JP2022520434A - 鉱物化合物を含有する足場を含む生体材料及び骨代用材としてのその使用 - Google Patents

鉱物化合物を含有する足場を含む生体材料及び骨代用材としてのその使用 Download PDF

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Abstract

本発明は、鉱物成分を含有する足場を含む生体材料であって、前記鉱物成分が少なくとも１つのリン酸カルシウム化合物を含み、前記足場が、多層液滴から作られた断続的コーティングでコーティングされた表面を有し、前記多層液滴が、ポリアニオンの層及びポリカチオンの層からなる少なくとも１個の層ペアから構成される液滴である生体材料に関する。

Description

本発明は、その表面に鉱物化合物及びナノリザーバーを含有する足場を含む生体材料、並びに特に骨代用材としてのその使用に関する。
骨代用材料は、自家骨移植に関連する重大な制限を代替及び克服することを目的とする骨組織工学の領域であり、整形外科及び外傷学の標準治療として現在認められている(Campana V, et al. Bone substitutes in orthopaedic surgery: from basic science to clinical practice. J Mater Sci Mater Med 25, 2445-2461 (2014); Kumar Saper et al, Korean J Intern Med. 2015 May; 30(3): 279-293; Pryor LS, et al. Review of bone substitutes. Craniomaxillofac Trauma Reconstr 2, 151-160 (2009); Roberts TT, Rosenbaum AJ. Bone grafts, bone substitutes and orthobiologics: the bridge between basic science and clinical advancements in fracture healing. Organogenesis 8, 114-124 (2012))。近年、二相性生体模倣原理に基づいて、革新的な骨代用材が開発され、整形外科手術市場において重要な位置を占めている。骨組織の天然組成を模倣して、これらの生体材料は、細胞のための増殖、浸潤及び分化の最良条件を提供するために、（コラーゲン又はポリマーから構成される）有機相を含有する(V. Campana, G. Milano, E. Pagano, M. Barba, C. Cicione, G. Salonna, W. Lattanzi, and G. Logroscino, 2014 J Mater Sci Mater Med. 2014; 25(10): 2445-2461; Kumar Saper et al, Korean J Intern Med. 2015 May; 30(3): 279-293; Pryor et al., Trauma Reconstr. 2009 Oct; 2(3): 151-160; Roberts et al., Organogenesis. 2012 Oct 1; 8(4): 114-124)。この有機部分は、鉱物相（セラミック、ヒドロキシアパタイト（Ｈａｐ）、リン酸三カルシウム（ＴＣＰ））に結合しており、機械的強度により適用される制約に対する抵抗性の点から、骨欠損の充填及び骨組織機能の代替を可能にする。組織工学構築物の成功は、組織の必須栄養素及び酸素化を提供するので、血管新生により制限される(Kaully T, Kaufman-Francis K, Lesman A, Levenberg S. Vascularization--the conduit to viable engineered tissues. Tissue Eng Part B Rev 15, 159-169 (2009); Baiguera S, Ribatti D. Endothelialization approaches for viable engineered tissues. Angiogenesis 16, 1-14 (2013); Brennan MA, et al. Pre-clinical studies of bone regeneration