CN112063577A - 用于胰岛培养的组合培养基及其制备方法 - Google Patents

用于胰岛培养的组合培养基及其制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN112063577A
CN112063577A CN202010819023.0A CN202010819023A CN112063577A CN 112063577 A CN112063577 A CN 112063577A CN 202010819023 A CN202010819023 A CN 202010819023A CN 112063577 A CN112063577 A CN 112063577A
Authority
CN
China
Prior art keywords
culture medium
amnion
culture
islet
amniotic membrane
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202010819023.0A
Other languages
English (en)
Other versions
CN112063577B (zh
Inventor
杨召铭
张佳林
郭庭维
林建贞
李峰
张城硕
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
First Hospital of China Medical University
Original Assignee
First Hospital of China Medical University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by First Hospital of China Medical University filed Critical First Hospital of China Medical University
Priority to CN202010819023.0A priority Critical patent/CN112063577B/zh
Publication of CN112063577A publication Critical patent/CN112063577A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN112063577B publication Critical patent/CN112063577B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0676—Pancreatic cells
    • C12N5/0677—Three-dimensional culture, tissue culture or organ culture; Encapsulated cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/70—Undefined extracts
    • C12N2500/80—Undefined extracts from animals
    • C12N2500/84—Undefined extracts from animals from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/998—Proteins not provided for elsewhere

Landscapes

  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种用于胰岛培养的组合培养基及其制备方法，所述培养基包括以下原料制成：CMRL1066培养基、BSA以及羊膜提取物。本发明的新型组合培养基是将人羊膜进行液氮研磨、超声匀浆、梯度离心、过滤除菌得到含羊膜提取物的培养基，含羊膜提取物新型组合培养基能有效保护胰岛体外存活及功能。

