로부터 소파(搔爬) 처리 등에 의해 상피를 제거한 것을 이용하는 것이 바람직하다. 상피의 제거에 의해, 항원성이 저하된다. 예를 들면, 상기한 바와 같이 동결 보존한 인간 양막을 해동한 후, EDTA나 단백 분해 효소로 처리하여 새포간의 접착을 늦추고, 그리고 셀 스크러퍼 등을 이용하여 상피를 소파함으로써, 상피가 제거된 인간 양막을 조제할 수 있다.

바람직하게는, 아래의 단계를 포함하는 방법으로 양막의 상피를 제거한다.

(1) 생체로부터 분리된 양막을 준비하는 단계.

(2) 상기 양막에 동결 융해 처리를 실시하는 단계.

(3) 동결 융해 처리 후의 양막에 트립신 처리를 실시하는 단계.

(4) 트립신 처리 후의 양막을 세정하는 단계.

해당 상피 제거법에 의하면, 종래의 수작업적인 상피 제거법과 동일한 정도로 기저막의 손상을 억제하면서 상피를 완전히 제거할 수 있다. 즉, 해당 상피 제거법에 의하면, 상피가 완전히 제거되며, 게다가 본래의 구조를 양호하게 보유한 기저막을 구비하는 양막이 얻어진다. 이러한 양막은 예를 들면, 세포 배양용 기질(기재)로서 양호하게 기능한다. 한편 아래의 상피 제거법은 종래의 수작업적인 방법에 비하여 조작이 대단히 간편하므로 조작 시간도 짧아진다. 또한, 동시에 다수의 양막을 용이하게 처리할 수도 있다. 또한, 숙련된 기술이 특별히 요구되지 않으므로 자동화도 용이하다.

이하, 상피 제거법의 각 단계를 상세하게 설명한다.

(양막의 준비: 단계 1)

단계(1)에서는 양막을 준비한다. 여기에서의 양막은 바람직하게는 인간 양막이다. 인간 양막은 예를 들면, 분만시에 후산으로서 얻어지는 인간 태아막, 태반 등으로부터 채취할 수 있다. 구체적으로는, 분만 직후에 얻어지는 인간 태아막, 태반 및 제대(탯줄)로부터 형성되는 일체물을 처리·정제함으로써 인간 양막을 조제할 수 있다. 이러한 인간 양막의 조제 방법은 특개 평 5-56987호에 기재된 방법 등의 공지된 방법을 채용할 수 있다. 전형적으로는 아래의 순서로 이 단계를 실시한다.

(1-1) 양막의 채취

분만시에 태반 조직의 일부를 채취하고, 이어서 태반 조직으로부터 양막 조직을 수작업에 의하여 박리한다. 이 단계에서 일단 동결할 수도 있다.

(1-2) 혈구 성분 등의 제거

양막에 부착된 혈구 성분을 생리 식염수 등으로 세정·제거한다. 또한, 융모막을 수작업에 의하여 박리하고, 제거한다. 이와 같이, 이 단계에 있어서 혈구성분 및 융모막을 제거한 양막으로 하는 것이 바람직하지만, 후술하는 동결 융해 처리(단계 2) 후에, 혈구 성분의 제거 및/또는 융모막의 박리를 행할 수도 있다.

이렇게 조제한 인간 양막은 다음 처리까지 동결하여 보존할 수 있다. 인간 양막의 동결은 예를 들면 -80℃, DMEM과 글리세롤을 부피비로 등량 혼합한 액 중에서 실시할 수 있다. 동결 보존함으로써 조작성이 향상되는 것은 물론, 항원성의 저하도 기대할 수 있다.

(프레임 고정)

상기 순서로 조제한 양막을 프레임에 고정한 후, 이후의 처리에 제공하는 것이 바람직하다. 양막을 프레임으로 고정함으로써 취급하기 쉬워진다.

양막의 고정 방법의 구체예를 도 2에 나타낸다. 도 2a의 예에서는 동일한 형상의 2개의 프레임(1, 2)이 사용된다. 이들 2개의 프레임에 그 주변부를 협지하여 양막(10)이 고정된다. 또한, 양막을 펼친 상태로 고정한다. 도 2b의 예에서는, 프레임(3)과 판형 부재(4)를 이용하여 양막(10)을 고정한다. 우선, 판형 부 재(4) 상에 양막(10)을 넓힌 상태로 탑재한다. 이때 양막(10)의 상피측을 위로 한다. 이어서, 양막(10) 위로부터 프레임(3)을 탑재하고, 양막(10)의 주변부를 판형 부재(4)와 프레임(3)으로 협지한다. 그 결과, 양막(10)의 상피측만이 노출된다. 따라서, 후술하는 트립신 처리를 실시할 경우, 트립신 용액을 양막의 상피측에만 접촉시킬 수 있다(예를 들면, 프레임(3)의 내측에 트립신 용액을 첨가함). 이에 의해, 상피 이외의 부분(양막 치밀층 및 기저막)에 영향을 미치지 않고 트립신 처리를 행할 수 있다. 즉, 양막의 상피에 대하여 트립신을 작용시키면서, 양막 치밀층 등을 트립신의 작용으로부터 보호할 수 있다.

(동결 융해 처리: 단계 2)

이 단계에서는 양막을 일단 동결시킨 후 융해시킨다. 이 동결 융해 처리에 의해, 이후의 트립신 처리시에 양막 상피층이 쉽게 박리된다. 이는, 양막 상피층과 기저막 사이의 접착 상태(결합 상태)가 완화됨에 따른 것으로 생각된다.

동결 온도로서 약 -20℃∼약 -80℃를 채용할 수 있다. 충분한 동결 상태를 얻을 수 있고, 범용적인 프리저(freezer)를 이용할 수 있다는 점 등을 고려하여, 약 -80℃로 동결시키는 것이 바람직하다. 한편, 융해 온도로서 약 4℃∼약 50℃를 채용할 수 있다. 바람직하게는 융해 온도를 약 37℃로 한다.

동결 융해 처리를 반복하여 실시하는 것이 바람직하다. 반복 실시함으로써, 이후의 트립신 처리에 있어서 상피가 쉽게 박리되는 동결 융해 처리의 효과가 증강된다. 단, 필요 이상으로 반복 실시하면 상피 이외의 부분에 악영향을 줄 수도 있을 것으로 예상된다. 따라서, 예를 들면 동결 융해 처리를 2∼4회의 범위에서 반 복 실시하는 것이 바람직하다. 본 발명자들의 검토 결과, 동결 온도 -80℃, 융해 온도 37℃의 동결 융해 처리를 2회 실시함으로써 필요 충분한 효과가 얻어지는 것으로 밝혀졌다. 이러한 발견으로부터, 동결 온도 -80℃, 융해 온도 37℃의 조건 하에서는 동결 융해 처리를 2회 실시하는 것이 바람직하다고 할 수 있다.

동결 융해 처리를 반복 실시할 경우의 각 회의 조건(동결 온도, 융해 온도)은 모두가 동일하거나, 일부 상이할 수도 있고, 또는 서로 상이할 수도 있다. 단, 조작성을 위하여, 각 회의 조건을 동일하게 하는 것이 바람직하다.

(트립신 처리: 단계 3)

이 단계에서는 동결 융해 처리 후의 양막을 트립신으로 처리한다. 트립신 처리는 트립신 용액을 양막에 접촉시킴으로써 행해진다. 트립신 용액으로서 예를 들면, 트립신 농도가 약 0.01%(w/v)∼약 0.05%(w/v)의 트립신 용액을 사용할 수 있다. 바람직하게는 트립신 농도가 약 0.02%(w/v)인 트립신 용액을 사용한다. 트립신 용액의 트립신 농도가 지나치게 낮으면 트립신의 작용이 충분히 발휘되지 않는다. 한편, 트립신 농도가 지나치게 높으면 양막 상피에 대하여 트립신을 양호하게 작용시킬 수 있는 반면, 양막 치밀층 및 기저막에도 트립신이 작용하여, 해당 부분이 손상된다.

트립신은 소 유래, 돼지 유래, 인간 유래의 것 등, 많이 시판되고 있다. 예를 들면, Trypsin-EDTA(Invitrogen社), 트립신 1:250(Sigma社)을 바람직하게 사용할 수 있다.

트립신 용액에는 보통 킬레이트제를 첨가하지만, 킬레이트제는 필수적이지 않다. 킬레이트제로서는 EDTA, NTA, DTPA, HEDTA, GLDA 등을 이용할 수 있다. 이들을 임의로 조합하여 사용할 수도 있다. 킬레이트제는, 예를 들면 약 0.1mM∼약 0.6mM의 농도가 되도록 첨가된다.

양막 상피측만이 트립신 용액에 접촉하는 조건 하에서 트립신 처리를 실시하는 것이 바람직하다. 양막 상피 이외의 부분을 트립신의 작용으로부터 보호하기 위해서이다. 예를 들면, 양막 상피측만을 트립신 용액에 침지하거나, 양막 상피측에 트립신 용액을 첨가 또는 도포하거나, 양막 융모막측을 블로킹해서 용액에 접하지 않도록 가공한 후에 트립신 액에 전체적으로 침지하는 등에 의해, 양막 상피측만을 트립신 용액에 접촉시킬 수 있다. 상술한 바와 같이, 도 2b에 도시한 것과 같은 프레임에 미리 고정한 양막(프레임 고정 양막)을 사용하면 양막의 상피측만이 노출된 상태이므로, 예를 들면 프레임 고정 양막을 트립신 용액에 침지함으로써 양막 상피측만을 트립신 용액에 접촉시킬 수 있다. 이 방법에서는, 프레임 고정한 양막을 침지하는 간편한 조작으로 트립신 처리를 행할 수 있다는 장점도 있다. 또한, 이렇게 프레임에 고정된 양막을 사용할 경우에 있어서도, 프레임과 함께 트립신 용액에 침지하는 방법이 아니라, 양막의 상피측 부분만을 트립신 용액에 침지하거나(예를 들면, 양막의 상피측을 아래로 하여 트립신 용액에 침지함), 프레임 내로 트립신 용액을 첨가하거나, 또는 양막 상피측으로 트립신 용액을 도포하는 등에 의해 양막의 상피측만을 트립신 용액에 접촉시킬 수도 있다.

트립신 처리 시간(트립신 용액의 접촉 시간)은, 예를 들면 약 5분∼약 60분으로 한다. 바람직하게는 약 10분∼약 20분, 더욱 바람직하게는 약 15분으로 한 다. 처리 시간이 지나치게 짧으면 트립신을 충분히 작용시킬 수 없고, 결과적으로 양막 상피의 제거가 불충분해진다. 한편, 처리 시간이 지나치게 길면 양막의 기저막, 치밀층에 대해서도 트립신이 작용하여 해당 부분을 손상시킬 우려가 있다.

트립신 처리의 온도 조건은 트립신이 양호하게 작용하도록 예를 들면 약 25℃∼약 42℃로 한다.

트립신 용액을 접촉시키는 동안 양막을 정치한 상태로 유지하는 것이 바람직하다. 트립신 용액이 기저막, 치밀층을 통하여 침투하기 어려워질 것으로 생각되기 때문이다.

트립신 처리를 복수회로 나누어서 실시할 수도 있다.

(세정: 단계 4)

이상의 방법으로 트립신 용액을 접촉시킨 후 양막을 세정한다. 이 세정에 의해 부착되어 있는 트립신 용액이 제거되며, 동시에 양막 상피(상피 세포)가 제거된다. 예를 들면, 적당한 흐름을 가진 액체 중(예를 들면, 유수 중)에 방치하거나, 적당한 액체에 침지한 상태로 진탕(예를 들면, 상하 진탕)하거나, 또는 적당한 액체에 침지한 상태로 초음파 등을 가함으로써, 트립신 처리 후의 양막을 세정한다. 세정에 사용하는 액체로서, 생리 식염수, 인산계 완충액, 순수, DMEM을 예시할 수 있다.

세정 후의 양막을 사용시까지 냉장 또는 냉동 보존할 수도 있다. 예를 들면, 글리세롤을 포함하는 보존액(예를 들면, 50% 글리세롤 함유 DMEM(GIBCOBRL社))에 침지한 상태로 보존할 수 있다.

2. 트레할로스의 부가: 단계(b)

양막에 대한 트레할로스의 부가는 예를 들면, 트레할로스 용액에 양막을 침지함으로써 실시할 수 있다. 예를 들면, 5%(w/v)∼20%(w/v)가 되도록 트레할로스를 증류수나 인산 완충화 생리 식염수(PBS(-))에 용해시켜서 얻어지는 용액에 양막을 침지한다. 침지시의 온도는 예를 들면 4℃∼37℃의 범위 내로 한다. 침지 시간은, 예를 들면 1시간∼1일의 범위 내로 한다. 또한, 트레할로스는 예를 들면 株式會社林原商事가 제공하는 토레하(등록상표)나 株式會社에이치플러스비·라이프사이언스가 제공하는 토레하노이노치 등을 이용할 수 있다.

