CN111821513A - 一种促进软骨形成的复合水凝胶及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本申请公开了一种促进软骨形成的复合水凝胶及其制备方法和应用。本申请的复合水凝胶主体结构为羧甲基壳聚糖‑氧化硫酸软骨素水凝胶,羧甲基壳聚糖‑氧化硫酸软骨素水凝胶中分散有负载Kartogenin的聚乳酸‑羟基乙酸共聚物微球。本申请的复合水凝胶,使用时,直接将其注射到软骨修复部位,能长期停留并作用于软骨修复部位;利用微球对Kartogenin进行缓释,能够在软骨修复部位长期可控的施药,促进软骨形成,起到软骨修复作用。采用本申请的复合水凝胶进行软骨修复,操作简单、成本低、效果好,为软骨修复提供了一种新的方案和途径。
Description
技术领域
本申请涉及软骨修复或形成领域,特别是涉及一种促进软骨形成的复合水凝胶及其制备方法和应用。
背景技术
软骨的损伤或功能障碍一直危害人类健康,是引发重大疾病和死亡的主要原因。近年来,因创伤、疾病、意外灾害或先天因素以及人口老龄化等原因导致的软骨损伤数量巨大,在给我国临床医疗体系带来重大困难的同时,也给国民健康发展带来严峻挑战。软骨是一种无壁无血管的组织,一旦受损无法自行愈合。在软骨消耗后,骨头直接接触就会有疼痛、肿胀等现象产生,限制了病人的运动能力。如果关节软骨损伤过度,到了不堪使用时,只有进行全膝关节置换手术,将破损不堪的关节锯下,以其他材料取代。
目前常见的软骨修复方法包括:关节软骨磨削成形术、关节清创术、软骨下骨钻孔术、微骨折术、自体骨软骨移植术等。这些传统疗法虽能在一定程度上修复受损的软骨,但都需要进行手术,成本较高,后期需要长时间的修养。而且修复后的软骨缺乏完整软骨应有的力学性能和带状组织,可能导致进一步的退化。
现在常见的软骨替换物是金属关节和自体软骨。其中金属关节会出现异体排斥,寿命短,仅有十五到二十年的使用寿命。而自体软骨虽然不会出现排斥反应,但是自体移植依赖于充分的整合。所以,如何更有效的实现软骨修复,是本领域的研究重点和难点。
发明内容
本申请的目的是提供一种新的促进软骨形成的复合水凝胶及其制备方法和应用。
本申请采用了以下技术方案:
本申请的第一方面公开了一种促进软骨形成的复合水凝胶,该复合水凝胶的主体结构为羧甲基壳聚糖-氧化硫酸软骨素水凝胶(缩写CMC-OCS水凝胶),羧甲基壳聚糖-氧化硫酸软骨素水凝胶中分散有负载Kartogenin的聚乳酸-羟基乙酸共聚物微球(缩写PLGA-KGN微球)。本申请的一种实现方式中,CMC-OCS水凝胶由羧甲基壳聚糖分子链上的氨基和氧化硫酸软骨素分子链上的醛基发生的席夫碱反应交联形成。
需要说明的是,本申请的复合水凝胶,在其凝胶之前具有很好的可注射性能,可以直接注射到需要软骨修复的部位,注射后在需要软骨修复的部位直接原位凝胶,形成本申请的复合水凝胶,具有强度高、润湿性好、生物相容性高等优点,并可在受损部位长期停留起效。本申请复合水凝胶中的PLGA-KGN微球具有缓释Kartogenin的效果,可在受损部位长期可控的施药,以促进软骨修复。并且,本申请的复合水凝胶所需的原材料易得,制备操作简单,可在生物医学工程材料领域广泛应用。
本申请的复合水凝胶,直接在受损部位促进软骨形成,从而起到修复软骨的作用。与现有的金属关节和自体软骨等软骨替换物相比,本申请是直接促进自身的软骨形成,没有排斥作用,也不需要移植,具有更好的修复效果。与现有的关节软骨磨削成形术、关节清创术、软骨下骨钻孔术、微骨折术等软骨修复方法相比,采用本申请的复合水凝胶进行软骨修复,几乎不需要手术,只需将本申请的复合水凝胶注射到受损部位即可;并且,本申请复合水凝胶形成的软骨具有完整软骨应有的力学性能和带状组织,软骨修复效果更好。
