CN115634316B - 牙囊组织脱细胞外基质生物墨水、制备方法及产品 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种牙囊组织脱细胞外基质生物墨水、制备方法及产品,本发明实施例中,牙囊组织脱细胞外基质生物墨水的组成成分为牙囊组织脱细胞外基质和甲基丙烯酸酯化明胶水凝胶溶液,其中,牙囊组织脱细胞外基质保留了牙囊组织的天然三维形态结构及细胞外基质成分,并且没有细胞成分,因此具有低免疫原性的特点,能为相应的组织再生提供良好的微环境,是保持细胞正常增殖、分化、代谢和功能活动的重要条件,牙囊组织脱细胞外基质生物墨水能够促进牙囊细胞的定向分化。进行生物打印之后,牙囊组织脱细胞外基质生物墨水在牙周膜组织的再生中展现比普通生物墨水更加优秀的组织再生能力。
Description
技术领域
本发明涉及生物医学基础研究领域,特别是涉及一种牙囊组织脱细胞外基质生物墨水、制备方法及产品。
背景技术
牙周病以进行性牙槽骨破坏和牙周组织丧失为特征,是全球成年人牙齿缺失的主要原因。牙周治疗的最终目标是再生牙齿支持组织并形成新附着。目前,植骨术、引导性组织/骨组织再生术(GTR/GBR)、局部使用生长因子等技术已在临床中用于牙周缺损的治疗并取得一定疗效,但上述方法仍存在一些不足,包括:易形成长结合上皮、再生牙骨质的能力较差、GTR的适应证较窄及膜降解时易塌陷等。
牙周组织具有十分巧妙的解剖结构,包括牙槽骨、牙骨质等硬组织和排列整齐的软组织牙周膜(PDL),且牙周膜以一定的角度锚定在两个硬组织之间,以维持牙齿的稳定性,承受咀嚼压力。实现功能性牙周再生的关键在于牙槽骨-牙周膜-牙骨质复合体的三明治结构,而定向的牙周膜纤维排列和功能性的牙槽骨-牙周膜界面是牙周再生中需要解决的首要问题。目前,基于细胞的组织工程技术在牙周再生领域取得了巨大进展。基于细胞的3D生物打印技术作为一种创新的生物构建策略,为各种组织和器官的生物重建提供了新的手段,尤其是定向排列的仿生牙周复合体的构建。结合计算机辅助设计,打印机可以在微米尺度上精确控制材料的排列和分布,再现人体组织的复杂性。在生物打印过程中,可以赋予生物材料所需的形状和结构。因此,3D生物打印技术是基于传统构建方法的一项重大进展,使得制造仿生和功能性牙周复合体成为可能。到目前为止,一些天然材料和合成材料(如胶原、明胶、海藻酸盐、丝素蛋白和聚乙二醇)已被用作生物墨水。此外,为了促进干细胞的定向分化,有时还会在墨水中加入生长因子,如血管内皮生长因子、骨形态发生蛋白等。但总的来说,上述生物墨水成分单一,与天然组织微环境差别较大。
因此,目前亟需一种新的生物墨水以及新的牙周病相关医学产品。
发明内容
为解决上述背景技术中存在的问题,本发明提供了一种牙囊组织脱细胞外基质生物墨水、制备方法及产品。
第一方面,本发明提供了一种牙囊组织脱细胞外基质生物墨水,所述生物墨水包括:牙囊组织脱细胞外基质、甲基丙烯酸酯化明胶水凝胶溶液,所述牙囊组织脱细胞外基质在所述甲基丙烯酸酯化明胶水凝胶溶液中的含量为:2.5mg/ml~10mg/ml;所述甲基丙烯酸酯化明胶水凝胶溶液的浓度为100mg/ml;
所述生物墨水用于为组织再生提供微环境。
第二方面,本发明提供了一种牙囊组织脱细胞外基质生物墨水的制备方法,所述方法包括:
步骤1:准备牙囊组织脱细胞基质;
步骤2:将所述牙囊组织脱细胞基质与甲基丙烯酸酯化明胶水凝胶溶液混合;所述牙囊组织脱细胞外基质在所述甲基丙烯酸酯化明胶水凝胶溶液中的含量为:2.5mg/ml~10mg/ml;所述甲基丙烯酸酯化明胶水凝胶溶液的浓度为100mg/ml。
可选地,所述步骤1包括:
收集牙囊组织,将收集的牙囊组织浸泡于加有100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的PBS缓冲液中反复冲洗三次以上;
将冲洗后的牙囊组织剪碎,加入1%Triton X100中,于4℃震荡12~24小时,用PBS缓冲液反复冲洗2小时后,进行离心并去除上清液;
向离心管中加入100U/ml DNase I,于37℃水浴锅中分别震荡12h或24h,组织变成乳白色,用PBS缓冲液反复冲洗2h后,进行离心并去除上清液;
向离心管中加入无菌PBS缓冲液震荡冲洗脱细胞的牙囊组织2天,去除残留的脱细胞试剂及细胞碎片,进行离心并去除上清液,获得牙囊组织脱细胞外基质。
第三方面,本发明提供了一种牙槽骨模块,所述牙槽骨模块为疏松多孔的立方体结构,所述牙槽骨模块的组成成分至少包括:牙囊组织脱细胞外基质生物墨水。
可选地,所述牙槽骨模块为空间网格结构,所述牙槽骨模块由层层堆叠互相垂直的多层蛇形长链组成。
可选地,所述牙槽骨模块的材料还包括:牙囊细胞,所述牙囊细胞的含量为2.5×106/ml。
第四方面,本发明提供了一种牙槽骨模块的制备方法,所述方法包括:
步骤1:制备牙囊组织脱细胞外基质生物墨水;
步骤2:将所述牙囊组织脱细胞外基质生物墨水作为牙槽骨模块基质,利用所述牙槽骨模块基质通过3D打印构建牙槽骨模块。
可选地,所述方法还包括:
准备牙囊细胞和牙囊组织脱细胞外基质生物墨水;
将所述牙囊细胞与所述牙囊组织脱细胞外基质生物墨水混合,得到牙槽骨模块基质,利用所述牙槽骨模块基质通过3D打印构建牙槽骨模块。
可选地,所述利用所述牙槽骨模块基质通过3D打印构建牙槽骨模块,包括:
使用直接墨水书写式打印机构建牙槽骨模块;所述牙槽骨模块为空间网格结构,所述牙槽骨模块由层层堆叠互相垂直的多层蛇形长链组成。
第五方面,本发明提供了如第三方面所述的牙槽骨模块的应用,所述牙槽骨模块仿牙槽骨结构,应用于牙周组织缺损的修复模块的构建。
第六方面,本发明提供了一种组合植入体,所述组合植入体包括:牙槽骨模块和牙周膜模块,所述牙槽骨模块为疏松多孔的立方体结构,所述牙周膜模块为薄片结构,所述牙槽骨模块与所述牙周膜模块的大面积面贴合;
所述牙周膜模块和所述牙槽骨模块的组成成分至少包括:牙囊组织脱细胞外基质生物墨水。
与现有技术相比,本发明包括以下优点:
本发明实施例中,牙囊组织脱细胞外基质生物墨水的组成成分为牙囊组织脱细胞外基质和甲基丙烯酸酯化明胶水凝胶溶液,其中,牙囊组织脱细胞外基质(dECM)保留了牙囊组织的天然三维形态结构及细胞外基质成分,并且没有细胞成分,因此具有低免疫原性的特点,能为相应的组织再生提供良好的微环境,是保持细胞正常增殖、分化、代谢和功能活动的重要条件,因此,本发明实施例提供的生物墨水可以模拟细胞外基质微环境,增强细胞的定向分化。
