CN113842502B - 一种含有去蛋白骨的注射填充剂及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种含有去蛋白骨的注射填充剂及其制备方法。该填充剂是由重组胶原蛋白‑去蛋白骨复合微球与含有交联透明质酸钠和重组胶原蛋白的凝胶混合而成，填充剂中的微球相是由动物源性骨组织颗粒经灭病毒、脱脂和脱细胞、去蛋白处理后粉粹并钝化成无棱角、外形不规则的微粒，再与重组胶原蛋白溶液乳化交联而制成，凝胶相由透明质酸钠和重组胶原蛋白通过交联后混入含或不含麻醉剂的磷酸盐缓冲液中而制成。本发明通过采用天然骨材料赋予了复合微球交联重组胶原蛋白外壳内去蛋白骨微粒结构优异的亲水性和相容性，同时经微球相和凝胶相混合而成的注射填充剂可以起到支持机体自身胶原再生的协调作用，为皮肤提供长效、安全的支撑作用。

Description

一种含有去蛋白骨的注射填充剂及其制备方法
技术领域
本发明属于医学美容、整形技术领域，具体涉及一种含有去蛋白骨的注射填充剂及其制备方法。
背景技术
为达到面部年轻化、美观化的效果，软组织填充剂的使用受到了越来越多的关注，并且对于软组织填充剂的性能和使用提出了更高的要求：良好的生物相容性、较高的安全性和更为持久的填充作用。目前最常用的软组织填充剂为透明质酸钠填充剂，经过交联工艺处理可以显著延长其在体内的存留时间，但仍不能实现长期的填充效果，同时其本身及降解产物多糖不具有促进植入部位内源性胶原蛋白再生的作用；另外一种较为常用的软组织填充剂为胶原蛋白，作为最早获得FDA批准使用的注射用填充剂活性成分，存在填充效果持续时间短的问题，同时因胶原蛋白主要来源于牛、猪等异种动物，免疫和病毒风险也阻碍了胶原蛋白的应用和发展。为了延长软组织填充剂在体内留存的时间，逐渐发展了以可吸收或不可吸收材料制成的微球，例如聚左旋乳酸(PLLA)、聚己内酯(PCL)、羟磷灰石钙、硅胶、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)等类的微球，与凝胶基质混合而形成的填充剂产品。
目前羟磷灰石钙类填充剂产品已获批上市。这类产品一般含有羟磷灰石钙微球、基质成分以及选择性添加的麻醉剂成分，随着基质成分的降解，羟磷灰石钙微球可刺激内源性胶原蛋白的生成。luminera公司的产品HArmonyCA含有羟磷灰石钙、交联透明质酸钠凝胶、磷酸缓冲液和利多卡因；MerZ公司的产品Radiesse含有30％的粒径在25-45μm羟磷灰石钙以及70％的羧甲基纤维素钠凝胶成分；中国专利201611075350.X、202010039494.X、202010545986.6分别公开了羟磷灰石钙与含有胶原蛋白的凝胶基质相混合而形成的注射填充剂；中国专利201110363121.9公开了一种羟基磷灰石与透明质酸钠、重组胶原蛋白相混合而形成的软组织填充材料。
以上这些专利技术和已上市的产品中，均采用合成羟磷灰石钙作为微球成分来源，而合成羟磷灰石钙常采用酸碱中和方法，即以特定比例加入反应试剂，在高温作用下搅拌反应生成羟磷灰石钙。这种方法依赖于反应体系，容易出现产品成分不均一的问题，同时形成的实心微球具有一定疏水性，引发填充剂的体内异物反应风险。同时，在凝胶基质的选择上，或单纯选择多糖成分，从而不能与微球成分共同实现促进自体胶原蛋白再生的协同作用；或选择多糖与胶原蛋白的复合成分，但在体内存留时间过短；从而影响填充剂的有效性。