Description

用于胰岛培养的组合培养基及其制备方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种用于胰岛培养的组合培养基及其制备方法。
背景技术
糖尿病是一种由于自身胰岛细胞破坏导致胰岛素生成不足或受体细胞对胰岛素产生抵抗而使胰岛素的代谢产生缺陷的葡萄糖、蛋白质及脂质代谢紊乱的综合征，主要分为1型糖尿病和2型糖尿病。自Edmonton Protocol发布以来，胰岛移植由于其相对于成体器官移植来说创伤小、又能取得可靠的移植效果而被视为治疗1型糖尿病和部分2型糖尿病的有效方法之一。
目前，在临床胰岛移植中为了胰岛的进一步纯化、胰岛质量的检测、胰岛的运输转移以及受体的免疫诱导，胰岛从被实验员在供体胰腺中提取出来到被外科医师移植到受体前需要在体外培养24-72小时，大多数移植中心采取的培养时间为48小时。在这段体外培养时间内，有超过20％的胰岛丢失。研究表明，胰岛在体外培养中主要的丢失原因为无血清引发的炎症反应。目前临床上用于体外胰岛培养的培养基为CMRL1066+0.625％HSA,0.625％HSA为胰岛的存活提供一定的渗透压，但缺少血清中的各种有利于胰岛细胞存活的细胞因子。
基础研究表明CMRL1066+10％FBS更适用于体外胰岛培养，但是由于动物源性而不被临床采用。人血清中含有细胞因子，但是同时存在和胰岛细胞发生免疫反应的细胞因子，容易导致胰岛细胞损坏。因此，亟需研究一种新的人胰岛体外培养组合培养基。
发明内容
为此，本发明提供用于胰岛培养的组合培养基及其制备方法。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
本发明提供一种用于胰岛培养的组合培养基，所述培养基包括以下原料制成：CMRL1066培养基、BSA以及羊膜提取物。
本发明的一个实施例中，所述BSA的质量百分数为0.625％。
本发明的一个实施例中，所述羊膜提取物蛋白的质量浓度为0.1-1.0mg/mL。
本发明还提供一种制备所述的用于胰岛培养的组合培养基的方法，其包括：向所述CMRL1066培养基中添加BSA和羊膜提取物，混合均匀，得到所述组合培养基。
本发明的一个实施例中，所述羊膜提取物的添加方法为：
用含青霉素和链霉素的PBS溶液清洗羊膜，将清洗后的羊膜切碎研磨成羊膜颗粒，将所述羊膜颗粒加入到CMRL1066基础培养基中，4℃超声匀浆，将超声匀浆物离心，取上清液，将所述上清液过滤后，得到滤液，再向所述滤液中添加BSA后，得到所述组合培养基。
本发明的一个实施例中，所述羊膜颗粒与所述CMRL1066培养基的质量体积比为1:2。
本发明的一个实施例中，所述超声匀浆过程中，匀浆机转速为10000rpm，超声匀浆温度为4℃，超声匀浆时间为1h。
本发明的一个实施例中，所述离心为梯度离心，先4000g离心10min后，提取上清液，将所述上清液再15000g离心5min后，再提取上清液，离心温度为4℃。
本发明的一个实施例中，所述青霉素的浓度为1000IU/ml，所述链霉素的浓度为0.1mg/ml。
本发明实施例中基于以下机理：吖啶橙(Acridine Orange,AO)可以透过活细胞膜，嵌入细胞核DNA，使之发出明亮的绿色荧光；溴乙锭(Ethidium Bromide，EB)不能透过活细胞膜，仅能通过受损的细胞膜，嵌入细胞核DNA或RNA，使之发红色荧光。因此绿色为活细胞，橙色为死细胞。正常胰岛细胞在高糖(16.8mM)刺激下会分泌大量胰岛素，功能受损的细胞胰岛素分泌量下降。
本发明具有如下优点：
本发明的新型组合培养基是将人羊膜进行液氮研磨、超声匀浆、梯度离心、过滤除菌得到含羊膜提取物的培养基，含羊膜提取物新型组合培养基能有效保护胰岛体外存活及功能。且本发明公开的新型组合培养基中含有的羊膜匀浆提取物包含有各种细胞因子，具有低免疫原性的优点，能为胰岛体外培养提供有利于存活的细胞因子的同时降低免疫反应的风险。
附图说明
为了更清楚地说明本发明的实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是示例性的，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图引伸获得其它的实施附图。
图1为传统培养基CMRL1066+0.625％BSA培养的胰岛活性；
图2为本发明组合培养基CMRL1066+0.625％BSA+羊膜提取物培养的胰岛活性；
图3为本发明浓度分别为2.8mM和16.8mM葡萄糖刺激胰岛素分泌实验对照图，其中，AME为组合培养基中羊膜提取物；
图4为本发明Stimulation Index图，其为高糖浓度下胰岛分泌的胰岛素量与低糖浓度下胰岛分泌的胰岛素量之比，其中，AME为组合培养基中羊膜提取物。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例中所涉及试剂如无特殊说明，均可商业购买获得，所采用的细胞提取、细胞培养、细胞染色及Elisa等实验操作，如无特殊说明，均为常规操作，或按照购买的试剂说明书使用即可。
本发明实施例中，BSA购自于Sigma；CMRL1066购自于Corning。
实施例1、本发明用于胰岛培养的组合培养基的制备
本发明提供培养胰岛的新型组合培养基，包括如下组分CMRL1066培养基、0.625重量％BSA和羊膜提取物。其中，羊膜提取物蛋白在组合培养基中的浓度为0.1-1.0mg/mL。
本发明的用于培养胰岛的新型组合培养基制备方法包括以下步骤：
1、用含有1000IU/ml青霉素和0.1mg/ml链霉素的PBS溶液清洗羊膜，将羊膜洗净至无血块；
2、将洗净的羊膜切成碎块，并浸入液氮中进行手动研磨，直至羊膜被研磨成羊膜细颗粒；
3、将羊膜细颗粒进行称重，按重量体积比为1：2(1：2wt/vol)加入基础培养基CMRL1066，置于4℃，进行超声匀浆。超声匀浆机设置为10000rpm，超声匀浆时间为1h，得到羊膜匀浆混合物；
4、羊膜匀浆混合物进行梯度离心，4000g离心10min后提取上清液，上清液进行15000g离心5min后，再提取上清液，离心全程在4℃环境下进行；
5、将离心后得到的上清液经过0.22μm的滤网过滤，得到羊膜提取物；
6、将得到的羊膜提取物经过Bradford法进行总蛋白浓度定量后，加入基础培养基CMRL1066，得到含羊膜提取物浓度为0.1-1.0mg/ml的培养基。
7、将所述含羊膜提取物的培养基中，加入0.625重量％BSA，制备得到所述用于培养胰岛的新型组合培养基。
实施例2、不同浓度羊膜提取物对C57/BL6小鼠原代胰岛细胞活性的影响
取超低黏附6孔板，将正常提取的小鼠原代胰岛按照每孔75个胰岛进行分组，分为对照组和实验组，对照组培养基成分为CMRL1066+0.625％BSA,实验组背包发明的组合培养基组成成分为CMRL1066+0.625重量％BSA+羊膜提取物，其中，组合培养基中，羊膜提取物蛋白质浓度为0.5mg/mL，每孔加培养基2mL，置于37℃、5％CO2的细胞培养箱中培养48h。培养结束后，将AO/EB按照每毫升培养液加20μl AO/EB 1：1混合液的比例加入含胰岛的培养孔中，混合后3-5min内进行荧光显色，结果如图1-2所示，中绿色为活细胞，橙色为死细胞，图1中橙色较多，其死细胞较多，图2中，橙色较少，甚至没有，其死细胞较少。
实施例3、不同浓度羊膜提取物对C57/BL6小鼠原代胰岛细胞功能的影响
取超低黏附6孔板，将正常提取的小鼠原代胰岛按照每孔75个胰岛进行分组，分为对照组和实验组，对照组培养基成分为CMRL1066+0.625％BSA,实验组本发明的组合培养基组成成分为CMRL1066+0.625％BSA+羊膜提取物，其中，组合培养基中，羊膜提取物蛋白浓度为0.1-1.5mg/mL，每孔加培养基2mL，置于37℃、5％CO2的细胞培养箱中，培养48h。
培养结束后，每组随机取10个胰岛进行ELISA实验检测胰岛分泌的胰岛素。选取的胰岛置于含2.8mM葡萄糖的Krebs-Ringer-bicarbonate buffer(KRBB)溶液中培养30min，弃上清；然后将胰岛置于1mL含2.8mM葡萄糖的Krebs-Ringer-bicarbonate buffer(KRBB)溶液中培养1h，收集上清；最后，将胰岛置于1mL含16.8mM葡萄糖的Krebs-Ringer-bicarbonate buffer(KRBB)溶液中培养1h，收集上清。所收集的含胰岛素的上清稀释10倍进行下述ELISA实验。实验中，使用的ELISA试剂盒为小鼠超敏胰岛素ELISA试剂盒(10-1249-01,Mercodia,Sweden)。按照试剂盒操作指南准备好1X的酶标抗体工作液，1X的清洗缓冲液以及样品。
将25μl的校准样品、实验组以及对照组的样品加入微孔板中，然后每孔加100μl的1X的酶标抗体工作液，室温置于摇床上(700-900rpm)孵育2h。倒置微孔板弃掉工作液，加入350μl的1X清洗缓冲液，弃掉清洗缓冲液，重复清洗5次。每孔加入200μl的底物TMB液，室温下静置孵育15min，然后每孔加入50μl的终止液并置于摇床上5s以保证充分混合。最后在30min内用酶标仪在450nm峰处进行读数。所得吸光度进行数据处理，即可得实验组和对照组中胰岛分泌的胰岛素含量，Stimulation Index为高糖浓度下，胰岛分泌的胰岛素量与低糖浓度下胰岛分泌的胰岛素量之比，实验结果如图3-4所示。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (9)