与传统的胶原生物墨水相比,牙囊组织脱细胞外基质生物墨水更能够促进牙囊细胞(DFCs)的定向分化。进行生物打印之后,牙囊组织脱细胞外基质生物墨水在牙周组织(包括:牙槽骨组织、牙周膜组织等)的再生中展现比普通生物墨水更加优秀的组织再生能力。具有重建更复杂的生物微环境、模拟组织特异性ECM成分或细胞因子、增强干细胞向特定方向分化的优点。
附图说明
图1是本发明实施例中一种完整的牙周缺损修复过程的流程图;
图2是本发明实施例中提供的牙囊组织脱细胞外基质生物墨水的生物学性能分析结果图;
图3是本发明实施例中提供的牙槽骨模块的生物学性能分析结果图;
图4是本发明实施例中组合植入物植入受体的植入过程示意图;
图5是本发明实施例中组合植入物植入受体后受体的器官损伤和全身转移评估结果图;
图6是本发明实施例中组合植入物植入受体后受体内的骨再生情况评估结果图;
图7是本发明实施例中组合植入物植入受体后受体内的牙周膜再生情况评估结果图;
图8是本发明实施例中组合植入物植入受体后受体内的功能性牙周组织再生情况评估结果图。
具体实施方式
提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明,并不局限于所述最佳实施方式,不对本发明的内容和保护范围构成限制,任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品,均落在本发明的保护范围之内。
实施例中未注明具体实验步骤或条件者,按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂以及其他仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市场购买获得的常规试剂产品。
在天然组织中,细胞生存的微环境是保持细胞正常增殖、分化、代谢和功能活动的重要条件,因此理想的生物墨水应能较好地模拟细胞生存的微环境,增强细胞定向分化。然而,目前没有任何一种单一成分的生物墨水能够精确地模拟原生细胞复杂的微环境。
利用脱细胞技术将组织中同种异体及异种的细胞成分去除,保留组织的天然三维形态结构及细胞外基质成分,因其无细胞成分,因此具有低免疫原性的特点,能为相应的组织再生提供良好的微环境。这一优点恰好弥补了传统墨水材料的不足。
为了实现牙周组织的完整再生,生物打印支架系统不仅需要提供牙周组织的形态线索,还需要提供与天然组织相似的诱导微环境,以确保有效的牙源性和成骨性分化。
由此,本发明实施例经过一系列地探索后,提出了一种牙囊组织脱细胞外基质生物墨水,所述生物墨水包括:牙囊组织脱细胞外基质、甲基丙烯酸酯化明胶水凝胶溶液(GelMA),所述牙囊组织脱细胞外基质在所述甲基丙烯酸酯化明胶水凝胶溶液中的含量为:2.5mg/ml~10mg/ml;所述甲基丙烯酸酯化明胶水凝胶溶液的浓度为100mg/ml;
所述生物墨水用于为牙周膜组织和/或牙槽骨组织的再生提供微环境。
牙囊组织作为牙周组织的前体,在牙体组织分化和成熟过程中最终将发育为牙周组织,具备了形成牙周组织的微环境。且牙囊组织相对完整,来源较丰富,能够获得足够的牙囊组织脱细胞外基质(dECM)制备生物墨水。从而,本发明实施例提供的牙囊组织脱细胞外基质生物墨水可以用于为牙周膜组织和/或牙槽骨组织的再生提供微环境。
本发明实施例中还提出了一种牙囊组织脱细胞外基质生物墨水的制备方法,所述方法包括:
步骤1:准备牙囊组织脱细胞基质。
本发明实施例中,可以采用相关技术中任一成熟的脱细胞技术对收集的牙囊组织进行脱细胞处理,得到牙囊组织脱细胞基质。
本发明实施例中,牙囊组织的来源可以是任意简单易得的生物来源,例如可以来源于猪未萌出恒牙的牙囊组织,还可以来源于大鼠、比格犬和人类等生物。
步骤2:将所述牙囊组织脱细胞基质与甲基丙烯酸酯化明胶水凝胶溶液混合。
其中,所述牙囊组织脱细胞外基质在所述甲基丙烯酸酯化明胶水凝胶溶液中的含量为:2.5mg/ml~10mg/ml;所述甲基丙烯酸酯化明胶水凝胶溶液的浓度为100mg/ml。
具体的,所述步骤1包括:
收集牙囊组织,将收集的牙囊组织浸泡于加有100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的PBS缓冲液中反复冲洗三次以上。
将冲洗后的牙囊组织剪碎,加入1%Triton X100中,于4℃震荡12~24小时,用PBS缓冲液反复冲洗2小时后,进行离心并去除上清液。
向离心管中加入100U/ml DNase I,于37℃水浴锅中分别震荡12~24h,组织变成乳白色,用PBS缓冲液反复冲洗2h后,进行离心并去除上清液。
向离心管中加入无菌PBS缓冲液震荡冲洗脱细胞的牙囊组织2天,去除残留的脱细胞试剂及细胞碎片,进行离心并去除上清液,获得牙囊组织脱细胞外基质。
如图1所示,本发明实施例中,可以收集猪未萌出恒牙的牙囊组织,对其进行脱细胞处理,得到牙囊组织脱细胞基质,再将牙囊组织脱细胞基质和甲基丙烯酸酯化明胶水凝胶溶液混合,得到牙囊组织脱细胞基质生物墨水。后续可以再将该生物墨水和牙囊细胞混合,得到用于3D打印的基体,从而得到牙槽骨模块以及牙周膜模块。
牙槽骨高度的恢复是评估牙周组织再生情况的重要指标之一,即使成功再生了定向排列的纤维组织,若没有足够的牙槽骨作为支撑,仍不能达到理想的再生效果。
基于此,本发明实施例中还提出了一种牙槽骨模块,所述牙槽骨模块为疏松多孔的立方体结构,所述牙槽骨模块的组成成分至少包括:牙囊组织脱细胞外基质生物墨水。
具体的,本发明实施例中,可以利用前述的牙囊组织脱细胞外基质生物墨水进行3D打印制备得到牙槽骨模块,从而可以利用牙囊组织脱细胞外基质的募集作用,招募受体的干细胞(例如:牙源性干细胞和骨髓间充质干细胞),在多种蛋白质和细胞因子的作用下实现干细胞的定向分化。
具体的,本发明实施例中,所述牙槽骨模块的材料还包括:牙囊细胞,所述牙囊细胞的含量为2.5×106/ml。
本发明实施例中,在利用牙囊组织脱细胞外基质生物墨水构建牙槽骨模块的同时还可以添加牙囊细胞,所述牙囊细胞可以和牙囊组织脱细胞外基质同源也可以异源,所述牙囊细胞可以和移植受体同源也可以异源。例如:牙囊组织脱细胞外基质生物墨水可以来源于猪,而牙囊细胞可以来源于人,而移植受体可以为比格犬。
本发明实施例中,牙槽骨模块为疏松多孔的立方体结构,从而可以便于DFCs成骨分化,在移植受体体内实现显著的骨再生,改善受体的牙槽骨高度和厚度。
