CN107456608A - 一种三维多孔结构的人工皮肤及制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种三维多孔结构的人工皮肤及制备方法。采用如下方法制备：(1)利用“溶剂‑盐析‑透析‑溶剂”序贯处理流程，提取、纯化生物材料，且提高其溶解度；(2)配置不同浓度材料溶液，冷冻干燥，交联剂交联，制备不同孔径的单层人工皮肤；(3)对上述单层人工皮肤进行细胞、动物疗效验证；(4)按照人类皮肤孔径梯度规律，首先将不同孔径的人工皮肤叠加，加压固定，然后浸入可溶解该材料的溶剂“水化”处理，最后冷冻干燥，保存。经动物实验证实，本方法制备的仿生皮肤显著促进创面愈合。

Description

一种三维多孔结构的人工皮肤及制备方法

技术领域

本发明属于仿生皮肤和生物材料领域，具体涉及一种三维多孔结构的人工皮肤及制备方法。

背景技术

疏松多孔结构的生物材料被广泛应用于人造器官、组织中，因为该结构利于细胞增殖、迁移，以及营养物质、氧气、代谢废物的输送，为细胞增殖和组织再生的微环境。研究结果显示，人造皮肤中的孔径可以显著影响皮肤细胞的粘附增殖、迁移。不同的种类的细胞在不同材料的组织工程支架中，生物学特性也大不相同。对于内皮细胞而言，其能适应的最大孔径为80微米左右，因内皮细胞在氮化硅支架中，无法跨越覆盖大于80微米的孔径；对于成纤维细胞而言，其在90微米左右孔径的氮化硅支架，以及38微米～150微米孔径的聚乳酸支架中，显示出更好的增殖、迁移性能。

除此之外，人天然皮肤组织学研究显示，靠近表皮和靠近皮下组织的真皮区域，胶原纤维和弹性纤维明显降低。该结果提示，真皮浅层和深层的组织间隙明显大于真皮中间层，即仿生皮肤中，孔径分布规律为浅层的孔径大于深层的孔径。

但是，目前仿生皮肤制备领域中，以下问题尚不明确：

问题之一：如何制备与天然皮肤有相似孔径梯度的仿生皮肤？

人造皮肤的结构显著影响接种细胞的活性和组织的性能。目前研究尚不明确，是否有一个“最佳”孔径来对应特定的细胞类型和支架成分。根据人类天然真皮研究结果显示，在不同深度，人真皮纤维空隙和纤维结构都不是均匀的。

但是，目前人工真皮支架倾向于设计成具有“最佳”孔径的均匀结构。然而，天然人真皮不仅结构并不是均匀的，而且孔径也变化非常大。文献报道，模仿软骨梯度结构的仿生多层胶原支架，与单层胶原支架相比，显著促进了小鼠成骨细胞增殖。由此可见，形态结构和孔径均对人工真皮支架产生重要影响。因此，与天然皮肤有相似孔径梯度的仿生皮肤，有望更加利于创面愈合(即浅层的孔径大于深层的孔径)。

问题之二：如何提高生物材料溶解度？

生物材料多为生物大分子结构，溶解度较低，难以配置成高浓度的溶液，而且天然生物材料杂质较多，需要经过纯化才能去除致热源、过敏原等对动物体有害的物质。通过常规方法难以制备结构密度高的生物材料支架。

因此，如何提高生物材料溶解度，且有效去除杂质，是制备高密度、复杂结构人造器官的必要条件之一。

问题之三：如何实现多层结构之间的无缝联结？

目前技术中，往往容易在材料制备阶段，实现材料融合。

但是，一旦单层材料做好之后，很难在不损坏单层结构的前提下，实现多层材料的无缝联结。

因此，实现材料无缝联结是构建复杂组合型人造器官的另一个必要条件。

针对以上问题，本发明方法拟从以下三方面解决：

第一，根据天然人类皮肤组织学证据，以及单层人工皮肤的生物实验结果，设计制备按照人天然皮肤的孔径梯度设计的多层仿生皮肤(即浅层的孔径大于深层的孔径)。通过动物实验验证其疗效。