还需要说明的是,本申请的Kartogenin(缩写KGN)是一种小分子有机化合物,是smad4/smad5通路激活剂,可以促进多功能间充质干细胞选择性分化为软骨细胞,具有极强的促进软骨形成和腱-骨愈合作用。本申请的关键就是利用水溶胶将KGN固定在软骨修复部位,起到靶向定点作用的效果;并利用PLGA-KGN微球的药物释放系统可控缓释KGN,使KGN长期作用于软骨修复部位,提高使用效率,使KGN能更好的发挥效能,从而更有效的促进软骨修复部位的软骨形成,起到软骨修复的效果。
本申请的一种实现方式中,复合水凝胶由重量份2-15的羧甲基壳聚糖、重量份2-15的氧化硫酸软骨素和重量份1-5的负载Kartogenin的聚乳酸-羟基乙酸共聚物微球组成。
可以理解,以上组份和配比只是本申请的一种实现方式中具体采用的复合水凝胶配方,不排除还可以采用其它配比;特别是PLGA-KGN微球的用量,可以根据其负载的Kartogenin含量,以及所需要的Kartogenin有效剂量进行调整。
本申请的一种实现方式中,负载Kartogenin的聚乳酸-羟基乙酸共聚物微球的粒径为10.28±0.46μm,分散度为0-0.2,包封率为35.48±0.6%。其中,分散度一般在0-0.2都具有较好的均一性,满足使用需求,本申请的一种实现方式中分散度可以达到0.119,均一性较好。
可以理解,PLGA-KGN微球的以上参数只是本申请的一种实现方式中具体制备的PLGA-KGN微球参数;在实际应用时,可以根据所需要的Kartogenin负载量,以及实际生产情况,调整微球的粒径、分散度以及包封率等。
本申请的一种实现方式中,复合水凝胶的压缩强度为20-50kPa,压缩应变为60-80%,压缩弹性模量为2-25kPa。
可以理解,复合水凝胶的以上参数是指其凝胶固化后的参数,该参数可以通过改变复合水凝胶中各组份的用量配比进行调整,具体的,根据产品设计以及软骨修复需求而定。
本申请的第二方面公开了本申请的复合水凝胶在制备修复软骨的药物中的应用。
可以理解,本申请的复合水凝胶能够作用于软骨修复部位,促进该部位的软骨形成,起到软骨修复作用;因此,可以作为修复软骨的药物使用。
本申请的第三方面公开了一种用于修复软骨的试剂盒,该试剂盒中含有独立包装的羧甲基壳聚糖、氧化硫酸软骨素和负载Kartogenin的聚乳酸-羟基乙酸共聚物微球。
本申请的试剂盒使用时,按照重量份2-15的羧甲基壳聚糖、重量份2-15的氧化硫酸软骨素和重量份1-5的负载Kartogenin的聚乳酸-羟基乙酸共聚物微球混合均匀,然后将混合物注射到需要软骨修复的部位形成复合水凝胶。
需要说明的是,本申请创造性的将羧甲基壳聚糖、氧化硫酸软骨素和负载Kartogenin的聚乳酸-羟基乙酸共聚物微球组装成用于修复软骨的试剂盒;按照本申请的试剂盒使用方法,能够很好的起到软骨修复作用,为软骨修复提供了一种新的方案和途径。
本申请的一种实现方式中,试剂盒中的负载Kartogenin的聚乳酸-羟基乙酸共聚物微球的粒径为10.28±0.46μm,分散度为0-0.2,包封率为35.48±0.6%。
本申请的一种实现方式中,试剂盒形成的复合水凝胶的压缩强度为20-50kPa,压缩应变为60-80%,压缩弹性模量为2-25kPa。
本申请的第四方面公开了本申请的复合水凝胶的制备方法,包括以下步骤:
氧化硫酸软骨素制备步骤,包括采用高碘酸钠对软骨素进行氧化,即获得所述氧化硫酸软骨素;
负载Kartogenin的聚乳酸-羟基乙酸共聚物微球制备步骤,包括以下步骤:
(1)将1-10重量份的Kartogenin溶于50-150份重量份的水中,作为水相,即W相;
(2)将1-10重量份的聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶于50-150重量份的甲基纤维素水溶液中,作为油相,即O相;