具体地,本发明实施例中,所述牙槽骨模块为空间网格结构,所述牙槽骨模块为空间网格结构,所述牙槽骨模块由层层堆叠互相垂直的多层蛇形长链组成。
具体地,牙槽骨模块的大小可以根据移植受体的需求(例如:受体牙周组织缺损区的大小和形状)进行定制,相应地,所述蛇形长链的尺寸数据也可以根据移植受体的需求确定。
可选地,本发明实施例中,所述蛇形长链中内链间距为744.63±197.5μm,所述蛇形长链的链直径为410.61±26.73μm。
本发明实施例提供的牙槽骨模块为疏松多孔的立方体结构,一方面可以便于DFCs在模块内的营养交换及存活,另一方面提供了良好的成骨微环境,可以促进DFCs成骨分化,将该牙槽骨模块移植到受体体内,随着DFCs的成骨分化和甲基丙烯酸酯化明胶水凝胶的降解,可以在受体体内形成较为理想的牙槽骨。
基于此,本发明实施例中还提出了一种如前所述的牙槽骨模块的应用,所述牙槽骨模块仿牙槽骨结构,应用于牙周组织缺损的修复模块的构建。
本发明实施例中还提出了一种牙槽骨模块的制备方法,所述方法还包括以下步骤:
S11,准备牙囊细胞和牙囊组织脱细胞外基质生物墨水;
S12,将所述牙囊细胞与所述牙囊组织脱细胞外基质生物墨水混合,得到牙槽骨模块基质,利用所述牙槽骨模块基质通过3D打印构建牙槽骨模块。
具体地,所述利用所述牙槽骨模块基质通过3D打印构建牙槽骨模块,包括:
使用直接墨水书写式打印机构建牙槽骨模块;所述牙槽骨模块为空间网格结构,所述牙槽骨模块由层层堆叠互相垂直的多层蛇形长链组成。
本发明实施例中,在实际应用时,可以根据受体需求对牙槽骨模块的尺寸数据进行调整,然后利用牙槽骨模块基质通过3D打印构建个性化定制的牙槽骨模块,以对受体的牙槽骨进行修复。
本发明实施例中,还提出了一种组合植入体,所述组合植入体包括:牙槽骨模块和牙周膜模块,所述牙槽骨模块为疏松多孔的立方体结构,所述牙周膜模块为薄片结构,所述牙槽骨模块与所述牙周膜模块的大面积面贴合;所述牙周膜模块和所述牙槽骨模块的组成成分相同,至少包括:牙囊组织脱细胞外基质生物墨水。
具体地,所述牙周膜模块和所述牙槽骨模块的组成成分还可以包括:牙囊细胞。
本发明实施例中牙周膜模块为薄片结构,并且其上具有孔隙,便于DFCs成骨分化,具体可以为已知的牙周膜模块结构,例如,所述牙周膜模块设有网格结构和柱状结构,网格结构由N个小格交织形成,小格为中空;柱状结构设有M个柱状体和底板,柱状体并列固定于底板上与底板形成一体;网状结构一端与底板固定,使网状结构与柱状结构嵌合成一体,且柱状体在底板上位置与网状结构中小格位置相对应,柱状体位于小格中;小格内壁与柱状体外壁之间设有孔隙,小格直径>柱状体直径。
具体的,如图1所示,本发明实施例中,利用前述的生物墨水和牙囊细胞相混合,得到用于3D打印的基体后,可以利用该基体分别打印得到牙周膜模块和牙槽骨模块,并将二者组合后,得到组合植入物,植入受体(比格犬)体内,以对比格犬的牙周缺损进行修复。
本发明实施例中,将牙槽骨模块和牙周膜模块组合后植入受体体内,可以在受体内观察到成熟牙周膜的新生和矿化良好的牙槽骨的新生,重要的是二者之间建立了良好的锚固结构,形成牙周复合体,从而完成受体牙周缺损的修复。
为使本领域技术人员更好地理解本发明,以下通过具体的实施例来说明本发明提供的牙囊组织脱细胞外基质生物墨水、制备方法及产品。
实施例1:牙囊组织脱细胞外基质生物墨水的制备
步骤1:准备牙囊组织脱细胞基质:
将收集的猪未萌出恒牙的牙囊组织浸泡于加有双抗(100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素)的PBS缓冲液中反复冲洗三次以上;
用眼科剪将牙囊组织稍剪碎,设置两个实验组,分别加入1%Triton X100中,于4℃分别震荡12h或24h,分别用PBS缓冲液反复冲洗2h后,1000rpm离心5min,弃上清;
向离心管中加入100U/ml DNase I,于37℃水浴锅中分别震荡12h或24h,组织变成乳白色,用PBS缓冲液反复冲洗2h后,1000rpm离心5min,弃上清;
加入无菌PBS缓冲液震荡冲洗脱细胞的牙囊组织2天,去除残留的脱细胞试剂及细胞碎片,1000rpm,5min离心,弃上清,得到12h处理和24h处理的两组牙囊组织脱细胞外基质(dECM);
利用组织学染色(H&E、Masson、免疫组化)及DAPI免疫荧光染色,评估两个实验组的细胞外基质的保留情况和细胞核的清除情况;利用扫描电镜(SEM)评估脱细胞前后组织表面形貌的变化及纤维的断裂状况;利用组织DNA提取试剂盒及DNA含量检测试剂盒对脱细胞效率进行定量分析,利用羟脯氨酸检测试剂盒及Blyscan sGAG检测试剂盒对脱细胞前后组织中胶原蛋白及sGAG含量进行定量分析,以确保细胞成分的充分去除及细胞外基质成分的最大保留。
适当的脱细胞处理时间是获得dECM的第一步,也是最重要的一步。H&E染色和Masson染色显示,12h处理和24h处理的两组脱细胞组织均无细胞成分,但24h处理组细胞外基质中的纤维结构被严重破坏。纤维连接蛋白Fibronectin和I型胶原免疫染色也显示脱细胞后ECM蛋白有不同程度的减少,而12h处理组保留了相对较多的蛋白。扫描电镜显示,12h处理组具有与新鲜组织相似的表面结构和孔隙率。24h处理组仅保留纳米纤维网状结构,表明ECM成分被破坏。因此,Triton X100和DNase I处理12h是更合适的脱细胞处理条件。为了进一步评估dECM中的剩余成分,对ECM的主要生物成分进行了定量分析。脱细胞后组织DNA含量降低了96%以上,DAPI染色也证实了这一变化。天然组织和脱细胞组织的胶原和sGAG含量表明活性成分得到了保留。
步骤2:将所述牙囊组织脱细胞基质与甲基丙烯酸酯化明胶水凝胶溶液混合:
本发明实施例中,甲基丙烯酸酯化明胶水凝胶溶液的浓度为100mg/ml,即10%GelMA。
将步骤1制备好的dECM经冻干后研磨成粉末;将粉末加入0.5M乙酸和胃蛋白酶(每100mg dECM加入15mg)中,于37℃溶解4天;于4000rpm离心10min后收集上清液,向收集到的上清液中加入适量冷NaOH调pH至7.3-7.5;将上述溶解后的dECM与10%GelMA混合分别形成10% GelMA+2.5mg/ml dECM,10% GelMA+5mg/ml dECM,10%GelMA+10mg/ml dECM三组混合墨水,以10% GelMA作为对照组。
1.1 GelMA/dECM混合生物墨水的机械性能评价
