CN101496914B - 骨支架材料及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种骨支架材料及其制备方法。本发明所提供的骨支架材料，是将骨垢的松质骨进行脱脂、脱蛋白和脱细胞处理得到的胶原质量百分含量为(23.35±3.04)g/100g、钙质量百分含量为(30.43±2)g/100g、孔径为200um-500um的骨基质。其中，脱脂、脱蛋白和脱细胞的处理方法是将松质骨浸入氯仿和甲醇混合液体中6-24小时，优选为8小时；再转入TritonX-100和氨水混合溶液中作用2-72小时，优选为8小时。该方法获得的骨基质材料其力学抗压性能有明显的提高，有较好的体外稳定性，并能在体内逐步降解，有良好的细胞和组织相容性。同时，获得的骨基质上的胶原蛋白质可与骨形态发生蛋白-2结合，结合后的复合物能较好的发挥骨诱导效应。

Description

骨支架材料及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及一种可用于骨损伤修复的骨支架材料及其制备方法与应用。

背景技术

骨组织工程是应用生物学和工程学的原理，研究开发能够修复、维持和改善损伤骨组织功能的生物替代物的一门学科。骨生物材料的开发与应用是骨组织工程中研究的重要组成部分，理想的骨生物材料需要良好的生物相容性，合适的降解速度，合适的孔径，并能为创伤部位提供足够的力学支持。目前，骨生物材料主要包括合成的高分子有机材料，金属植入材料，陶瓷植入材料及天然骨材料。天然材料主要包括来源于动物的异种骨移植物，它与人类的骨组织有着相似的结构和组成，因此在骨损伤修复中发挥着重要作用。

发明内容

本发明提供了一种骨支架材料及其制备方法。

本发明所提供的骨支架材料按照下述方法制备：将松质骨进行脱脂、脱蛋白和脱细胞处理，得到胶原质量百分含量为(23.35±3.04)g/100g、钙质量百分含量为(30.43±2)g/100g和孔径为200um-500um的骨基质即为骨支架材料。

所述松质骨可直接从商业途径获得，或也可从屠宰的动物中获得。

其中，可用现有的方法对所述骨垢的松质骨进行脱脂、脱蛋白和脱细胞处理，如采用丙酮或氯仿和甲醇进行脱脂；采用SDS，胰酶或TitonX-100脱细胞和蛋白。优选采用如下方法对所述骨垢的松质骨进行脱脂、脱蛋白和脱细胞处理：将松质骨浸入氯仿和甲醇混合液体中6-24小时，然后再转入TritonX-100和氨水混合溶液中作用2-72小时。

所述的氯仿和甲醇混合液中，氯仿和甲醇的体积比可为1∶1。

所述TritonX-100和氨水混合溶液中，所述TritonX-100的体积百分含量为0.1％-2％，氨的质量百分含量为0.3g/100ml；其中TritonX-100的体积百分含量具体可为0.2ml/100ml。

所述骨垢的松质骨在进行脱脂、脱蛋白和脱细胞处理前，可先放入pH为7.4的磷酸盐缓冲液中浸泡8-12小时。

上述制备所述的骨支架材料的方法也属于本发明的保护范围。

上述骨支架材料与骨形态发生蛋白-2形成的复合物也属于本发明的保护范围。该复合物能较好的发挥骨诱导效应，促进骨的再生。

本发明的骨支架材料不仅有合适的孔径(200um-500um)，通过体外对大鼠成骨细胞贴付，增殖及生存活力的分析及大鼠皮下包埋后免疫反应的分析发现该材料有良好的细胞和组织相容性，力学性能分析显示有较强的力学强度，合适的体内体外降解速度，其中的胶原蛋白结合能与胶原特异结合的生长因子后能达到良好的体内异位成骨效果。这种材料克服了传统的煅烧骨不能与生长因子特异结合的缺点，也克服了传统脱钙骨力学强度较弱的缺点，为生物材料在骨组织工程中的应用提供了重要数据。

附图说明

图1为CCMBM的结构(A)CCMBM的整体照片，(B和C)扫描电镜图。

图2为CCMBM的生物相容性(A)成骨细胞在CCMBM上培养2天的FDA染色，(B)成骨细胞在CCMBM上培养4天的FDA染色，(C)成骨细胞CCMBM上培养4天的FDA和Hoechest3342双染色图(D-F)CCMBM，未处理松质骨和黑橡胶，在大鼠皮下包埋14天后宏观照片(G-L)CCMBM，未处理松质骨和黑橡胶包埋后在大鼠皮下包埋7天和14天然后切片进行H&E染色，(G)CCMBM在大鼠皮下包埋7天，(H)未处理松质骨在大鼠皮下包埋7天，(I)黑橡胶在大鼠皮下包埋7天，(J)CCMBM在大鼠皮下包埋14天，(K)未处理松质骨在大鼠皮下包埋14天，(L)黑橡胶在大鼠皮下包埋14天。