with human bone marrow stromal cells and biphasic calcium phosphate. Stem Cell Res Ther 5, 114 (2014); Mertsching H, Walles T, Hofmann M, Schanz J, Knapp WH. Engineering of a vascularized scaffold for artificial tissue and organ generation. Biomaterials 26, 6610-6617 (2005); Khan OF, Sefton MV. Endothelialized biomaterials for tissue engineering applications in vivo. Trends Biotechnol 29, 379-387 (2011); Mao AS, Mooney DJ. Regenerative medicine: Current therapies and future directions. Proc Natl Acad Sci U S A 112, 14452-14459 (2015))。現在、宿主組織への非統合及び壊死により引き起こされる骨代用材適用の失敗は、特に大きな骨傷害の場合には血管新生の欠如に関連する(Mercado-Pagan AE, Stahl AM, Shanjani Y, Yang Y. Vascularization in bone tissue engineering constructs. Ann Biomed Eng 43, 718-729 (2015); Brennan et al., 2013 stem cell research; Baiguera et al. 2013; Boerckel JD, Uhrig BA, Willett NJ, Huebsch N, Guldberg RE. Mechanical regulation of vascular growth and tissue regeneration in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A 108, E674-680 (2011); Tsigkou et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 3311-3316 (2010))。これは、宿主血管系によるインプラントの浸潤が１日当たり約１０μmで起こり、次いで、３～４mmのインプラントに血管を通すために数週間を要し得るという事実により説明され得る(Baiguera et al., 2013)。今日、大きな骨欠損の処置は依然として、現在の医師にとっての課題である。
本発明の目的は、適切な血管新生特性を有する骨代用材として適切な新たな生体材料を提供することである。
本発明の目的はまた、鉱物成分及びポリマー成分の両方を含む新たなハイブリッド骨代用材であって、血管新生因子の持続放出に効率的である新たなハイブリッド骨代用材を提供することである。
本発明の別の目的は、成長因子の細胞接触依存性放出を可能にして、埋め込み後の受動放出を防止し、活性分子の過度な局所用量送達により引き起こされる副作用を回避するナノリザーバーを含む新たな生体材料を提供することである。
本発明の別の目的はまた、大きな骨欠損の処置に適切な新たな生体材料を提供することである。
したがって、本発明は、鉱物成分を含有する足場を含む生体材料であって、
前記鉱物成分が少なくとも１つのリン酸カルシウム化合物を含み、
前記足場が、多層液滴から作られた断続的コーティングでコーティングされた表面を有し、前記多層液滴が、ポリアニオンの層及びポリカチオンの層からなる少なくとも１個の層ペアから構成される液滴である生体材料に関する。
一実施態様によれば、本発明の生体材料の足場は、ポリマー成分をさらに含有する。
「生体材料」は、哺乳動物、特にヒト患者においてin vivoで使用するために適切な任意の材料を意味する。より具体的には、本発明の生体材料は、インプラントとしての使用に適切である。
上記のように、本発明の生体材料の足場は鉱物成分を含み、場合によりポリマー成分も含む。
鉱物成分