양막에 대한 트레할로스의 부가 방법으로서, 트레할로스 용액을 양막 표면에 도포하는 방법, 트레할로스 용액을 양막 표면에 세차게 내뿜는 방법, 트레할로스를 직접 양막 표면에 첨가하는 방법 등을 채용할 수 있다.

또한, 양막으로부터 상피를 제거하는 단계(예를 들면 상기 단계 2∼4) 전에 트레할로스를 부가하는 단계를 실시할 수도 있다.

3. 동결 처리 또는 건조 처리: 단계(c)

본 발명의 일 태양에서는 트레할로스 부가 후의 양막을 동결 또는 건조시킨다. 이 처리에 의해 보존성이 향상되고, 취급도 용이해진다. 특히, 건조 처리에 의하면, 보존성 및 취급성 면에서 지극히 우수한 시트형 조성물이 된다. 또한, 건조에 따른 표면 형태의 변화에 의해 양막의 생체 조직에 대한 친화성(접착성)이 향상되는 것을 기대할 수 있다. 양막의 건조는 동결 건조 처리로 실시하는 것이 바람직하다. 양막의 유연성의 저하를 억제할 수 있기 때문이다. 또한, 동결 건조 처리는 양막의 기저막 성분의 구조를 유지한다는 관점에서도 바람직하다. 동결 건조 처리에서는 일반적으로, 비점이 약 -20℃(107Pa, 0.8Torr)∼약 -50℃(4Pa, 0.03Torr)인 낮은 기압 환경(진공)에 있어서, 동결 고착화 상태의 시료(예를 들면, 약 -40℃로 동결시킨 것)로부터 승화에 의해 수분이 제거된다. 동결 건조 처리에 의하면 내부도 균일하게 탈수할 수 있고, 또한 높은 건조도가 실현되므로 본래의 기능 및 형태를 고도에 보유한 상태로 건조할 수 있다. 또한, 동결 건조 처리는, 1. 처리 중의 열화가 적고, 2. 무균화를 용이하게 할 수 있고, 3. 복원성이 우수한 건조체가 얻어지며, 4. 보존성이 우수한 건조체가 얻어진다는 등의 특징이 있다.

동결 건조 처리는, 진공실, 냉각·가열 장치, 배기 장치(콜드 트랩 및 진공 펌프)를 구비한 동결 건조기에 의해 실시할 수 있다. 수많은 동결 건조 장치가 시판되고 있으며, 이들 중에서 임의로 선택한 것을 이용하여 건조 처리할 수 있다. 또한, 처리 조건은 사용하는 장치에 첨부된 사용 설명서에 따라서 설정할 수 있다. 이 경우, 건조 처리에 제공하는 시료의 크기, 건조도 등을 고려할 수 있다. 건조도는 예를 들면 수분 활성(AW)이 0.5보다 작도록 설정할 수 있다.

동결 건조된 양막을 절단하거나, 오려냄으로써, 원하는 크기 및 형상의 건조 양막을 얻을 수 있다. 얻어진 건조 양막을 지지체나 프레임에 고정할 수도 있다.

본 발명의 일 태양에서는, 건조 처리에 의해 얻어진 건조 양막을 실질적으로 산소와 접촉이 없는 상태가 되도록 적당한 용기에 수납한다. 산소로부터 실질적으로 차단된 상태로 포장됨으로써, 보존성이 지극히 우수한 상피 비함유 건조 양막이 된다.

예를 들면, 건조 처리 후의 양막을 적당한 용기 내에 수납한 후, 용기 내의 공기를 흡인 제거하여 진공 상태를 형성하거나, 용기 내를 질소 치환하는 등에 의해, 양막을 산소로부터 실질적으로 차단한 상태로 포장할 수 있다. 또는, 용기 내에 탈산소제를 동봉함으로써, 잔존하는 산소를 제거할 수도 있다. 또한, 이들 방법을 임의로 조합하여 이용할 수도 있다. 용기로서는 예를 들면, 가소성의 합성 수지로부터 형성되는 자루형 또는 튜브형(2장의 시트를 포개어서 주변부를 실링한 것일 수도 있음), 또는 유리 등의 무기 재료로부터 형성된 병형의 것 등을 사용할 수 있다.

동결 처리 또는 건조 처리를 실시하기 전 또는 후에, 양막의 융모막측을 생체 흡수성 재료로 피복하는 단계를 실시할 수도 있다. 이 처리로 의해 양막의 강도를 향상시킬 수 있다. 생체 흡수성 재료로서는 폴리글락틴 910, 젤라틴, 콜라겐, 폴리락트산 등을 예시할 수 있다.

4. 멸균 처리 단계: 단계(d)

멸균 처리함으로써 균이 혼입될 리스크를 최소화할 수 있다. EOG(에틸렌옥사이드 가스), UV(자외선), γ선 처리 등에 의해 양막을 멸균할 수 있다. 이 중에서도 γ선 멸균을 채용하는 것이 바람직하다. 양막의 물성의 저하가 적기 때문이다. γ선 멸균에 있어서의 선량은, 예를 들면 2kGy∼50kGy, 바람직하게는 10kGy∼30kGy, 더욱 바람직하게는 15kGy∼25kGy다.

일련의 처리를 행한 후의 양막을 용기에 수납한 상태, 또는 필름이나 시트 등으로 포장한 상태로 멸균 처리하는 것이 바람직하다. 따라서, 멸균 처리에 선행 하여, 양막을 용기 등에 수납하는 등의 단계를 실시하는 것이 바람직하다. 또한, 실질적으로 산소와 접촉이 없는 상태에서 양막을 수납 또는 포장하는 것이 바람직하다. 품질의 열화를 억제할 수 있고, 장기 보존이 가능하기 때문이다.

5. 접착 성분의 부착: 단계(e)

본 발명의 일 태양에서는, 양막의 표면에 피브리노겐 및 트롬빈을 부착한다. 이들 성분의 부착은 예를 들면, 상기 건조 처리 후에 행할 수 있다. 건조 상태의 양막을 사용함으로써, 피브리노겐 등의 접착 성분을 보다 양호하게 부착할 수 있다.

양막의 표면에 대한 피브리노겐 및 트롬빈의 부착은 각각 단독 또는 동시에 행해진다. 부착 방법은 특별히 한정되지 않는다. 부착 방법의 예로서, 부착시킬 성분의 용해액을 양막 표면에 도포, 적하, 또는 분무하는 방법, 또는 부착시킬 성분의 용해액에 양막을 침지하는 방법을 들 수 있다. 또한, 피브리노겐 자체(또는 트롬빈 자체)를, 또는 피브리노겐(또는 트롬빈)을 적당한 용매에 용해한 후 석출시킨 성분을 양막 표면에 첨가함(내뿜음)으로써 피브리노겐(또는 트롬빈)을 양막 표면에 부착할 수도 있다.

바람직하게는 이들 2성분의 혼합액을 조제하고, 해당 혼합액을 이용한 도포, 적하 등에 의해 피브리노겐 및 트롬빈을 동시에 양막 표면에 부착한다. 이러한 2성분을 동시에 부착하는 방법의 구체예를 아래에 설명한다.

우선, 피브리노겐 용해액을 조제한다. 구체적으로는 피브리노겐을 원하는 농도가 되도록 에탄올(예를 들면, 94% 에탄올) 등의 용제(용매)에 용해한다. 에탄 올 이외에도 무수 에탄올, 이소프로판올, 메탄올 등의 알코올류나 아세톤 등을 용제로서 이용할 수 있다. 한편, 동일한 순서로 트롬빈 용해액을 별도 조제한다. 이 경우의 용제로서는 예를 들면 에탄올(예를 들면, 99.5% 에탄올), 무수 에탄올, 이소프로판올, 메탄올 등의 알코올류나 아세톤 등을 이용할 수 있다.

이어서, 상기 순서로 준비한 피브리노겐 용해액 및 트롬빈 용해액을 혼합한다. 이렇게 얻어진 혼합액을 이용하여 상기와 같이 양막 상에 도포, 적하 등을 실시한다. 이상과 같이 피브리노겐 용해액과 트롬빈 용해액을 혼합하고, 혼합액을 이용하여 부착 조작을 실시할 경우에는, 혼합액 중의 수분량이 많아지지 않도록 유의하는 것이 바람직하다. 만일 혼합액 중의 수분량이 많아지면, 부착 조작 전에 피브리노겐, 트롬빈간의 반응이 일어나서 부착 조작에 지장을 초래한다. 또한, 이식 후에 양호한 접착력을 얻기 위해서는, 피브리노겐과 트롬빈이 사전에 작용하지 않은 상태로 양막 상에 부착되어 있는 것이 바람직하다. 이상의 점을 고려하면, 피브리노겐의 용제 및 트롬빈의 용제로서 각각, 수용성이며 동시에 수분량이 적고 휘발성인 것을 채용하는 것이 바람직하다.

피브리노겐 용해액 및 트롬빈 용해액, 또는 피브리노겐과 트롬빈의 혼합액의 도포, 적하 등은 전형적으로는 양막 표면의 전체 영역에 대하여 균일하게 실시되지만, 예를 들면 일부 영역에만 실시하거나(예를 들면, 스폿적으로 간격을 두고 복수 영역에 행하거나, 주변부만에 행함), 부착량이 상이하도록 실시할 수도 있다.

상기 방법에서는, 피브리노겐 및 트롬빈의 부착이 동시에 행해지지만, 각각의 성분을 별개 공정으로 부착할 수도 있다. 즉, 피브리노겐의 부착과, 트롬빈의 부착을 2단계로 실시할 수도 있다. 단, 조작을 간략화가 가능하고, 피브리노겐과 트롬빈을 보다 균일한 분산 상태로 부착 가능하다는 점에서, 피브리노겐과 트롬빈의 혼합액을 이용하여 1단계로 부착 조작을 행하는 것이 바람직하다.

또한, 피브리노겐 및 트롬빈은 통상적인 방법을 따라서 혈액으로부터 조제할 수 있다. 재조합체의 피브리노겐 등을 사용할 수도 있고, 이 경우에는 적당한 배양 세포의 배양액 또는 세포 파쇄액으로부터 통상적인 방법에 의하여 조제할 수 있다. 또한, 시판되는 피브리노겐 등을 사용할 수도 있다. 예를 들면, 인간 유래의 피브리노겐은 백스터社에서 구입할 수 있다. 마찬가지로 인간 유래의 트롬빈은 백스터社에서 구입할 수 있다.

피브리노겐 및 트롬빈뿐만 아니라 아프로티닌을 양막 표면에 부착할 수도 있다. 즉, 해당 태양에서는 아프로티닌을 부착하는 단계(단계 b-1)를 더욱 실시한다. 아프로티닌의 부착은 피브리노겐 등과 동일한 수단 및 순서로 실시할 수 있다. 즉, 아프로티닌 용해액을 이용한 도포, 적하, 분무, 침지 등에 의해 양막 표면에 아프로티닌을 부착할 수 있다. 아프로티닌 용해액은, 염화나트륨 용액(예를 들면, 0.85% 용액), 염화칼륨 용액, 염화칼슘 용액, 염화마그네슘 용액 등에 아프로티닌을 용해함으로써 조제할 수 있다.

또한, 아프로티닌은 통상적인 방법을 따라서 소의 이자로부터 조제할 수 있다. 재조합체의 아프로티닌을 사용할 수도 있고, 이 경우에는 적당한 배양 세포의 배양액 또는 세포 파쇄액으로부터 통상적인 방법에 의하여 조제할 수 있다. 또한, 시판되는 아프로티닌을 사용할 수도 있다. 예를 들면, 소 유래의 아프로티닌은 바 이엘약품에서 구입할 수 있다.

아프로티닌을 부착하는 단계를 단독으로 실시할 수도 있지만, 피브리노겐 및 트롬빈을 부착하는 단계와 동시에 실시하는 것이 바람직하다. 접착 성분의 부착 조작이 전체적으로 간략화되기 때문이다. 또한, 피브리노겐, 트롬빈, 및 아프로티닌을 보다 균일하게 분산된 상태로 양막 표면에 부착할 수 있기 때문이다. 예를 들면, 피브리노겐, 트롬빈, 및 아프로티닌의 혼합액을 조제하고, 이를 도포하는 등에 의하여, 이들 3성분의 양막에 대한 동시 부착을 행할 수 있다. 이들 3성분의 혼합 순서는 특별히 한정되지 않는다.

피브리노겐 등의 부착은 양막의 일면 또는 양면에 대하여 실시된다. 전자의 경우에는 원칙적으로, 양막에 있어서의 상피의 유무에 관계없이, 상피측(상피가 존재했던 측)과 반대측 표면(즉, 융모막측)에 피브리노겐 등의 부착이 행해진다.