为了获得关于GelMA/dECM生物墨水流变行为的信息,使用HAAKE粘度测试仪iQAir进行粘弹性分析。使用锥形旋转器以1mm的间隙距离进行实验。在25℃下,剪切速率从0.1至100s-1,进行剪切速率扫描以测定各组GelMA/dECM生物墨水的剪切粘度。通过频率扫描来表征生物墨水的动态模量:在25℃下,在0.1-10Hz的频率范围内,施加的应变常数为0.01。
此外,还测定了含有和不含dECM的GelMA水凝胶的溶胀和降解性能。将各组水凝胶样品制备成体积相同的圆柱形(400μl),并暴露于405nm光下30s固化。在溶胀试验中,样品在37℃的PBS中孵育24h。从PBS中取出后,测定样品的湿重(Ws)。然后将样品冻干8h,测定干重(Wd)。通过方程Qs=(Ws-Wd)/Wd获得水凝胶的溶胀率。在降解试验中,将样品置于37℃含0.5mg/ml I型胶原酶的24孔板中,在每个预先确定的时间点(0、6、12、18和24h,n=3)采集样品。然后,本发明实施例将每个样品冻干8h以获得剩余重量(Wr)。以0h的重量为W0,通过方程Qd=Wr/W0×100%得到水凝胶的生物降解率(Qd)。
流变学是确定基于挤出式的3D生物打印生物墨水机械性能的有用工具。结果表明,随着dECM浓度的增加,水凝胶的粘度和动态模量逐渐增加。在测量的剪切速率范围内,四种墨水的剪切粘度均呈线性下降,表明dECM的加入并不影响GelMA水凝胶的剪切稀化行为。储存模量和损耗模量分别与生物墨水的弹性和粘性行为相关。在整个频率范围内,4种生物墨水的储存模量(G’)均高于损耗模量(G”)。这表明,GelMA/dECM生物墨水能够抵抗变形,并表现出稳健的水凝胶网络的弹性。加入dECM后,GelMA的溶胀率没有显著变化。此外,GelMA/dECM生物墨水的降解速度比纯GelMA水凝胶快,这表明dECM中含有更多的蛋白质和有机成分。本发明实施例还观察到,dECM浓度越高,降解越快。
1.2 GelMA/dECM混合生物墨水的打印性能评价
本发明实施例使用3D-Bioplotter系统测试了四组水凝胶样品,该系统安装了一个30CC的料桶。在挤压过程中,采用锥形的塑料喷嘴。每根喷嘴的内径为260μm。装载生物墨水的料桶温度为27℃,室温为23℃。初始挤出压力为10kPa,逐渐增加压力(每次10kPa),直至生物墨水能够挤出。记录从料桶中挤出生物墨水所需的最小压力及稳定挤出压力。观察生物墨水能否连续均匀挤出。
首先测量生物墨水的质量流率。将四组生物墨水在其稳定的生物打印压力下挤出5s,沉积在称量纸上,沉积后立即用精准天平称量含有生物墨水的纸张,记录挤出的墨水重量,计算质量流率=墨水重量/5s。以此为基础研究了生物打印速度对打印纤维直径的影响。将生物墨水装入料桶中,以各自的稳定挤出压力和固定的流率进行打印。将以不同打印速度(6、8、10和12mm/s)制备出的纤维打印到培养皿中,并在405nm光下曝光30s固化。在光学显微镜下观察并测量纤维的直径(Dreal)。根据质量流率计算纤维的理论直径(Dtheo),其比值记为Dreal/Dtheo。
形状保真度的评估:使用4组水凝胶样本分别打印出层距200μm的双层网格结构。各组生物墨水以相同的流速打印。生物打印速度分别设定为6、8、10、12mm/s,构建双层支架。对于内部结构,相邻两根纤维之间的距离设定为1.2mm。将打印的双层网格结构在405nm光下曝光30s后,在光学显微镜下观察其结构。通过测量双层支架所形成的孔隙的面积来表征生物墨水的形状保真度。每个支架随机采集3张图像,从每张图像中随机选取3个孔隙,用ImageJ软件进行测量。水凝胶的形状保真度(SF)由公式SF=ARE/ATE×100%得到,其中ARE为实际孔隙面积,ATE为理论孔隙面积。
3D打印需要具有良好挤出性的水凝胶。本发明实施例比较了四组(三组混合墨水和对照组)的最小挤出压力和稳定挤出压力,发现压力值随着dECM浓度的增加而增加。但挤出压力越大,剪切应力越大,对细胞的损伤越大。随着打印速度的增加,四种水凝胶的打印丝直径均减小。纤维的实际直径均大于理论直径。这主要是由于挤压的生物墨水沉积在平台上时发生了扩散。GelMA+5mg/ml dECM组的Dreal/Dtheo值最低(为1.04~1.31),可能与合适的黏度和挤出压力赋予其更好的可塑性有关。每种水凝胶的形状保真度随着打印速度的增加而增加。在打印喷头速度为8、10、12mm/s时,GelMA+5mg/ml dECM组仍能保持最高的形状保真度,GelMA+10mg/ml dECM组次之。
1.3 GelMA/dECM混合生物墨水的生物学性能评价
牙囊细胞(DFCs)细胞培养:收集16~20岁健康青年因临床原因拔除的有牙囊的阻生第三磨牙进行细胞分离。所有实验均遵循四川大学伦理委员会批准的伦理学程序进行,征得所有纳入研究的青少年监护人的书面知情同意。分离阻生第三磨牙的牙囊,用无菌PBS冲洗。将牙囊组织切成1×1mm的小块,使用I型胶原酶于37℃中消化组织40分钟,待组织变为絮状后,接种在添加10%胎牛血清的α-MEM中,在37℃、5%CO2中孵育。每2天更换细胞培养基。所有细胞实验均使用第3-5代DFCs。
将密度为2.5×106/ml的DFCs分别与四组生物墨水混合。然后将生物墨水制成具有相同体积(100μl)的圆柱形,并在405nm光下暴露30s固化。在体外培养1、3、7d后,使用Live/DeadTM活力/细胞毒性试剂盒对水凝胶内的细胞进行荧光观察,评估细胞活力。每组随机取6张图像导入ImageJ软件进行细胞计数。CCK-8细胞计数试剂盒被用来评估细胞在混合生物墨水中的增殖情况。DFCs在水凝胶内培养1、3、5、7d,采用分光光度计测定450nm处的光密度(OD)值。最后,培养7d后采用实时荧光定量PCR检测成骨相关基因Runx2、ALP、OPN、COL-1和成牙本质相关基因DSPP、periostin、laminin-β1的表达。引物序列列于表1。使用2-ΔΔCT方法计算相对表达水平,以h-GAPDH基因为内参。
使用Chemotaxicell小室(8μm孔径)测定混合生物墨水对细胞迁移的影响。血清饥饿24h后,DFCs悬液(100μl;1×106/ml)被添加到上室。然后,分别将500μl的四组生物墨水稀释液(含0.25mg/ml、0.5mg/ml、1mg/ml dECM或1% GelMA的无血清培养基)加入下室,37℃孵育12h。将迁移至膜下表面的细胞用4%多聚甲醛固定,1%结晶紫染色。于光学显微镜下采图后,导入ImageJ软件进行细胞阳性面积统计。
