CN107029224B - 一种免疫增强抗肿瘤胶原组合物、制备方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种免疫增强抗肿瘤胶原组合物、制备方法及其应用，其特征在于：所述的组合物包含抗肿瘤因子、胶原蛋白、多糖物质和活性因子。可应用于但不限于用于治疗乳腺癌、结直肠癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、膀胱癌、黑色素瘤、肺癌、胃癌、肝癌、头、颈部鳞状细胞癌、子宫颈癌、肾细胞癌、甲状腺癌、急性髓性白血病、骨髓瘤、食管鳞状细胞癌和淋巴瘤等的细胞中。

Description

一种免疫增强抗肿瘤胶原组合物、制备方法及其应用
技术领域
本发明涉及医用生物材料技术领域，具体涉及一种免疫增强抗肿瘤胶原组合物、制备方法及其应用，该组合物能用于肿瘤预防、肿瘤术后防复发或延长肿瘤患者的生存期。
背景技术
恶性肿瘤已成为威胁人类健康和生命的“第一杀手”，在人类死亡原因中，因患恶性肿瘤致死的病例已上升到首位。全世界每年大约有870万人患肿瘤，死亡约690万人，仅我国每年就有105万人死于晚期恶性肿瘤。目前治疗恶性肿瘤的方法十分有限，而肿瘤疫苗，是继手术切除、化疗、放疗等手段的另一种免疫治疗方案，包括治疗性和预防性疫苗。肿瘤疫苗包括肿瘤细胞疫苗、病毒疫苗、肿瘤抗原及抗原分子类疫苗、重组病毒、病菌疫苗、DNA疫苗、树突状细胞疫苗、热休克蛋白－多肽复合物疫苗等。
肿瘤细胞疫苗是研究、运用最早的肿瘤疫苗，是将整个肿瘤细胞作为抗原导入患者体内，经树突状细胞(DC)提呈免疫细胞，诱导特异性的抗肿瘤免疫应答。由于肿瘤细胞带有肿瘤的全部抗原，无需考虑分离肿瘤特异性抗原，而且由于自体肿瘤细胞具有和正常组织相同的人类白细胞抗原，不会引发机体强烈的免疫排斥反应。但是肿瘤能在人体内发生并持续生长，因其具有多重免疫逃逸机制，如免疫原性低下、缺少刺激粘附分子、抗原呈递效率低下等等。因此，为提高肿瘤细胞免疫效果，应在疫苗中加入免疫增强剂，与抗原合并使用能增强抗原免疫性，提高肿瘤疫苗形成抗体的成功率。目前被FDA批准用于人体免疫的增强剂只有铝盐佐剂，而该佐剂由于材料的高度异质性，生产过程也难以实现统一标准，皮下注射易引起严重反应(如出现红斑、皮下结节、接触性过敏和肉芽肿性炎症)。因此，免疫增强剂还可以从新材料中寻找更安全、更有效的替代品。
细胞外基质材料是一种潜在的生物型免疫增强剂材料，因此其本身在动物体内可以起到调控细胞微环境的作用，从而促进细胞相互作用、血管化及免疫反应。免疫原去除小肠粘膜下层(SIS)材料是在临床上广泛应用于腹壁、泌尿道、硬脑膜、血心管修复等软组织缺损修复、加固的生物医用材料。本身基质中除了I型胶原蛋白的主要成分，还含有糖胺聚糖、蛋白聚糖、纤维粘连蛋白、碱性纤维生长因子、血管内皮生长因子等生物因子，具有良好的生物相容性，可以促进缺损组织修复、血管化及功能重建。最为关键的是SIS材料与吞噬树突状细胞(DC)具有高度亲和性，而后者为最有效的抗原提呈细胞(APC)。另外SIS材料植入体内所激发的免疫反应主要为Th2通路，实现材料与宿主组织的整合与重建，而抑制Th1通路介导的促炎症反应。因此，SIS材料可以作为安全、可降解、高效的免疫增强剂，与肿瘤疫苗复合后作为免疫整体，用于肿瘤预防、肿瘤术后防复发或延长肿瘤患者的生存期。
发明内容
本发明提供一种免疫增强抗肿瘤胶原组合物，该组合物采用SIS材料作为生物免疫增强剂，增强肿瘤细胞疫苗的免疫反应，用于肿瘤预防、肿瘤术后防复发或延长肿瘤患者的生存期。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：一种免疫增强抗肿瘤胶原组合物，其特征在于：所述的组合物包含抗肿瘤因子、胶原蛋白、多糖物质和活性因子。
