CN102989038B - 可递送内皮抑制激素的胶原基复合角膜替代物的制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种可递送内皮抑制激素的胶原基复合角膜替代物的制备方法和应用。它由向接种在胶原/GMAA聚合物半互穿网络角膜替代物表面的MSCs转染内皮抑制素基因制备而成。此胶原基角膜替代物具有良好的生物相容性，可诱导和促进角膜再生，并随角膜再生而生物降解；该角膜替代物具备良好的力学和光学性能，且与人眼组织有良好的生物相容性，聚合物网络的引入提高角膜替代物在胶原酶中的稳定性及力学强度。通过在角膜替代物表面接种骨髓间充质干细胞(MSCs)并转染内皮抑制素基因，可在两周内持续检测到培养基中的内皮抑制素蛋白。该角膜替代物将基因转染与组织工程有效结合并用于眼科，制作方法简单，易于加工处理和长期保存及运输。
Description
技术领域
本发明属于组织工程领域，更加具体地说，涉及一种可递送内皮抑制激素的胶原分子与甲基丙烯酸甘油酯化精氨酸(Glycidyl Methacrylated Arginine，GMAA)聚合物网络复合的半互穿网络凝胶的制备方法，此多功能凝胶将组织工程与基因转染用于治疗眼科相关疾病，可作为潜在的角膜替代物。
背景技术
全球约一千万人承受由角膜损伤导致的失明所带来的痛苦。角膜损伤一般由角膜疾病或者外界的物理、化学伤害引起，已成为世界范围内仅次于白内障的第二大致盲因素。目前，由角膜捐献者所提供的同种异体角膜移植手术是针对不可恢复性角膜损伤的一种比较被广泛接受的治疗手段。尽管其手术成功率较高，但是大多数国家尤其是发展中国家的每年的角膜供体数量难以满足移植需要，而且对于角膜感染和角膜新生血管化严重的患者来说，角膜移植手术后的愈合情况较差，移植失败率高。鉴于此，开发能够替代同种异体角膜移植的方法，研制新型的角膜替代物显得刻不容缓。
自1859年将一片玻璃植入病人眼内首次提出了人工角膜的概念至今，多种由合成材料制成的人工角膜面世并成功应用于临床试验，但人工角膜移植引发的一些晚期并发症等严重制约了其临床应用，仅适用于常规角膜移植失败的双眼角膜混浊性失明患者。时至今日，人工角膜材料仍然不能完全替代角膜组织。随着组织工程技术的兴起和材料科学的发展，国内外众多研究者开始致力于组织工程角膜的研究。其特点是生物相容性良好，可在生物体内降解，促进细胞的生长分化从而实现角膜组织的再生和自我修复。其类型主要包括①在体外构建类似于角膜组织结构的材料并移植；②将负载种子细胞的支架材料移植，支架材料在动物体内的降解过程中完成角膜组织修复；③移植可促进组织再生修复的无细胞材料三种。
无论以何种方式来构建角膜替代物，其首要原则就是尽量多地复制天然生物体角膜的特性。同时，针对角膜移植手术后复杂的眼部病理环境，如何构建出一种集促进角膜组织再生修复和治疗于一身的多功能角膜替代物已成为研究工作的重点。
骨髓间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells，MSCs)来源于骨髓基质，具有多向分化潜能，可以在特定的诱导条件下向成骨、神经和心肌等多种细胞分化。MSCs应用于角膜组织工程的研究日渐增多，将MSCs接种到羊膜支架材料上，体外培养后移植到角膜基质并诱导其向角膜上皮细胞分化，最终可检测到角膜上皮细胞标志物的表达。另有研究表明MSCs作为组织工程角膜种子细胞移植后，除了具有重建受损角膜组织的功能外，还有抑制炎症和角膜新生血管的功效，这使其在角膜组织工程中的应用前景十分良好。