(3)将W相和O相混合,均质乳化形成初乳液;
(4)将初乳液倒入聚乙烯醇和氯化钠的混合水溶液中形成预复乳液;
(5)将预复乳液倒入快速膜乳化装置中,在氮气压力下通过四级串联的不锈钢膜,反复过膜2-5次;过膜后的乳液倒入预先准备好的固化液中,磁力搅拌3-10小时,使微粒析出;
(6)采用去离子水对步骤(5)固化后的乳液微粒进行2-6次洗涤,然后冷冻干燥,即获得本申请的负载Kartogenin的聚乳酸-羟基乙酸共聚物微球;
复合水凝胶制备步骤,将羧甲基壳聚糖、制备的氧化硫酸软骨素,与制备的负载Kartogenin的聚乳酸-羟基乙酸共聚物微球,按配比混合均匀,即获得本申请的复合水凝胶。
本申请的一种实现方式中,步骤(2)的甲基纤维素水溶液的浓度为5wt%-20wt%。
本申请的一种实现方式中,步骤(4)的聚乙烯醇和氯化钠的混合水溶液中,聚乙烯醇的浓度为1wt%-5wt%,氯化钠的浓度为1wt%-5wt%。
本申请的一种实现方式中,步骤(5)中,磁力搅拌的转速为300转/min-600转/min。
本申请的一种实现方式中,步骤(6)中,冷冻干燥的温度为-10℃至-50℃,冷冻干燥的时间为10-20小时,压力为1Pa-20Pa。
本申请的一种实现方式中,氧化硫酸软骨素制备步骤具体包括:
(a)将5-15重量份的软骨素完全溶解于100-300重量份的蒸馏水中,加入1-6重量份的高碘酸钠,在避光条件下反应10-30小时;
(b)在步骤(a)反应完成后的溶液中加入1-5重量份的乙二醇,搅拌30-60分钟,灭活剩余的高碘酸钠;
(c)将步骤(b)获得的溶液倒入透析袋中室温透析2-5天,每天换水2-5次,透析完成后,冷冻干燥,即获得本申请的氧化硫酸软骨素。
本申请的一种实现方式中,步骤(a)中,高碘酸钠为粉末材料。
本申请的一种实现方式中,步骤(c)中,冷冻干燥的温度为-20℃至-50℃,冷冻干燥的时间为12-48小时,压力为1Pa-10Pa。
本申请的第五方面公开了一种制备氧化硫酸软骨素的方法,包括以下步骤:
(a)将5-15重量份的软骨素完全溶解于100-300重量份的蒸馏水中,加入1-6重量份的高碘酸钠,在避光条件下反应10-30小时;
(b)在步骤(a)反应完成后的溶液中加入1-5重量份的乙二醇,搅拌30-60分钟,灭活剩余的高碘酸钠;
(c)将步骤(b)获得的溶液倒入透析袋中室温透析2-5天,每天换水2-5次,透析完成后,冷冻干燥,即获得本申请的氧化硫酸软骨素。
本申请的第六方面公开了一种制备负载Kartogenin的聚乳酸-羟基乙酸共聚物微球的方法,包括以下步骤:
(1)将1-10重量份的Kartogenin溶于50-150份重量份的水中,作为水相,即W相;
(2)将1-10重量份的聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶于50-150重量份的甲基纤维素水溶液中,作为油相,即O相;
(3)将W相和O相混合,均质乳化形成初乳液;
(4)将初乳液倒入聚乙烯醇和氯化钠的混合水溶液中形成预复乳液;
(5)将预复乳液倒入快速膜乳化装置中,在氮气压力下通过四级串联的不锈钢膜,反复过膜2-5次;过膜后的乳液倒入预先准备好的固化液中,磁力搅拌3-10小时,使微粒析出;
(6)采用去离子水对步骤(5)固化后的乳液微粒进行2-6次洗涤,然后冷冻干燥,即获得本申请负载Kartogenin的聚乳酸-羟基乙酸共聚物微球。
需要说明的是,本申请的复合水凝胶的制备方法中,实际上包含了氧化硫酸软骨素的制备和负载Kartogenin的聚乳酸-羟基乙酸共聚物微球的制备两个关键步骤。因此,本申请的第五方面和第六方面分别提供了氧化硫酸软骨素和PLGA-KGN微球的制备方法。可以理解,本申请制备氧化硫酸软骨素的方法中,以及制备负载Kartogenin的聚乳酸-羟基乙酸共聚物微球的方法中,一些细节参数都可以参考本申请的复合水凝胶的制备方法,在此不累述。