图3为加载BMP-2后CCMBM的诱骨能力(A)和(D)为实施例1的CCMBM(没有复合因子的对照)，(B)和(E)为实施例1的CCMBM加天然BMP-2组，(C)和(F)为实施例1的CCMBM加带有胶原结合区的BMP-2，细箭头为实施例1的CCMBM降解区，粗箭头为新生组织区，(D)，(E)，(F)为(A)，(B)，(C)的的放大图。

图4为经纯化和复性的带胶原结合区的BMP-2蛋白进行15％SDS-PAGE检测泳道M为Marker，泳道1为经纯化的表达蛋白(还原条件下)，泳道2为经复性的表达蛋白。

具体实施方式

现以骨垢的松质骨为例，阐明本发明的骨支架材料及其制备方法。

1、取屠宰牛的大腿骨，分离骨垢的松质骨，将其切成片状，去除周边皮质骨以及边缘密质骨，再将材料切成6×6×20mm的条状。

2、将步骤1获得的材料放于PBS缓冲液(pH＝7.4)中，浸泡8-12小时，期间不断换液，并搅拌。

3、脱脂处理：将步骤2获得的材料切成6×6×6mm的块，放于体积比为1∶1的氯仿和甲醇的混合液体中，搅拌6-24小时，然后在所述PBS中反复浸洗。

4.脱细胞和脱蛋白处理：将步骤3获得的材料切成2×6×6mm的薄片，放于TritonX-100和氨水混合溶液(TritonX-100的终浓度为0.1ml/100ml-2ml/100ml，氨的终浓度为0.3g/100ml)中作用2小时，搅拌，然后在所述的PBS中浸洗24小时，换液20次。

5.将步骤4获得的材料在冻干机中冻干过夜，Co60辐照灭菌，得到部分脱蛋白骨基质(CCMBM)。

具体的实验方法和结果见下述实施例。

实施例1、骨支架材料的制备

1、取屠宰牛的大腿骨，分离骨垢的松质骨，将其切成片状，去除周边皮质骨以及边缘密质骨，再将材料切成6×6×20mm的条状。

2、将步骤1获得的材料放于PBS缓冲液(PH＝7.4)中，浸泡8-12小时，期间不断换液，并搅拌。

3.脱脂处理：将步骤2获得的材料切成6×6×6mm的块，放于体积比为1∶1的氯仿和甲醇的混合液体中，搅拌8小时，然后在所述PBS中反复浸洗。

4.脱细胞和脱蛋白处理：将步骤3获得的材料切成2×6×6mm的薄片，放于TritonX-100和氨水混合溶液(TritonX-100的终浓度为2ml/100ml，氨的终浓度为0.3g/100ml)中作用2小时，搅拌，然后在所述的PBS中浸洗24小时，换液20次。

5.将步骤4获得的材料在冻干机中冻干过夜，Co60辐照灭菌，得到部分脱蛋白骨基质(CCMBM)。

实施例2、CCMBM的组成，孔径及力学强度分析

实施例1得到的CCMBM为白色的多孔材料。使用扫描电子显微镜对CCMBM的超微结构进行分析，发现材料的孔径为200um-500um，它有利于细胞长入和营养运输。为了解获得的骨基质的组成，对CCMBM的胶原含量和钙含量进行分析。

其中，测定实施例1的CCMBM的胶原含量的方法如下：CCMBM于12mol/l的盐酸中溶解，110℃烘干，按照文献(Reddy GK，Enwemeka CS.A simplified method forthe analysis of hydroxyproline in biological tissues.Clin Biochem1996；29(3)：225-9.)中描述的方法测定540nm的OD值，以羟脯氨酸为标准物制作标准曲线，测出羟脯氨酸的量，换算为胶原的量。实验重复三次。

测定钙含量的方法如下：CCMBM溶于0.6mol/l的盐酸溶液中，用钙-甲酚酞络合滴定法(参考Janssen JW，Helbing AR.Arsenazo III：an improvement of theroutine calcium determination in serum.Eur J Clin Chem Clin Biochem1991；29(3)：197-201.)滴定，计算出钙含量。实验重复三次。