鉱物成分は、少なくとも１つのリン酸カルシウム化合物を含み、前記リン酸カルシウム化合物は、好ましくは、ヒドロキシアパタイト（ＨＡ）、非晶質リン酸カルシウム（ＡＣＰ）、無水リン酸一カルシウム（ＭＣＰＡ）、リン酸一カルシウム一水和物（ＭＣＰＭ）、リン酸二カルシウム二水和物（ＤＣＰＤ）、無水リン酸二カルシウム（ＤＣＰＡ）、沈殿又はカルシウム欠乏アパタイト（ＣＤＡ）、β－リン酸三カルシウム（β－ＴＣＰ）、リン酸四カルシウム（ＴＴＣＰ）及びそれらの混合物からなる群より選択される。
一実施態様によれば、鉱物成分はヒドロキシアパタイトを含む。
一実施態様によれば、鉱物成分はβ－リン酸三カルシウムを含む。
好ましい実施態様によれば、鉱物成分は、ヒドロキシアパタイトとβ－リン酸三カルシウムとの混合物を含む。
ポリマー成分
一実施態様によれば、足場はまた、ポリマー成分を含む。本発明によれば、ポリマー成分はポリマーから作られる。
好ましくは、ポリマー成分は、ポリ（ε－カプロラクトン）、コラーゲン、フィブリン、ポリ（乳酸）、ポリ（グリコール酸）、ポリ（エチレングリコール）－テレフタラート、ポリ（ブチレンテレフタラート）又はそれらのコポリマー及びそれらの混合物からなる群より選択されるポリマーから作られる。
足場がポリマー成分と一緒に鉱物成分を含有する場合、足場の表面をコーティングする上記で定義される多層液滴は、鉱物成分の表面だけではなくポリマー部分の表面にも存在する。
足場の両部分上の多層液滴の存在は、本発明の生体材料の有利な特徴であり、したがって、有利な特性を有するハイブリッド生体材料を与える。
多層液滴
上記のように、本発明の足場は、多層液滴の断続的コーティングでコーティングされた表面を有する。これらの液滴は、「ナノリザーバー」又は「ナノコンテナ」とも称され得る。
本発明者らは、驚くべきことに、足場（その鉱物成分及びそのポリマー成分の両方）を、
－ポリアニオンの層；及び
－ポリカチオンの層
からなる少なくとも１個の層ペアでコーティングすることが可能であることを見出した。
いくつかの実施態様によれば、生体材料足場は、多層液滴コーティングされる。
本発明のコーティングは、好ましくは、足場表面にわたって不規則に広がる。
より具体的には、本発明の生体材料足場は、交互に負又は正に帯電した層で層ごとにコーティングされる。
このコーティングは、以下で説明されているように、治療用分子のナノリザーバーを作るような方法で、治療用分子で生体材料足場を機能化することを可能にする。
「多層液滴」という用語は、ポリアニオンの層及びポリカチオンの層からなる少なくとも１個の層ペアから構成される液滴又はパッチを指す。前記液滴は、様々な形状：円形、卵形又は目盛り様式（scale shaped）を示し得る。好ましくは、前記液滴は、１０～１５０nm、より好ましくは１５～１００nm、さらにより好ましくは２５～５０nmのサイズを有する。
本発明によれば、「多層液滴コーティング」という用語は、液滴又はパッチを足場の表面に配置させ、逆帯電した分子多層液滴の層ごとの（ＬｂＬ）堆積を得るコーティングを指す。
さらに、「多層液滴コーティング」という用語は、足場の断続的コーティング、すなわち、生体材料足場の表面に沿った連続フィルムの形態ではないコーティングを指す。多層液滴コーティングは、その不規則な形状を特徴とし得、及び／又は足場の表面の少なくとも一部がコーティングされないように、それが足場の表面全体を覆わないという事実を特徴とし得る。本発明の多層液滴コーティングは、滑らかな表面を有し、足場の表面全体を覆うフィルムコーティングと対比され得る。
コーティングの構築は、逆帯電した分子の層ごとの堆積に基づくものである。すなわち、生体材料足場のコーティングは、高分子電解質多層フィルムが作られるのと同じように作られる。したがって、本発明の生体材料は、生体材料足場の表面上に多数の多層液滴の形態で、高分子電解質多層を含む。
足場の表面全体を覆うフィルムコーティングとは対照的に、本発明の多層液滴コーティングは、好ましくは、足場の表面を部分的にのみ覆うものである。本発明のコーティングは層ごとに（ＬｂＬ）適用され、過剰量のポリアニオン又はポリカチオンは、各工程において、連続的な吸着工程の間のすすぎ工程で除去される。表面電荷の再配分により、ポリアニオン又はポリカチオン第１の層は、足場の表面に沿って吸着した小さな液滴又はパッチを形成する。ポリアニオン又はポリカチオン適用の各工程では、各液滴は、ポリアニオン又はポリカチオンの新たな層により覆われる。フィルムコーティング前に多層液滴コーティングが観察される場合、コーティングプロセスは中止される。多層液滴コーティングは、フィルムコーティングで観察されない有利な特性を足場に提供する。フィルムコーティングが得られる場合、多層液滴は、コーティング足場の表面に沿ってそれ以上得ることができない。