本申请的有益效果在于:
本申请促进软骨形成的复合水凝胶,使用时,直接将其注射到软骨修复部位,能够长期停留并作用于软骨修复部位;并且,利用微球对Kartogenin进行缓释,能够在软骨修复部位长期可控的施药,促进软骨形成,起到软骨修复作用。采用本申请的复合水凝胶进行软骨修复,无需进行手术,操作简单,原材料易获取且成本低,并且通过自身形成的软骨组织进行修复,效果更好,为软骨修复提供了一种新的方案和途径。
附图说明
图1是本申请实施例中复合水凝胶的红外分析图谱;
图2是本申请实施例中复合水凝胶的PLGA-KGN微球的扫描电镜图;
图3是本申请实施例中复合水凝胶的PLGA-KGN微球的粒径分布分析图;
图4是本申请实施例中复合水凝胶的扫描电镜图;
图5是本申请实施例中采用复合水凝胶进行软骨修复的医学影像图。
具体实施方式
现有的软骨修复普遍需要进行手术,并且软骨修复效果较差。常见的软骨替换物,例如金属关节,存在异体排斥作用,寿命短的缺陷;自体软骨虽然不会异体排斥,但是,自体移植依赖于充分的整合。所以寻找一种通过恢复透明软骨来修复软骨的治疗方式迫在眉睫。
本申请创造性的提出,如果能够在受损部位直接促进软骨形成,以此实现软骨修复,不仅能够解决软骨替换物的缺陷和不足;而且相对于关节软骨磨削成形术、关节清创术、软骨下骨钻孔术、微骨折术等传统疗法而言,在受损部位直接形成的软骨具有完整软骨应有的力学性能和带状组织,修复效果更好。
壳聚糖是一种天然多糖,因其出色的生物相容性,降解性,抗菌活性和低免疫原性而备受关注。分子上的活性氨基和羟基为各种侧基连接提供了位置,使壳聚糖成为理想的生物材料。然而,由于强的氢键作用,壳聚糖在水中的溶解性很差,限制了其进一步的应用。因此,壳聚糖的各种水溶性衍生物,例如羧甲基壳聚糖(CMC)被广泛用于生物材料中。硫酸软骨素(CS)是结缔组织和软骨中重要的结构成分,是一种天然的糖胺聚糖。它由β-1,3-连接的葡萄糖醛酸和(β-1,4)N-乙酰基-半乳糖胺的交替单元组成。基本上,基于天然多糖,如壳聚糖和硫酸软骨素衍生物,的水凝胶可用作药物递送系统,可以提供与人体组织的柔软、可渗透、亲水的界面。聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)由两种单体,乳酸和羟基乙酸随机聚合而成,是一种可降解的功能高分子有机化合物,具有良好的生物相容性、无毒、良好的成囊和成膜的性能,被广泛应用于制药、医用工程材料和现代化工业领域。
基于以上研究和认识,本申请创造性的提出以CMC-OCS水凝胶为载体,将KGN固定在受损部位,然后配合药物释放系统,利用PLGA-KGN微球的缓释作用,使KGN长期可控的在受损部位施药,促进软骨修复,从而起到软骨修复的效果。
因此,本申请研发并提供了一种促进软骨形成的复合水凝胶,该复合水凝胶的主体结构为CMC-OCS水凝胶,CMC-OCS水凝胶中分散有PLGA-KGN微球;其中,CMC-OCS水凝胶由羧甲基壳聚糖分子链上的氨基和氧化硫酸软骨素分子链上的醛基发生的席夫碱反应交联形成。
下面通过具体实施例和附图对本申请作进一步详细说明。以下实施例仅对本申请进行进一步说明,不应理解为对本申请的限制。
实施例一
本例促进软骨形成的复合水凝胶的主体结构为CMC-OCS水凝胶,CMC-OCS水凝胶中分散有负载Kartogenin的聚乳酸-羟基乙酸共聚物微球;CMC-OCS水凝胶由羧甲基壳聚糖分子链上的氨基和氧化硫酸软骨素分子链上的醛基发生的席夫碱反应交联形成。复合水凝胶由重量份5的羧甲基壳聚糖、重量份5的氧化硫酸软骨素和重量份1的负载Kartogenin的聚乳酸-羟基乙酸共聚物微球组成。