结果表明实施例1的CCMBM的胶原含量为(23.35±3.04)g/100g、钙含量为(30.43±2)g/100g；

为了解实施例1的CCMBM的力学性能，对CCMBM及未处理的松质骨和脱钙骨基质进行压力、最大抗压力和压缩能的测试分析。

DBM用来源于屠宰牛的大腿骨的松质骨，松质骨经过丙酮浸泡48小时脱脂，然后在0.6mol/l盐酸中浸泡48小时脱钙，最后冻干得到DBM。

其中，压力、最大抗压力、压缩能测试分析的方法如下：使用万能压力测试机(CMT8502)，6×6×6mm的CCMBM及未处理的松质骨和脱钙骨基质以25毫米/分钟的速度垂直施压，根据压力-形变的曲线确定最大抗压力(曲线最高点)，硬度(曲线最大斜率)和压缩能(最高点到零点之间的面积)。

结果表明实施例1的CCMBM的硬度为32.05±8.19N/mm、最大抗压力为81.15±25.16N和压缩能为104.04±41.59N.mm；实施例1中的未处理的松质骨的硬度为75.7±17.4N/mm、最大抗压力为161.5±23.3N和压缩能为173.3±15.37N.rm；由实施例1的松质骨制备的脱钙骨基质的硬度为3.04±1.09N/mm、最大抗压力为13.7±6.71N和压缩能为30.825±15.1N.mm。

压力测试分析的结果显示，实施例1的CCMBM的硬度、最大抗压力和压缩能都高于脱钙骨基质，这说明按照上述的方法获得的骨基质比脱钙骨基质有更好的抗压能力。

实施例3、CCMBM降解特性分析

为了解实施例1的CCMBM的降解特性，对实施例1的CCMBM进行体外降解实验和体内降解实验分析。实验重复三次。

体外降解实验方法如下：

将冻干的CCMBM浸泡于pH＝7.4PBS缓冲液(Hyclone)中，两天换液一次，在10，20，30，40，50和60天分别取出冻干后称重，计算剩余质量占原质量的百分比。

体外降解实验的结果显示，实施例1的CCMBM在PBS缓冲液中降解10，20，30，40，50和60天后测定其剩余的质量分别为99.8±0.23％、99.04±0.27％、98.34±0.21％、97.94±0.52％、97.45±0.62％和96.23％±0.47％。

体内降解实验方法为将实施例1的CCMBM在SD大鼠体内包埋60天后，取出，做切片及H&E。

体内降解实验表明，实施例1的CCMBM在SD大鼠体内包埋60天后，剩余材料面积为79％±9.2％。这说明实施例1的CCMBM在体外有较强的稳定性，在体内的降解速率适宜。

实施例4、CCMBM的生物相容性分析

实施例1的CCMBM的生物相容性分析可通成骨细胞在CCMBM上的增殖，存活，CCMBM释放物质的毒性进行评价。

成骨细胞(ATCC货号CRL-2593，品名MC3T3-E1)与实施例1的CCMBM共培养培养方法如下：将成骨细胞接种于60mm直径的培养皿中，将实施例1的CCMBM放于transwell培养容器中(使液体可在transwell和培养皿中自由交换，但与成骨细胞并无直接接触，以检测材料释放物质对细胞的毒性。用MTT法测定的结果来反应细胞的生长情况，MTT实验中测出的OD值与细胞数呈线性正相关。

检测成骨细胞在实施例1的CCMBM上的增殖和存活则直接将成骨细胞接种到实施例1的CCMBM上，进行染色分析。采用荧光素双醋酸酯(FDA)染色法、Hoechest33342/FDA双染色法检测分析成骨细胞的存活和增殖能力。实验重复三次。

Hoechest33342/FDA双染色法中FDA只染活细胞，Hochest33342可以染全部细胞，因此细胞存活率＝FDA阳性细胞/Hoechest33342细胞×100％。

实施例1的CCMBM的FDA染色及Hoechest33342/FDA染色双法检测结果显示成骨细胞在CCMBM上的存活率高达98.45/100±1.1/100；

MTT实验结果表明，与实施例1的CCMBM共培养的成骨细胞的细胞生长情况与单独培养的OD值相似，值为0.555±0.077(4天)，0.829±0.057(8天)。单独培养的成骨细胞的OD值为0.578±0.066(4天)，0.815±0.054(8天)。上述结果表明，实施例1的CCMBM的释放物质对细胞的增殖无负面影响。

