CN114177354A - 一种天然陶瓷化骨的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种天然陶瓷化骨的制备方法。本发明的方法在超临界萃取之前采用双氧水脱去大部分蛋白，并使得骨块疏松，便于进一步的超临界脱脂、脱蛋白，通过双氧水和超临界萃取处理后，无有害物质残留，且不破坏材料的机械性能，本发明采用梯度温度煅烧处理，彻底除去骨材料中有机成分，去除所有的病原体，抗原成分，保留完整的骨结构，并增加了材料的多级空隙，形成利于骨细胞生长的环境，本发明的方法制备的天然陶瓷骨具有孔隙率高，比表面积大的优点，且生产过程不采用有机溶剂，可以高效脱脂、脱蛋白、完全去除有机成分。

Description

一种天然陶瓷化骨的制备方法
技术领域
本发明属于生物医学工程材料技术领域，具体涉及一种天然陶瓷化骨的制备方法。
背景技术
口腔颌面、骨缺损等是临床中常见疾患，传统的治疗手段主要是通过自体骨、同种异体骨或异种骨移植用于修复、填充。其中，异种骨的取材比较广泛，价格低廉，且不涉及道德方面的问题。但由于异体骨进行移植时，不同种属存在抗原性差异，会产生免疫排斥，使得异种骨的移植受到很大的限制。通常经常规处理，很难达到100％的安全，去除所有的病原体、抗原成分，给临床应用带有很大的风险性。
CN 104689372A公开了一种超临界二氧化碳萃取同种骨中脂肪的方法，只是单纯的脱脂过程处理，未进一步去除组织中的全部有机成分，形成有利于骨细胞生长的多级的孔结构，也不能完全清除有机成分，达到去除蛋白成分。
中国专利号CN 1730106A、中国专利号CN1579562A等公开了煅烧的方法制备陶瓷化骨可以全部除去骨中的有机成分，但是该方法在脱脂、脱蛋白处理过程中采用大量的化学试剂，化学试剂在骨的空隙中扩散程度有限性，造成脱脂、脱蛋白不彻底，有毒物质的残留，破坏动物原有的羟基磷灰石结构，操作过程较为繁琐等问题，不利于产业化。
目前，尚未见到高效脱脂、脱蛋白、完全去除异种骨中的有机成分，生产出具有孔隙率高、比表面积大的骨修复材料的方法。
鉴于以上原因，特提出本发明。
发明内容
为了解决现有技术存在的以上问题，本发明提供了一种天然陶瓷化骨的制备方法，本发明的方法制备的天然陶瓷骨具有孔隙率高，比表面积大的优点，且生产过程不采用有机溶剂，可以高效脱脂、脱蛋白、完全去除有机成分。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种天然陶瓷化骨的制备方法，包括如下步骤：
(1)将动物骨骼表面进行清洗，去掉表面的附着物，切成小骨块，在纯净水中浸泡，每隔0.8-1.2h换一次水，至无血水渗出；
(2)将步骤(1)处理后的骨块加入浓度为2-4％的双氧水进行脱蛋白和灭菌处理，再进行超声处理，用纯净水清洗，烘干；
(3)将烘干的骨块采用超临界CO2萃取处理，再进行梯度温度煅烧处理；
(4)将煅烧处理的骨材料用4-6％氢氧化钠溶液清洗，再用水清洗，最后用PBS溶液调节至中性，干燥，得到所述的天然陶瓷化骨。
本发明中的超临界CO2萃取进行脱脂，进一步脱蛋白。氢氧化钠溶液清洗除去残留的内毒素，梯度温度煅烧处理去除不同温敏感性的有机质。
其中，步骤(1)中小骨块为30mm×30mm×5mm。
进一步的，步骤(2)中超声处理为在45-55℃的水浴中清洗25-35min,，超声频率35-45KHz。
进一步的，步骤(2)中超声处理为在50℃的水浴中清洗30min。
进一步的，步骤(2)中干燥温度为45-55℃。
进一步的，步骤(3)中超临界CO2萃取处理条件为：萃取压力20-30MPa，萃取温度30-40℃，流量25-35L/h，萃取时间3.5-4.5h，夹带剂为醇类。
进一步的，夹带剂为无水乙醇。
进一步的，步骤(3)中超临界CO2萃取处理条件为：萃取压力25MPa，萃取温度35℃，流量30L/h，萃取时间4h。
进一步的，步骤(4)中梯度温度煅烧具体为：600-800℃下煅烧45-55min，800-1000℃下煅烧45-55min，1000-1200℃下煅烧45-55min。
进一步的，步骤(4)中梯度温度煅烧具体为：600-800℃下煅烧50min，800-1000℃下煅烧50min，1000-1200℃下煅烧50min。