本例的复合水凝胶制备方法如下,以下各组份的用量均为重量份:
(1)5份软骨素(缩写CS)完全溶解于100份蒸馏水中,加入2份高碘酸钠,在避光条件下反应15小时。加入1份乙二醇以灭活剩余的高碘酸盐,搅拌30分钟。所得到的溶液倒入透析袋中室温透析2天,每天更换水2次。所得溶液在冷冻干燥12小时得到氧化硫酸软骨素(缩写OCS)。
(2)将2份KGN溶于50份水作为W相;将3份聚乳酸-羟基乙酸共聚物(缩写PLGA)溶于50份的浓度10wt%的甲基纤维素水溶液作为O相,将W相和O相混合,均质乳化形成初乳液。将初乳液倒入溶解有2wt%聚乙烯醇(缩写PVA)和2wt%NaCl的水溶液中形成预复乳液。将预复乳液倒入快速膜乳化装置中,在氮气压力下通过四级串联的不锈钢膜,反复过膜2-5次。过膜后的乳液迅速倒入预先准备好的固化液中,磁力搅拌300r/min处理3小时,使微粒充分析出。固化后的乳液加入去离子水离心清洗2-6次,冷冻干燥10小时得到PLGA-KGN微球。
(3)将5份羧甲基壳聚糖(缩写CMC),5份OCS,1份PLGA-KGN微球混合,即获得本例的复合水凝胶,标记为CMC-OCS+PLGA-KGN水凝胶。
实施例二
(1)5份CS完全溶解于100份蒸馏水中,加入2份高碘酸钠,在避光条件下反应15小时。加入1份乙二醇以灭活剩余的高碘酸盐,搅拌30分钟。所得到的溶液倒入透析袋中室温透析2天,每天更换水2次。所得溶液在冷冻干燥12小时得到OCS素。
(2)将2份KGN溶于50份水作为W相;将3份PLGA溶于50份的浓度10wt%的甲基纤维素水溶液作为O相,将W相和O相混合,均质乳化形成初乳液。将初乳液倒入溶解有2wt%PVA和2wt%NaCl的水溶液中形成预复乳液。将预复乳液倒入快速膜乳化装置中,在氮气压力下通过四级串联的不锈钢膜,反复过膜2-5次。过膜后的乳液迅速倒入预先准备好的固化液中,400r/min磁力搅拌3小时,使微粒充分析出。固化后的乳液加入去离子水离心清洗2-6次,冷冻干燥15小时得到PLGA-KGN微球。
(3)将10份CMC,5份OCS,3份PLGA-KGN微球混合,即获得本例的复合水凝胶,标记为CMC-OCS+PLGA-KGN水凝胶。
实施例三
(1)8份CS完全溶解于120份蒸馏水中,加入4份高碘酸钠,在避光条件下反应20小时。加入2份乙二醇以灭活剩余的高碘酸盐,搅拌50分钟。所得到的溶液倒入透析袋中室温透析2天,每天更换水2次。所得溶液在冷冻干燥18小时得到OCS。
(2)将5份KGN溶于80份水作为W相;将5份PLGA溶于80份的浓度10wt%的甲基纤维素水溶液作为O相,将W相和O相混合,均质乳化形成初乳液。将初乳液倒入溶解有2wt%PVA和2wt%NaCl的水溶液中形成预复乳液。将预复乳液倒入快速膜乳化装置中,在氮气压力下通过四级串联的不锈钢膜,反复过膜2-5次。过膜后的乳液迅速倒入预先准备好的固化液中,300r/min磁力搅拌3小时,使微粒充分析出。固化后的乳液加入去离子水离心清洗2-6次,冷冻干燥10小时得到PLGA-KGN微球。
(3)将8份CMC,5份OCS,3份PLGA-KGN微球混合,即获得本例的复合水凝胶,标记为CMC-OCS+PLGA-KGN水凝胶。
复合水凝胶性能测试
分别对实施例一、实施例二和实施例三制备的复合水凝胶进行红外光谱表征以及软骨修复试验,分析复合水凝胶的理化特征以及软骨修复效果。详细试验方法如下:
1.红外光谱表征
用溴化钾压片法制备待测样品,使用傅里叶红外光谱仪测定各样品的红外光谱。采用以上方案,本例分别对壳聚糖(chitosan)、羧甲基壳聚糖(CMC)、硫酸软骨素(CS)、氧化硫酸软骨素(OCS)、羧甲基壳聚糖-氧化硫酸软骨素水凝胶(CMC-OCS水凝胶)进行了红外光谱分析。其中,羧甲基壳聚糖-氧化硫酸软骨素水凝胶是实施例一、实施例二和实施例三的复合水凝胶的主体结构,本例以实施例一的5份CMC和5份OCS形成的CMC-OCS水凝胶为基础进行红外光谱分析。结果如图1所示。