目前亟待开发可发挥长效、安全的支撑作用的软组织填充材料。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供一种含有去蛋白骨的注射填充剂及其制备方法。
为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：
一种含有去蛋白骨的注射填充剂，该填充剂包括重组胶原蛋白-去蛋白骨复合微球(去蛋白骨微粒上修饰交联重组胶原蛋白)以及含有交联透明质酸钠和重组胶原蛋白的凝胶，所述复合微球分散在所述凝胶中。
优选的，所述复合微球:凝胶的质量比为1:6-1:1(例如1:4-1:2)，凝胶中透明质酸钠的浓度为5-25mg/mL(例如15-20mg/mL)。
优选的，所述凝胶中重组胶原蛋白的浓度为5-25mg/mL(例如5-15mg/mL)。
优选的，所述重组胶原蛋白选自通过微生物基因重组或植物基因重组表达系统得到的I型胶原蛋白、III型胶原蛋白、Ⅳ型胶原蛋白、Ⅶ型胶原蛋白、弹性蛋白、粘连蛋白或者纤连蛋白中的一种或多种，或者重组胶原蛋白选自含有所述I型胶原蛋白、III型胶原蛋白、Ⅳ型胶原蛋白、Ⅶ型胶原蛋白、弹性蛋白、粘连蛋白或者纤连蛋白的融合蛋白，以上重组胶原蛋白可以基于天然人胶原蛋白的特征和主要功能序列重新优化设计基因序列，并通过表达系统获得，具有良好的生物学相容性、可加工性以及无病毒传染风险等优点。
优选的，所述凝胶还含有麻醉剂，麻醉剂为利多卡因或苯佐卡因，凝胶中麻醉剂的浓度为1-5mg/mL。
优选的，所述凝胶是通过在碱性条件下将分子量为20万-300万的透明质酸钠和分子量为40K-120K的重组胶原蛋白进行化学交联后分散至生理缓冲溶液(例如pH6-8的磷酸盐缓冲液)而制成的。
优选的，所述复合微球是将去蛋白骨微粒通过乳化交联包覆重组胶原蛋白而形成的外形规则圆整的微粒，其中去蛋白骨微粒是动物源性骨组织颗粒经灭病毒、脱脂和脱细胞以及去蛋白处理后进行粉粹、钝化而形成的粒径10-80μm、外形不规则但无棱角的骨组织微粒。
一种含有去蛋白骨的注射填充剂的制备方法，包括以下步骤：
将透明质酸钠和重组胶原蛋白进行交联后与生理缓冲溶液混匀得凝胶，或者将透明质酸钠和重组胶原蛋白进行交联后与麻醉剂以及生理缓冲溶液混匀得凝胶；在上述去蛋白骨微粒上修饰交联重组胶原蛋白得复合微球；将所得凝胶与复合微球混合后依次进行脱气、灭菌，得含有去蛋白骨的注射填充剂。
优选的，所述注射填充剂的制备方法具体包括以下步骤：凝胶的制备、骨颗粒的制备、去蛋白骨微粒的制备、复合微球的制备、复合微球与凝胶混合及后处理；
1)凝胶的制备
在0.02-2M碱性溶液中加入终浓度(质量分数)分别为0.02％-5％、5％-25％及2％-20％的交联剂、透明质酸钠及重组胶原蛋白，然后于30-60℃反应1-16小时得凝胶I，将凝胶I水洗后用不含有或含有麻醉剂的pH6-8的磷酸盐缓冲液稀释至透明质酸钠的浓度为5-25mg/mL(或在将透明质酸钠的浓度稀释为5-25mg/mL同时将麻醉剂的浓度稀释为1-5mg/mL)，得凝胶II；
2)骨颗粒的制备
将切割成块状的动物骨组织用水清洗后粉碎为颗粒，然后用所含SDS、NaOH和有机溶剂的质量分数分别为0.2％-2％、0.3％-4％和20％-80％的混合水溶液，按照20-60分钟/次超声处理3-6次；然后用水清洗、干燥(低于60℃)，得到灭病毒、脱脂和脱细胞的骨组织颗粒；