本发明实施例还研究了dECM对水凝胶中干细胞生物学行为的影响。活/死染色显示(如图2中A部分所示,其示出了四组生物墨水中的细胞的活/死染色结果),DFCs在所有水凝胶中均分布均匀,并保持了较高的细胞活力。dECM的加入提高了水凝胶中DFCs的存活率,在第1、3、7天,GelMA+5dECM组和GelMA+10dECM组可以观察到更多的活细胞(如图2中B部分所示,其示出了四组生物墨水中的细胞的存活率数据)。CCK-8法分析DFCs生长曲线发现,在第5天和第7天,各dECM组的吸光度值均高于GelMA组,说明dECM具有促进细胞增殖的能力(如图2中C部分所示,其示出了四组生物墨水中的细胞的增殖情况)。GelMA/dECM 3组间差异无统计学意义。在Transwell板的孔中培养12h后,迁移到膜下表面的细胞被1%结晶紫染色(如图2中D部分所示,其示出了四组生物墨水中的细胞的迁移情况)。将dECM添加到GelMA水凝胶中显著提高了细胞迁移率。GelMA+5dECM组和GelMA+10dECM组的促进迁移能力最强,其次是2.5dECM组(如图2中E部分所示,其示出了四组生物墨水中的细胞的迁移情况)。在水凝胶中培养7d后,GelMA+5dECM组的DFCs中成骨标志物Runx2和ALP以及成牙标志物periostin和laminin-β1的表达量均显著高于其他组(如图2中F部分所示,其示出了四组生物墨水中的细胞的成骨标志物和成牙标志物的表达情况)。上述结果表明,所制备的GelMA/dECM生物墨水具有良好的生物相容性,为细胞分化提供了良好的环境,优于纯GelMA生物墨水。
综合考虑生物墨水的力学和生物学性能,本发明实施例最终选择GelMA+5mg/mldECM组作为后续实验的最佳浓度。
实施例2:牙槽骨模块和牙周膜模块的制备
利用DIW 3D-Bioplotter系统构建大小为10×10×2.5mm、设置内链间距为0.9mm、内链夹角为0°和90°的立方体结构模拟牙槽骨。将DFCs与两种生物墨水(GelMA生物墨水和GelMA+5mg/ml dECM生物墨水)以5×106个/ml的密度混合。打印喷头在z轴方向的偏移量为210μm,为每层打印丝理想直径(260μm)的80%。GelMA生物墨水的打印压力设置为90kPa,GelMA+5mg/ml dECM生物墨水设置为150kPa。打印速度为12mm/s,打印后的样品最后在405nm光下曝光30s固化。
其中,内链间距是指蛇形长链中两根相邻链之间的理论距离,内链夹角是指每层蛇形长链之间的方向夹角,例如:第一层长链为水平打印,夹角记为0°,第二层长链变为垂直方向打印,夹角记为90°,这样两层长链相交即围成了一个正方形。到第三层再变为0°水平打印,第四层90°垂直打印,以此类推,最终叠成高度2.5mm的立方体。最终打印得到的牙槽骨模块由层层堆叠互相垂直的多层蛇形长链组成,实际打印出来的蛇形长链内链间距经测量为744.63±197.5μm。
各组模块在体外培养1、3、7d后,采用Live/DeadTM活力/细胞毒性试剂盒检测模块中的DFCs细胞活力。所有样本均在激光扫描共聚焦显微镜下观察,每组随机选取7个视野进行定量分析。第7、14天行免疫荧光(IF)染色检测牙槽骨模块中DFCs成骨分化的情况。一抗包括抗ALP(1:100稀释度,Abcam,UK)、Runx2(1:100稀释度,Abcam,UK)和OCN(1:200稀释度,Zenbio,中国)。
本发明实施例中,设计了一个由水凝胶柱和正方形网格组成的400μm厚的牙周膜PDL模块。以水凝胶柱模拟定向的牙周纤维,方形网格提供机械支撑,防止水凝胶柱塌陷。每个单元格的内径为250μm,包括宽150μm的水凝胶柱,及其周围50μm的间隙。方形网格的厚度为40μm。本发明实施例在两个支架之间夹了一个狭窄的硅膜,以获得一个间隙,来控制模块的厚度。在计算机上设置数字三维图像后,在预留的间隙中添加DFCs密度为2×106/ml的GelMA/dECM混合生物墨水。405nm暴露10s后,获得PDL模块。采用异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)标记的GelMA,在激光扫描共聚焦显微镜下进行观察,以便更好地显示打印结构。
基于3D生物打印技术,本发明实施例构建了牙周软硬组织,包括使用DLP构建的PDL模块和使用直接墨水书写式(direct ink writing,DIW)打印机构建的牙槽骨模块,以实现结构完整性和生物学功能。
对于牙槽骨模块,本发明实施例选择骨组织工程中经典的空间网格结构(如图3中A部分所示,其示出了两组牙槽骨模块的基本形态和细胞分布情况)。打印的丝的平均直径约为410.61±26.73μm。第1天的活/死染色图像显示了明显的网格结构,DFCs局限于打印丝中(如图3中A部分所示)。3D打印后1d,GelMA组DFCs的细胞活力仅为70.67±3.81%,这可能是由于打印喷嘴挤压负载细胞的生物墨水时施加的剪切应力所致。加入dECM后,这种情况得到改善,第1天细胞活力约为82.06±2.92%。这一结果表明dECM为细胞生存提供了有利的微环境,减少了剪切力和可见光照射对DFCs的不利影响(如图3中B部分所示,其示出了两组牙槽骨模块中的细胞的存活情况)。培养7d后,GelMA+5dECM组细胞活力(90.11±1.83%)仍高于GelMA组(83.71±1.84%)。通过IF染色检测两个牙槽骨模块中成骨相关蛋白的表达(如图3中C部分所示,其示出了两组牙槽骨模块中细胞的成骨相关蛋白的表达情况)。在所有实验时间点,GelMA+5dECM组的早期成骨标志物ALP和Runx2以及晚期成骨标志物OCN的表达量均高于GelMA组。阳性表达的蛋白多位于丝的边缘。此外,随着体外培养时间的延长,14d时牙槽骨模块中早期成骨标志物的表达逐渐降低。因此,本发明实施例认为体外培养7天是后续原位移植的合适时间点。
实施例3:dECM在体内及体外的抗炎效果评价