目前已有研究和报道的用于构建组织工程角膜的生物材料有羊膜、细胞外基质材料(主要包括胶原、异种脱细胞角膜基质、纤维蛋白、蚕丝蛋白等)和天然高分子材料(主要包括壳聚糖、透明质酸、海藻酸盐等)。这些材料的生物相容性良好，利于细胞的粘附和繁殖，降解产物能被机体吸收，但降解速率不可控，强度和加工性能较差。Griffith等成功制备出了一系列的胶原基聚合物互穿网络(IPN)角膜替代物，向胶原中引入的网络包括聚两性电解质、温敏性聚合物、聚乙二醇和多糖等。其中胶原/磷酸胆碱聚合物角膜替代物(Collagen/MPC)对小型猪进行了深度角膜板层移植，术后一年显示了上皮细胞的重建，伴随基质细胞的长入，且观察到角膜神经的再生。在Collagen/MPC角膜替代物用于碱烧伤后的兔子角膜移植中，此材料不仅支持角膜细胞的生长繁殖以及组织重建，还显示了其抑制角膜新生血管化的能力。正常角膜透明无血管，角膜新生血管形成是角膜化学烧伤、角膜炎、角膜移植排斥反应等疾病带来的一个难题。尽管角膜新生血管的生长有利于病原微生物的清除和组织修复，但严重影响角膜的透明性，是造成角膜移植失败的原因之一。
发明内容
本发明的目的在于提供一种可递送内皮抑制激素的胶原基复合角膜替代物的制备方法和应用。该角膜替代物具备良好的力学性能、光学性能，在胶原酶中降解缓慢，且与人眼组织有良好的生物相容性。通过在凝胶表面接种骨髓间充质干细胞(MSCs)并转染内皮抑制素基因，可将组织工程与基因转染用于眼科，制备方法简单，可以长期保存和运输。
本发明的目的通过下述技术方案予以实现：
本发明提供一种胶原基复合角膜替代物，以胶原、GMAA为原料，以水为溶剂，以碳二亚胺(EDC)为交联剂对胶原进行交联，以光引发剂引发GMAA进行聚合反应，同时GMAA分子结构上的官能基团还可与胶原分子发生交联反应，由此将反应产物经过浇注成膜制备成胶原/GMAA半互穿聚合物网络角膜替代物。
其中EDC与胶原(以胶原分子上氨基数目计，表示为Coll-NH2)的摩尔比为1：（1—1.2）；EDC与N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）的摩尔比为1：1；光引发剂与GMAA的摩尔比为（0.02—0.03）：1；胶原(以胶原分子上氨基数目计，表示为Coll-NH2)与GMAA的质量比为1：（0.5—1）。
所述光引发剂选用1－[4－（2－羟乙氧基）－亚苯基]－2－羟基－2′，2′-二甲基乙酮(Irgacure2959)，也可选用甲基乙烯基酮、安息香。
所述胶原可选用猪Ⅰ型胶原，所述GMAA为甲基丙烯酸甘油化的精氨酸单体，将精氨酸分子和甲基丙烯酸甘油酯化制备而成（参考文献Jianshu Li,Zhizhang Guo,Jianyu Xin,Guanglei Zhao,Huining Xiao.21-Arm star polymers with different cationic groups based oncyclodextrin core for DNA delivery.Carbohydrate Polymers,2010,79,277-283.），结构如下：
在本发明的制备方法中可直接在室温，即在20-25℃下进行反应，先将胶原、GMAA、EDC、NHS、光引发剂按照计量在溶剂水中混合均匀，然后调整体系pH值为5—6，将混合反应溶液浇注到模具内，再放入夹具中夹紧固定，于紫外固化箱中固化30-40min（即光引发聚合和胶原固化同时发生），取出后保持湿度100%的条件下，室温20—25摄氏度反应至少12h，优选12—16h，再移入37℃的烘箱内熟化至少5h，经清洗即可得到胶原基复合角膜替代物，具体来说，包括以下步骤：
1)将胶原溶于水配成质量分数为13.7%的溶液，于4℃5000r/min离心去除气泡，按计量在冰水浴中与GMAA水溶液、EDC和NHS等物质的量混合的水溶液与引发剂Irgacure2959的无水乙醇溶液均匀混合反应，用2mol/L氢氧化钠溶液调节pH为5—6，优选5.5；
2)将混合反应溶液浇注到模具内，再放入夹具中夹紧固定，于紫外固化箱中固化30--40，优选40min，取出后保持湿度100%的条件下，室温反应至少12h，优选12--16h，再移入37℃的烘箱内熟化至少5h；