3)去蛋白骨微粒的制备
将灭病毒、脱脂和脱细胞的骨组织颗粒再次粉粹后于600-1200℃煅烧2-6小时以完成去蛋白处理，然后采用空气磨或球磨设备进行处理，将处理后的颗粒进行筛分，得到粒径在10-80μm之间的去蛋白骨微粒；
4)复合微球的制备
在浓度(质量分数)为5％-20％的重组胶原蛋白溶液中加入终浓度(质量分数)2％-10％的去蛋白骨微粒，得去蛋白骨微粒-胶原蛋白混合溶液；将去蛋白骨微粒-胶原蛋白混合溶液(水相)按照1:4-1:8的体积比加入到含有0.5％-2％浓度(质量分数)的乳化剂的液体石蜡(油相)中乳化均匀，然后进行交联固化，离心并去除上清，然后去除液体石蜡并脱水，将脱水产物干燥得到重组胶原蛋白-去蛋白骨复合微球；
5)复合微球与凝胶相混合及后处理
将重组胶原蛋白-去蛋白骨复合微球与凝胶II按照1:6-1:1的质量比混合后进行脱气、灭菌，得到含有去蛋白骨的注射填充剂。
优选的，所述步骤1)中，透明质酸钠的分子量为20万-300万(例如80万-240万)，且可以选用单一分子量分布的透明质酸钠，也可选用两种不同分子量分布的透明质酸钠(二者混合质量比为1:9-9:1)；重组胶原蛋白的分子量为40K-120K。
优选的，所述步骤1)中，碱性溶液为氢氧化钠溶液、氢氧化钾溶液或碳酸钠溶液，交联剂为缩水甘油醚类、环氧化物或二乙烯基砜中的任意一种，麻醉剂为利多卡因或苯佐卡因。
优选的，所述步骤2)中，有机溶剂为乙醇、正丙醇、异丙醇、丙酮、乙醚中的一种或多种。
优选的，所述步骤3)中，采用空气磨进行处理的控制参数为：气固比为2:1-4:1；第一阶段进气压力为0.4-0.6Mpa，分级轮转速为1600-2400r/min，进料速率为70-250g/min；第二阶段进气压力为0.1-0.2Mpa，分级轮转速为300-800r/min，进料速率为15-30g/min。
优选的，所述步骤4)中，乳化剂为Span-40、Span-80等非离子表面活性剂中的任意一种。
优选的，所述步骤4)中，乳化的条件为：400-1000r/min；交联固化的条件为：交联反应时间为5-20min，温度为2-40℃，交联剂为戊二醛、甲醛、碳二亚胺、环氧化物、京尼平、单宁酸、原花青素中的任意一种或多种。
优选的，所述步骤5)中，脱气具体包括以下步骤：采用真空脱泡法或离心法去除所述重组胶原蛋白-去蛋白骨复合微球与凝胶II的混合物中的气泡。
本发明的有益效果体现在：
本发明的注射填充剂中，微球相采用修饰有交联重组胶原蛋白的去蛋白骨微粒，凝胶相采用交联透明质酸钠和重组胶原蛋白为骨架，微球相可以刺激内源性胶原蛋白的生成，而微球相及凝胶相的重组胶原蛋白经降解生成的氨基酸，可以持续为植入部位的胶原再生提供底物，并促进组织细胞生长分化，从而支持局部胶原的再生，使得注射填充剂在皮肤整形术中提供长效、安全的支撑作用。
进一步的，本发明将透明质酸钠和重组胶原蛋白以一定比例混合后进行交联并制备凝胶，可以有效延长透明质酸钠和重组胶原蛋白在体内的存留时间，与复合微球结合使用可以为皮肤提供有效的中长期支撑作用。同时，透明质酸钠和重组胶原蛋白都可以通过发酵获得，免除了异种蛋白的免疫和病毒传染的风险，有利于提高注射填充剂的安全性和有效性。