本发明实施例中,将1×105个RAW264.7巨噬细胞接种到12孔板的每个孔中。以含10%胎牛血清和100U/mL青霉素/链霉素的RPMI-1640作为培养基。用含1μg/mL LPS、1μg/mLLPS+1% GelMA或1μg/mL LPS+0.5mg/mL dECM的培养基处理巨噬细胞3h,以含10%胎牛血清的RPMI-1640作为阴性对照。收集上清液,采用ELISA试剂盒检测炎症因子IL-6和TNF-α的浓度。收集诱导后的巨噬细胞,利用实时荧光定量PCR检测巨噬细胞中促炎因子IL-1β、IL-6、TNF-α和MCP1的基因表达。引物序列列于表1。使用2-ΔΔCT方法计算相对表达水平,以h-GAPDH基因为内参。
本发明实施例中描述的所有动物实验均按照四川大学伦理委员会批准的方案(ID:WCHSIRB-D-2021-622)进行。SD大鼠购自达硕实验动物有限公司。将GelMA和GelMA+5dECM生物墨水打印的牙槽骨模块在8周龄雄性SD大鼠(n=8)全身麻醉下移植至背部皮下组织内,进一步验证dECM在体内的抗炎作用。每只大鼠植入2个样本;第3天、第10天各收集1次标本(n=4)。样品用4%多聚甲醛固定过夜,在一系列乙醇溶液中脱水,石蜡包埋。制备石蜡切片,进行H&E、IF、免疫组化(IHC)染色。用CCR7和Alexa Fluor 555标记的山羊抗兔抗体(1:200稀释,Abcam,UK),通过IF染色鉴定M1型巨噬细胞;IHC染色检测炎症因子IL-1β(1∶100稀释度,Abcam,UK)和TGF-β(1∶200稀释度,Abcam,UK)在组织中的浸润情况。
为了评估dECM生物墨水的免疫调节功能,本发明实施例使用脂多糖(LPS)处理的巨噬细胞模拟炎症环境,并通过PCR分析与稀释的墨水共培养后,处理的细胞中炎症相关基因的表达情况。结果表明,加入LPS成功诱导巨噬细胞向M1型极化,并创造了一个炎症环境,这一结果可由促炎因子IL-1β、IL-6、TNF-α和MCP1的表达增加得到证实。而与LPS+GelMA组相比,LPS+5dECM组促炎相关基因表达水平明显下调,相对定量较LPS组降低50%。ELISA分析也证实了这些变化。在上清液中,与LPS处理组相比,与dECM共培养的巨噬细胞分泌的促炎细胞因子IL-6和TNF-α显著减少。
本发明实施例通过体内实验进一步证实dECM生物墨水的抗炎功能。皮下植入3d后,GelMA模块周围有部分炎性细胞聚集,而GelMA+5dECM模块周围仅有少量炎性细胞。第10天,GelMA模块周围形成较厚的包裹性纤维层,大量炎症细胞广泛浸润,提示存在持续慢性炎症。相比之下,dECM组炎症浸润明显较少,纤维包膜较薄。通过IF染色进行的进一步分析表明,在第10日,聚集在GelMA+5dECM模块周围的炎症细胞中,促炎M1型巨噬细胞的比例低于GelMA模块。此外,免疫组织化学(IHC)染色显示,第10天,在纯GelMA模块周围,促炎细胞因子IL-1β和抗炎细胞因子TGF-β的表达较高,表明有显著的炎症反应和组织修复过程。而GelMA+5dECM组IL-1β和TGF-β表达降低,进一步证实了dECM的免疫调节功能。免疫组织化学染色和IF染色显示,第3天两组巨噬细胞和炎性因子浸润不明显。这可能与移植早期移植物尚未降解有关。随着植入时间的延长,生物墨水逐渐降解,包裹的异种DFCs被释放,导致局部炎症。这些体外和体内的结果是一致的,共同证明了dECM可以有利于产生抗炎微环境。
实施例4:组合植入物用于牙周再生的体内评价
利用慢病毒标记eGFP标记DFCs,以便直接追踪DFCs在体内的分布和分化。将封装DFCs-GFP+的3D打印PDL模块在体外培养14d,将封装DFCs-GFP+的牙槽骨模块在体外培养7d。然后将两个模块整合并进行比格犬原位移植。选取1岁雄性比格犬双侧第3、4前磨牙,随机分为4组(n=4):(1)天然组;(2)空白组;(3)GelMA组;和(4)GelMA+5dECM组。麻醉后,从前磨牙颈部切开牙龈,翻黏骨膜瓣,暴露下颌牙槽骨。在近中根颊侧制备高6mm、宽4mm、深3mm的手术缺损。刮除牙根面的牙骨质,将复合模块植入缺损处,使得PDL模块面向牙根。仔细缝合牙龈,术后3d给予抗生素治疗。每2周进行1次牙周洁治。
3个月后处死动物,取下颌骨,4%多聚甲醛固定。Micro-CT分析牙槽骨再生情况。选取6×4×3mm的立方体作为感兴趣区(ROI)以定量统计BV/TV和Tb.Th。将样品经17%EDTA脱钙、脱水、石蜡包埋后切片,切片厚度为5μm。采用H&E染色、Masson三色染色、IF染色、天狼星红和Movat-Russell改良五色染色进行组织学评价。选取各组新生骨最低点的冠状面切面。用于IF的抗体包括periostin(1∶300稀释,Santa Cruz,USA)、mitochondria(1∶400稀释度,Abcam,UK)、OCN(1∶300稀释度,Zenbio,中国)和OPG(1∶200稀释度,Abcam,UK)。
应用Olympus数字图像系统,在偏振光下观察新生PDL组织中天狼星红染色的胶原结构。使用Adobe Photoshop中的颜色分析工具,采用统一的颜色范围,选择成熟胶原纤维对应的橙色/红色像素并计数。对绿色像素也做了同样的处理,绿色像素代表未成熟的胶原纤维。然后,确定PDL内的总像素。成熟/未成熟胶原纤维以其各自像素/总像素的百分比表示。
根据Movat-Russell改良五色染色的组织学结果来评估骨再生的高度,DH为牙槽嵴顶至缺损底部的距离,BRH为新骨顶部至缺损底部的距离。根据IF的结果来评估骨再生的潜力,使用Photoshop中的lasso工具选择一个ROI,即牙槽嵴顶和周围牙周膜,用于统计OCN在牙周组织中的表达情况。在该ROI内,计数OCN阳性细胞数和其他(DAPI识别的)细胞总数,并计算OCN阳性细胞占总细胞的比例。利用ImageJ软件统计OPG阳性表达的积分光密度。
在植入术前、术后均对比格犬行血常规、肝肾功能检查,探讨dECM的生物相容性。血常规检查包括定量白细胞、中性粒细胞、淋巴细胞和单核细胞。肝功能检测包括丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、白蛋白(ALB)、总蛋白(TP)和总胆红素(TBIL)。血清肌酐(CREA)、尿素和尿酸(UA)水平被认为是肾功能的指标。本发明实施例还进行了免疫学检查,以了解移植材料在比格犬中的免疫反应。免疫学指标包括补体C3、C4、免疫球蛋白IgA、IgG、IgM。所有血样均送成都里来生物科技有限公司检测,并出具相应报告。
为确定移植物是否会引起器质性病变,取比格犬的心、肝、脾、肾和胰腺,用4%多聚甲醛固定48h,然后包埋并切成5μm厚的切片进行组织学分析。利用GFP荧光标记进行IF染色,评估移植的DFCs是否发生全身转移。