3)去除夹具，打开模具取出角膜样品放入pH=7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)中浸泡，每隔12h更换新鲜的PBS，清洗7天后，将样品放入含有1wt%氯仿的pH=7.4的PBS中，于4℃下保存备用。
在制备得到本发明的胶原基复合角膜替代物之后，将其作为细胞培养基板向其表面接种骨髓间充质干细胞MSCs，待其融合率到达90%后进行由商业化转染试剂PolyJetTM介导的内皮抑制素基因转染后，即可得到可递送内皮抑制激素的胶原基复合角膜替代物，可分别在转染后的第2、5、8、12天取细胞培养基检测其中的内皮抑制素含量加以验证。
本发明的复合角膜替代物与现有的产品和技术相比具有如下的优点：
胶原基角膜替代物具有良好的生物相容性，可诱导和促进角膜再生，并随角膜再生而生物降解；该角膜替代物具有与人角膜相似的力学性能、光学性能，GMAA聚合物网络的引入明显提高了角膜替代物在胶原酶中的稳定性及力学强度。制备过程中除胶原外的第二组分是由人体自身具有的氨基酸制备而来，本身即具有良好地生物相容性。在凝胶制备过程中，除了同时进行的胶原分子自交联和GMAA光引发聚合外，胶原分子上的胺基还可与GMAA分子上的羧基交联，由此本发明中的复合角膜替代物体系无需再引入GMAA的交联剂这一组分，进一步提高了角膜替续检测到培代物的生物相容性。向此角膜替代物表面接种MSCs并转染内皮抑制素基因后，可在两周内持养基中的内皮抑制素蛋白，且MSCs作为组织工程角膜种子细胞移植后还具有潜在的可分化成角膜上皮细胞、重建受损角膜组织的功能。该角膜替代物将基因转染与组织工程有效结合，制作方法简单，易于加工处理和长期保存及运输。本发明的复合角膜替代物用于制造治疗眼科相关疾病的药物，可延缓替代物的降解和特定治疗因子的原位释放。
附图说明
图1为各组分角膜替代物在胶原酶溶液中的降解情况，其中■为胶原Collagen，●为实施例2制备的Arg-0.5，▲为实施例3制备的Arg-1。
图2为MSCs表达内皮抑制素基因的情况以及随着时间的变化趋势。
图3为胶原和本发明的复合材料的红外谱图。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步说明本发明的技术方案。商业化转染试剂PolyJetTMDNA InVitro Tranfection Reagent,SignaGen Laboratories Catalog#:SL100688；无血清DMEM培养基，Thermo Scientific HyClone Classical Liquid Media Dulbecco's Modified Eagles Medium,High Glucose，L-Glutamine/Without Sodium Pyruvate；内皮抑制素质粒(pEndo)，InvivoGenPblast49—mcs；骨髓间充质干细胞MSCs采用文献Non-viral endostatin plasmid transfectionof mesenchymal stem cells via collagen scaffolds，Biomaterials30（2009）1222—1231的方法提取分离MSCs。
GMAA的制备（参考文献Jianshu Li,Zhizhang Guo,Jianyu Xin,Guanglei Zhao,Huining Xiao.21-Arm star polymers with different cationic groups based on cyclodextrin corefor DNA delivery.Carbohydrate Polymers,2010,79,277-283.）：
1.取1g精氨酸溶解在10ml去离子水中，用2mol/L的NaOH溶液调节pH在11左右，向溶液中通入氮气10min；