フィルムコーティング又は非コーティング足場と比較した多層液滴コーティングの第１の利点は、その不規則な表面である。この不規則な形状は、足場への細胞接着を改善する。また、この不規則な形状は、コーティングと細胞との間の接触表面の増加を提供し、コーティングと細胞との間のやり取りを最適化する。その結果として、低濃度の治療用分子（存在する場合）が、細胞成長のより良い刺激を観察するために必要である。
加えて、本発明のコーティングは、フィルムコーティングよりも少ないポリアニオン及びポリカチオン層を使用する。したがって、層数の減少が、多層液滴コーティングを得るために必要である。
本明細書でさらに使用される場合、「高分子電解質多層」という用語は、特に、本発明の生体材料足場をコーティングする多層液滴を包含する。
本明細書の枠組みでは、「高分子電解質」という用語は、いくつかの電解質基を有する化合物、特にその反復単位が電解質基を有するポリマーを指す。前記基は水溶液中で解離して、ポリアニオン又はポリカチオンを生じさせ、場合によりポリマーを帯電させるであろう。
ナノファイバー足場をコーティングする高分子電解質多層は、ポリアニオンの層及びポリカチオンの層からなる少なくとも１個の層ペアから構成される。それらは、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５個又はそれを超える層ペアを含み得る。好ましくは、それは３～１２個の層ペアを含む。
本明細書に記載される高分子電解質多層、特に多層液滴は、生体材料足場をポリアニオン及びポリカチオン溶液に交互に浸漬することにより容易に得られ得る。
当業者には明らかなように、ポリアニオン及びポリカチオンの選択の唯一の条件は、分子の電荷である（すなわち、ポリアニオンは負に帯電したものであり、ポリカチオンは正に帯電したものである）。本発明のポリアニオン及びポリカチオンは、（場合により化学的に改変された）ポリペプチド又は多糖（シクロデキストリン、キトサンなどを含む）などの任意のタイプの分子に対応し得る。
好ましい実施態様によれば、本発明の生体材料では、ポリカチオンは、ポリ（リシン）ポリペプチド（ＰＬＬ）、共有結合シクロデキストリン－ポリ（リシン）（ＰＬＬ－ＣＤ）、ポリ（アルギニン）ポリペプチド、ポリ（ヒスチジン）ポリペプチド、ポリ（オルニチン）ポリペプチド、デンドリ－グラフトポリリシン（例えば、デンドリ－グラフトポリ－Ｌ－リシン）、キトサン及びそれらの混合物からなる群より選択される。
より好ましくは、ポリカチオンはキトサンである。
好ましい実施態様によれば、本発明の生体材料では、ポリアニオンは、ポリ（グルタミン酸）ポリペプチド（ＰＧＡ）、ポリ（アスパラギン酸）ポリペプチド及びそれらの混合物からなる群より選択される。
治療用分子
一実施態様によれば、本発明の生体材料は、少なくとも１つの多層液滴内に治療用分子をさらに含むか、又は前記治療用分子が帯電している場合には少なくとも１つの多層液滴を形成する。
一実施態様によれば、上記で説明されているように、多層液滴の少なくとも１個の層ペアは治療用分子を組み込む。
生体材料足場をコーティングする高分子電解質多層は治療用分子を組み込み得るか、又は高分子電解質多層の１つは治療用分子であり得る。
本発明の生体材料に組み込まれるべき治療用分子が帯電している場合、前記治療用分子は、高分子電解質多層を構築する場合にポリアニオン又はポリカチオンとして使用され得る。治療用分子が帯電していないか又は十分に帯電していない場合、それは、高分子電解質多層を構築するためにポリアニオン又はポリカチオン（例えば、上記リストに記載されているものの中の１つ）に共有結合的に連結され得る。
好ましい実施態様によれば、本発明の生体材料では、ポリアニオンは治療用分子（これは特にＶＥＧＦである）である。
好ましくは、治療用分子は、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、それらをコードする核酸及びそれらの混合物からなる群より選択される成長因子である。