进一步的，本发明中动物源性骨组织颗粒经过灭病毒、脱脂和脱细胞以及去蛋白处理(粉碎以及高温煅烧)，去除了动物源性骨材料中的抗原物质和可能存在的病毒传染风险，保证了其在注射填充剂应用的安全性。同时，经过处理后所得去蛋白骨微粒主要成分是保留了天然骨材料疏松多孔结构的羟磷灰石钙，成分均一稳定，并具有优良的亲水特性和生物相容性。
进一步的，本发明采用空气磨设备中产生的高压空气涡流，使得经过去蛋白处理的骨组织颗粒(物料)在气流作用下产生碰撞，并利用所设置的两个梯度的参数进行分阶段处理，其中在第一阶段使得物料在设备内实现高速、剧烈的碰撞，短时间内达到粉碎效果，在第二阶段降低作用强度、延长作用时间，通过摩擦去掉粉碎所得的微粒上的棱角以实现钝化，从而降低骨材料植入体内之后引起的刺激和异物反应，提高产品的安全性。同时配合筛分设备可以将去蛋白骨微粒粒径控制在更窄的范围内(10-80μm)，使得制备的复合微球和最终注射填充剂产品更为稳定、均一。
进一步的，本发明将重组胶原蛋白与去蛋白骨微粒以一定比例进行混合后加入到油相中进行乳化交联，所制得的复合微球表面光滑、外形规则，可以在凝胶中更好的分散，减少因微球堆积产生的硬结以及微球量较少而填充无效的情况发生，同时保证注射过程的通畅性和连续性，利于临床注射操作。
附图说明
图1为本发明实例1制备的重组胶原蛋白-去蛋白骨复合微球的扫描电镜照片(100×)。
图2为本发明实例1制备的去蛋白骨微粒的扫描电镜照片(5000×)。
图3为合成羟磷灰石钙微球的扫描电镜照片(100×)。
图4为合成羟磷灰石钙微球的扫描电镜照片(5000×)。
图5为本发明实例1制备的注射填充剂与对比例2的推挤力数据(A：实例1注射填充剂；B：对比例2)。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步的详细描述，所描述的实施例仅用于解释本发明，而非对本发明保护范围的限制。
本发明考虑利用动物源性骨材料替代合成羟磷灰石钙作为微球成分来源。但前期实验表明，经粉粹、钝化之后的去蛋白骨微粒尽管消除了表面的棱角，但并不是规则球形，分散性较差，影响填充剂产品均一性，容易导致注射过程中推挤不畅，也会影响填充效果。为此，本发明通过实验改进，将交联微球制作工艺(乳化交联法)应用于对去蛋白骨微粒表面修饰中，成功制备得到以去蛋白骨微粒为核心，并通过在该微粒表面包覆重组胶原蛋白而形成的复合微球。实验结果还表明，该复合微球与含有交联透明质酸钠和重组胶原蛋白的凝胶混合，所获得(经过一些简单的后处理，例如脱气、灭菌)的注射填充剂为植入部位对应皮肤提供长效、安全的支撑作用。
(一)含有去蛋白骨的注射填充剂的制备
实例1
1)凝胶相的制备
取交联剂BDDE并按照终浓度2wt％溶解于1M NaOH溶液中，在溶液中再加入分子量为120w-140w的透明质酸钠(终浓度15wt％)和分子量为60K左右的重组胶原蛋白(终浓度10wt％)，搅拌均匀，50℃交联4小时。将交联凝胶切割成小块后用纯水清洗以去除试剂残留，之后以混合盐酸利多卡因的磷酸盐缓冲液(pH6.8-7.6)定容至透明质酸钠终浓度为20mg/mL，盐酸利多卡因终浓度为2mg/mL；以过筛或均质方法制成最终所需凝胶(作为注射填充剂的凝胶相)。
2)骨颗粒的制备