2.在氮气保护环境下向精氨酸水溶液中缓慢滴加甲基丙烯酸缩水甘油酯(Glycidylmethacrylate，GMA)，令GMA与精氨酸的摩尔比为4：1，待滴加完毕后继续在室温下反应过夜；
3.使用分液漏斗除去体系中未反应的GMA(上层)，向溶液中加入其十倍体积的无水乙醚后充分搅拌，静置后使用分液漏斗除去乙醚相(上层)，将下层液体冷冻干燥后得到甲基丙烯酸甘油化的精氨酸单体。反应式如下：
实施例1：
胶原角膜替代物各组分比例如下：
猪皮Ⅰ型胶原：GMAA(质量比)=1：0
Coll-NH2：EDC：NHS(摩尔比)=1：1：1
用上述各组分制备复合角膜替代物的步骤如下：
1.交联胶原角膜替代物的制备：取0.5g13.7%的猪皮Ⅰ型胶原溶液到注射器内，并通过T型容器连接另一注射器密封，反复推拉混均，然后用微量注射器按计量注入交联剂EDC和NHS，其中Coll-NH2：EDC：NHS=1：1：1(摩尔比)，反复推拉混均，然后用微量注射器加入适量2mol/L的NaOH溶液调节pH在5.5左右。混合均匀后将溶液浇注到模具内，再放入夹具中夹紧固定，100%湿度，室温反应16h，再移入37℃的烘箱内熟化5h。去除夹具，打开模具取出角膜样品，放入20ml磷酸盐缓冲液(PBS，pH=7.4)中浸泡，每隔12h更换新鲜的PBS，清洗7天后，将样品放入含有1%氯仿的PBS溶液中，于4℃下保存备用。制得的角膜替代物厚400μm，直径11.5-12mm，与人角膜具有相同曲率。
2.取片状角膜替代物样品进行力学性能、光学性能和降解性能测试，此角膜替代物样品命名为Col1agen，其中进行力学性能测试的角膜替代物样品的尺寸为20mm×3mm，以上所述各项测试所用样品厚度皆为400μm。
实施例2：
胶原/GMAA复合角膜替代物各组分比例如下：
猪皮Ⅰ型胶原：GMAA(质量比)=1：0.5
Coll-NH2：EDC：NHS(摩尔比)=1：1：1
Irgacure2959：GMAA(摩尔比)=0.02
用上述各组分制备复合角膜替代物的步骤如下：
1.复合角膜替代物的制备：取0.5g13.7%的猪皮Ⅰ型胶原溶液到注射器内，并通过T型容器连接另一注射器密封，反复推拉混均；按计量为猪皮Ⅰ型胶原：GMAA=1：0.5(质量比)的GMAA单体溶于水中，用微量注射器通过密封垫移入T型容器内，反复推拉混合均匀，然后用微量注射器依次注入交联剂EDC、NHS和光引发剂Irgacure2959，其中Coll-NH2：EDC：NHS=1：1：1(摩尔比)，引发剂Irgacure2959：GMAA=0.02：1(摩尔比)，反复推拉混合均匀，然后加入适量2mol/L的NaOH溶液调节pH在5.5左右。混合均匀后将溶液浇注到模具内，再放入夹具中夹紧固定，于紫外固化箱中固化40min，取出后室温反应16h，再移入37℃的烘箱内熟化5h。去除夹具，打开模具取出角膜样品，放入20ml磷酸盐缓冲液(PBS，pH=7.4)中浸泡，每隔12h更换新鲜的PBS，清洗7天后，将样品放入含有1%氯仿的PBS溶液中，于4℃下保存备用。制得的复合角膜替代物厚500-600μm，直径11.5-12mm，与人角膜具有相同曲率。
2.取片状角膜替代物样品进行力学性能、光学性能和降解性能测试，此角膜替代物样品命名为Arg-0.5，其中进行力学性能测试的角膜替代物样品的尺寸为20mm×3mm，以上所述各项测试所用样品厚度皆为400μm。
实施例3：
胶原GMAA复合角膜替代物各组分比例如下：
猪皮Ⅰ型胶原：GMAA(质量比)=1
Coll-NH2：EDC：NHS(摩尔比)=1：1：1
Irgacure2959：GMAA(摩尔比)=0.02
用上述各组分制备复合角膜替代物的步骤如下：