治療用分子は、例えば、国際公開公報第０２／０８５４２３号、国際公開公報第２００６／０７９９２８号、Lynn (2006 Soft Matter 2:269-273), Decher (1997 Science 277:1232-1237)及びJessel et al. (2003 Advanced Materials 15:692-695)に記載されているように高分子電解質多層に組み込まれ得る。
本発明の枠組みでは、生体材料足場が治療用分子で機能化されて、本発明の生体材料の埋め込み部位における前記治療用分子の持続放出が可能になる。
本明細書全体を通して使用される場合、「治療用分子」という用語は、疾患を処置又は予防することを目的とする任意の分子を指す。それは、例えば、（例えば、European Medicines Agency (EMA)により、又はU.S. Food and Drug Administration (FDA)により）販売承認が出されている薬物、又は臨床試験若しくは前臨床試験を受けている候補薬物に対応し得る。治療用分子は、例えば、ポリペプチド（リコンビナントタンパク質、抗体及びペプチドを含む）、核酸（ＲＮＡ分子及びＤＮＡ分子を含む）、化学分子（例えば、小分子）又は糖（例えば、リポ多糖）に対応し得る。
本発明の生体材料が骨再生及び／又は軟骨再生に使用される場合、前記成長因子は、最も好ましくは、骨形成タンパク質２（ＢＭＰ２）、骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４）、骨形成タンパク質７（ＢＭＰ７）、線維芽細胞成長因子１（ＦＧＦ１）、線維芽細胞成長因子２（ＦＧＦ２）、線維芽細胞成長因子４（ＦＧＦ４）、線維芽細胞成長因子８（ＦＧＦ８）、線維芽細胞成長因子９（ＦＧＦ９）及び線維芽細胞成長因子１８（ＦＧＦ１８）からなる群より選択される。
特定の実施態様では、高分子電解質多層は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５個又はそれを超える層ペアを含むか、又はそれらからなり、各層ペアは、
－治療用分子（例えば、ポリペプチド、特に成長因子など）を含むか、又はそれからなるポリアニオン層；及び
－キトサン若しくはリシンポリマー（例えば、ポリ（リシン）ポリペプチド（ＰＬＬ）又はデンドリグラフトポリ－リシン（ＤＧＬ）など）を含むか、又はそれらからなるポリカチオン層
からなる。
生細胞
一実施態様によれば、本発明の生体材料は生細胞をさらに含む。
本発明の文脈では、生体材料足場は、生細胞でさらに機能化され得る。実際、生細胞の移植は、組織又は器官の修復に対する有望な解決策である。
骨再生及び／又は軟骨再生の文脈では、前記生細胞は、例えば、骨芽細胞、軟骨細胞、幹細胞（例えば、間葉系幹細胞）、骨髄間質細胞又はそれらの混合物を含み得るか、又はそれらからなり得る。好ましくは、前記生細胞は、骨芽細胞、軟骨細胞又はそれらの混合物を含むか、又はそれらからなる。特定の実施態様では、胚性幹細胞は、本発明の生細胞から除外され得る。
前記生細胞は、好ましくはヒト細胞であり、最も好ましくは自家細胞（すなわち、処置されるべき患者から得られる細胞）である。
前記生細胞は、好ましくは、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）技術により得られる。
特定の実施態様では、前記生細胞は、前記コーティング足場上に堆積するヒドロゲル（例えば、アルギン酸ヒドロゲル又はコラーゲンヒドロゲル）内に含まれる。換言すれば、本発明の生体材料は、コーティング足場に加えて、生細胞を含むヒドロゲルを含み得る。
ヒドロゲルは当業者に周知である。コラーゲンヒドロゲルは、例えば、コラーゲン（例えば、ラット尾Ｉ型コラーゲン ３mL）を１０％ＦＢＳ含有培地（例えば、５．５．mL）及び０．１Ｍ ＮａＯＨ溶液（例えば、０．５．mL）と混合することにより調製され得る。アルギン酸ヒドロゲルは、例えば、アルギン酸塩及びヒアルロン酸の混合物（例えば、０．１５Ｍ ＮａＣｌ溶液（ｐＨ７．４）中で調製され得るアルギン酸塩：ヒアルロン酸溶液（４：１））であり得る。
本発明の好ましい実施態様では、本発明の生体材料は、
－ポリアニオンの層及びポリカチオンの層からなる少なくとも１個の層ペアでコーティングされた足場；並びに
－（前記コーティング足場上に堆積した）コラーゲンヒドロゲル内に場合により含まれる骨芽細胞
を含むか、又はそれらからなる。
別の好ましい実施態様では、本発明の生体材料は、
－ポリアニオンの層及びポリカチオンの層からなる少なくとも１個の層ペアでコーティングされた足場；