所述组合物以动物小肠粘膜下层组织材料制成。
所述动物为哺乳动物，优选猪或牛。
所述抗肿瘤因子为灭活后肿瘤细胞疫苗。
所述肿瘤细胞包括乳腺癌、结直肠癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、膀胱癌、黑色素瘤、肺癌、胃癌、肝癌、头、颈部鳞状细胞癌、子宫颈癌、肾细胞癌、甲状腺癌、急性髓性白血病、骨髓瘤、食管鳞状细胞癌、淋巴瘤细胞或它们的组合。
所述灭活方式为紫外线法、热灭活法、深冷冻融法、戊二醛法或它们的组合。
所述的胶原蛋白为包含I型、III型、IV型和VI型胶原蛋白的组合物。
所述的多糖物质为包含硫酸软骨素和透明质酸的组合物。
所述的活性因子为包含纤维粘连蛋白、层粘连蛋白、整合素及生长因子的组合物。
所述组合物是可体内降解的片状或颗粒状组合物。
所述组合物的体内降解时间为1-3个月。
所述的免疫增强抗肿瘤胶原组合物片状形态为：长1-10cm，宽1-10cm，厚度0.1-1mm。
所述的免疫增强抗肿瘤胶原组合物颗粒状粒径为500μm以下。该颗粒尺寸用于注射。
本发明还提供一种免疫增强抗肿瘤胶原组合物的制备方法，其特征在于：采用动物小肠粘膜下层组织作为原料，依次通过组织前置处理、病毒灭活、免疫原消除、冷冻干燥、灭菌解析、肿瘤细胞培养、肿瘤细胞灭活、冷冻干燥、成型和灭菌解析；获得清除动物源病毒风险、细胞成分、DNA成分和α-Gal抗原，保留细胞外基质成分的物质，然后与抗肿瘤因子复合为组合物。
本发明上述的免疫增强抗肿瘤胶原组合物的制备方法，具体的步骤包括：
(1)组织前置处理：取动物小肠粘膜下层组织材料，清洗并将水滤干；
(2)病毒灭活：采用过氧乙酸-乙醇溶液浸泡动物小肠粘膜下层组织材料进行病毒灭活，然后进行超声清洗；
(3)免疫原去除：免疫原去除液采用加入胰蛋白酶和EDTA的PBS溶液，免疫原去除过程在多频超声装置中进行，然后进行超声清洗；得到动物小肠粘膜下层基质材料；
(4)冷冻干燥：将一层或多层动物小肠粘膜下层基质材料固定于模具上，将模具放置于真空冷冻干燥机中进行真空冷冻干燥；
(5)灭菌解析：采用环氧乙烷进行灭菌，并进行解析；
(6)肿瘤细胞培养：取自体或同种异体肿瘤切除组织，在MEM培养基中剪碎，体外培养传代后，分散为单个细胞，配制细胞培养液，向从步骤(4)得到的动物小肠粘膜下层基质材料上滴加细胞培养液；然后在培养箱中培养；
(7)肿瘤细胞灭活：肿瘤细胞培养完成后，将动物小肠粘膜下层基材料与肿瘤细胞一同从培养基中取出，得到复合免疫增强剂肿瘤疫苗组合物。
进一步地，本发明还可以包括以下步骤：将由步骤(7)得到的复合免疫增强剂肿瘤疫苗组合物放入冷冻干燥装置中冻干。得到片状复合免疫增强剂肿瘤疫苗组合物。
进一步地，本发明还可以包括以下步骤：采用液氮破碎装置将片状复合免疫增强剂肿瘤疫苗组合物研磨破碎；然后进行过筛，得到粉状复合免疫增强剂肿瘤疫苗材料。
进一步地，本发明还可以包括以下步骤：将由片状组合物或粉状组合物最后灭菌解析。
本发明步骤(2)的过氧乙酸-乙醇溶液，其中过氧乙酸的体积百分比浓度为0.1％-5％、乙醇的体积百分比浓度为5％-40％，过氧乙酸-乙醇溶液与动物小肠粘膜下层组织材料的体积比为(3-20)︰1，灭活时间2-4小时，温度范围为10-40℃。采用pH6-8中的PBS溶液超声处理，温度10-40℃，溶液与动物小肠粘膜下层组织材料体积比为20：1至40：1之间，每次10-30分钟；清洗2-4次；然后采用纯化水超声清洗，温度范围为10-40℃，纯化水与动物小肠粘膜下层组织材料比例为20：1至40：1之间，检测电导率为10μS/cm以下终止。超声装置频率优选40kHz，功率优选3000W以上。
