CN109355247B - 一种小型猪胰岛细胞体外培养方法 - Google Patents

一种小型猪胰岛细胞体外培养方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种小型猪胰岛细胞体外培养方法，该方法包括如下步骤：配置细胞生长液；配置细胞培养液；取出小型猪胰岛细胞冻存管，融化，放入装有细胞生长液的离心管中，离心处理，弃去上清液，采用细胞生长液将离心管底部的细胞悬浮起来，然后吸入装有细胞生长液的第一培养皿中，放入培养箱中进行培养；培养后，更换培养皿和培养基，采用装有细胞培养液的第二培养皿进行培养，以后每1‑3天更换一次培养皿和培养基，且均采用细胞培养液作为培养基。本发明能够降低细胞凋零率，提高胰岛β细胞活力，且所培养的细胞有敏感葡萄糖刺激应答，能够满足研究人类胰岛疾病的要求，具有重要的市场价值和社会价值。

Description

一种小型猪胰岛细胞体外培养方法
技术领域
本发明涉及动物细胞培养技术领域，具体涉及一种小型猪胰岛细胞体外培养方法。
背景技术
猪作为人类最早豢养的动物，其杂食性与人类相同，而与犬（肉食性）和猴（素食性）相差迥异。其生理功能、物质代谢方式、器官形态和疾病发生机制等与人类非常相似。猪与人类有着相似的细胞色素氧化酶P450系统，重要代谢酶学特征决定着药物在其体内的生物转化与人极为相似，是药物安全性评价及筛选、人类疾病的理想模型动物，尤其在抗肿瘤药物、心血管系统药物、皮肤渗透性药物、非甾体类抗生素、消化系统用药方面表现出明显优于犬和非人灵长类的优势。加之小型猪饲养成本低，操作简便，因此小型猪人类疾病模型应用于新药开发研究已成为国际范围内的焦点。
细胞增殖异常是许多重大疾病的病理基础,如细胞恶性增殖形成肿瘤、缺乏细胞新生导致某些退行性疾病等。在研发与细胞增殖异常相关疾病的新药中,新药候选物可以作用于基因、sRNA、代谢酶等靶点,但最终药效应当落在细胞增殖这个关键点。通过研究新药候选物对活体细胞的细胞增殖的药效，常是评价该新药候选物是否真实有效和安全的关键点。小型猪作为人类疾病模型的较佳选择，在研究人类胰岛疾病（如糖尿病）的过程中，进行小型猪胰岛细胞的体外培养是必要步骤。现有的小型猪胰岛细胞体外培养技术存在细胞凋亡率高、细胞活力低以及稳定性差的缺陷。
发明内容
本发明的目的在于提供一种小型猪胰岛细胞体外培养方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案。
一种小型猪胰岛细胞体外培养方法，包括如下步骤：
1）配置细胞生长液，所述细胞生长液包括小牛血清、F12培养基液和DMEM培养基液组成的第一基液，并在所述第一基液中加入细胞凋亡抑制剂Z-VAD-FMK、胰岛素样生长因子、血管内皮生长因子、成纤维细胞生长因子、TGF-β、胰岛素、青霉素、链霉素、转铁蛋白、第一添加剂；
2）配置细胞培养液，所述细胞培养液包括小牛血清、F12培养基液和DMEM培养基液组成的第二基液，并在所述第二基液中加入细胞凋亡抑制剂Z-VAD-FMK、胰岛素样生长因子、血管内皮生长因子、成纤维细胞生长因子、TGF-β、胰岛素、青霉素、链霉素、转铁蛋白、第二添加剂；
3）取出装有小型猪胰岛细胞的冻存管，融化后放入装有所述细胞生长液的离心管中，并采用所述细胞生长液将冻存管清洗，以把粘附在冻存管壁上的小型猪胰岛细胞洗下，再离心处理后弃去上清液，采用所述细胞生长液将离心管底部的细胞悬浮起来，然后吸入装有所述细胞生长液的第一培养皿中培养；
4）更换培养皿和培养基，采用装有所述细胞培养液的第二培养皿进行培养；
5）再次更换培养皿和培养基，采用装有所述细胞培养液的第三培养皿进行培养。
优选的，步骤1）所述第一添加剂的制备包括以下步骤：
101）按照重量比1:1称取甘葛粉和天花粉，合并成混合物1后，加入10-12倍混合物1重量的去离子水，超声波提取50-60min后，过滤，获得第一提取液和第一提取残渣；
102）将第一提取残渣加入6-8倍第一提取残渣重量的去离子水，超声波提取后，过滤，获得第二提取液和第二提取残渣；