1.一种用于胰岛培养的组合培养基，其特征在于，所述培养基包括以下原料制成：CMRL1066培养基、BSA以及羊膜提取物。
2.如权利要求1所述的用于胰岛培养的组合培养基，其特征在于，
所述BSA的质量百分数为0.625％。
3.如权利要求1所述的用于胰岛培养的组合培养基，其特征在于，
所述羊膜提取物蛋白的质量浓度为0.1-1.0mg/mL。
4.一种制备权利要求1所述的用于胰岛培养的组合培养基的方法，其特征在于包括：向所述CMRL1066培养基中添加BSA和羊膜提取物，混合均匀，得到所述组合培养基。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，
所述羊膜提取物的添加方法为：
用含青霉素和链霉素的PBS溶液清洗羊膜，将清洗后的羊膜切碎研磨成羊膜颗粒，将所述羊膜颗粒加入到CMRL1066基础培养基中，4℃超声匀浆，将超声匀浆物离心，取上清液，将所述上清液过滤后，得到滤液，再向所述滤液中添加BSA后，得到所述组合培养基。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，
所述超声匀浆过程中，匀浆机转速为10000rpm，超声匀浆温度为4℃，超声匀浆时间为1h。
7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，
所述离心为梯度离心，先4000g离心10min后，提取上清液，将所述上清液再15000g离心5min后，再提取上清液，离心温度为4℃。
8.如权利要求5所述的方法，其特征在于，
所述青霉素的浓度为1000IU/ml，所述链霉素的浓度为0.1mg/ml。
9.如权利要求4所述的方法，其特征在于，
所述羊膜颗粒与所述CMRL1066培养基的质量体积比为1:2。
CN202010819023.0A 2020-08-14 2020-08-14 用于胰岛培养的组合培养基及其制备方法 Active CN112063577B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010819023.0A CN112063577B (zh) 2020-08-14 2020-08-14 用于胰岛培养的组合培养基及其制备方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010819023.0A CN112063577B (zh) 2020-08-14 2020-08-14 用于胰岛培养的组合培养基及其制备方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN112063577A true CN112063577A (zh) 2020-12-11
CN112063577B CN112063577B (zh) 2023-05-16