－（前記コーティング足場上に堆積した）コラーゲンヒドロゲル内に場合により含まれる骨芽細胞；並びに
－（前記コーティング足場上に堆積した）アルギン酸ヒドロゲル内に含まれる軟骨細胞
を含むか、又はそれらからなる。
本発明のさらに別の好ましい実施態様では、本発明の生体材料は、
－ポリアニオンの層及びポリカチオンの層からなる少なくとも１個の層ペアでコーティングされた足場；
－（前記コーティングナノファイバー足場上に堆積した）アルギン酸ヒドロゲル内に含まれる軟骨細胞
を含むか、又はそれらからなる。
本発明のさらに別の好ましい実施態様では、本発明の生体材料は生細胞を含まない。より具体的には、それは、ポリアニオンの層及びポリカチオンの層からなる少なくとも１個の層ペアでコーティングされた上記で定義される足場から単になり得る。
生体材料を調製するための方法
本発明はまた、上記で定義される生体材料を調製するための方法であって、鉱物成分及び任意選択のポリマー成分を含有する足場を、ポリアニオンの層及びポリカチオンの層からなる少なくとも１個の層ペアでコーティングする工程を含む方法に関する。
好ましくは、少なくとも１個の層ペアでコーティングする上記工程は、以下：
ｉ．足場を、ポリカチオンを含む溶液中に（例えば、約５～６０分間、好ましくは約１５分間）浸漬する工程；
ｉｉ．工程（ｉ）の終了時に得られた足場を（例えば、約５～６０分間、好ましくは約１５分間）すすぐ工程；
ｉｉｉ．工程（ｉｉ）の終了時に得られた足場を、ポリアニオンを含む溶液中に（例えば、約５～６０分間、好ましくは約１５分間）浸漬する工程；
ｉｖ．工程（ｉｉｉ）の終了時に得られた足場を（例えば、約５～６０分間、好ましくは約１５分間）すすぐ工程；及び場合により、
ｖ．工程（ｉ）～（ｉｖ）を少なくとも２回反復する工程；及び場合により、
ｖｉ．工程（ｉｖ）又は（ｖ）の終了時に得られた足場を（例えば、紫外線への曝露により）滅菌する工程
を含む。
工程（ｉ）及び（ｉｉｉ）では、ポリカチオン又はポリアニオンを含む溶液は、例えば、約２０μM～約５００μM、好ましくは約５０μM～約２００μMの範囲内の濃度のポリカチオン又はポリアニオンを含み得る。前記溶液は、例えば、ポリアニオン又はポリカチオンに加えて、０．０２Ｍ ２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）及び０．１５Ｍ ＮａＣｌを含み得るか、又はそれらからなり得る。溶液のｐＨは、好ましくは、中性（例えば、ｐＨ７．４）である。
工程（ｉｉ）及び（ｉｖ）では、足場を、例えば、中性ｐＨ（例えば、ｐＨ７．４）を有する溶液ですすぎ得る。前記溶液は、例えば、０．０２Ｍ ＭＥＳ及び０．１５Ｍ ＮａＣｌを含み得るか、又はそれらからなり得る。
足場をコーティングするべき層ペアの数に応じて、工程（ｖ）は任意の回数、反復され得る。
工程（ｖｉ）は、例えば、紫外線への曝露により行われ得る（例えば、２５４nm、３０Ｗ、照明距離２０cm、約１５分間～約１時間、好ましくは約３０分間）。
使用前に、本発明の生体材料は、（例えば、本発明の生体材料を無血清培地に接触させることにより）平衡化し得る。
当業者にはすぐに明らかなように、ナノファイバー足場を、ポリカチオン又はポリアニオンを含む溶液中に浸漬する工程は、前記溶液を足場に噴霧する工程で置き換えられ得る。
本発明の生体材料を生産するための上記方法は、
ａ）生細胞（例えば、骨欠損及び／又は軟骨欠損を患っている患者から単離された骨芽細胞又は軟骨細胞）を提供又は入手する工程；
ｂ）前記生細胞をヒドロゲル（例えば、コラーゲンヒドロゲル又はアルギン酸ヒドロゲル）と混合する工程；及び
ｃ）工程（ｄ）で得られた混合物を工程（ｂ）で得られた生体材料上に堆積させる工程
をさらに含み得る。
ヒドロゲルを調製するための方法は当業者に周知である。コラーゲンヒドロゲルは、例えば、コラーゲン（例えば、ラット尾Ｉ型コラーゲン ３mL）を１０％ＦＢＳ含有培地（例えば、５．５．mL）及び０．１Ｍ ＮａＯＨ溶液（例えば、０．５．mL）と混合することにより調製され得る。アルギン酸ヒドロゲルは、例えば、アルギン酸塩及びヒアルロン酸の混合物（例えば、０．１５Ｍ ＮａＣｌ溶液（ｐＨ７．４）中で調製され得るアルギン酸塩：ヒアルロン酸溶液（４：１））であり得る。