每个实验独立重复至少3次。所有数据均以均值±标准差表示。采用SPSS 20.0软件进行统计学分析。采用配对t检验和单因素方差分析进行统计学分析。p<0.05为差异有统计学意义。
本发明实施例中,根据前面的结果,3D生物打印PDL模块在体外培养14d,牙槽骨模块体外培养7d。然后,将两个模块结合并移植到比格犬的牙周缺损处(如图4中A部分所示,其示出了将组合植入物植入比格犬体内的流程示意图)。手术过程如图4中B部分所示,在术后X线片上可以看到一个界限清楚的箱状缺损。每2周进行1次牙周洁治和术后随访。未见牙龈肿胀、牙龈炎和明显牙周炎。X线片示缺损区骨密度逐渐增加,缺损的边界消失。未见异常牙槽骨吸收。为确定移植物是否会引起全身免疫排斥反应和肝肾功能损害,定期采集比格犬血液样本进一步分析。血常规结果显示,白细胞(WBC)尤其是中性粒细胞数量在术后1d升高,1周内恢复正常,这考虑为手术创伤所致。肝脏和肾脏的各项血清生化指标均在一定范围内波动,未见明显异常。血清免疫球蛋白A、G、M(IgA、IgG、IgM)及体液免疫标志物C3、C4含量均未见明显异常;在正常范围内波动。此外,本发明实施例获取了比格犬的主要脏器并进行染色,以评估移植的细胞和材料是否会导致器官损伤和全身转移(如图5所示,其示出了本发明实施例中,组合植入物植入受体后受体的器官损伤和全身转移评估结果图)。H&E染色和IF染色均未发现器质性病变及植入细胞的转移,证实了牙周模块的安全性。综上所述,我们的生物打印牙周模块没有引起比格犬明显的免疫排斥反应或系统性损伤。
3个月后,micro-CT结果显示空白组矿化较差,骨体积/组织体积(bone volume/tissue volume,BV/TV)和骨小梁厚度(trabecular thickness,Tb.Th)相对较低。与其他组相比,GelMA+5dECM组观察到了显著的骨再生,牙槽骨高度和厚度均得到明显改善,BV/TV和Tb.Th显著增加(图6中A部分和B部分所示,其示出了比格犬牙周缺损区内的骨再生情况)。虽然GelMA组也恢复了一定的骨量,但高度和厚度都不理想。组织学染色显示,在接受GelMA+5dECM模块的缺损中,牙根表面有大量的新骨形成,新骨和牙根之间存在软组织(如图7中A部分所示,其示出了缺损区内牙周软硬组织再生情况)。GelMA组和GelMA+5dECM组新生的软组织均由成纤维细胞和胶原纤维组成,排列致密、规整。值得注意的是,邻近骨表面的部分纤维插入到新骨中,形成硬/软组织界面,与天然牙齿中的Sharpey纤维高度相似。GelMA组和GelMA+5dECM组牙周软组织间隙内可见大量血管。这些血管为组织再生提供了良好的营养供应,但也对新生纤维的方向和排列产生不利影响。进一步使用IF染色鉴定新生的牙周膜组织(如图7中B部分所示)。Periostin作为PDL组织的特异性标记物,在所有实验组和天然牙根中均可见到阳性表达,提示新生组织确实是PDL纤维。GelMA组和GelMA+5dECM组中人类细胞特异性线粒体蛋白和GFP的阳性表达,证明打印模块中包裹的DFCs参与了PDL和新骨的形成。
为了进一步评估新生PDL中的胶原成熟情况,本发明实施例在偏振光下观察了天狼星红染色切片,以区分成熟和未成熟的纤维(如图8中A部分所示)。GelMA+5dECM组的胶原基质看起来更成熟,胶原面积更大,其次是GelMA组(如图8中B部分所示)。空白组胶原面积最小,以未成熟胶原为主。GelMA+5dECM组新形成的PDL纤维方向良好,排列均匀,与天然牙相似(图8A)。Movat-Russell改良五色染色显示,空白组和GelMA组的新骨与天然骨之间有明显的分界线(如图8中C部分所示)。GelMA组在邻近分界线的新生骨中可见部分不成熟的骨单位,而空白组未见。而GelMA+5dECM组新旧骨分界不清晰,新生骨区域可见较大的哈佛斯系统,证实了较高的骨矿化程度。术后3个月采用五色染色图像定量分析骨再生高度(BRH)。根据无统计学意义的缺损高度(DH),两组模块的缺损区均表现出稳健的骨再生。然而,GelMA+5dECM模块比GelMA模块产生了更高的BRH值(如图8中D部分所示)。此外,在接受GelMA或GelMA+5dECM模块的新生组织中,有一定密度的晚期成骨标志物OCN阳性细胞,但在空白组几乎没有(图8E和8F)。在GelMA+5dECM组中,抑制破骨细胞形成和活性的OPG蛋白表达量显著高于GelMA组和空白组,表明其具有更高的成骨潜能。总之,GelMA+5dECM生物墨水构建的生物打印牙周模块促进了功能性牙周组织的再生,包括更高的牙槽骨高度恢复,更成熟的PDL纤维形成,以及更复杂的软硬组织界面整合。
表1、引物序列
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对于方法实施例,为了简单描述,故将其都表述为一系列的动作组合,但是本领域技术人员应该知悉,本发明并不受所描述的动作顺序的限制,因为依据本发明,某些步骤可以采用其他顺序或者同时进行。其次,本领域技术人员也应该知悉,说明书中所描述的实施例均属于优选实施例,所涉及的动作和部件并不一定是本发明所必须的。
以上对本发明所提供的一种牙囊组织脱细胞外基质生物墨水、制备方法及产品进行了详细介绍,本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述,以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想;同时,对于本领域的一般技术人员,依据本发明的思想,在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处,综上所述,本说明书内容不应理解为对本发明的限制。
Claims (8)
1.一种牙囊组织脱细胞外基质生物墨水,其特征在于,所述生物墨水包括:牙囊组织脱细胞外基质、甲基丙烯酸酯化明胶水凝胶溶液,所述牙囊组织脱细胞外基质在所述甲基丙烯酸酯化明胶水凝胶溶液中的含量为:2.5mg/ml~10mg/ml;所述甲基丙烯酸酯化明胶水凝胶溶液的浓度为100mg/ml;
所述生物墨水用于打印得到牙周膜模块和牙槽骨模块、为牙周膜组织和牙槽骨组织的再生提供微环境。
2.一种牙槽骨模块,其特征在于,所述牙槽骨模块为疏松多孔的立方体结构,所述牙槽骨模块的组成成分至少包括:牙囊组织脱细胞外基质生物墨水,所述牙槽骨模块是利用权利要求1所述的牙囊组织脱细胞外基质生物墨水进行3D打印制备得到的。