图1中“Chitosan”曲线表示壳聚糖、“CMC”曲线表示羧甲基壳聚糖、“CS”曲线表示硫酸软骨素、“OCS”曲线表示氧化硫酸软骨素、“CMC-OCS”曲线表示羧甲基壳聚糖-氧化硫酸软骨素水凝胶。图1的结果显示,多糖的N-H和O-H拉伸振动的特征峰在3200-3500cm-1区域内有宽带。通过与CS的比较,OCS的光谱在1715.3cm-1附近出现了一个新的吸收峰,与醛基相对应。CMC-OCS凝胶的光谱与CMC相似。对于CMC-OCS水凝胶,在1241.9cm-1处的峰对应于C-O拉伸振动,在1715.3cm-1处不存在峰,表明OCS通过席夫碱键参与了凝胶化。亚胺基团的光谱表明发生了席夫碱反应,通常在1590-1690cm-1处有一个很强的峰。
红外谱图结果显示,羧甲基壳聚糖分子链上的氨基和氧化硫酸软骨素分子链上的醛基发生了席夫碱反应交联,从而形成了CMC-OCS水凝胶,结果与预期相符。
2.PLGA-KGN微球的形貌表征
使用扫描电镜分析实施例一、实施例二和实施例三制备的PLGA-KGN微粒的形貌,使用粒度分析仪表征微粒的粒径分布。部分结果如图2和图3所示。
图2为实施例一的PLGA-KGN微粒的形貌观察图,图3是实施例一的PLGA-KGN微粒的粒径分布图。图2和图3的结果显示,PLGA-KGN微球粒径为10.28±0.46μm,分散度为0.119,包封率为35.48±0.6%,与预期相符。
3.复合水凝胶形貌表征
在实施例二的基础上,分别制备了CMC-OCS水凝胶、CMC-OCS+KGN水凝胶、CMC-OCS+PLGA水凝胶、CMC-OCS+PLGA-KGN水凝胶。
其中,CMC-OCS水凝胶即实施例二的10份CMC和5份OCS混合形成的水凝胶;CMC-OCS+KGN水凝胶即实施例二的10份CMC、5份OCS和2份KGN形成的水凝胶;CMC-OCS+PLGA水凝胶即实施例二的10份CMC、5份OCS和3份不负载KGN的PLGA微球形成的水凝胶;CMC-OCS+PLGA-KGN水凝胶即实施例二10份CMC,5份OCS,3份PLGA-KGN微球混合制备获得的复合水凝胶。其中,不负载KGN的PLGA微球制备方法与实施例二的步骤(2)相同,只是不添加KGN。
采用扫描电镜对以上四种水凝胶进行观察,结果如图4所示。图4中,1图为CMC-OCS水凝胶的观察结果,2图为CMC-OCS+KGN水凝胶的观察结果,3图为CMC-OCS+PLGA水凝胶的观察结果,4图为CMC-OCS+PLGA-KGN水凝胶的观察结果。
图4的结果显示,添加PLGA微球的水凝胶能够观察到完整的微球结构,说明PLGA微球能够很好的复合在水凝胶中,与预期相符。
4.软骨修复后的医学影像图
在实施例二的基础上,分别制备了CMC-OCS水凝胶和CMC-OCS+PLGA-KGN水凝胶。制备方法与“3.复合水凝胶形貌表征”相同。
本实验以12-16周的小鼠为研究对象,将小鼠平均分为三组,即CMC-OCS水凝胶试验组、CMC-OCS+PLGA-KGN水凝胶试验组,和对照组;每组5只小鼠;术前小鼠禁食12小时,使用2-3%的异氟烷麻醉小鼠。实验时,沿着小鼠的脊柱切开软组织,暴露脊柱后使用高精度牙钻在腰椎连接处制造直径为1mm的圆形缺损,缺损用生理盐水冲洗。分别使用CMC-OCS水凝胶、CMC-OCS+PLGA-KGN水凝胶对两组小鼠的缺损进行填充治疗;对照组不使用水凝胶治疗。术后使用7-0Vicryl缝合线缝合小鼠皮肤,喂养小鼠10天后观测小鼠的缺损部位并进行造影,结果如图5所示。