动物(例如牛、猪)骨切割成块，纯水清洗至无骨髓和血液，粉碎成粒径2-6mm的颗粒，然后用含有2wt％SDS、1wt％NaOH和45wt％丙酮的混合溶液(余量为纯水)浸泡，同时采用超声波清洗机强化处理，处理时间为50分钟，重复处理3次。然后用纯水清洗去除试剂残留，50℃烘箱干燥，获得灭病毒、脱脂和脱细胞骨颗粒。
3)去蛋白骨微粒的制备
再次粉碎并控制粉碎后骨颗粒粒径在10-2000μm之间，将再次粉碎后的骨颗粒置于马弗炉中，升温至1200℃，恒温煅烧2小时，获得去蛋白骨颗粒；以空气磨对去蛋白骨颗粒进行粉碎，控制气固比4:1，设置梯度参数进行破碎处理(第一阶段：进气压力0.6Mpa，分级轮转速1600r/min，进料速率230g/min；第二阶段：进气压力0.2Mpa，分级轮转速400r/min，进料速率28g/min)。将获得的颗粒进行筛分，分级粒径在25-50μm之间，即获得去蛋白骨微粒。
4)复合微球的制备
水相：配制浓度为8wt％的重组胶原蛋白溶液，向该溶液中加入去蛋白骨微粒(终浓度4wt％)；将混合了去蛋白骨微粒的重组胶原蛋白溶液搅拌均匀；
油相：在液体石蜡中加入Span-40(终浓度2wt％)，搅拌均匀；
将混合了去蛋白骨微粒的重组胶原蛋白溶液缓慢加入到上述油相中，使油相:水相体积比在8:1，800r/min乳化均匀，之后加入戊二醛交联固化14min。停止反应后，离心去上清，石油醚清洗沉淀三次后乙醇脱水，将产物冻干得复合微球(即采用乳化交联法制备重组胶原蛋白-去蛋白骨复合微球)。
5)制备填充剂
将复合微球与凝胶相进行混合(复合微球:凝胶相混合质量比为1:2)，混合均匀后采用真空脱泡法去除气泡。随后进行灌装、湿热灭菌。即制得含有去蛋白骨的注射填充剂。
实例2
1)凝胶相的制备
取交联剂二甲基亚砜并按照终浓度4.5wt％溶解于0.25M KOH溶液中，在溶液中再加入分子量为220w-240w的透明质酸钠(终浓度8wt％)和分子量为90K左右的重组胶原蛋白(终浓度16wt％)，搅拌均匀，40℃交联16小时。将交联凝胶切割成小块后用纯水清洗以去除试剂残留，之后以混合苯佐卡因的磷酸盐缓冲液(pH6.8-7.6)定容至透明质酸钠终浓度为10mg/mL，苯佐卡因终浓度为4mg/mL；以过筛或均质方法制成最终所需凝胶(作为注射填充剂的凝胶相)。
2)去蛋白骨颗粒的制备
动物(例如牛、猪)骨切割成块，纯水清洗至无骨髓和血液，粉碎成粒径2-6mm的颗粒，然后用含有0.5wt％SDS、4wt％NaOH和70wt％异丙醇的混合溶液(余量为纯水)浸泡，同时采用超声波清洗机强化处理，处理时间为20分钟，重复处理6次。然后用纯水清洗去除试剂残留，50℃烘箱干燥，获得灭病毒、脱脂和脱细胞骨颗粒。
3)去蛋白骨微粒的制备
再次粉碎并控制粉碎后骨颗粒粒径在10-2000μm之间，将再次粉碎后的骨颗粒置于马弗炉中，升温至700℃，恒温煅烧5小时，获得去蛋白骨颗粒；以空气磨对去蛋白骨颗粒进行粉碎，控制气固比2:1，设置梯度参数进行破碎处理(第一阶段：进气压力0.4Mpa，分级轮转速2200r/min，进料速率100g/min；第二阶段：进气压力0.1Mpa，分级轮转速700r/min，进料速率20g/min)。将获得的颗粒进行筛分，分级粒径在25-50μm之间，即获得去蛋白骨微粒。
4)复合微球的制备
水相：配制浓度为15wt％的重组胶原蛋白溶液，向该溶液中加入去蛋白骨微粒(终浓度8wt％)；将混合了去蛋白骨微粒的重组胶原蛋白溶液搅拌均匀；