本发明步骤(3)中的免疫原去除液包括：胰蛋白酶、EDTA和pH值为6-8的PBS溶液；所述免疫原去除液中胰蛋白酶质量百分比浓度为0.01-0.2％，EDTA的浓度为0.1-1mmol/L；进一步包括：免疫原去除液中胰蛋白酶的质量百分比浓度为0.02-0.05％，EDTA的浓度为0.4-0.8mmol/L，免疫原去除液pH值为7.0-8.0，优选为7.2-7.5；所述免疫原去除液与小肠粘膜下层组织材料体积比为(20-40)︰1；所述超声装置至少具有两个超声频率，其中低频频率范围为20-40KHz，高频频率为60-90KHz，其中低频处理5-40min，高频处理5-40min，温度范围为20-35℃。
步骤(4)中的冷冻干燥包括：预冻至-45℃，保温1-2小时，然后调节温度至-15℃，保温5-7小时，再调节温度至0℃，保温2-5小时，最后调节温度至25℃，保温3-8小时。
步骤(5)中的灭菌解析包括：采用环氧乙烷进行灭菌，灭菌条件为：在温度20-40℃保温，然后通入环氧乙烷灭菌；解析过程在通风的解析室中进行，温度控制在20℃之间，时间14天。
步骤(6)中的肿瘤细胞培养包括：取自体或同种异体肿瘤切除组织，在MEM培养基中剪碎，体外培养传代后，分散为单个细胞，进行细胞计数，配制(1.0-10.0)×106个/ml细胞培养液，向动物小肠粘膜下层基质材料滴加细胞培养液；然后在二氧化碳培养箱中培养3-28天，每隔一天换一次液。
步骤(7)中的肿瘤细胞灭活包括：肿瘤细胞培养完成后，将动物小肠粘膜下层基质材料与肿瘤细胞一同从培养基中取出，使用清洗液清洗，清洗液为pH6-8的PBS溶液，PBS溶液温度为20-40℃，PBS溶液与复合材料(动物小肠粘膜下层基质材料与肿瘤细胞)的比例(体积比)为20-40︰1，多次清洗。清洗后可采用-80℃深冷冻融灭活肿瘤细胞，或者可采用紫外线法、热灭活法或戊二醛法进行细胞灭活，得到复合免疫增强剂肿瘤疫苗材料。
进一步地，本发明还可以包括以下步骤：将由步骤(7)得到的复合免疫增强剂肿瘤疫苗组合物放入冷冻干燥装置中冻干，包括：预冻至-45℃，保温1-2小时，然后调节温度至-15℃，保温5-7小时，再调节温度至0℃，保温2-5小时，最后调节温度至25℃，保温3-8小时。得到片状复合免疫增强剂肿瘤疫苗组合物。
进一步地，本发明还可以包括以下步骤：片状复合免疫增强剂肿瘤疫苗材料切碎或剪碎，在进一步用低温破碎装置研磨破碎，在研磨破碎过程中将液氮与被切碎或剪碎的材料送入低温破碎装置中进行破碎，然后使破碎后的颗粒通过筛网，筛选500μm以下的颗粒，得到粉状组合物。
进一步地，本发明还可以包括以下步骤：将片状组合物或粉状组合物最后灭菌解析，具体的灭菌解析步骤包括：采用环氧乙烷进行灭菌，灭菌条件为：在温度20-40℃保温，然后通入环氧乙烷灭菌；解析过程在通风的解析室中进行，温度控制在20℃之间，时间14天。
其中步骤(7)的灭活方式可以采用深冷冻融法、紫外线法、热灭活法或戊二醛法的组合来进行。
所述肿瘤细胞灭活步骤为将免疫原去除基质与肿瘤细胞一同从培养基中取出，使用清洗液清洗后，灭活(包括但不限于紫外线、热灭活、深冷冻融、戊二醛等物理化学方法)肿瘤细胞。
本发明进一步提供上述免疫增强抗肿瘤胶原组合物的应用方法，具体为：通过植入或注射方式进入体内，通过激发增强免疫反应提高人体对肿瘤细胞杀灭能力。
本发明上述免疫增强抗肿瘤胶原组合物，所述的片状组合物用于皮下、肌肉植入，所述的颗粒状组合物用于皮下、肌肉植入或注射。
本发明上述免疫增强抗肿瘤胶原组合物，可预防肿瘤形成、生长、复发，延长肿瘤患者肿瘤切除后的生存期。