피브리노겐 및 트롬빈(경우에 따라서는 추가적으로 아프로티닌)을 부착한 후, 필요에 따라서 건조 처리한다. 이에 의해, 보존 안정성이 우수한 시트형 조성물이 된다. 또한, 취급(수송, 이식 조작 등)의 면에서도 바람직한 형태가 된다.

건조 처리로서, 풍건(風乾), 진공 건조, 감압 건조, 동결 건조 등, 일반적인 건조 처리 방법을 채용할 수 있다.

(세포층을 포함하는 시트형 조성물의 제조 방법)

본 발명의 일 태양에서는, 양막 상에 생체 유래 세포를 이용한 세포층이 형성된다. 세포층을 형성하는 단계는 아래 순서로 실시할 수 있다. 우선, 적절한 생체 유래 세포를 준비한다(생체 유래 세포를 조제하는 단계). 생체 유래 세포로 서는, 최종적으로 얻어지는 시트형 조성물의 용도에 적합한 세포를 사용한다. 예를 들면, 피부 표피 조직의 재생용 시트를 제조할 경우에는, 피부 표피 세포(그 줄기 세포, 전구 세포를 포함함)나 모낭 상피 세포(그 줄기 세포, 전구 세포를 포함함) 등이 바람직하게 사용된다. 마찬가지로, 각막 상피 조직의 재생을 목적으로 할 경우에는 각막 상피 세포(그 줄기 세포, 전구 세포를 포함함)가 바람직하게 사용되고, 점막 상피 조직의 재생을 목적으로 할 경우에는 점막 상피 세포(그 줄기 세포, 전구 세포를 포함함)가 바람직하게 사용된다. 점막 상피 세포의 예로서는 구강 점막 상피 세포, 장관 점막 상피 세포, 기도 점막 상피 세포 등을 들 수 있다.

생체 유래 세포의 조제 방법에 대하여, 피부 표피 세포, 각막 상피 세포, 구강 점막 상피 세포, 장관 점막 상피 세포 및 기도 점막 상피 세포를 예로 들어 설명한다.

(피부 표피 세포)

우선, 피부의 채취시에는, 미리 채취 부위를 예방적으로 포비돈요드 등의 소독약으로 소독하고, 항진균제의 외용 도포를 행한 후, 소피부편을 피부 생체 검사에 따라서 채취한다. 표피 각질 형성 세포의 배양시에는 가위로 피부편으로부터 지방 조직과 진피를 가능한 제거하고, Dulbecco 인산 완충액(PBS)으로 수회 세정한다. 70% 에탄올에 1분간 침지하여 멸균한다. 단편형으로 절단하고, 디스파제액에 침지하여, 4℃에서 하룻밤 동안 정치한다. 이어서 표피를 진피로부터 박리한다. 박리한 표피를 세정 후, 표피편을 풀고(disentangling), 표피 각질 형성 세포 부유 액을 조정한다. 세포를 무혈청 배지에 현탁하고, 콜라겐 코팅 샬레에 파종하고, 2차 배양(subculture)을 실시한다.

(각막 상피 세포)

각막 상피 세포는 각막 윤부 조직(limbus tissue)으로부터 얻을 수 있다. 예를 들면, 각막 윤부 조직으로부터 내피 세포를 박리 제거하고, 결막을 절제하여 단일 세포 현탁액을 제조한다. 그리고 이를 질소 탱크에 보존하고, 이어서 급속히 37℃로 융해하여 각막 상피 세포 부유액을 조정한다. 필요에 따라서 2차 배양한다. 2차 배양에는, 예를 들면 무혈청 배지인 EpiLife^TM(캐스케이드社), MCDB153 배지(日水製藥株式會社)나 이들 배지의 아미노산 조성 등을 변화시켜서 제조되는 배지 등을 사용할 수 있다.

(구강 점막 상피 세포)

구강 점막 상피 세포로서는 치근부에 존재하는 세포(구강내 연점막 상피 세포), 입술부의 세포, 구개부의 세포, 볼부의 세포 등을 이용할 수 있다. 이 중에서도 구강내 연점막 상피 세포는 그 증식능이 높고, 또한 항원성이 낮기 때문에, 이를 이용하는 것이 특히 바람직하다. 구강 점막 상피 세포는 목적으로 하는 세포가 존재하는 장소를 메스 등으로 절제하거나, 소파함으로써 채취할 수 있다. 구강내 연점막 상피 세포에 있어서는, 발치(拔齒)에 부착되어 있는 구강 점막 상피를 에나멜 시멘트 이행부로부터 분리하여, 이로부터 채취할 수 있다. 또한, 결합 조직 등의 불순물을 제거하기 위하여, 디스파제나 트립신 등의 효소에 의한 처리나, 필터 처리를 실시하는 것이 바람직하다.

(장관 점막 상피 세포)

장관 점막 상피 세포는 대장 내시경하 장관 상피 생체 검사 조직로부터 채취, 또는 개복 수술시에 통상의 방법으로 채취된다. 또한, 조직으로부터 lazer capture microdissection에 의해 상피 세포를 절제할 수도 있다. 식도, 위, 십이지장, 소장, 대장의 인간의 모든 소화관 상피 세포를 이용하여 제조되는 시트형 조성물에 대해서도 본 발명의 기술은 적용된다. 궤양이나 염증 등에 의해 인간의 소화관 상피가 손상될 경우, 골수 유래 세포가 긴급 사태에 대응하는 레스큐적인(rescue) 역할을 하고, 상피가 수복된다. 소화관 상피 세포도 일부이기는 해도 골수로부터 만들어진다. 이러한 의미에서, 본 발명의 의의는 각막 상피 세포를 이용하는 것과 동일한 것이라고 볼 수 있다. 통상적으로는 불과 1000개당 수개 정도밖에 없는 골수로부터 생기는 상피 세포가, 위궤양, 대장염 등에 의해 생성된 소화관 내면의 궤양(상처 자리)이 진행되는 과정에서는 50배 내지 100배로도 증가하고, 대략 10개당 1개의 소화관 상피 세포가 골수 유래인 것이 밝혀지고 있다. 여기에서, 제조되는 소화관 점막 상피 세포 유래 시트형 조성물은 불치병으로 지정되어 있는 중증 장관 감염증, 궤양성 대장염, 클론병, 베체트병 등의 장질환의 치료가 어려운 궤양, 염증에 대하여 장관 상피의 재생을 촉진하는 의미에 있어서도 대단히 의의가 있은 것으로 생각된다. 장관 알레르기에 대해서도 유용성이 기대된다.

(기도 점막 상피 세포)

기도 점막 상피 세포는 기도 점막의 생체 검사 조직으로부터 용이하게 얻어 지고, 전술한 조직과 동일하게 결합 조직 등의 불순물을 제거하기 위하여, 디스파제나 트립신 등의 효소에 의한 처리나, 필터 처리를 실시하는 것이 바람직하다. 기도 점막 상피 세포는 β디펜신(defensin)의 생합성, 방출 등을 통하여, 각종 감염증의 용태 진전에 중요한 작용을 한다. 또한, 천식이나 알레르기 질환에 있어서도 기도 점막 상피가 달성하는 역할은 높다. 조직 장해를 받은 기도 점막에 본 발명의 기도 점막 상피 세포로부터 제조되는 시트형 조성물을 제공하는 것은, 긴급시 대응뿐만이 아니라, 인공 기도의 제공도 가능하게 하는 것이다. 특히, 양막 상에 제조된 시트가 가지는 면역 억제 작용은 유익하다.

구강 점막 상피 세포나 장관 점막 상피 세포 등은 특히, 조직의 채취 후, 결합 조직 등의 불순물을 제거하기 위해서, 디스파제나 트립신 등의 효소에 의한 처리나, 필터 처리를 실시하는 것이 바람직하다.

생체 유래 세포는 시트형 조성물의 이식을 받는 자(수용자)로부터 조제하는 것이 바람직하다. 즉, 생체 유래 세포의 도너(donor)와, 생체 이식 시트의 수용자가 동일인인 것이 바람직하다. 이러한 자가 세포를 이용함으로써 면역 거부 문제가 해소된다.

조제된 생체 유래 세포는 양막 상에 파종되고(생체 유래 세포를 양막 상에 파종하는 단계), 이어서 배양에 이용된다(파종한 생체 유래 세포를 배양하여 증식시키는 단계).

이 태양에 있어서는 특히, 상피가 제거된 양막을 이용하는 것이 바람직하다. 상피의 제거에 의해 항원성의 저하를 기대할 수 있고, 또한 불필요한 세포를 사전 에 제외함으로써 양호하게 원하는 세포층을 형성할 수 있다. 상피가 제거된 양막을 이용할 경우, 상피를 제거하여 표출된 면측(즉, 기저막측)에 생체 유래 세포를 파종하는 것이 바람직하다. 이 면에는 IV형 콜라겐이 풍부하게 포함되어 있어서, 파종된 생체 유래 세포의 증식, 중층화가 양호하게 진행되는 것으로 생각되기 때문이다.

여기에서, 2종 이상의 세포를 이용하여 하이브리드화된 세포층을 형성할 수도 있다. 이러한 경우의 세포층의 구체적인 형성 방법을 각막 상피의 재건용 시트형 조성물을 제조할 경우를 예로 하여 아래에 상술한다.

우선, 세포층의 형성에 사용하는 세포종의 하나(제1 세포)로서 구강 점막 상피 세포, 결막 상피 세포, 비강 점막 상피 세포, 또는 그 밖의 점막 상피 세포, 또는 이들 어느 하나의 점막 상피를 구축 가능한 미분화 세포를 바람직하게 이용할 수 있다. 한편, 제1 세포와 함께 세포층의 형성에 사용되는 세포종(제2 세포)으로서는, 각막 상피 세포, 결막 상피 세포, 또는 양막 상피 세포 바람직하게 이용할 수 있다. 이들 세포는 이들이 존재하는 생체 조직으로부터 채취된다. 구체적으로는 예를 들면, 원하는 세포가 존재하는 조직의 일부를 메스 등으로 채취한 후, 결합 조직의 제거, 세포의 분리 등의 처리를 거쳐서 세포 부유액(현탁액)의 형태로 조제한다. 또한, 제1 세포로서 상이한 2종 이상의 세포를 이용할 수도 있다. 제2 세포에 대해서도 마찬가지로, 상이한 2종 이상의 세포를 이용할 수도 있다.

제1 세포의 채취원으로서 적합한 구강 점막 상피로는 줄기 세포의 존재가 시사되고 있으며, 상피 세포층을 형성하는 세포로 분화 유도하기 용이할 것으로 생각 된다. 또한, 구강 점막 상피 세포를 이용하는 것은 채취가 용이하고, 다량의 세포를 채취 가능하고, 또한 양안성 환자를 처치할 경우에 있어서도 자기 세포를 이용하여 이식 재료를 조제할 수 있다는 등의 장점이 있다. 특히, 각막 상피 세포를 채취 불가능한 환자에 대하여, 자기 세포 유래의 이식 재료를 적용할 수 있다는 장점은 임상적으로 지극히 중요한 거부 반응 문제를 대폭 해소할 수 있을 것으로 기대된다.

구강 점막 상피 세포로서는 치근부에 존재하는 세포(구강내 연점막 상피 세포), 입술부의 세포, 구개부의 세포, 볼부의 세포 등을 이용할 수 있다. 이 중에서도 구강내 연점막 상피 세포는 그 증식능이 높고, 또한 항원성이 낮으므로, 이를 이용하는 것이 특히 바람직하다. 구강 점막 상피 세포는 목적으로 하는 세포가 존재하는 장소를 메스 등으로 절제하거나, 소파함으로써 채취할 수 있다. 구강내 연점막 상피 세포에 있어서는, 발치에 부착되어 있는 구강 점막 상피를 에나멜 시멘트 이행부로부터 분리하여, 이로부터 채취할 수 있다. 또한, 결합 조직 등의 불순물을 제거하기 위하여, 디스파제나 트립신 등의 효소에 의한 처리나, 필터 처리를 실시하는 것이 바람직하다.

본 발명에 의해 제조되는 시트형 조성물을 이식 예정의 환자 이외의 구강으로부터 채취한 구강 점막 상피 세포를 이용할 수도 있지만, 면역 거부 반응을 고려하면, 환자 자신의 구강으로부터 구강 점막 상피 세포를 채취하여, 배양에 제공하는 것이 바람직하다.

구강 점막은 증식능이 높고, 통상적으로 수술 후 수일 동안의 항생제 내복, 이소딘(isdine) 소독 등으로 창상 치유하기 때문에, 점막 채취에 의한 환자 자신의 침습은 미미한 것으로 생각된다.