1.复合角膜替代物的制备：取0.5g13.7%的猪皮Ⅰ型胶原溶液到注射器内，并通过T型容器连接另一注射器密封，反复推拉混均；按计量为猪皮Ⅰ型胶原：GMAA=1(质量比)的GMAA溶于水中，用微量注射器通过密封垫移入T型容器内，反复推拉混合均匀，然后用微量注射器依次注入交联剂EDC、NHS和光引发剂Irgacure2959，其中Coll-NH2：EDC：NHS=1：1：1(摩尔比)，引发剂Irgacure2959：GMAA=0.02：1(摩尔比)，反复推拉混合均匀，然后加入适量2mol/L的NaOH溶液调节pH在5.5左右。混合均匀后将溶液浇注到模具内，再放入夹具中夹紧固定，于紫外固化箱中固化40min，取出后室温反应16h，再移入37℃的烘箱内熟化5h。去除夹具，打开模具取出角膜样品，放入20ml磷酸盐缓冲液(PBS，pH=7.4)中浸泡，每隔12h更换新鲜的PBS，清洗7天后，将样品放入含有1%氯仿的PBS溶液中，于4℃下保存备用。制得的复合角膜替代物厚500-600μm，直径11.5-12mm，与人角膜具有相同曲率。
2.取片状角膜替代物样品进行力学性能、光学性能和降解性能测试，此角膜替代物样品命名为Arg-1，其中进行力学性能测试的角膜替代物样品的尺寸为20mm×3mm，以上所述各项测试所用样品厚度皆为400μm。
将胶原和Arg-1进行红外光谱分析，结果如附图3所示，纯胶原凝胶谱图特征峰为：3300～3500cm-1处的N-H伸缩振动吸收峰，1640cm-1处的酰胺I带，1548cm-1处的酰胺Ⅱ带，1455cm-1处-CH2-。Arg-1红外谱图：3300～3500cm-1处的N-H伸缩振动吸收峰加强，1725cm-1处的酯基C=O以及1153cm-1处的C-O伸缩振动峰。另外，纯胶原凝胶的1640cm-1，1548cm-1，1455cm-1特征峰都得到了很好的体现，说明胶原/GMAA聚合物半互穿网络角膜替代物的成功制备。
实施例4：
1.将Arg-1凝胶切成48孔培养板形状大小，灭菌后转移到48孔培养板中，使其完全置于孔板底部并将孔板中的液体全部吸出。再将孔板在紫外灯下灭菌30分钟，使凝胶完全贴壁。
2.将生长至指数生长期的MSCs细胞悬液加入到底部铺有凝胶的孔板中(对于48孔板，每孔加培养基300μl，接种密度约为4×104/孔)，在37℃，5%CO2，100%湿度条件下培养24小时。
3.根据商业化DNA转染试剂PolyJetTM说明书配置PolyJetTM/DNA复合物：将内皮抑制素质粒(pEndo)和PolyJetTM分别用无血清DMEM培养基稀释后混合，比例为3μl PolyJetTM/1μgDNA，吹打混匀后静置复合15-20分钟(注意复合时间不要超过20分钟，否则可能导致复合物解离)。
4.将孔板中的液体吸出，每孔加入DMEM培养基450μl(10%FBS)，放入细胞培养箱30分钟后加入再向每孔中加入50μl含1μg或1.5μg质粒DNA的PolyJetTM/DNA复合物，置于37℃，5%CO2，100%湿度条件下培养。
5.6小时后将孔板中的液体全部吸出，再加入300μl DMEM培养基(10%FBS)继续培养48小时。
6.取200μl孔板中的培养基使用酶联免疫吸附法（使用ELISA试剂盒RayBiotech，Inc.The Protein Array Pioneer Company）检测其中的内皮抑制素表达量，再向孔板中加入200μl新鲜DMEM培养基(10%FBS)继续培养。
7.在转染后的第5、8、12天重复步骤的操作。
实施例1至实施例3制备的角膜替代物性能指标参数如表1、图1所示
实施例4所测得内皮抑制素的表达量及其随时间的变化情况如图2所示。
表1角膜替代物的物理性能参数
| 人角膜 | Collagen | Arg-0.5 | Arg-1 | |
| 平衡含水量(%) | 78 | 90 | 92.7 | 91.7 |
| 白光透过率(%) | >87 | 96.2±0.4 | 90.3±0.9 | 88.46±2.01 |
| 拉伸强度(MPa) | 3.81±0.40 | 0.40±0.02 | 0.66±0.04 | 1.18±0.30 |