本发明上述免疫增强抗肿瘤胶原组合物，可应用于但不限于用于治疗乳腺癌、结直肠癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、膀胱癌、黑色素瘤、肺癌、胃癌、肝癌、头、颈部鳞状细胞癌、子宫颈癌、肾细胞癌、甲状腺癌、急性髓性白血病、骨髓瘤、食管鳞状细胞癌和淋巴瘤等的细胞中。
与现有技术相比，本发明具有以下显著优点和有益效果：
(1)灭活肿瘤细胞疫苗技术：通过物理、化学方法灭活肿瘤细胞，使肿瘤细胞丧失侵染能力，但是保留肿瘤细胞生理特征，增强人体免疫系统对肿瘤细胞识别能力；
(2)免疫增强机制：将灭活肿瘤细胞作为抗原物质，与SIS胶原组合物配伍使用，强化人体免疫反应，增强抗原提呈细胞识别肿瘤细胞能力；
(3)酶法细胞洗脱工艺：本发明采用更温和的胰蛋白酶和EDTA复合溶液以及双频超声处理相配合进行脱细胞处理，这一步骤是制造生物材料很重要的一个环节，只有将作为免疫原的细胞含量降至极低或完全去除，植入体内的材料才不会引发免疫反应，从而保证了材料的安全性；采用胰蛋白酶和EDTA使细胞与细胞外基质之间的连接被破坏，然后采用低频超声对细胞进行破碎，同时使用高频超声作用于破碎的细胞及细胞外基质，进一步使细胞脱离细胞外基质，从而达到脱细胞目的，针对脱细胞的各个环节采用对应的方法进行细节上的处理，使脱细胞效果更好，细胞残留更低；脱除细胞过程温和，减少对基质结构的破坏，保留基质中的活性生长因子；
(4)高效破碎技术：低温超高速剪切破碎技术，保护胶原蛋白、生物因子成分不受破坏；
(5)可降解吸收：体内可降解，降解过程可控，作用周期长；
(6)一种新型复合免疫增强剂肿瘤疫苗，包括肿瘤疫苗与免疫增强剂，增强肿瘤细胞疫苗的免疫反应，用于肿瘤预防、肿瘤术后防复发或延长肿瘤患者的生存期。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步具体描述，但不局限于此。
本发明中注射用水的使用标准依照国家药典中规定。
本发明所述小肠粘膜下层组织材料取自哺乳动物，猪小肠粘膜下层组织材料(SIS)或牛小肠粘膜下层组织材料均适用于本发明的实施例。
实施例1：
本实施例免疫增强抗肿瘤胶原组合物，通过以下步骤制备而成：
(1)组织前置处理：
取小肠粘膜下层组织材料分割成宽10cm，长15cm的规定尺寸，剔除淋巴组织，用自来水冲洗3次，再用纯化水冲洗至表面无污渍，然后放置于不锈钢滤网等滤水装置上，静置5分钟以上，将水滤干。
(2)病毒灭活：
采用过氧乙酸-乙醇溶液浸泡小肠粘膜下层组织材料进行病毒灭活，该过程可在不锈钢桶中进行。过氧乙酸-乙醇溶液中过氧乙酸的体积百分比浓度为1％、乙醇的体积百分比浓度为24％，过氧乙酸-乙醇溶液与小肠粘膜下层组织材料的体积比为6︰1，灭活时间2小时，温度范围为20℃。然后在超声装置中分别用PBS和纯化水清洗，其中采用pH7的PBS溶液超声处理，温度25℃，溶液与动物小肠粘膜下层组织材料体积比为30:1，每次10分钟；清洗3次；然后采用纯化水超声清洗，温度范围为25℃，纯化水与动物小肠粘膜下层组织材料比例为30:1，检测电导率为10μS/cm以下终止。超声装置频率优选45kHz，功率3000W。
(3)免疫原去除：
免疫原去除液采用加入胰蛋白酶和EDTA的pH7的PBS溶液，其中胰蛋白酶的质量百分比浓度为0.025％和EDTA质量百分比浓度为0.02％，免疫原去除液与小肠粘膜下层组织材料混合体积比为30︰1，免疫原去除过程在至少包括两个超声频率的超声波装置中进行，其中低频频率范围为24kHz，高频频率为80kHz，其中低频处理10min，高频处理15min，温度为25℃，超声波功率至少在5000W以上。然后在超声装置中分别用PBS和纯化水清洗，其中采用pH7的PBS溶液超声处理，温度25℃，溶液与动物小肠粘膜下层组织材料体积比为30:1，每次10分钟；清洗3次；然后采用25℃注射用水超声清洗，温度范围为25℃，注射用水与动物小肠粘膜下层组织材料比例为30:1，检测清洗后注射用水与清洗前注射用水电导率差为1μS/cm以下终止。超声装置频率优选45kHz，功率3000W。得到小肠粘膜下层基质材料。