实施例1的CCMBM、未处理的松质骨和黑橡胶分别包埋到SD大鼠皮下，每只包埋0.2g，7天和14天后分别取出做切片和H&E染色。

结果如图2(G-L)所示，实施例1的CCMBM有较少的免疫细胞及血细胞渗漏，而未处理的材料和黑橡胶有较多的免疫细胞入侵和血管渗漏现象。

综上所述，实施例1的CCMBM比未处理的松质骨和黑橡胶有更好的生物相容性。

实施列5、CCMBM加载骨形态发生蛋白-2后体内诱骨能力的检测

一、带有胶原结合区的BMP-2的制备

1、带有胶原结合区的BMP-2原核表达载体的构建

根据已知的人BMP2(hBMP2)的cDNA序列(GenBank号为：650)设计PCR扩增引物，并在正向引物中引入胶原结合结构域(CBD)“TKKTLRT”(序列表中的SEQID №：1)的编码序列，引物序列如下：

hBMP2F1：5’-TACCGGTAGCGCGGGCAGTGCTGCGGGTTCTGGCGGTGTCGACCAAGCCAAACAC-3’

hBMP2F2：5’-CCGCATATGACTAAGAAAACCCTGCGTACTGGTACCGGTAGC-3’

hBMP2R：5’-CCGCTCGAGCTATTAACGACAACCACAACC-3’

提取人的总RNA，反转录为cDNA，以此为模板，在引物hBMP2F1和hBMP2R的引导下进行PCR扩增，30μl PCR反应体系为：正、反向引物各1pmol/μl、dNTPs200μmol/μl、Taq酶3ul；PCR反应条件为：先94℃预变性5min；然后94℃变性30s，55℃退火1min，72℃延伸1min，循环30次；最后72℃延伸10min。反应结束后，对扩增产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，结果经PCR扩增得到一条长度约400bp的DNA片段。对该片段进行回收并纯化后，作为第二次PCR的模板，再在引物hBMP2F2和hBMP2R的引导下进行第二次PCR扩增，PCR反应体系及反应条件同上，扩增结束后，对PCR产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，结果得到一条长度约430bp的条带，对其进行回收并纯化后，用限制性内切酶Nde I和Xho I双酶切后与经相同酶双酶切的原核表达载体pET-28a(Novagen)在16℃下，用T4 DNA连接酶连接12-24小时，将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆，提质粒，对该表达载体多克隆位点区进行测序，结果插入序列与预期序列相符，具有序列表中SEQ ID №：3的核苷酸序列，序列表中的SEQ ID №：3由477个碱基组成，编码序列表中SEQ ID №：2的氨基酸残基序列，包括CBD区，linker区和hBMP2成熟肽编码区，在插入区前还融合一段组氨酸亲和标签，其CBD区的保守序列为序列表中SEQ ID №：2自氨基端第22-28位氨基酸残基，linker区为自氨基端第31-43位氨基酸残基，hBMP2成熟肽为自氨基端第46-159位氨基酸残基，表明得到了正确的含有带有胶原结合区的BMP-2编码序列的重组质粒，命名为pET-28a-BMP2-h。

2、带有胶原结合区的BMP-2的原核表达

将步骤1构建的原核表达载体pET-28a-BMP2-h转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，将筛选到的阳性单克隆转接于LB液体培养基中，37℃培养12-24小时，再以2％接种比例转接于100mL LB液体培养基中，37℃培养3小时至OD₆₀₀值达到0.8，加入终浓度为1mM的IPTG，相同条件下继续诱导培养4小时。培养结束后，离心收集菌体，用PBS洗涤后再次离心收集菌体，用10mL PBS重悬菌体，超声破碎菌体，对裂解液进行15％SDS-PAGE检测，检测结果表明得到了蛋白粗提液，表达蛋白以包涵体的形式存在。

3、带有胶原结合区的BMP-2的纯化和复性

首先将步骤2经超声破碎的菌体离心收集包涵体。将稀释复性得到的蛋白溶液进行超滤浓缩处理，然后将蛋白质溶剂体系用50mM MES缓冲液(GIBCO)置换，冷冻干燥后低温保存。对经纯化和复性的表达蛋白进行15％SDS-PAGE检测，检测结果如图4所示(泳道M为Marker，泳道1为经纯化的表达蛋白(还原条件下)，泳道2为经复性的表达蛋白)，泳道1的纯化结果表明15KD的目的蛋白已经达到相当纯度，由于BMP2的活性形式是通过一对二硫键形成的二聚体形式，在非还原条件下可看到其二聚体条带，泳道2的检测结果表明复性形成的二聚体已达到30％，将经纯化的带有胶原结合区的BMP-2命名为rhBMP2-h。