油相：在液体石蜡中加入Span-80(终浓度0.8wt％)，搅拌均匀；
将混合了去蛋白骨微粒的重组胶原蛋白溶液缓慢加入到上述油相中，使油相:水相体积比在4:1，500r/min乳化均匀，之后加入戊二醛交联固化8min。停止反应后，离心去上清，石油醚清洗沉淀三次后乙醇脱水，将产物冻干得复合微球(即采用乳化交联法制备重组胶原蛋白-去蛋白骨复合微球)。
5)制备填充剂
将复合微球与凝胶相进行混合(复合微球:凝胶相混合质量比为1:5)，混合均匀后采用真空离心法去除气泡。随后进行灌装、湿热灭菌。即制得含有去蛋白骨的注射填充剂。
(二)注射填充剂对照样品的制备
对比例1
本对比例中：将重组胶原蛋白-去蛋白骨复合微球置换为合成的羟磷灰石钙微球，其他与实例1相同。
对比例2
本对比例中：不将去蛋白骨微粒与重组胶原蛋白进行乳化交联处理，直接将凝胶相与去蛋白骨微粒进行混合；其他与实例1相同。
对比例3
本对比例中：不含复合微球，即将实例1中的含有交联透明质酸钠和重组胶原蛋白的凝胶相作为注射填充剂对照样。
对比例4
本对比例中：将实例1中未进行交联的透明质酸钠成分与重组胶原蛋白成分在磷酸盐缓冲液中混合后作为分散复合微球的基质，其他与实例1相同。
(三)含有去蛋白骨的注射填充剂的性能测试
参见图1、图3以及图4，将本发明制备的重组胶原蛋白-去蛋白骨复合微球与合成的羟磷灰石钙微球进行微观结构观察和比较，结果可见本发明制备的复合微球具有与合成羟磷灰石钙微球相同的粒径分布以及一致的均一度。与合成羟磷灰石钙微球不同的是，本发明制备的重组胶原蛋白-去蛋白骨复合微球以保留了天然骨材料的微孔结构的去蛋白骨微粒(图2)为核心，具有高比表面积和较强的亲水性(表1)，随着外层重组胶原蛋白的降解，可增大与体内植入部位细胞、体液的接触面积，赋予填充剂更好的组织相容性和促进组织再生的能力，而且有效的延长了发挥填充作用的时间，从而优于采用表面光滑的单一成分合成微球(合成羟磷灰石钙微球)的填充剂产品(对比例1)。
参见表1，将制备的去蛋白骨微粒与合成羟磷灰石钙进行吸水率测试：取一定量的材料(Mdry)浸于水中，12小时后过滤去除多余水分，记录其质量Mwet，与吸水前的质量进行比较，计算其吸水率＝(Mwet—Mdry)/Mdry，结果表明天然骨材料来源微粒的吸水性能明显高于合成材料来源微粒，说明去蛋白骨微粒具有优良的亲水特性。
表1.去蛋白骨微粒与合成羟磷灰石钙的吸水率测试结果
去蛋白骨微粒 合成羟磷灰石钙
吸水率(12h) 35.3％±5.7％ 5.7％±2.1％
参见图5，将本发明制备注射填充剂与对比例2进行推挤力对比。结果表明，乳化交联形成的复合微球有利于材料(去蛋白骨微粒)在凝胶相中的分散，保证了注射填充剂的产品均一性，同时也保证了注射过程的可操作性。
参见表2，将本发明制备的注射填充剂与对比例3、对比例4进行大鼠皮内注射(约150μL/只)，分别在注射后、1周、4周、12周、26周、52周，用数显卡尺进行体外尺寸测量，计算植入物体积，从而评价植入物的降解情况和有效性。结果表明不含有微球成分的植入物(对比例3)降解时间最长，可持续52周左右(无法保证持续稳定的填充效果)，凝胶成分未经交联的植入物(对比例4)在植入早期(12-26周之内)快速降解，在此过程中微球成分刺激机体生成胶原蛋白后对植入物体积具有一定的提升作用；而本发明制备的注射填充在植入后，可以实现在植入部位持续稳定的发挥填充效果。