Family

ID=73661880

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010819023.0A Active CN112063577B (zh) 2020-08-14 2020-08-14 用于胰岛培养的组合培养基及其制备方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN112063577B (zh)

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1652686A (zh) * 2002-03-14 2005-08-10 组织技术公司 用于组织表面的羊膜覆盖物与利于膜固定的装置
CN101316602A (zh) * 2005-09-27 2008-12-03 组织技术公司 羊膜制品和纯化的组合物及其使用方法
CN102552979A (zh) * 2012-01-20 2012-07-11 陕西瑞盛生物科技有限公司 一种角膜板层材料的制备方法
WO2017171706A1 (en) * 2016-03-28 2017-10-05 Tello Celso Amniotic or placental preparation and device for ophthalmic use as a dressing to enhance healing

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN100554407C (zh) * 2006-09-18 2009-10-28 郑州福恩生物工程技术有限公司 可修复仔猪胰岛细胞的生产方法
CN101914488B (zh) * 2010-08-04 2014-08-27 北京科润维德生物技术有限责任公司 将人羊膜间充质细胞诱导分化成胰岛分泌细胞的方法
CN102391982A (zh) * 2011-12-08 2012-03-28 遵义医学院附属医院 一种体外诱导人羊膜间充质干细胞分化为胰岛素分泌细胞的方法
CN102492651A (zh) * 2011-12-08 2012-06-13 遵义医学院附属医院 一种体外诱导人羊膜上皮细胞分化为胰岛素分泌细胞的方法
CN103184186A (zh) * 2011-12-28 2013-07-03 中国医学科学院基础医学研究所 一种制备胰岛素分泌细胞的方法及其专用培养基组合物
CN103911340A (zh) * 2013-01-04 2014-07-09 广州康睿生物医药科技有限公司 一种促胰岛细胞增殖培养液及其制备方法
CN103695367B (zh) * 2013-12-24 2015-10-28 湖南赛诺生物科技有限责任公司 一种改良的新生猪胰岛细胞培养基及其使用方法
CN109355247B (zh) * 2018-10-27 2022-03-29 华南理工大学 一种小型猪胰岛细胞体外培养方法
CN110423720A (zh) * 2019-07-23 2019-11-08 南昌大学 一种羊膜上皮干细胞诱导分化为功能性胰岛β细胞的方法及其应用