二、体内诱骨能力的检测

实验分三组：天然BMP2组、带有胶原结合区的BMP-2(rhBMP2-h)组和对照组。首先将实施列1的CCMBM制成1cm×1cm×0.1cm的正方形薄片，将5mg实施例1的CCMBM用总量为0.3nmol的BMP-2(sigma，B3555)溶液浸泡(天然BMP2组)，同时将5mg实施例1的CCMBM用总量为0.3nmol的rhBMP2-h溶液浸泡(rhBMP2-h组)，使实施例1的CCMBM与天然BMP-2和带有胶原结合区的骨形态发生蛋白-2(rhBMP2-h)结合，对照组只加载PBS，冷冻干燥后备用。

选用成年雄性SD大鼠，背部皮下包埋制备好的上述加载不同蛋白的CCMBM材料块。包埋8周后，取出包埋物，切片并进行HE染色，结果如图3所示，加载天然BMP2的实验组植入的CCMBM材料块及组织学切片观察结果，由于BMP-2本身具有异位诱骨能力，启动了一定的骨化过程，诱导了少量间充质细胞向骨系细胞分化，因而分泌出少量胶原基质和钙离子沉积于材料之上，其组织学切片显示有少量编织骨(woven bones，WB)形成。rhBMP2-h的实验组的CCMBM材料块及组织学切片观察结果，改造过的rhBMP2-h与CCMBM的胶原具有特异的结合作用，且作用力较强，植入体内不易扩散稀释，始终在作用位点保持较高的浓度，诱导大量间充质细胞向骨系细胞分化。分化形成的骨系细胞又可以分泌出大量新的胶原基质和钙离子沉积在原有CCMBM材料上，原材料降解释放出的rhBMP2-h又有部分可能结合在新形成的胶原上，组织学切片显示有板层骨(lamella bones，LB)形成，并可见骨基质(bone marrows)形成。

上述结果表明复合物CCMBM/BMP-2和CCMBM/rhBMP2-h包埋到大鼠背部皮下，能产生较好的异位骨形成。

                    序列表

Claims (12)

1.一种骨支架材料，是将松质骨进行脱脂、脱蛋白和脱细胞处理得到的胶原质量百分含量为(23.35±3.04)g/100g、钙质量百分含量为(30.43±2)g/100g和孔径为200um-500um的骨基质。

2.根据权利要求1所述的骨支架材料，其特征在于：所述松质骨按照如下方法进行脱脂、脱蛋白和脱细胞处理：将骨垢的松质骨浸入氯仿和甲醇混合液体中6-24小时；然后再转入TritonX-100和氨水混合溶液中作用2-72小时。

3.根据权利要求2所述的骨支架材料，其特征在于：所述松质骨按照如下方法进行脱脂、脱蛋白和脱细胞处理：将骨垢的松质骨浸入氯仿和甲醇混合液体中8小时；然后再转入TritonX-100和氨水混合溶液中作用24小时。

4.根据权利要求2所述的骨支架材料，其特征在于：所述氯仿和甲醇混合液中，氯仿和甲醇的体积比为1∶1。

5.根据权利要求2、3或4所述的骨支架材料，其特征在于：所述TritonX-100和氨水混合溶液中，所述TritonX-100的体积百分含量为0.1％-2％，氨的质量百分含量为0.3％。

6.制备权利要求1-5中任一所述的骨支架材料的方法，是将松质骨进行脱脂、脱蛋白和脱细胞处理，得到的胶原质量百分含量为(23.35±3.04)g/100g、钙质量百分含量为(30.43±2)g/100g和孔径为200um-500um的骨基质即为骨支架材料。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述松质骨按照如下方法进行脱脂、脱蛋白和脱细胞处理：将松质骨浸入氯仿和甲醇混合液体中6-24小时；然后再转入TritonX-100和氨水混合溶液中作用2-72小时。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述松质骨按照如下方法进行脱脂、脱蛋白和脱细胞处理：将松质骨浸入氯仿和甲醇混合液体中8小时；然后再转入TritonX-100和氨水混合溶液中作用8小时。

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述氯仿和甲醇混合液中，氯仿和甲醇的体积比为1∶1。

10.根据权利要求7、8或9所述的方法，其特征在于：所述TritonX-100和氨水混合溶液中，所述TritonX-100的体积百分含量为0.1％-2％，氨的质量百分含量为0.3％。

11.一种骨支架材料，是权利要求1-5中任一所述的骨支架材料与骨形态发生蛋白-2形成的复合物。

12.权利要求1、2、3、4、5或11所述骨支架材料在制备骨支架中的应用。

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