图5的结果显示,使用CMC-OCS水凝胶治疗的小鼠的软骨间虽然发生了桥接,但效果较差且可以观察到明显的骨痂;使用CMC-OCS+PLGA-KNG水凝胶治疗的小鼠不但受损软骨桥接效果好,而且受损部位与周围成熟组织间融合,影像中未出现明显骨痂。反观空白组,受损软骨间不但没有发生桥接,而且出现了比CMC-OCS水凝胶组更明显的骨痂。综上,CMC-OCS+PLGA-KNG复合水凝胶能够促进软骨形成,具有很好的软骨修复效果。
采用实施例一和实施例三的复合水凝胶进行相同的软骨修复试验,结果与实施例二的CMC-OCS+PLGA-KNG效果相当,都具有良好的软骨修复效果。
在以上试验的基础上,以实施例一为基础,进一步对复合水凝胶的组份配比进行了试验,结果显示,重量份2-15的羧甲基壳聚糖、重量份2-15的氧化硫酸软骨素和重量份1-5的负载Kartogenin的聚乳酸-羟基乙酸共聚物微球组成的复合水凝胶都具有良好的促进软骨形成的效果。
以上内容是结合具体的实施方式对本申请所作的进一步详细说明,不能认定本申请的具体实施只局限于这些说明。对于本申请所属技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本申请构思的前提下,还可以做出若干简单推演或替换。
Claims (10)
1.一种促进软骨形成的复合水凝胶,其特征在于:所述复合水凝胶的主体结构为羧甲基壳聚糖-氧化硫酸软骨素水凝胶,所述羧甲基壳聚糖-氧化硫酸软骨素水凝胶中分散有负载Kartogenin的聚乳酸-羟基乙酸共聚物微球。
2.根据权利要求1所述的复合水凝胶,其特征在于:所述复合水凝胶由重量份2-15的羧甲基壳聚糖、重量份2-15的氧化硫酸软骨素和重量份1-5的负载Kartogenin的聚乳酸-羟基乙酸共聚物微球组成。
3.根据权利要求1或2所述的复合水凝胶,其特征在于:所述负载Kartogenin的聚乳酸-羟基乙酸共聚物微球的粒径为10.28±0.46μm,分散度为0-0.2,包封率为35.48±0.6%;
优选的,所述复合水凝胶的压缩强度为20-50kPa,压缩应变为60-80%,压缩弹性模量为2-25kPa。
4.根据权利要求1-3任一项所述的复合水凝胶在制备修复软骨的药物中的应用。
5.一种用于修复软骨的试剂盒,其特征在于:所述试剂盒中含有独立包装的羧甲基壳聚糖、氧化硫酸软骨素和负载Kartogenin的聚乳酸-羟基乙酸共聚物微球;
优选的,所述负载Kartogenin的聚乳酸-羟基乙酸共聚物微球的粒径为10.28±0.46μm,分散度为0-0.2,包封率为35.48±0.6%;
优选的,所述复合水凝胶的压缩强度为20-50kPa,压缩应变为60-80%,压缩弹性模量为2-25kPa。
6.根据权利要求1-3任一项所述的复合水凝胶的制备方法,其特征在于:包括以下步骤,
氧化硫酸软骨素制备步骤,包括采用高碘酸钠对软骨素进行氧化,即获得所述氧化硫酸软骨素;
负载Kartogenin的聚乳酸-羟基乙酸共聚物微球制备步骤,包括以下步骤,
(1)将1-10重量份的Kartogenin溶于50-150份重量份的水中,作为W相;
(2)将1-10重量份的聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶于50-150重量份的甲基纤维素水溶液中,作为O相;
(3)将W相和O相混合,均质乳化形成初乳液;
(4)将初乳液倒入聚乙烯醇和氯化钠的混合水溶液中形成预复乳液;
(5)将预复乳液倒入快速膜乳化装置中,在氮气压力下通过四级串联的不锈钢膜,过膜2-5次;过膜后的乳液倒入预先准备好的固化液中,磁力搅拌3-10小时,使微粒析出;
(6)采用去离子水对步骤(5)固化后的乳液微粒进行2-6次洗涤,然后冷冻干燥,即获得所述负载Kartogenin的聚乳酸-羟基乙酸共聚物微球;