한편, 제2 세포로서는 타인(allo)의 각막 상피 세포를 바람직하게 이용할 수 있다. 이러한 각막 상피 세포는 예를 들면, 감염증이 없는 도너의 안구를 아이 뱅크(Northwest lions eye bank 등)로부터 입수할 수 있다. 제2 세포로서 사용가능한 세포는 각막 상피 세포에만 한정되지 않고, 결막 상피 세포, 양막 상피 세포 등을 이용할 수도 있다. 단, 생체에 있어서의 각막 상피를 구성하는 세포인 각막 상피 세포, 또는 그 이웃에 존재하는 결막 상피 세포를 채용하면, 각막 상피의 특성에 따라서 양호하게 재현되는 시트형 조성물을 구축할 수 있는 것으로 생각된다. 본 발명자들의 검토 결과, 제2 세포로서 각막 상피 세포를 사용할 경우에는, 각막 상피와 유사한 세포층을 구축할 수 있는 것이 확인되었다. 이러한 사실은 상기 예상을 지지하는 것임과 동시에, 제2 세포로서 각막 상피 세포가 특히 바람직함을 뒷받침하는 것이다. 한편, 제2 세포로서 양막 상피 세포를 이용할 경우에도, 각막으로서 요구되는 특성을 양호하게 재현한 세포층을 형성할 수 있음이 확인되었다. 이 사실은 제2 세포로서 양막 상피 세포도 바람직하게 사용할 수 있음을 나타내는 것이다.

제2 세포로서 자기의 세포를 이용할 수도 있지만, 타인의 세포를 이용하고자 한다면 세포를 더욱 용이하게 입수할 수 있다. 예를 들면, 양안성 환자의 치료용으로 시트형 조성물을 제조할 경우에 있어서도, 제2 세포로서의 각막 상피 세포를 입수할 수 있다.

각각 조제된 제1 세포와 제2 세포(이하, 이들을 함께 "제1 세포 등"이라고도 지칭함)는 양막 상에 파종되어 배양에 이용된다. 통상적으로, 세포 부유액의 형태로 조제된 제1 세포와 제2 세포를 각각 양막 상에 적하하고, 배양을 실시한다.

전형적으로는, 제1 세포의 파종과 제2 세포의 파종을 동시(여기에서의 "동시"는 문자 그대로의 동시는 물론, 하나를 파종한 후에 실질적인 시간적 간격을 두지 않고 다른 하나를 파종할 경우를 포함함)에 실시하지만, 예를 들면, 제1 세포의 파종 후, 수 분∼수 시간 경과한 시점에서 제2 세포를 파종하는 등, 양자를 상이한 시간대에 파종할 수도 있다. 이렇게 파종의 시기를 늦춤으로써, 예를 들면 제1 세포에서 유래하는 세포가 많은 영역이 국부적으로 존재하는 세포층을 구축하는 등, 균질하지 않은 세포층을 구축할 수도 있다.

파종되는 제1 세포 등의 비율은 특별히 한정되지는 않지만, 전형적으로는, 약 동일한 수의 제1 세포와 제2 세포가 파종되도록 한다. 또한, 제1 세포로서 구강 점막 상피 세포를, 제2 세포로서 각막 상피 세포를 이용한 실험에 있어서, 제1 세포의 수:제2 세포의 수가 3:7의 경우, 5:5의 경우, 및 7:3의 경우를 비교한 결과, 세포의 증식 및 중층화에 있어서 이들의 사이에 명확한 차이는 확인되지 않았다(데이터 나타내지 않음).

양막 상에서 제1 세포 및 제2 세포를 배양함으로써, 이들 세포가 증식하여 세포층을 형성한다(이 과정에 있어서 적어도 일부의 세포가 분화되는 것으로 생각된다). 세포층이 형성된 후, 해당 세포층의 표층을 공기에 접촉시키는 단계를 실시한다. 또한, 이 단계를 본 명세서에 있어서 에어-리프팅(air-lifting)이라 지칭 한다. 이 단계는 세포층을 형성하는 세포의 분화, 및 배리어 기능의 유도를 위하여 행해진다.

이 단계는 배양액의 일부를 스포이트, 피펫 등을 이용하여 일시적으로 제거 함으로써 배양액 표면을 저하시켜서, 이에 의해 세포층의 최표층을 일시적으로 배양액 외부로 노출시킴으로써 실시할 수 있다. 또는, 세포층을 양막과 함께 들어올리고, 최표층을 배양액 표면에서 일시적으로 노출시킴으로써 행할 수도 있다. 또한, 튜브 등을 이용하여 공기를 배양액 중으로 보내어 세포층의 최상층에 공기를 접촉시킬 수도 있다. 조작의 용이성 면에서, 배양액 표면을 저하시켜서 세포층의 최표층을 노출시키는 방법으로 실시하는 것이 바람직하다.

이 단계를 행하는 시간, 즉 중층화된 세포층의 최표층을 공기에 접촉시키는 시간은 세포의 상태나 배양 조건 등에 따라서 달라지지만, 예를 들면 3일∼2주일 정도이며, 바람직하게는 1주일 이내, 더욱 바람직하게는 3일 이내이다.

상기 본 발명의 방법에 의해 양막 상에 있어서, 제1 세포 등이 중층화된 각막 상피의 세포층이 형성된다. 이렇게 얻어진 시트형 조성물은 제1 세포 등의 배양 기질로서 이용할 수 있는 양막과 함께, 각막이 손상, 훼손된 환자에게 대한 이식 재료(각막 상피의 대체)로서 이용할 수 있다. 이 경우, 양막이 안구측이 되도록 각막 상피 손상부에 이식된다.

본 발명의 일 태양에서는, 생체 유래 세포의 배양을 지지 세포의 존재 하에서 실시한다. 지지 세포는 feeder 세포라 지칭되는 배양액 중에 성장 인자 등을 공급한다. 지지 세포와의 공존 하에서 배양함으로써, 세포의 증식 효율이 향상된 다. 지지 세포에는, 예를 들면 3T3 세포(스위스 마우스 3T3 세포, 마우스 NIH3T3 세포, 3T3J2 세포 등) 등을 이용할 수 있다. 이 중에서도, 증식 효율, 취급의 용이성 등의 관점에서 마우스 NIH3T3 세포를 지지 세포로서 이용하는 것이 바람직하다.

지지 세포를 미리 마이토마이신 C 등을 이용하여 불활성화하는 것이 바람직하다. 지지 세포 자체가 증식함으로써 생체 유래 세포의 증식이 저해되는 것을 방지하고, 생체 유래 세포의 증식 효율을 상승시키기 위해서이다. 이러한 불활성화는 방사선 처리 등에 의해서도 행할 수 있다.

지지 세포의 세포 밀도는, 예를 들면 약 1×10²개/cm² 이상, 바람직하게는 약 1×10²개/cm²∼약 1×10⁷개/cm², 더욱 바람직하게는 약 1×10³개/cm²∼약 1×10⁵개/cm²로 할 수 있다. 제1 세포 등과 비교하면, 사용하는 지지 세포의 수를, 예를 들면 생체 유래 세포의 총수에 대하여 1/10³배∼1×10²배, 바람직하게는 1/10²∼1배의 조건으로 배양할 수 있다. 지지 세포의 수가 적으면 생체 유래 세포의 증식율이 저하되고, 지나치게 적을 경우에는 양호한 생체 유래 세포의 증식 및 중층화가 얻어지지 않는다. 한편, 지지 세포수가 지나치게 많을 경우에는, 오히려 생체 유래 세포의 증식율이 저하되므로 바람직하지않다.

생체 유래 세포의 배양을 지지 세포의 공존 하에서 행할 경우에는, 지지 세포와 양막 사이에 지지 세포가 통과할 수 없는 세공 크기의 격리막을 존재시키는 것이 바람직하다. 이러한 격리막을 이용함으로써, 배양시에 양막측(즉, 생체 세포측)에 지지 세포가 침입하는 것을 방지할 수 있다. 그 결과, 최종적으로 얻어지는 시트형 조성물 내에 지지 세포가 혼재할 우려가 없어진다. 이는, 지지 세포에 의한 면역 거부의 문제가 없는 시트형 조성물의 제조가 가능함을 의미하고, 임상적으로 지극히 의미가 있다.

격리막으로서는 지지 세포가 통과할 수 없는 세공 크기를 가지는 공지된 것을 적절하게 선택하여 사용할 수 있다. 예를 들면, 폴리카보네이트 재질, 세공 크기가 약 0.4㎛∼3.0㎛의 막을 이용할 수 있다. 격리막의 재질은 특별히 한정되지 않고, 폴리카보네이트 이외에도 폴리에스테르 등일 수도 있다. 이러한 격리막은 시판되고 있으므로 용이하게 입수할 수 있다.

격리막을 이용할 경우의 배양 방법의 예로서 아래의 방법을 들 수 있다. 우선, 샬레 등의 용기(제1 용기)에 불활성화된 지지 세포를 파종하여 배양함으로써, 용기 표면에 지지 세포층을 형성시킨다. 이어서, 격리막에서 저면을 형성한 제2 용기를 제1 용기 내에 설치한다. 이때, 제2 용기의 저면이 배양액 중에 위치하도록 제2 용기의 위치를 조정한다. 계속하여 제2 용기의 저면, 즉 격리막 상에 양막을 탑재 또는 부착시킨다. 그리고, 양막 상에 생체 유래 세포를 파종하고, 배양한다.

제2 용기의 저면에 미리 양막을 탑재 또는 부착하고(예를 들면, 제2 용기의 저면에 상피를 제거한 양막을 탑재하고, 이 상태로 일단 건조 처리함), 이 제2 용기를 지지 세포를 파종한 제1 용기 내에 설치하고, 그리고 양막 상에 생체 유래 세 포를 파종하고, 배양할 수도 있다.

생체 유래 세포를 배양할 때 이용할 수 있는 배양액은 해당 세포를 증식시켜, 중층화할 수 있는 것이라면 특별히 한정되지 않는다. 예를 들면, 상피 세포의 성장에 통상적으로 이용할 수 있는 DMEM과 햄 F12 배지(Ham's F12 medium)를 소정 비율로 섞고, FBS, 성장 인자, 항생 물질 등을 첨가한 배지를 사용할 수 있다. 구체예로서는, FBS(10%), 인슐린(5mg/ml), 콜레라톡신(0.1nM), 상피 세포 증식 인자(EGF)(10ng/ml), 및 페니실린-스트렙토마이신(50IU/ml)을 첨가한, DMEM과 햄 F12 배지의 혼합 배지(혼합 부피비 1:1)를 들 수 있다. 또한, 트리요오도사이로닌(예를 들면, 2nM), 글루타민(예를 들면, 4mM), 트렌스페린(예를 들면, 5mg/ml), 아데닌(예를 들면, 0.18mM), 및/또는 하이드로코르티존(예를 들면, 0.4mg/ml)을 추가로 첨가한 DMEM/햄 F12 혼합 배지를 이용할 수도 있다.

생체 유래 세포의 배양을 이종 동물 세포 비존재하에서 행할 수도 있다. 본 발명에 있어서 "이종 동물 세포 비존재하"란, 생체 유래 세포를 배양할 때의 조건으로서, 해당 생체 유래 세포에 대하여 이종인 동물의 세포가 사용되지 않는 것을 말한다. 구체적으로는 생체 유래 세포로서 인간 세포(예를 들면, 인간 피부 표피 세포나 인간 각막 상피 세포)를 사용할 경우에, 마우스나 래트 등, 인간 이외의 동물 종의 세포가 배양액 중에 존재(병존)하지 않는 조건을 말한다. 이러한 조건으로 배양을 실시함으로써, 최종적으로 얻어지는 이식 재료(즉, 시트형 조성물)에 이종 유래의 성분(이종 세포 자체를 포함함)이 혼입될 우려가 없어진다.

생체 유래 세포를 배양할 때 이용할 수 있는 배지는 해당 세포를 증식시키는 것이라면 특별히 한정되지 않는다. 예를 들면, MCDB153 배지(日水製藥株式會社)나, EpiLife^TM(캐스케이드社), 이들 배지의 아미노산 조성 등을 변화시켜서 제조되는 배지, 상피 세포의 성장에 통상적으로 이용할 수 있는 DMEM과 햄 F12 배지를 소정 비율로 혼합한 배지 등을 사용할 수 있다. 특히, 본 발명에서는 무혈청인 동시에 이종 동물 유래의 단백질을 포함하지 않는 배지를 이용하는 것이 바람직하다. 한편, 성장 인자나 항생 물질 등이 첨가된 배지를 사용할 수도 있다. 단, 혈청을 포함하지 않는 배지를 사용하는 것이 바람직하다. 즉, 본 발명에 있어서의 배양 방법으로서 무혈청 배양법을 채용하는 것이 바람직하다. 혈청 유래의 성분의 혼입에 의한 면역 거부 등의 문제를 회피할 수 있기 때문이다. 또한, 혈청을 포함하는 배지 중에서 배양할 수도 있지만, 이 경우에는 동종 유래의 혈청(인간의 생체 유래 세포를 배양할 경우에는 인간 유래의 혈청)을 사용하거나, 자가 혈청을 사용하는 것이 바람직하다. 물론, 가능하면, 면역 거부 반응이 야기될 우려가 없는 자가 혈청을 사용하는 것이 바람직하다.