(4)冷冻干燥：
将一层或多层小肠粘膜下层基质材料固定于模具(模具结构可以参考发明专利ZL201310203588.6和ZL201310203602.2)上，将模具平铺于真空冷冻干燥机中，关闭冻干室的门，打开循环泵约1min，开启压缩机对冻干箱致冷，将步骤(6)模具连同材料预冻至-45℃，保温2小时，然后开启真空泵，调节温度至-15℃，保温7小时，再调节温度至0℃，保温2小时，最后调节温度至25℃，保温4小时，真空冷冻干燥完成。
(5)灭菌解析：
采用环氧乙烷进行灭菌，灭菌条件为：先温度40℃保温4小时，湿度30-70％，然后通入浓度400mg/L环氧乙烷，灭菌6小时；解析过程在通风的解析室中进行，温度控制在20℃之间，时间14天。
(6)肿瘤细胞培养：
取自体或同种异体肿瘤切除组织，在MEM培养基中剪碎，体外培养传代后，分散为单个细胞，进行细胞计数，配制(1.0-10.0)×106个/ml细胞培养液，按每2×2cm2步骤(4)所得小肠粘膜下层基质材料滴加1ml细胞培养液的比例滴加细胞培养液；然后在体积百分比浓度5％二氧化碳培养箱中保持37℃培养3-28天，每隔一天换一次液。
(7)肿瘤细胞灭活：
肿瘤细胞培养完成后，将小肠粘膜下层基质材料与肿瘤细胞一同从培养基中取出，使用清洗液清洗，清洗液为pH6-8的PBS溶液，PBS溶液温度为40℃，PBS溶液与复合材料(小肠粘膜下层基质材料与肿瘤细胞)的比例(体积比)为30︰1，清洗3次，每次30min。清洗后采用-80℃深冷冻融灭活肿瘤细胞，得到复合免疫增强剂肿瘤疫苗组合物。
进一步地，本实施方式还可以包括以下步骤：将由步骤(7)得到的复合免疫增强剂肿瘤疫苗组合物放入冷冻干燥装置中冻干，包括：预冻至-45℃，保温1-2小时，然后调节温度至-15℃，保温5-7小时，再调节温度至0℃，保温2-5小时，最后调节温度至25℃，保温3-8小时。得到片状复合免疫增强剂肿瘤疫苗组合物。
进一步地，本实施方式还可以包括以下步骤：片状复合免疫增强剂肿瘤疫苗材料切碎或剪碎，在进一步用低温破碎装置研磨破碎，在研磨破碎过程中将液氮与被切碎或剪碎的材料送入低温破碎装置中进行破碎，然后使破碎后的颗粒通过筛网，筛选400μm的颗粒，得到粉状组合物。
进一步地，本实施方式还可以包括以下步骤：将片状组合物或粉状组合物最后灭菌解析，具体的灭菌解析步骤包括：采用环氧乙烷进行灭菌，灭菌条件为：在温度20-40℃保温，然后通入环氧乙烷灭菌；解析过程在通风的解析室中进行，温度控制在20℃之间，时间14天。
其中的灭活方式可以采用紫外线法、热灭活法、深冷冻融法、戊二醛法或它们的组合来进行。
实施例2：
对实施例1中样品进行性能检测，检测项目与结果如下：
1)胶原蛋白亚型鉴别：采用免疫组化染色法检测I、III、IV型和VI型胶原蛋白，3μm厚连续切片，二甲苯脱蜡，梯度乙醇脱水。将切片移入电饭煲水浴中(内含0.01mol/L，pH6.0的枸橼酸三钠缓冲液)，温度保持在95-100℃，煮20min，进行抗原修复，取出后在室温下自然冷却。磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤，5min×3次。二步法免疫组化：分别滴加I、III、IV型和VI型胶原蛋白单克隆抗体一抗，浓度1：100，4℃冰箱过夜室温下孵育60min，PBS洗涤3次。滴加Envision反应液，室温下孵育30min。PBS洗涤3次。0.05％的3，3一二氨基联苯胺+0.03％的H2O2显色5-10min。流水洗，苏木精衬染。递增梯度乙醇脱水，二甲苯透明，常规树脂封固。结果表明，显微镜下观察四种染色标本皆可见棕黄染色，为阳性，表明样品中可检测到I、III、IV型和VI型胶原蛋白。