103）将第二提取残渣加入6-8倍第二提取残渣重量的去离子水，超声波提取40-45min后，过滤，获得第三提取液和第三提取残渣；
104）将第一提取液、第二提取液和第三提取液合并，蒸发浓缩为60℃下相对密度为1.10-1.15的浓缩液，喷雾干燥后，辐照杀菌，即得第一添加剂。
优选的，步骤2）所述第二添加剂的制备方法为：
201）按照重量比2:3称取甘葛粉和天花粉，合并成混合物2后，加入10-12倍混合物2重量的去离子水，超声波提取50-60min后，过滤，获得第四提取液和第四提取残渣；
202）将第四提取残渣加入6-8倍第四提取残渣重量的去离子水，超声波提取后，过滤，获得第五提取液和第五提取残渣；
203）将第五提取残渣加入6-8倍第五提取残渣重量的去离子水，超声波提取40-45min后，过滤，获得第六提取液和第六提取残渣；
204）将第四提取液、第五提取液和第六提取液合并，蒸发浓缩为60℃下相对密度为1.10-1.15的浓缩液，喷雾干燥后，辐照杀菌，即得第二添加剂。
优选的，步骤1）中，所述细胞生长液包括小牛血清、F12培养基液和DMEM培养基液按照体积比5:100:25组成的第一基液，并在所述第一基液中加入细胞凋亡抑制剂Z-VAD-FMK 8-10μM、胰岛素样生长因子12-15μg/L、血管内皮生长因子5-8μg/L、成纤维细胞生长因子2-5μg/L、TGF-β 6-10μg/L、胰岛素12-15μg/L、青霉素60-120U/mL、链霉素60-120U/mL、转铁蛋白3-4μg/L、第一添加剂25-30μg/L。
进一步优选的，所述细胞生长液包括小牛血清、F12培养基液和DMEM培养基液按照体积比5:100:25组成的第一基液，并在所述第一基液中加入细胞凋亡抑制剂Z-VAD-FMK 9μM、胰岛素样生长因子13μg/L、血管内皮生长因子6μg/L、成纤维细胞生长因子4μg/L、TGF-β8μg/L、胰岛素13μg/L、青霉素90U/mL、链霉素90U/mL、转铁蛋白3.5μg/L、第一添加剂28μg/L。
优选的，步骤2）中，所述细胞培养液包括小牛血清、F12培养基液和DMEM培养基液按照体积比3:90:30组成的第二基液，并在所述第二基液中加入细胞凋亡抑制剂Z-VAD-FMK13-16μM、胰岛素样生长因子6-10μg/L、血管内皮生长因子2-4μg/L、成纤维细胞生长因子2-5μg/L、TGF-β 12-15μg/L、胰岛素8-10μg/L、青霉素60-120U/mL、链霉素60-120U/mL、转铁蛋白3-4μg/L、第二添加剂18-20μg/L。
进一步优选的，所述细胞培养液包括小牛血清、F12培养基液和DMEM培养基液按照体积比3:90:30组成的第二基液，并在所述第二基液中加入细胞凋亡抑制剂Z-VAD-FMK 14μM、胰岛素样生长因子8μg/L、血管内皮生长因子3μg/L、成纤维细胞生长因子4μg/L、TGF-β13μg/L、胰岛素9μg/L、青霉素90U/mL、链霉素90U/mL、转铁蛋白3.5μg/L、第二添加剂19μg/L。
优选的，步骤3）所述融化是在37℃温水中融化；所述清洗的次数为2-3次；所述离心处理是在800-900转/分钟的转速下离心处理4-5分钟；所述培养是放入37℃的5 vol%二氧化碳培养箱中进行培养。
优选的，步骤3）中，所述培养的时间为三天。
优选的，步骤4）中，所述培养的时间为两天，以后每两天更换一次培养皿和培养基，且均采用所述细胞培养液作为培养基。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明小型猪胰岛细胞体外培养方法能够降低细胞凋零率，提高胰岛β细胞活力，且所培养的细胞有敏感葡萄糖刺激应答，能够满足研究人类胰岛疾病的要求，具有重要的市场价值和社会价值。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明的技术方案作进一步详细地说明,但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