생체 유래 세포의 양호한 증식을 위하여, 배양 단계 도중에 배양 조건을 변경할 수도 있다.

배양 단계의 결과, 양막 상에서 생체 유래 세포가 증식한다. 이렇게 얻어진 세포층의 표층을 각화할(keratinized) 필요가 있을 경우(예를 들면, 피부 표피 세포를 이용하여 피부 표피 시트를 제조할 경우나, 각막 상피 세포를 이용하여 각막 상피 시트를 제조할 경우)에는, 상술한 에어-리프팅을 실시할 수 있다.

생체 유래 세포는, 예를 들면 세포 밀도가 약 1×10³개/cm² 이상, 바람직하게는 약 1×10³개/cm²∼약 1×10⁷개/cm², 더욱 바람직하게는 약 1×10⁴개/cm²∼약 1×10⁶개/cm²가 되도록 양막 상에 파종된다.

바람직한 일 태양에서는, 미리 조제한 인간 섬유 아세포 함유 콜라겐 매트릭스 상에 양막을 탑재하고, 이어서 양막 상에 생체 유래 세포를 파종하고, 배양한다. 즉, 이 태양에서는, 콜라겐 겔 내에서 인간 섬유 아세포를 배양하는 단계(단계 B), 및 상기 콜라겐 겔 상에 양막을 탑재한 후, 상기 생체 유래 세포를 상기 양막 상에 파종 또는 탑재하는 단계(단계 C)가 행해진다. 이러한 순서로 제조된 시트형 조성물은 인간 섬유 아세포를 함유하는 콜라겐 겔 상에 탑재된 양막 상에서 증식시킨 생체 유래 세포를 함유하는 것이 된다. 이러한 태양의 시트형 조성물은 콜라겐 매트릭스를 제거한 후에 이식 재료로서 이용할 수도 있다. 또한, 콜라겐 매트릭스와 함께 이식 재료로서 이용할 수도 있다.

"콜라겐 겔"은 인간 섬유 아세포의 배양 기질로서 기능한다. 콜라겐 겔의 원재료가 되는 콜라겐의 종류는 특별히 한정되지 않으며, I형 콜라겐, III형 콜라겐, IV형 콜라겐 등을 이용할 수 있다. 복수 종류의 콜라겐이 혼재하는 것을 이용할 수도 있다. 이들 콜라겐은 돼지, 소, 양 등의 동물의 피부, 연골 등의 결합 조직으로부터, 산 가용화법, 알칼리 가용화법, 효소 가용화법 등에 의해 추출, 정제할 수 있다. 또한, 항원성을 저하시키기 위하여, 펩신이나 트립신 등의 분해 효소로 처리함으로써 텔로펩티드(telopeptide)를 제거한, 소위 아테로콜라 겐(atherocollagen)으로 한 것을 이용하는 것이 바람직하다. 콜라겐 겔 재료로서 양막 유래, 특히 인간 양막 유래의 콜라겐을 이용할 수도 있다. 여기에서, 양막 유래는 넓은 의미로 양막을 출발 원료로서 얻어진 것을 의미한다.

콜라겐 겔이 함유하는 인간 섬유 아세포의 유래는 특별히 한정되지 않고, 콜라겐을 생산하는 것이라면 어떠한 조직 유래된 것일 수도 있으며, 예를 들면, 피부 조직, 구강 점막 조직 등으로부터 조제된 인간 섬유 아세포를 사용할 수 있다.

콜라겐 매트릭스의 제조 방법의 구체예를 나타낸다. 우선, 아래의 순서로 인간 섬유 아세포를 조제한다. 피부를 채취하고, 이어서 피부로부터 진피를 박리한다. 진피를 가늘게 자르고, I형 콜라겐막 접시에 밀착시킨다. 정치 배양하고, 진피편으로부터 유주(遊走)하는 인간 섬유 아세포를 2차 배양한다. 세포를 접시 저면으로부터 박리시키고, 세포 부유액을 조정하고, 세포 배양용 접시에 파종한다. 적절하게 세포를 동결 보존(예를 들면, 액체 질소 중에서 보존)한다.

한편, I형 콜라겐을 이용하여 중화 콜라겐액을 조제한다(후술하는 실시예 참조). 이를 배양 용기(예를 들면, 배양 인서트)에 첨가하고, 실온에서 10분 정도 정치시켜서 겔화시킨다. 이어서, 상기 방법에 의해 미리 배양한 대수 증식기(logarithmic growth phase)의 인간 섬유 아세포를 상기 겔에 혼합하고, 다시 겔화시킨다. 이어서, 정치 배양한다. 상기 순서에 의해 인간 섬유 아세포를 함유하는 콜라겐 매트릭스가 얻어진다. 이러한 창의적 연구에 의해, 필요한 강도를 가지고, 양막층이나 생체 유래 세포를 탑재할 수 있는 콜라겐 매트릭스가 되는 것이, 본 발명의 근간이 된다. 콜라겐 매트릭스 상에는 별도 준비한 양막이 탑재(밀착) 된다. 이어서, 상기 순서로 세포의 파종, 배양이 실시된다.

또한, 양막 표면에 접착 성분(피브리노겐 등)을 부착하는 조작이 수반될 경우에는, 접착 성분의 부착 조작에 선행하여 세포층을 형성한다. 즉, 이 태양에서는, 양막 상에 세포층을 형성한 후, 피브리노겐 등의 접착 성분을 양막 표면(세포층이 형성되지 않는 측의 표면)에 부착한다.

[실시예 1]

1. 트레할로스 처리·동결 건조 양막의 조제

1-1. 양막의 채취

전신적 합병증이 없는 제왕 절개 예정의 임산부에 대하여 사전에 산부인과 의사와 함께 충분히 설명하여 동의(informed consent)를 구한 후, 수술실에서 제왕 절개시에 양막을 채취하였다. 조작은 청결하게 주의하고, 수술 조작에 준해서 손을 씻은 후에 전용 가운을 착용하였다. 분만 전에 청결한 양막 채취용 배트(vat)와 세정용 생리 식염수를 준비하였다. 분만 후에 태반 조직을 배트에 옮기고, 수작업으로 양막 조직을 태반으로부터 박리하였다. 양막과 태반의 유착이 강한 부분은 가위로 절제하였다.

1-2. 양막의 처리

양막 처리의 과정은 (1) 세정, (2) 트리밍, (3) 보존의 순으로 행하였다. 모든 과정에 있어서, 조작은 청결한 드래프트 내에서 실시하는 것이 바람직하고, 사용하는 용기나 기구도 모두 멸균된 것을 사용하고, 샬레 등은 멸균된 １회 용(disposable) 형태의 것을 사용하였다. 채취한 양막에 부착된 혈액 성분을 생리 식염수로 세정하면서 제거하고, 추가로 충분한 량의 생리 식염수(0.005% ofloxacin 첨가)로 세정하였다. 이어서, 페니실린-스트렙토마이신(50IU)을 첨가한 인산 완충 액(PBS)으로 합계 3회 세정하였다. 이어서, 양막을 샬레 내로 옮기고, 가위를 이용하여 약 4×3cm 정도의 크기로 분할하였다. 분할 후, 형상이나 두께 등을 기준으로 상태가 좋은 양막을 선별하였다.

1-3. 양막의 보존

2cc의 멸균 크라이오튜브(cryotube)에 1cc씩 보존액을 넣고, 여기에 채취, 세정하여 선별된 양막을 1장씩 넣어 라벨을 부착한 후, -80℃의 디프 프리저(deep freezer)에 보존하였다. 보존액으로는 50% 멸균된 글리세롤 in DMEM(GIBCOBRL社)을 사용하였다. 보존된 양막의 사용 기한은 3개월로 하고, 기한이 지나면 소각 처분하였다. 또한, 이러한 보존 처리를 행하지 않고, 하기 상피 처리를 행할 수도 있다.

1-4. 양막 상피의 처리

-80℃로 보존한 양막을 실온에서 해동한 후, 페니실린-스트렙토마이신(50IU)을 첨가한 인산 완충액(PBS)으로 2회 세정하였다. 세정 후의 양막을 0.02% EDTA 용액(Nacalai tesque社)에 침지하고(100mm 배양 접시), CO₂ 배양기 내에서 37℃, 1시간 반응시켰다. 반응 후, 양막을 충분한 량의 PBS로 2회 세정하고, 실체 현미경하, cell scraper(Nunc社 USA)를 이용하여 수작업으로 상피를 소파(제거)하였다. 또한, 이 처리 방법에 의해 1층의 양막 상피가 완전히 제거 소파된 것을 광학적 및 전자 현미경적 조작(주사 전자 현미경)으로 확인하였다.

1-5. 트레할로스 처리·동결 건조 양막의 제조

상피를 제거한 양막을 10%(w/v) 트레할로스 용액에 37℃에서 2시간 침지하였다. 트레할로스 용액은, 트레할로스(토레하노이노치, 株式會社에이치플러스비·라이프사이언스, 林原 제품)를 증류수로 희석하여 제조하였다. 용액의 pH는 7∼10의 범위로 유지하였다. 양막을 한 쌍의 멸균된 플라스틱 프레임으로 협지한 후, 클립으로 고정하였다. 프레임과 함께 -80℃의 디프 프리저 내로 옮기고, 양막이 동결된 것을 확인한 후, 진공 동결 건조기(Yamato, NEOCOOL)를 이용하여 동결 건조 처리(-110℃, 약 1시간)하였다. 사용 설명서를 따라서 충분한 건조체가 얻어지도록 조건 설정하였다. 동결 건조 처리 후의 양막을 프레임으로부터 분리하고, 외측이 폴리아미드 나일론, 내측이 폴리에틸렌으로 형성된 2층 구조의 자루에 옮기고, 가정용 진공팩기(프레임노바, 매직팩)를 이용하여 진공 포장하였다. 이렇게 얻어진 진공팩 상태의 양막에 γ선을 조사하여(약 25kGy) 멸균하였다. 멸균 처리 후의 양막을 진공팩 상태로 사용 직전까지 상온 보존하였다. 또한, 보존 시작으로부터 12개월 경과한 시점에 있어서도 동결 건조 직후의 상태를 유지하고 있었다. 이후의 실험은 1개월 상온 보존한 건조 양막을 사용하여 행하였다.

2. 트레할로스 처리·동결 건조 양막의 물성 평가

상기 순서로 조제된 트레할로스 처리·동결 건조 양막(트레할로스 처리 FD-AM라고도 지칭함)을 충분히 복원될 때까지 실온에서 PBS에 침지한 후, 그 물성을 평가하였다. 시험 항목, 시험 방법은 다음과 같다. 또한, 별도 조제한 5장의 트레할로스 처리·동결 건조 양막을 각 시험에 제공하고, 얻어진 측정값의 평균을 평가에 이용하였다. 또한, 상피 처리, 트레할로스 처리 및 동결 건조 처리를 실시하지 않은 양막(생 양막)과, 트레할로스 처리를 실시하지 않는 것 이외에는 동일한 순서로 조제한 동결 건조 양막을 준비하고, 물성 평가의 기준(비교 대조)으로 하였다.

(1) 두께

두께의 측정은 기엔스 제품 더블스캔 고정밀도 레이저 측정기(LT-9010M)로 행하였다.

(2) 투명도

日本電色社 제품 탁도계(NDH2000)를 이용하여 탁도를 측정하고, 투명도의 평가에 이용하였다. 탁도는 이하의 식으로 산출된다. Haze(탁도)=확산 투과율(DF)/전체 광선 투과율(TT)

(3) 인장 강도

인장 강도의 측정에는 A&D社 제품 인장 강도계(텐시론 RTC-1210A)를 이용하였다.

(4) 유연성

유연성의 측정을 위해서, 칼츠이스 제품, 마이크로 서져리용 현미경을 이용하여 육안으로 주름의 존재를 검출하였다. 안구 전면의 범위에서의 주름의 수를 3사람이 각각 측정하고, 그 평균에 의해 유연성을 평가하였다.

시험 결과를 도 3∼도 6에 나타낸다. 우선, 도 3에 도시된 바와 같이 트레할로스 처리·동결 건조 양막은 동결 건조 양막보다 두꺼운 것을 알 수 있다. 이는 트레할로스 처리에 의해 수분 유지능이 높아졌기 때문으로 생각된다. 또한, 상피층이 제거되어 있는 것을 반영하면, 트레할로스 처리·동결 건조 양막은 생 양막(AM)보다도 크게 얇다.

어어서, 도 4에 도시된 바와 같이 트레할로스 처리·동결 건조 양막은 동결 건조 양막보다 투명도가 높다. 이와 같이, 트레할로스 처리에 의해 투명성이 향상된다는 놀라운 사실이 명확해졌다. 트레할로스 처리·동결 건조 양막에 비하여 생 양막의 투명도가 떨어지는 것은 상피층의 존재에 의한 것이다.