第二，通过“溶剂-盐析-透析-溶剂”流程，进行生物材料溶液的纯化，且去除杂质，最终提高生物材料的溶解度。

第三，通过“溶剂水化-冷冻干燥”流程，实现材料无缝联结。利用可溶解特定材料的溶剂，首先进行“水化”处理，然后进行冷冻干燥，最终实现多层生物材料之间的无缝联结。

发明内容

针对上述情况，本发明目的是模仿天然真皮纤维分布稀疏规律，根据细胞实验、动物实验结果，提供一种孔径在30μm～200μm之间，且浅层孔径大于深层孔径的仿生皮肤及制备方法。

为达上述目的，本发明所采用的技术方案如下：

一种与人类皮肤有相似孔径分布梯度的多层仿生皮肤及制备方法，包括以下步骤：

(1)通过“溶剂-盐析-透析-溶剂”序贯处理流程纯化生物材料，提高其溶解度：

将生物材料溶解于溶剂中，持续震荡，离心，取上清液，去掉沉渣。

往上清液中加入10％-15％NaCl溶液，盐析，取沉淀物。

将盐析沉淀得到的生物材料装入半透膜，透析掉盐离子。

透析后的生物材料再用上述溶剂溶解，备用。

(2)制作与人类皮肤有相似孔径分布梯度(浅层的孔径大于深层的孔径)的多层仿生皮肤：

将步骤(1)制得的溶液，等比稀释，配置成等比浓度梯度的生物材料溶液。

将上述溶液装入多孔板中，冰箱冷冻，然后放入冻干机中，冻干24-48h，用30％戊二醛蒸汽交联，6-12h，最后，用0.1M-0.5M甘氨酸溶液浸泡12-24h，中和残余的戊二醛。

利用扫描电镜测量该单层人工皮肤的平均孔径。

按照天然人类真皮的孔径分布梯度规律，选取合适直径的单层人工皮肤，逐层叠加起来，两侧用多孔薄片固定。

(3)通过“溶剂水化-冷冻干燥”流程，实现多层生物材料之间的无缝联结：

将步骤(2)制得的多层材料进入溶剂中约10-20分钟，进行“水化”处理。

然后，将上述多层材料放入冻干机，冷冻干燥处理约24小时。

干燥后，保存。

(4)根据步骤(3)生物验证的结果，按照人类皮肤孔径梯度规律，首先将不同孔径的膜叠加，适当加压固定，然后浸入可溶解该材料的溶剂“水化”处理，最后冷冻干燥，实现各层之间无缝联结。

进一步的，步骤(1)中设定的单层人工皮肤孔径在30μm～200μm之间。

进一步的，步骤(1)中，利用“溶剂-盐析-透析-溶剂”序贯处理流程，进行生物材料的纯化，且提高生物材料的溶解度。

进一步的，步骤(1)中设定的制作支架的生物材料，包括具有生物安全性、相容性、可部分或全部溶解于某溶剂的所有生物材料，包括但不限于胶原蛋白、羟基乙酸衍生物、乳酸衍生物以及其他的聚酯纤维衍生物等。

进一步的，步骤(1)中设定的材料加工技术，包括可将材料制备成三维多孔结构的所有技术，包括但不限于冷冻干燥法，气泡制孔法、相分离制孔法等。

进一步的，步骤(2)通过控制生物材料浓度调节人工皮肤的孔径(浓度越高，冻干得到的孔径越小)。

进一步的，步骤(2)按照人类皮肤的孔径分布梯度(浅层的孔径大于深层的孔径)来制备多层仿生皮肤。

进一步的，步骤(2)所述的人类皮肤的孔径分布梯度，依据是组织学研究数据、细胞实验、动物实验结果，即位于支架外表面的较大孔径直接与新生上皮或者创基接触，有望促进肉芽组织生成和新生上皮生长；位于支架内部的较小孔径可以更好的抵御生物降解，有望更久的维持支架的三维结构。

进一步的，步骤(3)通过“溶剂水化-冷冻干燥”流程，实现多层生物材料之间的无缝联结，而避免使用外源性添加的粘合剂。

进一步的，步骤(4)中，通过“溶剂水化-冷冻干燥”序贯处理流程，实现多层生物材料之间的无缝联结；步骤(4)中，多层仿生皮肤孔径分布规律为浅层的孔径大于深层的孔径。