一种小型猪胰岛细胞体外培养方法，步骤如下：
1）配置细胞生长液，所述细胞生长液包括由小牛血清、F12培养基液和DMEM培养基液按照体积比5:100:25组成的第一基液，并在第一基液中加入细胞凋亡抑制剂Z-VAD-FMK8μM（基于细胞生长液中所有物质总摩尔量）、胰岛素样生长因子12μg/L、血管内皮生长因子5μg/L、成纤维细胞生长因子2μg/L、TGF-β 6μg/L、胰岛素12μg/L、青霉素90U/mL、链霉素90U/mL、转铁蛋白3μg/L、第一添加剂25μg/L；
2）配置细胞培养液，所述细胞培养液包括由小牛血清、F12培养基液和DMEM培养基液按照体积比3:90:30组成的第二基液，并在第二基液中加入细胞凋亡抑制剂Z-VAD-FMK13μM、胰岛素样生长因子6μg/L、血管内皮生长因子2μg/L、成纤维细胞生长因子2μg/L、TGF-β 12μg/L、胰岛素8μg/L、青霉素90U/mL、链霉素90U/mL、转铁蛋白3μg/L、第二添加剂18μg/L；
3）取出小型猪胰岛细胞冻存管，在37℃温水中融化，放入装有10mL细胞生长液的离心管中，并采用细胞生长液将冻存管清洗2次，以把粘附在冻存管壁上的小型猪胰岛细胞洗下，然后在800转/分钟的转速下离心处理4分钟，弃去上清液，采用1mL细胞生长液将离心管底部的细胞悬浮起来，然后吸入装有10mL细胞生长液的第一培养皿中，放入37℃的5vol%二氧化碳培养箱中进行培养；
4）培养三天后，更换培养皿和培养基，采用装有10mL细胞培养液的第二培养皿进行培养；
5）培养两天后，再次更换培养皿和培养基，采用装有10mL细胞培养液的第三培养皿进行培养，以后每两天更换一次培养皿和培养基，且均采用10mL细胞培养液作为培养基。
其中，所述第一添加剂的制备方法为：
101）按照重量比1:1称取甘葛粉和天花粉，合并后，加入10倍重量的去离子水，超声波提取50min后，过滤，获得第一提取液和第一提取残渣；
102）将第一提取残渣加入6倍重量的去离子水，超声波提取40min后，过滤，获得第二提取液和第二提取残渣；
103）将第二提取残渣加入6倍重量的去离子水，超声波提取30min后，过滤，获得第三提取液和第三提取残渣；
104）将第一提取液、第二提取液和第三提取液合并，蒸发浓缩为60℃下相对密度为1.10的浓缩液，喷雾干燥后，辐照杀菌，即得第一添加剂。
所述第二添加剂的制备方法为：
201）按照重量比2:3称取甘葛粉和天花粉，合并后，加入10倍重量的去离子水，超声波提取50min后，过滤，获得第四提取液和第四提取残渣；
202）将第四提取残渣加入6倍重量的去离子水，超声波提取40min后，过滤，获得第五提取液和第五提取残渣；
203）将第五提取残渣加入6倍重量的去离子水，超声波提取30min后，过滤，获得第六提取液和第六提取残渣；
204）将第四提取液、第五提取液和第六提取液合并，蒸发浓缩为60℃下相对密度为1.10的浓缩液，喷雾干燥后，辐照杀菌，即得第二添加剂。
实施例2
一种小型猪胰岛细胞体外培养方法，步骤如下：
1）配置细胞生长液，所述细胞生长液包括由小牛血清、F12培养基液和DMEM培养基液按照体积比5:100:25组成的第一基液，并在第一基液中加入细胞凋亡抑制剂Z-VAD-FMK9μM、胰岛素样生长因子13μg/L、血管内皮生长因子6μg/L、成纤维细胞生长因子4μg/L、TGF-β 8μg/L、胰岛素13μg/L、青霉素90U/mL、链霉素90U/mL、转铁蛋白3.5μg/L、第一添加剂28μg/L；
2）配置细胞培养液，所述细胞培养液包括由小牛血清、F12培养基液和DMEM培养基液按照体积比3:90:30组成的第二基液，并在第二基液中加入细胞凋亡抑制剂Z-VAD-FMK14μM、胰岛素样生长因子8μg/L、血管内皮生长因子3μg/L、成纤维细胞生长因子4μg/L、TGF-β 13μg/L、胰岛素9μg/L、青霉素90U/mL、链霉素90U/mL、转铁蛋白3.5μg/L、第二添加剂19μg/L；