2)多糖物质含量检测：取10个样品，取样，浸提，用Biocolor硫酸软骨素检测试剂盒测试硫酸软骨素含量，样品中硫酸软骨素含量平均值为5842±320μg/g；用透明质酸检测试剂盒测试透明质酸(HA)含量，结果显示，样品的透明质酸(HA)保留量平均值为321±24μg/g。
3)活性因子种类鉴别：将样品浸泡PBS 24h后，固定于4％多聚甲醛5-10min，用0.1mol/LPBS洗3次，每次5min，然后用玻璃细管转至涂有多聚赖氨酸的玻片上,进行免疫组织化学染色。LN抗体、FN抗体和整合素效价均为1∶100，0.5％胰酶消化3-5min暴露抗原，0.1％Triton X100作用10min增加抗体的穿透性。免疫组织化学染色显阳性，表面样品中包含纤维粘连蛋白、层粘连蛋白、整合素及其配体的等物质。
4)DNA残留：依据生物制剂残留DNA检测方法《中国药典》2015年版第四部，采用荧光染色法检测实施例1所提供的样品DNA残留量，结果：实施例1所提供的样品的DNA残留量100±5ng/mg。
5)半乳糖苷酶(α-Gal)清除率：取动物源性生物材料Gal阳性参考品，Gal抗原阴性参考品各2mg，加裂解液1ml，裂解30-90min，配制成20、10、5、2.5、1.25、0.625μg的Gal标准曲线样品，测试免疫原去除前后的测试品各取50mg，加裂解液2ml，裂解30-90min；取裂解液与M86抗体反应后的上清液，加入96孔板，加二抗，加显色剂，采用ELISA方法450nm检测吸光度值，按标准曲线计算出样品的Gal值，免疫原去除处理前材料的Gal值为22.25±2.36×1014/mg，实施例1中样品的Gal值为0.16±0.02×1014/mg，半乳糖苷酶(α-Gal)清除率在99.28％以上。
6)病毒检测：选择伪狂犬病毒为指示病毒，采用实时定量PCR法检测病毒的DNA拷贝数，检测3批样品。结果：病毒DNA拷贝数为0。
7)细菌内毒：按照GB/T 14233.2-2005《医用输液、输血、注射器具检验方法第2部分：生物学试验方法》进行检测，共3批样品，结果：细菌内毒小于20EU/包装。
8)环氧乙烷残留量：按GB/T14233.1-2008《医用输液、输血、注射器具检验方法第1部分：化学分析法》中9的规定的方法试验，结果：产品环氧乙烷残留量不超过10μg/包装。
9)重金属检查：铅、铬按GB/T 14233.1-2008中5.9.1《医用输液、输血、注射器具检验方法第1部分：化学分析法》规定的方法试验，汞、砷按GB/T 14233.1-2008中5.9.3《医用输液、输血、注射器具检验方法第1部分：化学分析法》规定的方法试验，产品检验液中铅、铬、汞、砷总重金属含量少于1ug/g。
10)生长因子残留量：对实施例1中样品采用ELISA法检测样品中碱性生长因子(bFGF)和血管内皮生长因子(VEGF)含量，并对免疫原去除前动物组织作为对照。结果发现碱性生长因子(bFGF)免疫原去除前后含量分别为2634±231ng/L、941±102ng/L，保留生长因子30％以上；血管内皮生长因子(VEGF)含量免疫原去除前后含量分别为773±63ng/L、3361±22ng/L，保留生长因子40％以上。
实施例3：
按照实施例1，取鼠肺癌细胞灭活后制得灭活肺癌细胞复合免疫增强剂片状材料，以3月龄健康实验鼠侧翼皮下注射0.1ml，106个肺癌细胞，造肿瘤模型，当肿瘤生成后，行肿瘤切除手术，保留肿瘤基底，动物随机分为对照组、SIS组、灭活肺癌细胞复合免疫增强剂片状材料组，将材料覆盖于创面上并固定，对照组只切除肿瘤，3周后观察肿瘤切除后创面肿瘤复发、肿瘤重量、肿瘤转移情况，发现肿痛复发率为100％，记录肿瘤重量与转移情况如下表，表明SIS组材料可以减缓肿瘤生长速度，但无法控制肿瘤转移，但是灭活肺癌细胞与SIS复合后，不仅明显减缓肿瘤生长速度，同时也控制肿瘤转移的发生。