| 断裂伸长率(%) | ---- | 36.3±5.4 | 15.4±2.1 | 24.35±7.9 |
| 弹性模量(MPa) | 3-13 | 1.62±0.34 | 4.86±0.63 | 5.88±0.12 |
以上对本发明做了示例性的描述，应该说明的是，在不脱离本发明的核心的情况下，任何简单的变形、修改或者其他本领域技术人员能够不花费创造性劳动的等同替换均落入本发明的保护范围。
Claims (8)
1.一种胶原基复合角膜替代物，其特征在于，以胶原、GMAA为原料，以水为溶剂，以碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺为交联剂对胶原进行交联，以光引发剂引发GMAA进行聚合反应，同时GMAA分子结构上的官能基团与胶原分子发生交联反应，由此将反应产物经过浇注成膜制备成胶原/GMAA半互穿聚合物网络角膜替代物；
所述GMAA为甲基丙烯酸甘油化的精氨酸单体，将精氨酸分子和甲基丙烯酸甘油酯化制备而成，结构如下：
其中碳二亚胺与胶原的摩尔比为1：(1—1.2)，所述胶原以胶原分子上氨基数目计；光引发剂与GMAA的摩尔比为(0.02—0.03)：1；胶原与GMAA的质量比为1：(0.5—1)；碳二亚胺与N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1：1。
2.根据权利要求1所述的一种胶原基复合角膜替代物，其特征在于，所述光引发剂选用1－[4－(2－羟乙氧基)－亚苯基]－2－羟基－2′，2′－二甲基乙酮(Irgacure2959)、甲基乙烯基酮或者安息香中的一种。
3.根据权利要求1所述的一种胶原基复合角膜替代物，其特征在于，所述胶原可选用猪Ⅰ型胶原。
4.一种胶原基复合角膜替代物的制备方法，其特征在于，先将胶原、甲基丙烯酸甘油化的精氨酸单体、碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺、光引发剂按照计量在溶剂水中混合均匀，然后调整体系pH值为5—6，将混合反应溶液浇注到模具内，再放入夹具中夹紧固定，于紫外固化箱中固化30—40min，取出后保持湿度100％的条件下，室温20—25摄氏度反应至少12h，再移入37℃的烘箱内熟化至少5h，经清洗即可得到胶原基复合角膜替代物；
其中碳二亚胺与N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1：1；光引发剂与甲基丙烯酸甘油化的精氨酸单体的摩尔比为(0.02—0.03)：1；胶原与甲基丙烯酸甘油化的精氨酸单体的质量比为1：(0.5—1)；碳二亚胺与胶原的摩尔比为1：(1—1.2)，所述胶原以胶原分子上氨基数目计。
5.根据权利要求4所述的一种胶原基复合角膜替代物的制备方法，其特征在于，调整体系pH值为5.5。
6.根据权利要求4所述的一种胶原基复合角膜替代物的制备方法，其特征在于，待从紫外固化箱中取出后，保持湿度100％的条件下，室温20—25摄氏度反应12—16h，再移入37℃的烘箱内熟化至少5h，然后去除夹具，打开模具取出角膜样品放入pH＝7.4的磷酸盐缓冲液中浸泡，每隔12h更换新鲜的PBS，清洗7天后，将样品放入含有1wt％氯仿的pH＝7.4的磷酸盐缓冲液中，于4℃下保存备用。
7.可得到可递送内皮抑制激素的胶原基复合角膜替代物的制备方法，其特征在于，利用如权利要求1所述的胶原基复合角膜替代物，将其作为细胞培养基板向其表面接种骨髓间充质干细胞MSCs，待其融合率到达90％后进行由商业化转染试剂PolyJetTM介导的内皮抑制素基因转染后，即可得到可递送内皮抑制激素的胶原基复合角膜替代物。
8.如权利要求1所述的胶原基复合角膜替代物在制造治疗眼科相关疾病的药物中的应用，可实现延缓替代物的降解和特定治疗因子的原位释放。
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