3）取出小型猪胰岛细胞冻存管，在37℃温水中融化，放入装有10mL细胞生长液的离心管中，并采用细胞生长液将冻存管清洗3次，以把粘附在冻存管壁上的小型猪胰岛细胞洗下，然后在900转/分钟的转速下离心处理4.5分钟，弃去上清液，采用1mL细胞生长液将离心管底部的细胞悬浮起来，然后吸入装有10mL细胞生长液的第一培养皿中，放入37℃的5vol%二氧化碳培养箱中进行培养；
4）培养三天后，更换培养皿和培养基，采用装有10mL细胞培养液的第二培养皿进行培养；
5）培养两天后，再次更换培养皿和培养基，采用装有10mL细胞培养液的第三培养皿进行培养，以后每两天更换一次培养皿和培养基，且均采用10mL细胞培养液作为培养基。
其中，所述第一添加剂的制备方法为：
101）按照重量比1:1称取甘葛粉和天花粉，合并后，加入11倍重量的去离子水，超声波提取55min后，过滤，获得第一提取液和第一提取残渣；
102）将第一提取残渣加入7倍重量的去离子水，超声波提取42min后，过滤，获得第二提取液和第二提取残渣；
103）将第二提取残渣加入7倍重量的去离子水，超声波提取30min后，过滤，获得第三提取液和第三提取残渣；
104）将第一提取液、第二提取液和第三提取液合并，蒸发浓缩为60℃下相对密度为1.12的浓缩液，喷雾干燥后，辐照杀菌，即得第一添加剂。
所述第二添加剂的制备方法为：
201）按照重量比2:3称取甘葛粉和天花粉，合并后，加入11倍重量的去离子水，超声波提取55min后，过滤，获得第四提取液和第四提取残渣；
202）将第四提取残渣加入7倍重量的去离子水，超声波提取42min后，过滤，获得第五提取液和第五提取残渣；
203）将第五提取残渣加入7倍重量的去离子水，超声波提取30min后，过滤，获得第六提取液和第六提取残渣；
204）将第四提取液、第五提取液和第六提取液合并，蒸发浓缩为60℃下相对密度为1.12的浓缩液，喷雾干燥后，辐照杀菌，即得第二添加剂。
实施例3
一种小型猪胰岛细胞体外培养方法，步骤如下：
1）配置细胞生长液，所述细胞生长液包括由小牛血清、F12培养基液和DMEM培养基液按照体积比5:100:25组成的第一基液，并在第一基液中加入细胞凋亡抑制剂Z-VAD-FMK10μM、胰岛素样生长因子15μg/L、血管内皮生长因子8μg/L、成纤维细胞生长因子5μg/L、TGF-β 10μg/L、胰岛素15μg/L、青霉素90U/mL、链霉素90U/mL、转铁蛋白4μg/L、第一添加剂30μg/L；
2）配置细胞培养液，所述细胞培养液包括由小牛血清、F12培养基液和DMEM培养基液按照体积比3:90:30组成的第二基液，并在第二基液中加入细胞凋亡抑制剂Z-VAD-FMK16μM、胰岛素样生长因子10μg/L、血管内皮生长因子4μg/L、成纤维细胞生长因子5μg/L、TGF-β 15μg/L、胰岛素10μg/L、青霉素90U/mL、链霉素90U/mL、转铁蛋白4μg/L、第二添加剂20μg/L；
3）取出小型猪胰岛细胞冻存管，在37℃温水中融化，放入装有10mL细胞生长液的离心管中，并采用细胞生长液将冻存管清洗3次，以把粘附在冻存管壁上的小型猪胰岛细胞洗下，然后在900转/分钟的转速下离心处理5分钟，弃去上清液，采用1mL细胞生长液将离心管底部的细胞悬浮起来，然后吸入装有10mL细胞生长液的第一培养皿中，放入37℃的5vol%二氧化碳培养箱中进行培养；
4）培养三天后，更换培养皿和培养基，采用装有10mL细胞培养液的第二培养皿进行培养；
5）培养两天后，再次更换培养皿和培养基，采用装有10mL细胞培养液的第三培养皿进行培养，以后每两天更换一次培养皿和培养基，且均采用10mL细胞培养液作为培养基。
其中，所述第一添加剂的制备方法为：
101）按照重量比1:1称取甘葛粉和天花粉，合并后，加入12倍重量的去离子水，超声波提取60min后，过滤，获得第一提取液和第一提取残渣；