한편, 도 5에 도시된 바와 같이 트레할로스 처리·동결 건조 양막은 동결 건조 양막보다 인장 강도가 높다. 놀랍게도, 상피를 구비하는 양막(생 양막)과 비교해도 트레할로스 처리·동결 건조 양막이 강도가 크다. 이와 같이, 트레할로스 처리는 양막의 강도를 높이기 위하여 대단히 효과적인 것이 명확해졌다.

또한, 도 6에 도시된 바와 같이 트레할로스 처리·동결 건조 양막의 유연성은 동결 건조 양막과는 크게 상이하고 생 양막과 동일하다. 이와 같이, 트레할로스 처리는 양막의 유연성을 높이기 위하여 대단히 효과적인 것이 명확해졌다.

3. 트레할로스 처리·동결 건조 양막의 생체 적합성 평가

생체에 이식되는 재료에는 생체 적합성이 높은 것이 요구된다. 여기에서, 트레할로스 처리·동결 건조 양막의 생체 적합성을 아래의 순서로 평가하였다.

6주령 일본 집토끼의 안구 표면으로부터 메스에 의하여 각막 실질층에 깊이 삽입하였다. 이어서, 적당한 크기의 트레할로스 처리·동결 건조 양막을 실질층의 벤 자국 내에 삽입하였다. 상기 이식 수술 후, 안구 표면의 상태를 시간 경과에 따라서 관찰하였다. 이식 직후 및 이식 후 1개월의 안구 표면의 상태를 도 7에 나타낸다. 이식 후 1개월에 있어서 주위에서의 신생 혈관 생성은 없고, 염증 반응도 관찰되지 않는다. 또한, 안구 표면의 투명성도 이식 직후와 비교하여 특히 향상되었다. 이러한 결과로부터 트레할로스 처리·동결 건조 양막의 생체 적합성은 미처리 양막과 동일한 것으로 판단되었다.

생체 적합성을 더욱 상세하기 조사하기 위해서, 이식 후 1개월의 시점에서, 이식부를 포함하는 각막의 일부를 적출해서 HE 염색에 제공하였다. HE 염색상을 도 8에 나타낸다. 이식편(즉, 트레할로스 처리·동결 건조 양막)을 화살표로 나타내었다. 도 8로부터 명확한 것과 같이, 상피의 분화 이상, 각막 내 신생 혈관 생성, 상피 부종, 및 세포 침윤은 모두 관찰되지 않았다. 이러한 결과로부터, 트레할로스 처리·동결 건조 양막은 항원성이 지극히 낮고, 생체 적합성이 우수한 것으로 확인되었다.

4. 트레할로스 처리·동결 건조 양막을 이용한 배양 각막 상피 시트의 제조

4-1. 각막 상피 세포의 회수

6주령 일본 백색 집토끼로부터 채취한 각막을 10% 소 태아 혈청(FBS)을 함유하는 DMEM에 침지하고, 결막, 각막 내피 등 불필요한 조직을 절제하였다. 이어서, 조직을 인산 완충액(PBS)으로 세정하고, 1.2U/ml 디스파제(Nacalai tesque社)를 함유하는 인산 완충액(PBS)에 37℃에서 1시간 침지하였다. 처리 후의 조직을 꺼내 어, 0.02% EDTA에 실온에서 2분간, 이어서 인산 완충액에 실온에서 2분간 침지하여 디스파제 활성을 정지시켰다. 10% 소 태아 혈청(FBS)을 함유하는 DMEM 중에서 각막 상피 세포를 소파한 후, 원심 처리에 의해 각막 상피 세포를 농축, 회수하였다.

4-2. 공(共)배양 세포의 조제

공배양의 세포(지지 세포)로서, NIH-3T3 세포(이하, "3T3 세포"로 약칭함)를 사용하였다. 사전에 배양하여 75F 플라스크(BD Falcon社)에서 콘플루언트(confluent)된 3T3 세포를 0.05% 마이토마이신 C 용액에 2시간 침지하여, 3T3의 증식 활성을 억제하였다. 이어서, 인산 완충액(PBS)으로 수회 세정하여 마이토마이신 C를 제거하였다. 세포를 0.05% 트립신 EDTA 용액으로 처리한 후, 피펫팅하여 세포 현탁액(3T3 세포 현탁액)으로 하였다.

4-3. 세포층의 형성

1.에서 얻어진 트레할로스 처리·동결 건조 양막을 충분히 복원될 때까지 실온에서 PBS에 침지하였다. 이렇게 조제한 양막을 기질로 하여 각막 상피 세포와 3T3 세포를 하기 순서로 공배양하였다. 배양 기구로서는 6well의 배양 접시(Corning社, NY)와 배양 인서트(배양 삽입 용기)(폴리카보네이트 재질, 평균 세공 크기 3.0㎛, Corning社, NY)를 이용하였다.

우선, 배양 접시 상에 약 1×10⁴개/cm²의 세포 밀도가 되도록 3T3 세포 현탁액을 파종하고, 37℃, 5% CO₂의 조건 하에서 배양하였다. 또한, 배양 인서트 상에 기저막측(상피가 존재했던 측)을 위로 하여 양막을 부착하고, 실온에서 10분간 건 조시켰다. 이어서, 양막을 부착한 배양 인서트 상에 약 1×10⁵개/cm²의 세포 밀도가 되도록 각막 상피 세포 현탁액을 파종하였다.

상기 조작 후, 도 9에 나타낸 바와 같이, 배양 인서트를 배양 접시 내에 설치하고, 3T3 세포와 각막 상피 세포를 동일한 배지 중에서 배양하였다. 또한, 도 9는 배양 중의 상태를 나타내는 모식 단면도이다. 배양 접시(11) 내에 배양 인서트(12)가 정치되고, 배양 접시(11) 저면에는 3T3 세포층(15)이 형성된다. 또한, 배양 인서트(12)의 저면 상에 양막(13)이 정치되고, 그 위에 각막 상피 세포(14)가 배양되는 상태를 나타낸다. 부호 16은 배지이다.

배지에는, DMEM/햄 F12 혼합 배지(혼합 부피비 1:1)에, 10% FBS, 인슐린(5mg/ml), 콜레라톡신(0.1nM), 페니실린스트렙토마이신(50IU/ml), 인간 재조합 상피 세포 증식 인자(EGF)(10ng/ml)을 첨가한 것을 사용하였다.

상기 배지 중에서 3주일 배양하였다(Submerge). 이어서, 점막 상피의 분화를 유도하기 위하여, 소위 에어-리프팅법을 이용하여 1주일 배양하였다. 에어-리프팅법은 배지의 액면을 양막 상에 형성된 각막 상피 세포 유래의 세포층면까지로 하고, 해당 세포층의 표면을 공기 중에 노출하는 방법이다. Submerge 중에는 격일간으로 배지를 교환하고, 에어-리프팅 후에는 매일 배지를 교환하여 배양하였다. 그 결과, 양막 상에 세포층이 형성되었다.

5. 배양 각막 상피 시트의 조직학적 특성의 검증

에어-리프팅 후, 2일간 배양한 시점에서, 각막 상피와 유사한 세포층이 형성 되었다(도 10 우측란). 세포층에서는 정상 각막 상피와 동일하게 5∼7층으로 세포가 중층화되어 있는 것을 알 수 있다. 이 세포층의 양막측에는 비교적 원주형의 기저 세포 유사 세포군이 존재하고 있었다. 또한, 최표층의 세포는 편평형을 나타내고 있지만 핵을 가지고 있어서, 피부와는 달라 그 표면은 각화되지 않았다. 이렇게, 양막 상에 각막 상피 유사 세포층(각막 상피층)이 형성되어 있는 것이 확인되었다. 또한, 트레할로스 처리를 실시하지 않고 동결 건조한 양막(동결 건조 양막)을 기질로서 동일하게 각막 상피 세포를 배양할 경우, 세포층은 형성되지만, 1∼2층의 중층화만이 인지되었다(도 10 좌측란). 이러한 점에서, 트레할로스 처리를 실시한 동결 건조 양막은 각막의 정상 분화를 촉진시키는 기능을 발휘한다고 할 수 있다.

이어서, 세포층의 조직학적 특성을 더욱 검토하기 위하여 면역 염색을 행하였다. 우선, 얻어진 세포층을 양막과 함께 적절한 크기로 절제해서 OCT compound에 동결 포매(frozen-embedded)하였다. 이어서, 크라이오스탯(cryostat)으로 얇게 썰어서, 슬라이드 절편을 제조하였다. 면역 염색시에는, 대표적인 세포 골격 단백인 케라틴 관련 검토를 행하였다. 즉, 각막 특이적인 케라틴 3, 표피 특이적인 케라틴 10, 및 결막 특이적인 케라틴 13의 발현을 조사하였다. 방법은 아래와 같다. 슬라이드 절편을 인산 완충액(PBS)으로 세정한 후, 1% 소 태아 혈청(FBS)으로 블록킹하여 비특이적인 항체 반응을 억제하였다. 이러서, 각 케라틴에 대한 항체(1차 항체)를 실온에서 1시간 반응시켰다. 반응 후 triton-X 함유 PBS로 15분, 3회의 조건으로 세정하고, 계속하여 형광 표식화 항체(2차 항체)를 실온에서 1시간 반응 시켰다. 반응 후, 인산 완충액(PBS)으로 15분, 3회의 조건으로 세정하고, 봉입한 후 공초점 현미경(confocal microscope)으로 조직을 관찰하였다.

세포층에 대한 각종 케라틴의 항체 반응은 아래와 같다. 우선, 표피 특이적 케라틴 10, 및 결막 특이적 케라틴 13에 대한 염색성은 모두 확인되지 않았다(도 11 하단). 한편, 각막 특이적 케라틴 3에 대한 염색성이 광범위하게 확인되었다(도 11 상단 우측). 케라틴 3에 대한 염색성은 세포층의 상부에서 강하다. 이상의 결과로부터, 정상 각막 상피와 유사한 상피 세포층이 형성되어 있음을 확인할 수 있었다.

6. 배양 각막 상피 시트를 이용한 이식 실험

4.에서 제조된 양막 상에 각막 상피의 세포층이 형성된 시트(배양 각막 상피 시트)를 이용하여 아래의 이식 실험을 행하였다.

우선, 각막 상피 세포를 채취한 집토끼에 대하여, 윤부로부터 4mm 외측으로부터 크레센트 나이프를 이용하여 각막 및 결막 상피를 100㎛의 두께로 모두 제거하였다. 이 조작에 의해 각막 상피 줄기 세포를 포함하는 상피 세포가 존재하지 않게 되므로, 인위적인 안구 표면 줄기 세포 피폐증이 재현된다고 생각할 수 있다.

이어서, 배양 각막 상피 시트를 윤부로부터 다소 내측의 영역으로 이식하였다. 이식시에는 10-0 나일론 실을 이용하여 주위의 조직에 봉합하였다. 이식 후, 이식편 상에 치료용 소프트 콘택트 렌즈를 봉합하였다. 수술 후, 항생제 및 스테로이드 눈 연고를 2회/일 도포하였다. 이식 후의 시점에서 안구 표면은 이식 전의 배양 각막 상피 시트와 동일한 투명도를 나타내었다.

이식 수술을 시행한 안구 표면을 이식 후 2일 및 14일에 관찰하였다. 동시에, 플루오레세인 염색 시험을 실시하였다. 또한, 플루오레세인 염색 시험은, 플루오레세인 시험지에 항생제의 점안(点眼) 등의 수분을 포함시켜서 직접 안구 표면에 도포하고, 2, 3번 깜박거리게 한 후, 안구 표면의 플루오레세인 염색성을 관찰함으로써 행하였다. 각막 상피가 잔존하면, 치밀한 세포간 접착 구조에 의해 플루오레세인 색소가 침윤되지 않고, 플루오레세인에 의한 염색이 보이지 않는다.

이식 후 2일에 있어서, 안구 표면은 투명성을 유지하고 있었다(도 12 상단 좌측). 또 플루오레세인 염색에 의해, 배양 각막 시트가 안구 표면에 손상 없이 잔존하고 있는 것이 확인되었다(도 12 하단 좌측). 한편, 이식한 배양 각막 상피 시트가 플루오레세인 염색성을 나타내지 않음으로써, 배양 각막 상피 시트가 각막 상피와 동일한 배리어 기능을 갖추고 있는 것이 확인되었다. 게다가, 이식한 배양 각막 상피 시트의 주위에서는 전체 주위에 걸쳐서 플루오레세인의 염색성이 확인되었고, 이식부에 존재하는 조직이 주위의 잔존 결막 상피의 오염이 아닌 것이 확인되었다.