3.根据权利要求2所述的牙槽骨模块,其特征在于,所述牙槽骨模块为空间网格结构,所述牙槽骨模块由层层堆叠相互垂直的多层蛇形长链组成。
4.根据权利要求2所述的牙槽骨模块,其特征在于,所述牙槽骨模块的材料还包括:牙囊细胞,所述牙囊细胞的含量为2.5×106/ml。
5.如权利要求2中所述的牙槽骨模块的制备方法,其特征在于,所述方法包括:
步骤1:制备牙囊组织脱细胞外基质生物墨水;
步骤2:将所述牙囊组织脱细胞外基质生物墨水作为牙槽骨模块基质,利用所述牙槽骨模块基质通过3D打印构建牙槽骨模块;
所述利用所述牙槽骨模块基质通过3D打印构建牙槽骨模块,包括:使用直接墨水书写式打印机构建牙槽骨模块;所述牙槽骨模块为空间网格结构,所述牙槽骨模块由层层堆叠互相垂直的多层蛇形长链组成。
6.根据权利要求5所述的制备方法,其特征在于,所述方法还包括:
准备牙囊细胞和牙囊组织脱细胞外基质生物墨水;
将所述牙囊细胞与所述牙囊组织脱细胞外基质生物墨水混合,得到牙槽骨模块基质,利用所述牙槽骨模块基质通过3D打印构建牙槽骨模块。
7.一种如权利要求2所述的牙槽骨模块的应用,其特征在于,所述牙槽骨模块仿牙槽骨结构,应用于牙周组织缺损的修复模块的构建。
8.一种组合植入体,其特征在于,所述组合植入体包括:牙槽骨模块和牙周膜模块,所述牙槽骨模块为疏松多孔的立方体结构,所述牙周膜模块为薄片结构,所述牙槽骨模块与所述牙周膜模块的大面积面贴合;
所述牙周膜模块和所述牙槽骨模块的组成成分至少包括:牙囊组织脱细胞外基质生物墨水,所述牙周膜模块和所述牙槽骨模块是利用权利要求1所述的牙囊组织脱细胞外基质生物墨水进行3D打印制备得到的。
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Families Citing this family (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN117258047A (zh) * | 2023-10-12 | 2023-12-22 | 成都世联康健生物科技有限公司 | 一种猪牙髓组织脱细胞外基质水凝胶及其制备方法和应用 |
CN117752866A (zh) * | 2024-02-22 | 2024-03-26 | 中山大学 | 一种基于氧化糖原与脱细胞外基质的3d打印墨水及其制备方法和应用 |
Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2004000497A (ja) * | 2002-04-23 | 2004-01-08 | Olympus Corp | 細胞移植治療材料およびその製造方法 |
JP2009045014A (ja) * | 2007-08-21 | 2009-03-05 | Nitta Gelatin Inc | ゼリー用材料、その製造方法および用途 |
KR20180125776A (ko) * | 2017-05-16 | 2018-11-26 | 울산과학기술원 | 3차원 프린팅용 바이오 잉크 조성물 및 이의 제조방법 |
CN111110922A (zh) * | 2019-12-25 | 2020-05-08 | 四川大学 | 一种用于3d生物打印的牙周生物模块及构建方法及应用 |
EP3744356A1 (en) * | 2019-05-31 | 2020-12-02 | Musculoskeletal Transplant Foundation | Acellular soft tissue-derived matrices and methods for preparing same |
Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP3852823A4 (en) * | 2018-09-17 | 2022-05-04 | Rejuvablast LLC | COMBINED GRAFTS FOR TISSUE REPAIR OR REGENERATION APPLICATIONS |
-
2022
- 2022-11-04 CN CN202211378269.4A patent/CN115634316B/zh active Active
Patent Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2004000497A (ja) * | 2002-04-23 | 2004-01-08 | Olympus Corp | 細胞移植治療材料およびその製造方法 |
JP2009045014A (ja) * | 2007-08-21 | 2009-03-05 | Nitta Gelatin Inc | ゼリー用材料、その製造方法および用途 |
KR20180125776A (ko) * | 2017-05-16 | 2018-11-26 | 울산과학기술원 | 3차원 프린팅용 바이오 잉크 조성물 및 이의 제조방법 |
EP3744356A1 (en) * | 2019-05-31 | 2020-12-02 | Musculoskeletal Transplant Foundation | Acellular soft tissue-derived matrices and methods for preparing same |
CN111110922A (zh) * | 2019-12-25 | 2020-05-08 | 四川大学 | 一种用于3d生物打印的牙周生物模块及构建方法及应用 |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
付小兵等.《生物3D打印与再生医学》.武汉:华中科技大学出版社,2020,(第1版),第322-323页. * |
唐慧琳等.《三维生物打印技术在牙再生中的研究进展》.《口腔生物医学》.2022,第13卷(第2期),第120-124页. * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN115634316A (zh) | 2023-01-24 |
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