进一步的，步骤(1)中所述的动物骨骼选自牛、羊、猪大型哺乳动物的股骨骨干、肋骨骨骼。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明的方法在超临界萃取之前采用双氧水脱去大部分蛋白，并使得骨块疏松，便于进一步的超临界脱脂、脱蛋白，通过双氧水和超临界萃取处理后，无有害物质残留，且不破坏材料的机械性能，本发明采用梯度温度煅烧处理，彻底除去骨材料中有机成分，去除所有的病原体，抗原成分，保留完整的骨结构，并增加了材料的多级空隙，形成利于骨细胞生长的环境，本发明的方法制备的天然陶瓷骨具有孔隙率高，比表面积大的优点，且生产过程不采用有机溶剂，可以高效脱脂、脱蛋白、完全去除有机成分。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例2制备的天然陶瓷化骨的红外图谱；
图2是本发明实施例2制备的天然陶瓷化骨的XRD图；
图3是本发明实施例2制备的天然陶瓷化骨的SEM图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。
实施例1
本实施例的天然陶瓷化骨的制备方法，包括如下步骤：
(1)将冷冻储存的牛骨骼解冻并切割成易处理的状态，并使用高压水枪冲洗血水，骨髓等骨表面附着物，切成30mm×30mm×5mm的小骨块，在纯净水中浸泡，每隔0.8h换一次水，目测至无血水渗出；
(2)将步骤(1)处理后的骨块加入浓度为2％的双氧水进行脱蛋白和灭菌处理，再进行超声处理，超声处理为在45℃的水浴中清洗35min，超声频率35KHz，用纯净水清洗，在45℃下烘干；
(3)将烘干的骨块采用超临界CO2萃取处理，超临界CO2萃取处理条件为：萃取压力20MPa，萃取温度40℃，流量25L/h，萃取时间4.5h，夹带剂为无水乙醇，在氮气保护下，再进行梯度温度煅烧处理，梯度温度煅烧具体为：600℃下煅烧45min，1000℃下煅烧55min，1200℃下煅烧45min；
(4)将煅烧处理的骨材料用4％的氢氧化钠溶液清洗去除内毒素，再用水清洗，最后用PBS溶液调节至中性，干燥，得到所述的天然陶瓷化骨。
实施例2
本实施例的天然陶瓷化骨的制备方法，包括如下步骤：
(1)将冷冻储存的猪骨骼解冻并切割成易处理的状态，并使用高压水枪冲洗血水，骨髓等骨表面附着物，切成30mm×30mm×5mm的小骨块，在纯净水中浸泡，每隔1h换一次水，目测至无血水渗出；
(2)将步骤(1)处理后的骨块加入浓度为3％的双氧水进行脱蛋白和灭菌处理，再进行超声处理，超声处理为在50℃的水浴中清洗30min，超声频率40KHz，用纯净水清洗，在50℃下烘干；
(3)将烘干的骨块采用超临界CO2萃取处理，超临界CO2萃取处理条件为：萃取压力25MPa，萃取温度35℃，流量30L/h，萃取时间4h，夹带剂为无水乙醇，在氮气保护下，再进行梯度温度煅烧处理，梯度温度煅烧具体为：700℃下煅烧50min，900℃下煅烧50min，1100℃下煅烧50min；
(4)将煅烧处理的骨材料用5％的氢氧化钠溶液清洗去除内毒素，再用水清洗，最后用PBS溶液调节至中性，干燥，得到所述的天然陶瓷化骨。
实施例3
本实施例的天然陶瓷化骨的制备方法，包括如下步骤：
(1)将冷冻储存的牛骨骼解冻并切割成易处理的状态，并使用高压水枪冲洗血水，骨髓等骨表面附着物，切成30mm×30mm×5mm的小骨块，在纯净水中浸泡，每隔1.2h换一次水，目测至无血水渗出；
(2)将步骤(1)处理后的骨块加入浓度为4％的双氧水进行脱蛋白和灭菌处理，再进行超声处理，超声处理为在55℃的水浴中清洗25min，超声频率45KHz，用纯净水清洗，在55℃下烘干；
(3)将烘干的骨块采用超临界CO2萃取处理，超临界CO2萃取处理条件为：萃取压力30MPa，萃取温度30℃，流量35L/h，萃取时间3.5h，夹带剂为无水乙醇，在氮气保护下，再进行梯度温度煅烧处理，梯度温度煅烧具体为：800℃下煅烧55min，800℃下煅烧45min，1000℃下煅烧55min；
(4)将煅烧处理的骨材料用6％的氢氧化钠溶液清洗去除内毒素，再用水清洗，最后用PBS溶液调节至中性，干燥，得到所述的天然陶瓷化骨。
对比例1
本对比例的天然陶瓷化骨的制备方法与实施例2相同，不同之处在于，去掉步骤(2)中的双氧水处理。
对比例2
本对比例的天然陶瓷化骨的制备方法与实施例2相同，不同之处在于，步骤(3)中不采用梯度温度煅烧处理，而只在700℃下煅烧150min。
对比例3
本对比例的天然陶瓷化骨的制备方法与实施例2相同，不同之处在于，步骤(3)中不采用梯度温度煅烧处理，而只在900℃下煅烧150min。