또한, 통상적인 각막 상피에서는 세포가 서로 치밀한 접착 구조로 결합하고 있기 때문에, 그 표면에서 플루오레세인의 색소가 침윤되지 않는다. 즉, 플루오레세인 염색 시험에 있어서 염색성을 나타내지 않는다. 한편, 새포간 접착이 느슨해지거나, 세포 자체가 박리되어 배리어 기능이 손상되었을 경우에는, 플루오레세인 색소의 침윤이 발생하여 조직이 염색된다. 따라서, 플루오레세인 염색에 의한 염색성을 조사함으로써, 이식한 배양 각막 상피 시트가 각막 상피와 동일한 배리어 기능을 갖출 수 있을지의 여부를 확인할 수 있다.

한편, 이식 후 14일에 있어서도 배양 각막 상피 시트는 안구 표면에 잔존하고 있으며, 게다가 이식 후 2일의 상태에 비하여 주위로 진행되고, 안구 표면 전체를 피복하고 있는 것이 확인되었다(도 12 상단 우측). 또한, 안구 표면은 플루오레세인 염색성을 나타내지 않으며, 배양 각막 상피 시트가 배리어 기능을 유지하고 있는 것이 확인되었다(도 12 하단 우측). 투명성에 있어서도 이식 후 2일의 시점과 변화없이, 여전히 높은 투명성이 유지되어 있었다(도 12 상단 우측).

이상의 결과로부터, 트레할로스 처리·동결 건조 양막을 기질로 하여 얻어지는 배양 각막 상피 시트는 안구 표면에 대한 양호한 생착성을 구비하고, 이는 장기간에 걸쳐서 유지되는 것이 실증되었다. 또한, 이식 후에 주위로 진행되는 동시에, 각막 상피로서 필요한 배리어 기능을 장기간에 걸쳐서 발휘하고, 동시에 높은 투명성을 유지하는 것도 확인되었다. 즉, 상기 방법으로 얻어지는 배양 각막 상피 시트는 각막 상피의 대체로서 양호하게 기능하며, 각막의 손상, 훼손 등의 경우에 안구 표면을 재건하기 위한 이식 재료로서 바람직하게 이용할 수 있는 것이 확인되었다.

7. 이식 후의 배양 각막 상피 시트의 조직학적 특성 평가

이어서, 이식 후 2주의 배양 각막 상피 시트를 적출하고, 그 조직학적 특성을 검토하였다. 도 13의 상단 좌측에 배양 각막 상피 시트의 HE 염색상을 나타낸다. 트레할로스 처리·동결 건조 양막(TH-AM, 기호 **) 상에 정상 각막 상피와 같이 세포가 규칙적으로 정렬되어 구성된 세포층을 확인할 수 있다. 이 세포층은 상 층 정도에 편평형 세포가 많고, 각막 상피와 지극히 유사한 구조를 유지하고 있다.

도 13의 상단 우측 및 하단에, 각종 케라틴에 대한 염색 시험의 결과를 나타낸다. 대략, 이식 전의 배양 각막 상피 시트와 동일한 염색성을 나타내었다. 즉, 표피 특이적 케라틴 10, 및 결막 특이적 케라틴 13에 대한 염색성은 모두 확인되지 않고(도 13 하단), 각막 특이적 케라틴 3에 대한 염색성이 세포층 전체적으로 확인되었다(도 13 상단 우측). 이상과 같이, 배양 각막 상피 시트는 이식 후에 있어서도, 각막 특이적인 케라틴을 유지하고 있는 것이 확인되었다. 이러한 결과는, 배양 각막 상피 시트가 각막 상피와 동일한 기능을 장기간에 걸쳐서 발휘할지의 여부를 조직학적 견지로부터 강하게 지지하는 것이다.

8. 기저막 성분 및 치밀층 성분에 대한 면역 염색

세포 배양용 기질로서 양막이 양호하게 작용하기 위해서는 기저막 및 치밀층이 그 본래의 구조를 유지하고 있는 것이 바람직한 것으로 생각된다. 기저막 및 치밀층이 그 본래의 구조를 유지하고 있는지의 여부는, 각각에 대하여 특징적인 성분의 유무(잔존하고 있는지의 여부)를 조사함으로써 평가할 수 있다. 여기에서, 트레할로스 처리·동결 건조 양막에 있어서 기저막 성분 및 치밀층 성분이 잔존하고 있는지의 여부를 아래에 나타내는 면역 염색법으로 조사하였다. 또한, 상피 처리, 트레할로스 처리, 및 동결 건조 처리를 행하지 않은 양막(생 양막)과, 트레할로스 처리를 행하지 않은 것 이외에는 트레할로스 처리·동결 건조 양막과 동일한 방법으로 조제한 양막(동결 건조 양막)을 비교 대상으로 하였다.

우선, 각 양막을 각각 1.5×1.5cm의 크기로 절단하고, OCT 컴파운드로 포매 하고, -80℃로 동결하여 동결 표본으로 하였다. 이 표본을 동결 상태로 쿠리오스텟(CM1900 Leica社 제품)을 사용하여 두께 8㎛로 양막면에 대하여 수직 방향으로 절단하고, 슬라이드 글라스 상에 장착하여 동결 절편을 제조하였다. 이 절편을 이용하여 아래의 순서로 면역 염색을 행하였다.

1. 아세톤 고정 5분, 2. PBS세정 30분, 3. PBS/3% BSA에 의한 블록킹 15분, 4. 1차 항체 1시간, 5. PBS 세정 30분, 6. PBS/3% BSA에 의한 블록킹 15분, 7. 2차 항체 1시간, 8. PBS 세정 30분, 9. 봉입.

봉입 후의 샘플을 형광 현미경(Leica DMIRB) 하에서 관찰하였다.

또한, 사용한 항체는 아래와 같고, 적용량은 각 제조사의 메뉴얼을 따랐다.

콜라겐 I(Collagen I): LSL LB-1190, 콜라겐 III(Collagen III): LSL LB1300, 콜라겐 IV(Collagen IV): LSL LB-1407, 콜라겐 V(Collagen V): LSL LB1581, 콜라겐 VII(Collagen VII) :Chemicon MAB1345, 라미닌 5(Laminin-5): Chemicon MAB19562, 피브로넥틴(Fibronectin): LSL LB-1021.

양막 기저막층에는 콜라겐 IV, VII, 라미닌 5, 치밀층에는 콜라겐 I, III, V, 피브로넥틴이 발현되어 있다. 따라서 각 항체에서의 면역 염색을 행함으로써, 양막 기저막과 치밀층의 잔존을 관찰할 수 있다. 그리고, 본 실험에서는 PI 염색도 행하므로, 양막 상피 세포의 유무에 대해서도 동시에 판별할 수 있다.

면역 염색의 결과를 도 14에 나타낸다. A 열이 생 양막의 염색상, B 열이 동결 건조 양막의 염색상, C 열이 트레할로스 처리·동결 건조 양막의 염색상이다. 각 열에 있어서 위로부터 순서대로 (1) 콜라겐 I의 염색상, (2) 콜라겐 III의 염색 상, (3) 콜라겐 IV의 염색상, (4) 콜라겐 V의 염색상, (5) 콜라겐 VII의 염색상, (6) 라미닌 5의 염색상, (7) 피브로넥틴의 염색상이다.

염색 결과로부터 다음 사항이 명확해졌다. 우선, 동결 건조 양막에 비하여, 트레할로스 처리·동결 건조 양막에서는 기저막 성분(콜라겐 IV, 콜라겐 VII, 라미닌 5)의 신호가 강하고, 즉 기저막 성분에 관한 염색성이 생 양막의 염색성과 유사하다. 이는 트레할로스 처리·동결 건조 양막에서는 기저막이 본래의 구조를 고도로 유지하고 있음을 시사한다.

일부의 염색 결과(콜라겐 IV, 피브로넥틴)에 있어서, 동결 건조 양막에서는 전체적으로 걸쳐서 염색성이 확인되지만, 트레할로스 처리·동결 건조 양막에서는, 생 양막과 동일하게 염색되는 부위와 염색되지 않는 부위의 경계가 비교적 명확하다. 이는 트레할로스 처리·동결 건조 양막에서는, 기저막과 치밀층이 각각 본래의 구조를 고도로 유지하고 있음을 시사한다.

치밀층에 관한 염색 결과로부터 명확한 바와 같이, 트레할로스 처리·동결 건조 양막의 치밀층은 동결 건조 양막의 치밀층에 비하여 두껍다. 이러한 점으로부터, 트레할로스 처리를 실시함으로써, 습윤 상태로 되돌렸을 때, 치밀층이 양호하게 팽윤하고, 생 양막에 가까운 두께로 회복됨을 알 수 있다.

이상과 같이, 트레할로스 처리·동결 건조 양막은 기저막 및 치밀층의 구조가 생 양막의 구조와 유사하다는 것이 명확해졌다. 즉, 트레할로스 처리를 실시함으로써, 동결 건조시에 기저막 및 치밀층의 구조가 손상되는 것을 방지할 수 있고, 생 양막과 유사한 구조의 기저막 및 치밀층을 구비한 양막이 얻어지는 것이 확인되 었다.

9. 상피 제거법의 검토

도 15에 나타낸 순서로 양막을 처리하여 상피가 제거된 양막(상피 비함유 양막)을 조제하였다. 이하, 각 공정의 사용 방법(처리 방법), 조작 조건(처리 조건) 등을 상세하게 설명한다.

9-1. 양막의 채취

양막은, 전신적 합병증이 없는 제왕 절개 예정의 임산부에 대하여 사전에 산부인과 의사와 함께 충분하게 설명하여 동의를 구한 후, 수술실에서 제왕 절개시에 채취하였다. 조작은 청결하게 주의하여, 수술 조작에 준하여 손을 씻은 후에 전용 가운을 착용하였다. 분만 전에 청결한 양막 채취용 배트와 세정용 생리 식염수를 준비하였다. 분만 후에 태반 조직을 배트에 옮기고, 수작업으로 양막 조직을 태반으로부터 박리하였다. 양막과 태반의 유착이 강한 부분은 가위로 절제하였다.

9-2. 혈액 성분의 제거, 융모막의 박리

우선, 채취한 양막에 부착된 혈액 성분을 생리 식염수로 세정하면서 제거하고, 추가적으로 충분한 량의 생리 식염수(0.005% ofloxacin 첨가)로 세정하였다. 이어서 양막에 접착되어 있는 융모막을 수작업으로 제거하였다.

9-3. 양막의 고정

도 2b에 나타낸 방법으로 양막을 고정하였다. 우선, 상피측이 위쪽이 되도록 양막을 멸균된 플루오르 수지 시트에 탑재하였다. 이어서, 주름, 느슨함이 없도록 양막을 펴고, 멸균된 플루오르 수지 시트 프레임을 양막에 탑재하였다. 클립 등을 이용하여 플루오르 수지 시트와 플루오르 수지 시트 프레임을 고정하였다. 이에 의해 양막은 플루오르 수지 시트와 플루오르 수지 시트 프레임에 협지된 상태가 된다(프레임 고정). 외측으로 새어나온 여분의 양막을 절단 제거하였다. 실태 현미경 하에서 관찰하여, 상피측이 위쪽이 되어 있음을 확인하였다.

9-4. 동결 융해 처리

프레임 고정된 양막을 -80℃의 디프 프리저 내로 옮기고, 약 30분 방치하였다(동결). 디프 프리저로부터 낸 후, 37℃의 배양기 내로 옮기고, 약 30분 방치하였다(융해). 이상의 조작을 한번 더 행하였다.

9-5. 트립신 처리

동결 융해 처리 후, 트립신 용액(0.02% 트립신, 0.2mM EDTA 함유 인산 완충액)에 양막의 상피측을 침지하여 약 15분간 방치하였다(37℃). 침지 방법은 도 16a에 나타낸 방법을 채용하였다. 즉, 프레임 고정된 양막(10)을 플루오르 수지 시트(4)가 아래가 되도록 유지한 상태로 트립신 용액(5)을 플루오르 수지 시트 프레임(3) 내에 첨가하였다. 이에 의해, 양막(10)의 상피 부분만이 트립신 용액(5)에 침지된다. 또한, 도 16b에 나타낸 바와 같이, 프레임 고정된 양막(10)을, 그 상피측이 아래가 되도록 용기(6) 내에 넣음으로서 트립신 용액(5)에 침지할 수도 있다. 이 예에서는 용기(6)의 내측에 형성된 돌기(7)에 플루오르 수지 시트 프레임(3)이 걸리게 함으로써, 트립신 용액(5)의 액면(5a)과 양막(10)이 원하는 위치가 되도록 하고 있다.

9-6. 세정

트립신 처리 후의 양막을 플루오르 수지 시트 및 플루오르 수지 시트 프레임으로부터 분리하여 PBS 중으로 옮기고, 진탕하여 세정하였다(140rpm 15분, 2회). 이 조작에 의해 트립신 용액 및 양막 상피 세포가 제거된다.