表1 3周后复发肿瘤重量(g)
Figure BDA0001238003030000101
表2 3周后肿转移情况
Figure BDA0001238003030000102
由此可见，本发明制备得到的免疫增强抗肿瘤胶原组合物：
(1)与灭活肿瘤细胞复合使用，强化肿瘤免疫效果，降低肿瘤转移风险，减缓肿瘤生长速率，延长患者生存时间；
(2)降低引起过敏、感染、炎症、肉芽肿、局部脓肿的风险；
(3)体内可降解，降解过程可控，作用周期长；
(4)生产过程可实现标准化、产业化；
(5)可用肿瘤切除面的植入材料，也可制成针剂进行肌肉注射也可以皮下注射。
本发明的上述实施例是对本发明的说明而不能用于限制本发明，与本发明的权利要求书相当的含义和范围内的任何改变，都应认为是包括在权利要求书的范围内。

Claims (12)

1.一种免疫增强抗肿瘤胶原组合物，其特征在于：所述的组合物包含抗肿瘤因子、胶原蛋白、多糖物质和活性因子；
所述免疫增强抗肿瘤胶原组合物采用以下方法制备：
（1）组织前置处理：取动物小肠粘膜下层组织材料，清洗并将水滤干；
（2）病毒灭活：采用过氧乙酸-乙醇溶液浸泡动物小肠粘膜下层组织材料进行病毒灭活，然后进行超声清洗；
（3）免疫原去除：免疫原去除液采用加入胰蛋白酶和EDTA的PBS溶液，免疫原去除过程在多频超声装置中进行，然后进行超声清洗；得到动物小肠粘膜下层基质材料；
所述免疫原去除液包括：胰蛋白酶、EDTA和pH值为6-8的PBS溶液；所述免疫原去除液中胰蛋白酶质量百分比浓度为0.01-0.2%，EDTA的浓度为0.1-1mmol/L；所述免疫原去除液pH值为7.0-8.0；所述免疫原去除液与小肠粘膜下层组织材料体积比为(20-40)︰1；所述超声装置至少具有两个超声频率，其中低频频率范围为20-40KHz，高频频率为60-90KHz，其中低频处理5-40min，高频处理5-40min，温度范围为20-35℃；
（4）冷冻干燥：将一层或多层动物小肠粘膜下层基质材料固定于模具上，将模具放置于真空冷冻干燥机中进行真空冷冻干燥；
（5）灭菌解析：采用环氧乙烷进行灭菌，并进行解析；
（6）肿瘤细胞培养：取自体或同种异体肿瘤切除组织，在MEM培养基中剪碎，体外培养传代后，分散为单个细胞，配制细胞培养液，向从步骤（4）得到的冻干的动物小肠粘膜下层基质材料上滴加细胞培养液；然后在培养箱中培养；
（7）肿瘤细胞灭活：肿瘤细胞培养完成后，将动物小肠粘膜下层基质材料与肿瘤细胞一同从培养基中取出，清洗后灭活肿瘤细胞；得到复合免疫增强剂肿瘤疫苗胶原组合物。
2.根据权利要求1所述的免疫增强抗肿瘤胶原组合物，其特征在于：所述组合物以动物小肠粘膜下层组织材料制成。
3.根据权利要求2所述的免疫增强抗肿瘤胶原组合物，其特征在于：所述动物为哺乳动物。
4.根据权利要求3所述的免疫增强抗肿瘤胶原组合物，其特征在于：所述哺乳动物为猪或牛。
5.根据权利要求1所述的免疫增强抗肿瘤胶原组合物，其特征在于：所述抗肿瘤因子为灭活后的肿瘤细胞形成的肿瘤疫苗；所述的肿瘤细胞包括乳腺癌、结直肠癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、膀胱癌、黑色素瘤、肺癌、胃癌、肝癌、头颈部鳞状细胞癌、子宫颈癌、肾细胞癌、甲状腺癌、急性髓性白血病、骨髓瘤、食管鳞状细胞癌、淋巴瘤细胞或它们的组合，所述的灭活具体的方式为紫外线法、热灭活法、深冷冻融法、戊二醛法或它们的组合。