102）将第一提取残渣加入8倍重量的去离子水，超声波提取45min后，过滤，获得第二提取液和第二提取残渣；
103）将第二提取残渣加入8倍重量的去离子水，超声波提取30min后，过滤，获得第三提取液和第三提取残渣；
104）将第一提取液、第二提取液和第三提取液合并，蒸发浓缩为60℃下相对密度为1.15的浓缩液，喷雾干燥后，辐照杀菌，即得第一添加剂。
所述第二添加剂的制备方法为：
201）按照重量比2:3称取甘葛粉和天花粉，合并后，加入12倍重量的去离子水，超声波提取60min后，过滤，获得第四提取液和第四提取残渣；
202）将第四提取残渣加入8倍重量的去离子水，超声波提取45min后，过滤，获得第五提取液和第五提取残渣；
203）将第五提取残渣加入8倍重量的去离子水，超声波提取30min后，过滤，获得第六提取液和第六提取残渣；
204）将第四提取液、第五提取液和第六提取液合并，蒸发浓缩为60℃下相对密度为1.15的浓缩液，喷雾干燥后，辐照杀菌，即得第二添加剂。
对比例
为了验证本发明所公开的小型猪胰岛细胞体外培养方法的培养效果，进行了对比培养实验。
实验组：采用本发明实施例2所公开的小型猪胰岛细胞体外培养方法对小型猪胰岛细胞进行体外培养，分别记录培养6天和培养10天的胰岛细胞存活率和β细胞所占百分比，并在第10天进行葡萄糖刺激试验。
对照组：采用申请号为2013107199276所公开的培养基及培养方法对小型猪胰岛细胞进行体外培养，分别记录培养6天和培养10天的胰岛细胞存活率和β细胞所占百分比，并在第10天进行葡萄糖刺激试验。
实验结果如表1所示。
表1
Figure 480358DEST_PATH_IMAGE002
从表1可以看出，实验组培养6天和培养10天的胰岛细胞存活率均优于对照组，实验组培养6天和培养10天的β细胞所占百分比与对照组相当，实验组培养10天的葡萄糖刺激试验结果稍微优于对照组。
综上，实验组所采用的培养方法优于对照组所采用的培养方法。
本发明小型猪胰岛细胞体外培养方法能够降低细胞凋零率，提高胰岛β细胞活力，且所培养的细胞有敏感葡萄糖刺激应答，能够满足研究人类胰岛疾病的要求，具有重要的市场价值和社会价值。
上面对本发明的较佳实施方式作了详细说明，但是本发明并不限于上述实施方式，在本领域的普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。

Claims (6)

1.一种小型猪胰岛细胞体外培养方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)配置细胞生长液，所述细胞生长液包括小牛血清、F12培养基液和DMEM培养基液组成的第一基液，并在所述第一基液中加入细胞凋亡抑制剂Z-VAD-FMK、胰岛素样生长因子、血管内皮生长因子、成纤维细胞生长因子、TGF-β、胰岛素、青霉素、链霉素、转铁蛋白、第一添加剂；
2)配置细胞培养液，所述细胞培养液包括小牛血清、F12培养基液和DMEM培养基液组成的第二基液，并在所述第二基液中加入细胞凋亡抑制剂Z-VAD-FMK、胰岛素样生长因子、血管内皮生长因子、成纤维细胞生长因子、TGF-β、胰岛素、青霉素、链霉素、转铁蛋白、第二添加剂；
3)取出装有小型猪胰岛细胞的冻存管，融化后放入装有所述细胞生长液的离心管中，并采用所述细胞生长液将冻存管清洗，以把粘附在冻存管壁上的小型猪胰岛细胞洗下，再离心处理后弃去上清液，采用所述细胞生长液将离心管底部的细胞悬浮起来，然后吸入装有所述细胞生长液的第一培养皿中培养；
4)更换培养皿和培养基，采用装有所述细胞培养液的第二培养皿进行培养；
5)再次更换培养皿和培养基，采用装有所述细胞培养液的第三培养皿进行培养；
步骤1)所述第一添加剂的制备包括以下步骤：
101)按照重量比2:1-1:2称取甘葛粉和天花粉，合并成混合物1后，加入10-12倍混合物1重量的去离子水，超声波提取50-60min后，过滤，获得第一提取液和第一提取残渣；
102)将第一提取残渣加入6-8倍第一提取残渣重量的去离子水，超声波提取40-45min后，过滤，获得第二提取液和第二提取残渣；