进一步的，所述的与人类皮肤有相似孔径分布梯度的多层仿生皮肤，用于治疗哺乳动物皮肤缺损的仿生皮肤、创面覆盖物中的用途，其中，所述哺乳动物选自人、狗、猫、牛、马、兔、猪、小鼠或大鼠，并且优选是人。

本发明优点：实验结果提示：该多层仿生皮肤可显著促进创面愈合，有较好疗效。

附图说明

下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细说明：

图1：小孔径人工皮肤大体图(左)、H&E染色图(中)、扫描电镜图(右)。

图2：大孔径人工皮肤大体图(左)、H&E染色图(中)、扫描电镜图(右)。

图3：荧光显微镜观察细胞在人工皮肤中的分布。箭头指的是细胞核。左侧：小孔径人工皮肤；右侧：大孔径人工皮肤。

图4：扫描电镜观察细胞在人工皮肤表面分布。箭头指的是细胞。左侧：小孔径人工皮肤；右侧：大孔径人工皮肤。

图5：多层仿生皮肤扫描电镜图(上层、下层为大孔径；中间层为小孔径)。扫描电镜示：各层之间已经无缝联结在一起。

图6：动物实验检测该多层仿生皮肤疗效。

具体实施方式

下面给出的实施例拟对本发明作进一步说明，但不能理解为是对本发明保护范围的限制，本领域技术人员根据本发明内容对本发明的一些非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。

本发明方法制备了与人类皮肤有相似孔径分布梯度的多层仿生皮肤，通过动物实验证实，该仿生皮肤有效促进创面愈合，有较好疗效。

实施例1：小孔径胶原膜的制备、H&E染色、扫描电镜观察。

将胶原蛋白粗品溶解于1.0％醋酸溶液中，持续震荡。离心后取上清液，加入10％NaCl溶液，盐析沉淀胶原蛋白。将盐析沉淀得到的胶原蛋白装入半透膜，透析掉盐离子。透析后的胶原蛋白用1.0％醋酸溶液溶解。

取上述胶原蛋白溶液(不稀释)，装入多孔板中，冰箱冷冻8小时。取出后，放入冻干机中，冻干时间为48h。冻干后予以戊二醛蒸汽交联。取出后，用0.1M甘氨酸溶液浸泡24h，中和残余的戊二醛。纯净水漂洗5次。

干燥后，放置于扫描电镜下观察、拍照。H&E染色观察人工皮肤微观形态。该小孔径人工皮肤大体图、H&E染色图、扫描电镜图如图1所示。

实施例2：大孔径胶原膜的制备、H&E染色、扫描电镜观察。

将胶原蛋白粗品溶解于1.0％醋酸溶液中，持续震荡。离心后取上清液，加入10％NaCl溶液，盐析沉淀胶原蛋白。将盐析沉淀得到的胶原蛋白装入半透膜，透析掉盐离子。透析后的胶原蛋白用1.0％醋酸溶液溶解。

取上述胶原蛋白溶液(稀释为原浓度的二分之一)，装入多孔板中，冰箱冷冻8小时。取出后，放入冻干机中，冻干时间为48h。冻干后予以戊二醛蒸汽交联。取出后，用0.1M甘氨酸溶液浸泡24h，中和残余的戊二醛。纯净水漂洗5次。

干燥后，放置于扫描电镜下观察、拍照。H&E染色观察人工皮肤微观形态。该大孔径人工皮肤大体图、H&E染色图、扫描电镜图如图2所示。

实施例3：荧光显微镜观察细胞在人工皮肤中的分布。

分离、培养和接种小鼠成纤维细胞。接种细胞后，在细胞培养箱(37℃，5％CO²)内培养。培养至第3天后，将该人工皮肤浸泡在4％(v/v)多聚甲醛溶液中1小时，用冷冻切片包埋剂，冷冻包埋，显微切片。荧光显微镜下观察细胞在人工皮肤内部的分布(图3)。