对比例4
本对比例的天然陶瓷化骨的制备方法与实施例2相同，不同之处在于，步骤(3)中不采用梯度温度煅烧处理，而只在1100℃下煅烧150min。
试验例1
将实施例2制备的天然陶瓷化骨进行红外测试，如图1所示，XRD测试如图2所示，SEM结果如图3所示。
如图1所示，本实施制备的天然陶瓷化骨是由磷灰石矿物组成。其中，PO4 3-特征峰为1067cm-1及其弯曲振动550cm-1～600cm-1，SO4 2-的弯曲振动1400cm-1～1500cm-1。此外，该结果也表明该方法有效的去除有机成分。
如图2所示，2θ在26°、32°出现较高结晶度的羟基磷灰石特征峰，结晶度为54.2±1.3％，此结果与红外结果一致。
如图3所示，本发明的方法有利于骨细胞生长的多级的孔结构，未出现材料结构的坍塌。
本发明人也对其他实施例做了上述实验，结果基本一致，由于篇幅有限，不再一一列举。
试验例2
将实施例1-3和对比例1-4制备的天然陶瓷化骨进行成分的分析，结果如表1所示。
表1
Figure BDA0003426654940000071
采用微量凯氏定氮法测得材料蛋白质的列于表1，结果表明采用双氧水先脱蛋白比对例1未采用双氧水处理脱出蛋白的方法，双氧水先处理脱大蛋白效果明显较好，且高出未使用双氧水处理的5～10倍。此外，采用梯度煅烧法的蛋白含量低于未使用梯度煅烧的，表明梯度煅烧更有利于去除有机成分，可能由于原材料组织成分不同的温度敏感性特点，逐一除去目标成分更加高效。
根据GB5009.6-2016食品中脂肪含量的测量方法测得脂肪的含量列于表1，结果表明对比例1未先采用双氧水处理的脂肪的含量高于先用双氧水处理的异种骨材料，证明了双氧水可以疏松骨组织结构，有利于高效脱脂及进一步脱蛋白作用。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

Claims (9)

1.一种天然陶瓷化骨的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将动物骨骼表面进行清洗，去掉表面的附着物，切成小骨块，在纯净水中浸泡，每隔0.8-1.2h换一次水，至无血水渗出；
(2)将步骤(1)处理后的骨块加入浓度为2-4％的双氧水进行脱蛋白和灭菌处理，再进行超声处理，用纯净水清洗，烘干；
(3)将烘干的骨块采用超临界CO2萃取处理，在氮气保护下，再进行梯度温度煅烧处理；
(4)将煅烧处理的骨材料用4-6％的氢氧化钠溶液清洗，再用水清洗，最后用PBS溶液调节至中性，干燥，得到所述的天然陶瓷化骨。
2.根据权利要求1所述的天然陶瓷化骨的制备方法，其特征在于，步骤(2)中超声处理为在45-55℃的水浴中清洗25-35min，超声频率35-45KHz。
3.根据权利要求2所述的天然陶瓷化骨的制备方法，其特征在于，步骤(2)中超声处理为在50℃的水浴中清洗30min。
4.根据权利要求1所述的天然陶瓷化骨的制备方法，其特征在于，步骤(2)中干燥温度为45-55℃。
5.根据权利要求1所述的天然陶瓷化骨的制备方法，其特征在于，步骤(3)中超临界CO2萃取处理条件为：萃取压力20-30MPa，萃取温度30-40℃，流量25-35L/h，萃取时间3.5-4.5h，夹带剂为醇类，优选的，夹带剂为无水乙醇。
6.根据权利要求2所述的天然陶瓷化骨的制备方法，其特征在于，步骤(3)中超临界CO2萃取处理条件为：萃取压力25MPa，萃取温度35℃，流量30L/h，萃取时间4h。
7.根据权利要求1所述的天然陶瓷化骨的制备方法，其特征在于，步骤(4)中梯度温度煅烧具体为：600-800℃下煅烧45-55min，800-1000℃下煅烧45-55min，1000-1200℃下煅烧45-55min。
8.根据权利要求7所述的天然陶瓷化骨的制备方法，其特征在于，步骤(4)中梯度温度煅烧具体为：600-800℃下煅烧50min，800-1000℃下煅烧50min，1000-1200℃下煅烧50min。
9.根据权利要求1-8任一所述的天然陶瓷化骨的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述的动物骨骼选自牛、羊、猪大型哺乳动物的股骨骨干、肋骨骨骼。
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