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1652686A (zh) * 2002-03-14 2005-08-10 组织技术公司 用于组织表面的羊膜覆盖物与利于膜固定的装置
CN101316602A (zh) * 2005-09-27 2008-12-03 组织技术公司 羊膜制品和纯化的组合物及其使用方法
CN102552979A (zh) * 2012-01-20 2012-07-11 陕西瑞盛生物科技有限公司 一种角膜板层材料的制备方法
WO2017171706A1 (en) * 2016-03-28 2017-10-05 Tello Celso Amniotic or placental preparation and device for ophthalmic use as a dressing to enhance healing

Also Published As

Publication number Publication date
CN112063577B (zh) 2023-05-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
LU500561B1 (en) In vitro construction method and use of liver organoids
Edwards et al. Isolation of mesophyll cells and bundle sheath cells from Digitaria sanguinalis (L.) Scop. leaves and a scanning microscopy study of the internal leaf cell morphology
CN110583619B (zh) 一种结直肠癌实体瘤组织样本保存液
WO2010040262A1 (zh) 分离动物胚胎间质性干细胞并提取其分泌物的方法
CN110133282A (zh) 炎症类标志物复合质控品及其制备方法与应用
CN106038597B (zh) 间充质干细胞在制备治疗急性肺损伤制剂中的应用
CN106854638B (zh) 一种诱导间充质干细胞分化为胰岛样细胞的方法
WO2010043076A1 (zh) 适于临床应用的人胎盘间质细胞库的建立方法
CN107034189A (zh) 一种造血干细胞培养方法
CN104293731A (zh) 建鲤原代肝细胞的分离培养方法
CN107099504A (zh) 一种造血干细胞培养基
Burghen et al. Factors influencing isolation of islets of Langerhans
Zhao et al. Human islets derived from donors after cardiac death are fully biofunctional
CN112063577B (zh) 用于胰岛培养的组合培养基及其制备方法
Crowther et al. Porcine islet isolation, cellular composition and secretory response
CN103977395A (zh) 生长因子制剂及其生产方法
Nikolic et al. Comparative analysis of collagenase XI and liberase H1 for the isolation of human pancreatic islets
CN113755441B (zh) 一种肺癌微肿瘤细胞模型的培养方法
Ohgawara et al. Preparation of adult pig pancreatic cells: comparative study of methods with or without proteolytic enzymes
KR20220162201A (ko) 소장 유래 줄기세포를 포함하는 소장 오가노이드의 제조 방법 및 이의 용도
CN110201025B (zh) 青钱柳提取物在制备治疗或防治糖尿病心肌病药物中的应用
Liang et al. Characteristics of research-focused human islet preparations from organ donors with type 2 diabetes
CN113881633B (zh) 一种脐带血造血干细胞体外干性扩增的培养基及方法
CN112076117B (zh) 青木瓜发酵物及其制造方法与用途
CN113817682B (zh) 一种结直肠癌微肿瘤细胞模型的培养方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
CB03 Change of inventor or designer information
CB03 Change of inventor or designer information

Inventor after: Zhang Jialin

Inventor after: Yang Zhaoming

Inventor after: Guo Tingwei

Inventor after: Lin Jianzhen

Inventor after: Li Feng

Inventor after: Zhang Chengshuo

Inventor before: Yang Zhaoming

Inventor before: Zhang Jialin

Inventor before: Guo Tingwei

Inventor before: Lin Jianzhen

Inventor before: Li Feng

Inventor before: Zhang Chengshuo

GR01 Patent grant
GR01 Patent grant