实施例4：扫描电镜观察细胞在人工皮肤表面分布。

分离、培养和接种小鼠成纤维细胞。接种细胞后，在细胞培养箱(37℃，5％CO²)内培养。培养至第3天后，将该人工皮肤浸泡在10％(v/v)戊二醛溶液中3小时，叔丁醇、酒精梯度脱水，干燥、喷金。扫描电镜下观察细胞在人工皮肤表面的分布(图4)。

实施例5：扫描电镜观察该多层仿生皮肤(上层、下层为大孔径；中间层为小孔径)。

将上述制备的两种孔径的人工皮肤，按照“大孔径-小孔径-大孔径”的顺序，逐层叠加起来，两侧用多孔薄片固定。将上述多层材料进入1.0％醋酸溶液中约20分钟，进行“水化”处理。然后，将上述多层材料放入冻干机，冷冻干燥处理约24小时。扫描电镜观察该多层仿生皮肤，提示各层之间已经无缝联结在一起(图5)。

实施例6：动物实验检测该多层仿生皮肤疗效。

首先，取实验用小鼠，通过腹腔注射1％戊巴比妥麻醉(0.01mg/g体重)进行麻醉。刮去小鼠背部毛发，酒精消毒皮肤。在小鼠背部(脊柱两侧对称的位置)用4mm打孔器制作两个对称的全层皮肤缺损创面。然后，将该多层仿生皮肤移植到创面中。支架移植后第1、3、5、7天，以佳能数码相机拍照，观察创面愈合比例(在创面旁放置直径为4mm的参照物)。实验结果提示：该多层仿生皮肤可显著促进创面愈合，有较好疗效(图6)。

Claims (4)

1.一种三维多孔结构的人工皮肤及制备方法，其特征在于：采用如下方法制备得到：(1)通过“溶剂-盐析-透析-溶剂”序贯处理流程纯化生物材料，提高其溶解度：将生物材料溶解于溶剂中，持续震荡，离心，取上清液，去掉沉渣，往上清液中加入10％-15％NaCl溶液，盐析，取沉淀物，将盐析沉淀得到的生物材料装入半透膜，透析掉盐离子，透析后的生物材料再用上述溶剂溶解，备用；(2)制作与人类皮肤有相似孔径分布梯度(浅层的孔径大于深层的孔径)的多层仿生皮肤：将步骤(1)制得的溶液，等比稀释，配置成等比浓度梯度的生物材料溶液，将上述溶液装入多孔板中，冰箱冷冻，然后放入冻干机中，冻干24-48h，用30％戊二醛蒸汽交联，6-12h，最后，用0.1M-0.5M甘氨酸溶液浸泡12-24h，中和残余的戊二醛，利用扫描电镜测量该单层人工皮肤的平均孔径，按照天然人类真皮的孔径分布梯度规律，选取合适直径的单层人工皮肤，逐层叠加起来，两侧用多孔薄片固定；(3)通过“溶剂水化-冷冻干燥”流程，实现多层生物材料之间的无缝联结：将步骤(2)制得的多层材料进入溶剂中约10-20分钟，进行“水化”处理，然后，将上述多层材料放入冻干机，冷冻干燥处理约24小时，干燥后，保存；(4)根据步骤(3)生物验证的结果，按照人类皮肤孔径梯度规律，首先将不同孔径的膜叠加，适当加压固定，然后浸入可溶解该材料的溶剂“水化”处理，最后冷冻干燥，实现各层之间无缝联结。

2.如权利要求1所述的一种三维多孔结构的人工皮肤及制备方法，其特征在于：步骤(1)中设定的单层人工皮肤孔径在30μm～200μm之间。

3.如权利要求1所述的一种三维多孔结构的人工皮肤及制备方法，其特征在于：步骤(2)中，通过控制生物材料浓度，进而调节人工皮肤的孔径(浓度越高，制备得到的孔径越小)。

4.如权利要求1所述的一种三维多孔结构的人工皮肤及制备方法，其特征在于：步骤(4)中，通过“溶剂水化-冷冻干燥”序贯处理流程，实现多层生物材料之间的无缝联结，多层仿生皮肤孔径分布规律为浅层的孔径大于深层的孔径。