复合水凝胶制备步骤,将羧甲基壳聚糖、制备的氧化硫酸软骨素,与制备的负载Kartogenin的聚乳酸-羟基乙酸共聚物微球,按配比混合均匀,即获得所述复合水凝胶。
7.根据权利要求6所述的制备方法,其特征在于:所述步骤(2)中,所述甲基纤维素水溶液的浓度为5wt%-20wt%;
优选的,所述步骤(4)的所述聚乙烯醇和氯化钠的混合水溶液中,聚乙烯醇的浓度为1wt%-5wt%,氯化钠的浓度为1wt%-5wt%;
优选的,所述步骤(5)中,所述磁力搅拌的转速为300转/min-600转/min;
优选的,所述步骤(6)中,所述冷冻干燥的温度为-10℃至-50℃,冷冻干燥的时间为10-20小时,压力为1Pa-20Pa。
8.根据权利要求6或7所述的制备方法,其特征在于:所述氧化硫酸软骨素制备步骤具体包括,
(a)将5-15重量份的软骨素完全溶解于100-300重量份的蒸馏水中,加入1-6重量份的高碘酸钠,在避光条件下反应10-30小时;
(b)在步骤(a)反应完成后的溶液中加入1-5重量份的乙二醇,搅拌30-60分钟,灭活剩余的高碘酸钠;
(c)将步骤(b)获得的溶液倒入透析袋中室温透析2-5天,每天换水2-5次,透析完成后,冷冻干燥,即获得所述氧化硫酸软骨素;
优选的,所述步骤(a)中,所述高碘酸钠为粉末材料;
优选的,步骤(c)中,所述冷冻干燥的温度为-20℃至-50℃,冷冻干燥的时间为12-48小时,压力为1Pa-10Pa。
9.一种制备氧化硫酸软骨素的方法,其特征在于:包括以下步骤,
(a)将5-15重量份的软骨素完全溶解于100-300重量份的蒸馏水中,加入1-6重量份的高碘酸钠,在避光条件下反应10-30小时;
(b)在步骤(a)反应完成后的溶液中加入1-5重量份的乙二醇,搅拌30-60分钟,灭活剩余的高碘酸钠;
(c)将步骤(b)获得的溶液倒入透析袋中室温透析2-5天,每天换水2-5次,透析完成后,冷冻干燥,即获得所述氧化硫酸软骨素;
优选的,所述步骤(a)中,所述高碘酸钠为粉末材料;
优选的,步骤(c)中,所述冷冻干燥的温度为-20℃至-50℃,冷冻干燥的时间为12-48小时,压力为1Pa-10Pa。
10.一种制备负载Kartogenin的聚乳酸-羟基乙酸共聚物微球的方法,其特征在于:包括以下步骤,
(1)将1-10重量份的Kartogenin溶于50-150份重量份的水中,作为W相;
(2)将1-10重量份的聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶于50-150重量份的甲基纤维素水溶液中,作为O相;
(3)将W相和O相混合,均质乳化形成初乳液;
(4)将初乳液倒入聚乙烯醇和氯化钠的混合水溶液中形成预复乳液;
(5)将预复乳液倒入快速膜乳化装置中,在氮气压力下通过四级串联的不锈钢膜,过膜2-5次;过膜后的乳液倒入预先准备好的固化液中,磁力搅拌3-10小时,使微粒析出;
(6)采用去离子水对步骤(5)固化后的乳液微粒进行2-6次洗涤,然后冷冻干燥,即获得所述负载Kartogenin的聚乳酸-羟基乙酸共聚物微球;
优选的,所述步骤(2)中,所述甲基纤维素水溶液的浓度为5wt%-20wt%;
优选的,所述步骤(4)的所述聚乙烯醇和氯化钠的混合水溶液中,聚乙烯醇的浓度为1wt%-5wt%,氯化钠的浓度为1wt%-5wt%;
优选的,所述步骤(5)中,所述磁力搅拌的转速为300转/min-600转/min;
优选的,所述步骤(6)中,所述冷冻干燥的温度为-10℃至-50℃,冷冻干燥的时间为10-20小时,压力为1Pa-20Pa。
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