表2.大鼠皮内植入结果(单位：mm3)
实例1中的注射填充剂 对比例3 对比例4
注射后(0周) 150.49±39.77 151.21±40.13 149.26±36.41
1周 178.85±28.82 176.50±33.35 177.29±35.97
4周 128.66±25.13 126.68±23.17 102.98±26.72
12周 123.65±22.71 89.35±20.33 63.56±15.67
26周 116.49±23.34 55.98±13.46 98.48±20.45
52周 119.48±25.87 23.66±9.51 115.59±21.12
(四)本发明注射填充剂的特点
1)选用天然的动物源性骨材料作为微球结构成分的主要来源，与合成材料相比，其材料成分更加稳定、均一，同时天然骨材料存在微孔结构，使得材料具有较好的亲水性和相容性；在骨材料安全性方面，采用了灭病毒、脱脂和脱细胞以及高温煅烧，彻底去除了免疫物质和病毒传染风险。
2)去蛋白骨颗粒经粉碎、表面钝化处理，消除了骨微粒表面的尖锐棱角，降低了天然骨材料植入体内之后可能引起的异物反应，提高了产品的安全性，经筛分分级后的去蛋白骨微粒具有更好的均一性，有助于产品的质量稳定。
3)去蛋白骨微粒与重组胶原蛋白经乳化交联形成复合微球，有助于去蛋白骨微粒在凝胶体系中的分散，避免植入术后形成不均匀填充；同时减少了注射过程的推挤阻力，使注射过程更加顺畅连续，保证了产品的操作性和有效性。
4)以透明质酸钠和重组胶原蛋白为原料制备凝胶相，二者均可通过发酵获得，不存在免疫和病毒传染风险，且经过交联可以有效延缓其在体内的降解时间。
5)凝胶相降解产物中的氨基酸对于细胞的生长分化、胶原蛋白生成具有促进作用。与去蛋白骨微粒结合发挥了协同作用，可以更好的促进植入部位胶原沉积和组织再生，实现长效填充效果。

Claims (9)

1.一种含有去蛋白骨的注射填充剂，其特征在于：该填充剂包括重组胶原蛋白-去蛋白骨复合微球以及含有交联透明质酸钠和重组胶原蛋白的凝胶，所述复合微球分散在所述凝胶中；
所述复合微球是将去蛋白骨微粒通过乳化交联包覆重组胶原蛋白而形成的外形规则圆整的微粒，其中去蛋白骨微粒是动物源性骨组织颗粒经灭病毒、脱脂和脱细胞以及去蛋白处理后进行粉粹、钝化而形成的粒径10-80μm、外形不规则但无棱角的骨组织微粒；
在质量分数为5%-20%的重组胶原蛋白溶液中加入终浓度2%-10%的去蛋白骨微粒，得去蛋白骨微粒-胶原蛋白混合溶液；将去蛋白骨微粒-胶原蛋白混合溶液按照1:4-1:8的体积比加入到含有0.5%-2%浓度的乳化剂的液体石蜡中进行乳化，然后进行交联固化，离心并去除上清，然后去除液体石蜡并脱水，将脱水产物干燥得到重组胶原蛋白-去蛋白骨复合微球。
2.根据权利要求1所述一种含有去蛋白骨的注射填充剂，其特征在于：所述复合微球:凝胶的质量比为1:6-1:1，凝胶中透明质酸钠的浓度为5-25 mg/mL。
3.根据权利要求1所述一种含有去蛋白骨的注射填充剂，其特征在于：所述凝胶中重组胶原蛋白的浓度为5-25 mg/mL。
4.根据权利要求1所述一种含有去蛋白骨的注射填充剂，其特征在于：所述凝胶还含有麻醉剂，麻醉剂为利多卡因或苯佐卡因，凝胶中麻醉剂的浓度为1-5 mg/mL。