9-7. 동결 건조

세정 후의 양막을 한 쌍의 멸균된 플라스틱 프레임으로 협지한 후, 클립으로 고정하였다. 프레임과 함께 -80℃의 디프 프리저 내로 옮기고, 양막이 동결한 것을 확인한 후, 진공 동결 건조기(Yamato, NEOCOOL)를 이용하여 동결 건조 처리(-110℃, 약 1시간)를 행하였다. 사용 설명서를 따라서 충분한 건조체가 얻어지도록 조건 설정하였다. 동결 건조 처리 후의 양막을 플라스틱 프레임으로부터 분리하고, 외측이 폴리아미드 나일론, 내측이 폴리에틸렌으로 형성된 2층 구조 자루에 옮기고, 가정용 진공팩기(프레임노바, 매직팩)를 이용하여 진공 포장하였다. 이렇게 얻어진 진공팩 상태의 양막에 γ선을 조사하여(약 25kGy) 멸균하였다. 멸균 처리 후의 양막을 진공팩 상태로 사용 직전까지 상온 보존하였다.

9-8. 동결 융해 처리 및 트립신 처리에 의한 상피 제거법의 평가

상기 양막 상피 제거법을 아래의 방법으로 평가하였다. 평가 실험에는, 트립신 처리 후, 세정하여 얻어지는 상피 비함유 양막(트립신 처리 양막)을 사용하였다.

(1) HE 염색

상피 비함유 양막(트립신 처리 양막)을 다음 순서로 HE 염색하였다. 또한, 상피를 제거하지 않은 양막(생 양막)과 수작업으로 상피를 제거한 양막(수작업 처 리 양막)을 비교 대상으로 하였다.

우선, 상피 비함유 양막(트립신 처리 양막), 생 양막, 수작업으로 상피를 제거한 양막(수작업 처리 양막)을 각각 1.5×1.5cm의 크기에 절단하고, OCT 컴파운드로 포매하고, -80℃로 동결하여 동결 표본으로 하였다. 이 표본을 동결 상태로 쿠리오스텟(CM1900 Leica社 제품)을 사용하여 두께 8㎛로 양막면에 대하여 수직 방향으로 절단하고, 슬라이드 글라스 상에 장착하여 동결 절편을 제조하였다.

HE 염색의 순서 및 조건은 아래와 같다. 1. 10% 포르말린액 5분, 2. 유수 세정 15분, 3. 헤마톡실린액 10초, 4. 유수 세정 15분, 5. 에오신액 10초, 6. 유수 세정 15분, 7. 70% 에탄올 10초, 8. 90% 에탄올 10초, 9. 95% 에탄올 10초, 10. 100% 에탄올 10초, 11. 100% 크실렌 10초, 12. 100% 크실렌 30분, 13. 봉입.

봉입 후의 샘플을 광학 현미경(Olympus BX50) 하에서 관찰하였다.

양막을 이용하여 헤마톡실린으로 염색할 경우, 양막 상피 세포와 치밀층 유핵 세포가 염색된다. 한편, 에오신으로 염색하면 치밀층이 염색된다. 따라서, HE 염색에 의하면, 상피 세포의 박리의 유무, 치밀층의 손상 유무를 판별할 수 있다.

HE 염색 결과를 도 17에 나타낸다. 생 양막에서는 세포층(상피)을 확인할 수 있다. 트립신 처리 양막에서는 수작업 처리 양막과 동일하게 세포층(상피)은 관찰되지 않는다. 이 결과로부터 상기 방법에 의하면 상피를 완전히, 또한 얼룩 없이 제거할 수 있는 것이 확인되었다. 또한, 치밀층의 손상은 확인되지 않았다.

(2) 기저막 성분 및 치밀층 성분에 대한 면역 염색

세포 배양용 기질로서 양호하게 작용하기 위해서는, 상피층이 완전히 제거되 어 있을 뿐만 아니라, 기저막 및 치밀층이 그 본래의 구조를 유지하고 있는 것이 바람직한 것으로 생각된다. 기저막 및 치밀층이 구조를 유지하고 있는지의 여부는, 각각에 대하여 특징적인 성분의 유무(잔존하고 있는지의 여부)를 조사함으로써 평가할 수 있다. 여기에서, 트립신 처리 양막에 있어서 기저막 성분 및 치밀층 성분이 잔존하고 있는지의 여부를 아래에 나타내는 면역 염색법으로 조사하였다. 또한, HE 염색의 경우과 동일하게, 상피를 제거하지 않은 양막(생 양막)과 수작업으로 상피를 제거한 양막(수작업 처리 양막)을 비교 대상으로 하였다.

양막의 동결 절편의 제조 방법은 HE 염색의 경우와 동일하다. 이 절편을 이용하여 아래의 순서에 의해 면역 염색을 행하였다.

1. 아세톤 고정 5분, 2. PBS 세정 30분, 3. PBS/3% BSA에 의한 블록킹 15분, 4. 1차 항체 1시간, 5. PBS 세정 30분, 6. PBS/3% BSA에 의한 블록킹 15분, 7. 2차 항체 1시간, 8. PBS 세정 30분, 9. 봉입.

봉입 후의 샘플을 형광 현미경(Leica DMIRB) 하에서 관찰하였다.

또한, 사용한 항체는 아래와 같고, 적용량은 각 제조사의 메뉴얼을 따랐다.

콜라겐 I(Collagen I): LSL LB-1190, 콜라겐 III(Collagen III): LSL LB1300, 콜라겐 IV(Collagen IV): LSL LB-1407, 콜라겐 V(Collagen V): LSL LB1581, 콜라겐 VII(Collagen VII): Chemicon MAB1345, 라미닌 5(Laminin-5): Chemicon MAB19562, 피브로넥틴(Fibronectin): LSL LB-1021.

양막 기저막층에는 콜라겐 IV, VII, 라미닌 5, 치밀층에는 콜라겐 I, III, V, 피브로넥틴이 발현되어 있다. 따라서, 각 항체에서의 면역 염색을 행함으로써 양막 기저막과 치밀층의 잔존을 관찰할 수 있다. 그리고 본 실험에서는 PI 염색도 행하므로, 양막 상피 세포의 유무에 대해서도 동시에 판별할 수 있다.

면역 염색의 결과를 도 18∼도 21에 나타낸다. 도 18 및 도 19는 트립신 처리 양막의 면역 염색상, 도 20은 생 양막(상피가 있는)의 면역 염색상, 도 21은 수작업 처리 양막의 면역 염색상이다. 면역 염색의 결과를 정리한 표를 도 22에 나타내었다. 이들 결과로부터 명확한 바와 같이 트립신 처리 양막에서는, 기저막 성분, 치밀층 성분도 수작업 처리 양막과 동일한 정도로 잔존하고 있다. 즉, 상기 처리 방법에 의하면, 종래의 수작업 처리 방법과 동일하게 기저막 성분 및 치밀층 성분을 잔존시킬 수 있다.

9-9. 정리

이상의 실험 결과로부터, 동결 융해 처리와 트립신 처리를 조합한 방법으로 양막을 처리하면, 양막의 기저막 및 치밀층을 실질적으로 손상시키지 않고(즉, 본래의 구조를 양호하게 유지한 상태로), 상피를 완전히 제거할 수 있음이 확인되었다.

본 발명의 시트형 조성물은 조직 재건용 이식 재료, 유착 방지제 등으로서 광범위한 영역에서 이용될 수 있다. 본 발명의 시트형 조성물의 적용 영역으로서 안과 영역, 소화기 외과 영역, 산부인과 영역, 피부과 영역을 예시할 수 있다.

본 발명은 상기 발명의 실시 형태 및 실시예의 설명에 전혀 한정되지 않는다. 특허 청구의 범위의 기재를 일탈하지 않으면서, 당업자가 용이하게 생각할 수 있는 범위에서 각종 변형 태양도 본 발명에 포함된다.

본 명세서에서 명시한 논문, 공개 특허 공보, 및 특허 공보 등의 내용은 그 모든 내용을 원용에 의해 인용한다.

Claims (27)

1. 트레할로스(trehalose)를 부가한 양막(羊膜)을 포함하는 시트형 조성물.
2. 제1항에 있어서,

   동결 상태 또는 건조 상태인 것을 특징으로 하는 시트형 조성물.
3. 제2항에 있어서,

   동결 건조 상태인 것을 특징으로 하는 시트형 조성물.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,

   상기 양막이 상피 세포층이 제거된 양막인 것을 특징으로 하는 시트형 조성물.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,

   상기 양막은 기저막 성분인 콜라겐 IV, 콜라겐 VII, 및 라미닌 5가 미처리 양막과 동등한 강도로 검출되는 양막인 것을 특징으로 하는 시트형 조성물.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,

   상기 양막이 인간 양막인 것을 특징으로 하는 시트형 조성물.
7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,

   생체 유래 세포로부터 형성된 세포층이 상기 양막 상에 형성되어 있는 것을 특징으로 하는 시트형 조성물.
8. 제7항에 있어서,

   상기 세포층에 있어서 상기 생체 유래 세포가 중층화되어 있는 것을 특징으로 하는 시트형 조성물.
9. 제7항에 있어서,

   상기 생체 유래 세포는 각막 상피, 결막 상피, 피부 표피, 모낭 상피, 구강 점막 상피, 홍채 색소 상피, 망막 색소 상피, 기도 점막 상피 또는 장관(腸管) 점막 유래의 세포인 것을 특징으로 하는 시트형 조성물.
10. 제7항에 있어서,

    상기 세포층은 약 5∼7층으로 중층화된 세포로부터 구축되며, 각막 상피와 유사한 성질을 구비하는 것을 특징으로 하는 시트형 조성물.
11. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,

    유착(癒着) 방지용 재료 또는 수술 침습(侵襲)에 의한 장기 또는 기관의 표 면 조직 장해의 재건용 재료로서 사용되는 것을 특징으로 하는 시트형 조성물.
12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,

    상기 양막의 융모막측 표면에 접착 성분이 부착되어 있는 것을 특징으로 하는 시트형 조성물.
13. 제12항에 있어서,

    상기 접착 성분이 피브리노겐(fibrinogen) 및 트롬빈(thrombin)인 것을 특징으로 하는 시트형 조성물.
14. 제12항에 있어서,

    상기 접착 성분이 피브리노겐, 트롬빈 및 아프로티닌(aprotinin)인 것을 특징으로 하는 시트형 조성물.
15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,

    상기 양막의 융모막측 표면이 생체 흡수성 재료로 피복되어 있는 것을 특징으로 하는 시트형 조성물.
16. 제1항 내지 제15중 어느 한 항에 따른 시트형 조성물을 이식 재료로서 사용하는 이식 방법.
17. 하기 단계를 포함하는 시트형 조성물의 제조 방법:

    (a) 양막을 조제하는 단계;

    (b) 상기 양막에 트레할로스를 부가하는 단계.
18. 제17항에 있어서,

    하기 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 제조 방법:

    (c) 단계 b 후에 동결 처리 또는 건조 처리하는 단계.
19. 제18항에 있어서,

    하기 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 제조 방법:

    (d) 단계 c 후에 멸균 처리하는 단계.
20. 제17항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서,

    상기 단계 a는 하기 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 제조 방법:

    (a1) 양막으로부터 상피를 제거하는 단계.
21. 제20항에 있어서,

    상기 단계 a1은 하기 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 제조 방법:

    (1) 생체로부터 분리된 양막을 준비하는 단계,

    (2) 상기 양막에 동결 융해 처리를 행하는 단계,

    (3) 동결 융해 처리 후의 양막에 트립신 처리를 행하는 단계,

    (4) 트립신 처리 후의 양막을 세정하는 단계.
22. 제21항에 있어서,

    상기 동결 융해 처리에 있어서, 동결 온도는 약 -20℃∼약 -80℃이며, 융해 온도는 약 4℃∼약 50℃인 것을 특징으로 하는 제조 방법.
23. 제21항 또는 제22항에 있어서,

    상기 동결 융해 처리를 2회 이상 반복하여 행하는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
24. 제20항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서,

    상기 트립신 농도는 약 0.01%(w/v)∼약 0.05%(w/v)의 트립신 용액을 사용하여 상기 트립신 처리를 행하는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
25. 제24항에 있어서,

    상기 트립신 용액은 EDTA, NTA, DTPA, HEDTA, GLDA 및 이들 임의의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 킬레이트제를 약 0.1mM∼약 0.6mM 함유하는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
26. 제20항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서,

    상기 양막 상피측에만 트립신 용액이 접촉하는 조건 하에서 상기 트립신 처리를 행하는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
27. 제20항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서,

    상기 단계 b 후에, 하기 단계가 행해지는 것을 특징으로 하는 제조 방법:

    (A) 생체 유래 세포로부터 형성된 세포층을 상기 양막 상에 형성하는 단계.

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