6.根据权利要求1所述的免疫增强抗肿瘤胶原组合物，其特征在于：所述的胶原蛋白为包含I型、III型、IV型和VI型胶原蛋白的组合物；所述的多糖物质包含硫酸软骨素和透明质酸；所述的活性因子为包含纤维粘连蛋白、层粘连蛋白、整合素及生长因子的组合物。
7.根据权利要求1所述的免疫增强抗肿瘤胶原组合物，其特征在于：所述的组合物为能体内降解的片状或颗粒状组合物；所述的组合物体内降解的时间为1-3个月；所述片状的形态是长1-10cm，宽1-10cm，厚度0.1-1mm；所述颗粒状的形态的粒径为500μm以下。
8.一种免疫增强抗肿瘤胶原组合物的制备方法，其特征在于：采用动物小肠粘膜下层组织作为原料，包括以下步骤：
（1）组织前置处理：取动物小肠粘膜下层组织材料，清洗并将水滤干；
（2）病毒灭活：采用过氧乙酸-乙醇溶液浸泡动物小肠粘膜下层组织材料进行病毒灭活，然后进行超声清洗；
（3）免疫原去除：免疫原去除液采用加入胰蛋白酶和EDTA的PBS溶液，免疫原去除过程在多频超声装置中进行，然后进行超声清洗；得到动物小肠粘膜下层基质材料；
所述免疫原去除液包括：胰蛋白酶、EDTA和pH值为6-8的PBS溶液；所述免疫原去除液中胰蛋白酶质量百分比浓度为0.01-0.2%，EDTA的浓度为0.1-1mmol/L；所述免疫原去除液pH值为7.0-8.0；所述免疫原去除液与小肠粘膜下层组织材料体积比为(20-40)︰1；所述超声装置至少具有两个超声频率，其中低频频率范围为20-40KHz，高频频率为60-90KHz，其中低频处理5-40min，高频处理5-40min，温度范围为20-35℃；
（4）冷冻干燥：将一层或多层动物小肠粘膜下层基质材料固定于模具上，将模具放置于真空冷冻干燥机中进行真空冷冻干燥；
（5）灭菌解析：采用环氧乙烷进行灭菌，并进行解析；
（6）肿瘤细胞培养：取自体或同种异体肿瘤切除组织，在MEM培养基中剪碎，体外培养传代后，分散为单个细胞，配制细胞培养液，向从步骤（4）得到的冻干的动物小肠粘膜下层基质材料上滴加细胞培养液；然后在培养箱中培养；
（7）肿瘤细胞灭活：肿瘤细胞培养完成后，将动物小肠粘膜下层基质材料与肿瘤细胞一同从培养基中取出，清洗后灭活肿瘤细胞；得到复合免疫增强剂肿瘤疫苗胶原组合物。
9.根据权利要求8所述的免疫增强抗肿瘤胶原组合物的制备方法，其特征在于，还包括以下步骤：将由步骤（7）得到的复合免疫增强剂肿瘤疫苗胶原组合物冷冻干燥形成片状免疫增强抗肿瘤胶原组合物。
10.根据权利要求9所述的免疫增强抗肿瘤胶原组合物的制备方法，其特征在于，还包括以下步骤：将片状免疫增强抗肿瘤胶原组合物经低温破碎装置破碎，并过筛，得到粉末状免疫增强抗肿瘤胶原组合物。
11.根据权利要求8所述的免疫增强抗肿瘤胶原组合物的制备方法，其特征在于：所述步骤（6）肿瘤细胞培养为：取肿瘤切除组织，体外培养传代后，配制(1.0-10.0)×106个/ml细胞培养液，按每2×2cm2动物小肠粘膜下层基质材料加1ml细胞培养液为比例滴加细胞培养液，然后在二氧化碳培养箱中保持37℃培养3-28天，每隔一天换一次液。
12.一种根据权利要求1-7中任意一项所述的免疫增强抗肿瘤胶原组合物在制备植入物中的应用，其特征在于：所述植入物用于预防肿瘤形成、生长、复发，延长肿瘤患者肿瘤切除后的生存期，或者所述植入物用于治疗乳腺癌、结直肠癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、膀胱癌、黑色素瘤、肺癌、胃癌、肝癌、头颈部鳞状细胞癌、子宫颈癌、肾细胞癌、甲状腺癌、急性髓性白血病、骨髓瘤、食管鳞状细胞癌和淋巴瘤。
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