103)将第二提取残渣加入6-8倍第二提取残渣重量的去离子水，超声波提取15-45min后，过滤，获得第三提取液和第三提取残渣；
104)将第一提取液、第二提取液和第三提取液合并，蒸发浓缩为60℃下相对密度为1.10-1.15的浓缩液，喷雾干燥后，辐照杀菌，即得第一添加剂；
步骤2)所述第二添加剂的制备方法为：
201)按照重量比2:3称取甘葛粉和天花粉，合并成混合物2后，加入10-12倍混合物2重量的去离子水，超声波提取50-60min后，过滤，获得第四提取液和第四提取残渣；
202)将第四提取残渣加入6-8倍第四提取残渣重量的去离子水，超声波提取40-45min后，过滤，获得第五提取液和第五提取残渣；
203)将第五提取残渣加入6-8倍第五提取残渣重量的去离子水，超声波提取40-45min后，过滤，获得第六提取液和第六提取残渣；
204)将第四提取液、第五提取液和第六提取液合并，蒸发浓缩为60℃下相对密度为1.10-1.15的浓缩液，喷雾干燥后，辐照杀菌，即得第二添加剂；
步骤1)中，所述细胞生长液包括小牛血清、F12培养基液和DMEM培养基液按照体积比5:100:25组成的第一基液，并在所述第一基液中加入细胞凋亡抑制剂Z-VAD-FMK 8-10μM、胰岛素样生长因子12-15μg/L、血管内皮生长因子5-8μg/L、成纤维细胞生长因子2-5μg/L、TGF-β6-10μg/L、胰岛素12-15μg/L、青霉素60-120U/mL、链霉素60-120U/mL、转铁蛋白3-4μg/L、第一添加剂25-30μg/L；
步骤2)中，所述细胞培养液包括小牛血清、F12培养基液和DMEM培养基液按照体积比3:90:30组成的第二基液，并在所述第二基液中加入细胞凋亡抑制剂Z-VAD-FMK 13-16μM、胰岛素样生长因子6-10μg/L、血管内皮生长因子2-4μg/L、成纤维细胞生长因子2-5μg/L、TGF-β12-15μg/L、胰岛素8-10μg/L、青霉素60-120U/mL、链霉素60-120U/mL、转铁蛋白3-4μg/L、第二添加剂18-20μg/L。
2.根据权利要求1所述的一种小型猪胰岛细胞体外培养方法，其特征在于，步骤1)中，所述细胞生长液包括小牛血清、F12培养基液和DMEM培养基液按照体积比5:100:25组成的第一基液，并在所述第一基液中加入细胞凋亡抑制剂Z-VAD-FMK 9μM、胰岛素样生长因子13μg/L、血管内皮生长因子6μg/L、成纤维细胞生长因子4μg/L、TGF-β8μg/L、胰岛素13μg/L、青霉素90U/mL、链霉素90U/mL、转铁蛋白3.5μg/L、第一添加剂28μg/L。
3.根据权利要求1所述的一种小型猪胰岛细胞体外培养方法，其特征在于，步骤2)中，所述细胞培养液包括小牛血清、F12培养基液和DMEM培养基液按照体积比3:90:30组成的第二基液，并在所述第二基液中加入细胞凋亡抑制剂Z-VAD-FMK 14μM、胰岛素样生长因子8μg/L、血管内皮生长因子3μg/L、成纤维细胞生长因子4μg/L、TGF-β13μg/L、胰岛素9μg/L、青霉素90U/mL、链霉素90U/mL、转铁蛋白3.5μg/L、第二添加剂19μg/L。
4.根据权利要求1所述的一种小型猪胰岛细胞体外培养方法，其特征在于，步骤3)所述融化是在35-40℃温水中融化；所述清洗的次数为2-3次；所述离心处理是在800-900转/分钟的转速下离心处理4-5分钟；所述培养是放入37℃的5vol％二氧化碳培养箱中进行培养。
5.根据权利要求1所述的一种小型猪胰岛细胞体外培养方法，其特征在于，步骤3)中，所述培养的时间为2-4天。
6.根据权利要求1所述的一种小型猪胰岛细胞体外培养方法，其特征在于，步骤4)中，所述培养的时间为1-3天，以后每1-3天更换一次培养皿和培养基，且均采用所述细胞培养液作为培养基。
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