5.根据权利要求1所述一种含有去蛋白骨的注射填充剂，其特征在于：所述凝胶是通过在碱性条件下将分子量为20万-300万的透明质酸钠和分子量为40K-120K的重组胶原蛋白进行化学交联后分散至生理缓冲溶液而制成的。
6.一种如权利要求1所述的含有去蛋白骨的注射填充剂的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
将透明质酸钠和重组胶原蛋白进行交联后与生理缓冲溶液混匀得凝胶，或者将透明质酸钠和重组胶原蛋白进行交联后与麻醉剂以及生理缓冲溶液混匀得凝胶；在去蛋白骨微粒上修饰交联重组胶原蛋白得复合微球；将所得凝胶与复合微球混合。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于：所述注射填充剂的制备方法具体包括以下步骤：
1）在0.02-2M碱性溶液中加入终浓度分别为0.02%-5%、5%-25%及2%-20%的交联剂、透明质酸钠及重组胶原蛋白，然后于30-60℃反应1-16小时得凝胶I，将凝胶I水洗后用含或不含麻醉剂的pH6-8的磷酸盐缓冲液稀释至透明质酸钠的浓度为5-25 mg/mL，得凝胶II；
2）将切割成块状的动物骨组织用水清洗后粉碎为颗粒，然后用所含SDS、NaOH和有机溶剂的质量分数分别为0.2%-2%、0.3%-4%和20%-80%的混合水溶液，按照20-60分钟/次超声处理3-6次；然后用水清洗、干燥，得到灭病毒、脱脂和脱细胞的骨组织颗粒；
3）将灭病毒、脱脂和脱细胞的骨组织颗粒再次粉粹后于600-1200℃煅烧2-6小时，然后采用空气磨或球磨设备进行处理，将处理后的颗粒进行筛分，得到粒径10-80μm的去蛋白骨微粒；
4）在质量分数为5%-20%的重组胶原蛋白溶液中加入终浓度2%-10%的去蛋白骨微粒，得去蛋白骨微粒-胶原蛋白混合溶液；将去蛋白骨微粒-胶原蛋白混合溶液按照1:4-1:8的体积比加入到含有0.5%-2%浓度的乳化剂的液体石蜡中进行乳化，然后进行交联固化，离心并去除上清，然后去除液体石蜡并脱水，将脱水产物干燥得到重组胶原蛋白-去蛋白骨复合微球；
5）将重组胶原蛋白-去蛋白骨复合微球与凝胶II按照1:6-1:1的质量比混合后进行脱气、灭菌，得到含有去蛋白骨的注射填充剂。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于：所述步骤3）中，采用空气磨进行处理的控制参数为：气固比为2:1-4:1；第一阶段进气压力为0.4-0.6MPa ，分级轮转速为1600-2400r/min，进料速率为70-250g/min；第二阶段进气压力为0.1-0.2MPa ，分级轮转速为300-800r/min，进料速率为15-30g/min。
9.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于：所述步骤4）中，乳化剂为非离子表面活性剂中的任意一种；乳化的条件为：400-1000r/min；交联固化的条件为：交联反应时间为5-20min，温度为2-40℃，交联剂为戊二醛、甲醛、碳二亚胺、环氧化物、京尼平、单宁酸、原花青素中的任意一种或多种。
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