特定の実施態様では、生細胞は骨芽細胞であり、ヒドロゲルはコラーゲンヒドロゲルである。この実施態様の枠組みでは、工程（ｄ）は、骨芽細胞懸濁液（例えば、細胞 ２×１０５個／mL）をコラーゲンヒドロゲルと混合することにより行われ得る（例えば、１mLの骨芽細胞懸濁液をヒドロゲル ９mLと混合する）。工程（ｅ）では、コラーゲン調製物を、工程（ｂ）で得られた生体材料の表面上にかけることができ、次いで、ポリマー化させるためにインキュベーションし得る（例えば、３７℃で約３０分間）。
別の特定の実施態様では、生細胞は軟骨細胞であり、ヒドロゲルはアルギン酸ヒドロゲルである。この実施態様の枠組みでは、工程（ｄ）は、軟骨細胞懸濁液（例えば、細胞 １×１０５個／mL）をアルギン酸ヒドロゲルと混合することにより実施され得る。工程（ｅ）では、この調製物を、工程（ｂ）で得られた生体材料の表面上にかけることができる。
使用前に、（例えば、滅菌生検パンチを使用して）シリンダーを切断し、約３７℃で、例えば５％ＣＯ２の加湿環境中で一晩インキュベーションし得る。
あるいは、生細胞はまた、事前にヒドロゲルと混合せずに、工程（ｂ）又は（ｅ）で得られたコーティング足場上に直接堆積され得る。
骨芽細胞及び軟骨細胞の両方を、本発明のコーティング足場上に堆積させるべき場合、本発明の生体材料を生産するための上記方法は、工程（ａ）及び（ｂ）の後に、
ｃ）（例えば、骨欠損及び／又は軟骨欠損を患っている患者から単離された）骨芽細胞を提供又は入手する工程；
ｄ）場合により、前記骨芽細胞をコラーゲンヒドロゲルと混合する工程；
ｅ）工程（ｃ）で得られた骨芽細胞又は工程（ｄ）で得られた混合物を工程（ｂ）で得られた生体材料上に堆積させる工程；
ｆ）（例えば、骨欠損及び／又は軟骨欠損を患っている患者から単離された）軟骨細胞を提供又は入手する工程；
ｇ）前記軟骨細胞をアルギン酸ヒドロゲルと混合する工程；及び
ｈ）工程（ｇ）で得られた混合物を工程（ｅ）で得られた生体材料上に堆積させる工程
をさらに含み得る。
これらの工程（ｃ）～（ｈ）は、例えば、上記に詳細に記載されているように行われ得る。
本発明はさらに、本明細書に記載される方法により得られ得る生体材料を提供する。
使用
本発明はまた、骨代用材としての上記で定義される生体材料の使用に関する。
本発明はまた、骨及び／若しくは軟骨欠損充填材料として使用するための、又は骨及び／若しくは軟骨再生において使用するための上記で定義される生体材料に関する。
本発明はまた、骨及び／又は軟骨欠損の処置において使用するための上記で定義される生体材料に関する。
骨欠損及び／又は軟骨欠損は、骨若しくは軟骨のいずれか又は両方に影響を与え得る。それは、例えば、軟骨欠損、骨軟骨欠損又は軟骨下骨欠損であり得る。
本発明の特定の実施態様では、骨欠損及び／又は軟骨欠損は、軟骨下骨欠損である。したがって、本発明は、軟骨下骨再生に使用するための、及び／又は軟骨下骨欠損の処置に使用するための、上記段落に記載されている生体材料を提供する。
本発明はまた、骨軟骨の骨再生において使用するための、及び／又は骨軟骨の骨欠損の処置において使用するための上記段落に記載される生体材料を提供する。
特に、本発明の生体材料は、離断性骨軟骨症、骨壊死、骨軟骨骨折、脊椎固定、傷害（例えば、スポーツの傷害又は事故による傷害）による骨欠損及び／若しくは軟骨欠損、老化による骨欠損及び／若しくは軟骨欠損、顎顔面再建が必要な骨欠損及び／若しくは軟骨欠損、サイナスリフトが必要な骨欠損及び／若しくは軟骨欠損、歯槽堤増成が必要な骨欠損及び／若しくは軟骨欠損、又は腫瘍（良性腫瘍及びガン性腫瘍を含む）による骨減少及び／若しくは軟骨減少を患っている患者における骨欠損及び／又は軟骨欠損の処置において使用される。
特定の実施態様では、骨欠損及び／又は軟骨欠損は、例えば、膝及び／又は足首の欠損などの関節欠損である。
骨及び／又は軟骨の修復及び再生の枠組みでは、本発明の生体材料は、生細胞を含んでもよいし又は含まなくてもよい。それが生細胞を含む場合、細胞は、好ましくは、自家細胞（すなわち、処置されるべき患者から単離された細胞）である。上記に示されているように、これらの生細胞はヒドロゲル内に含まれ得る。
生体材料が、（例えば、顎顔面手術又は整形手術の枠組みで）小さな骨欠損及び／又は小さな軟骨欠損の処置にインプラントとして使用するためのものである場合、生体材料は生細胞を欠き得る。
他方、骨欠損及び／又は軟骨欠損が大きな及び／又は深い欠損である場合、生体材料が生細胞を含むことが好ましい。例えば、生体材料が、大きな及び／又は深い骨欠損の処置にインプラントとして使用するためのものである場合、生体材料は、好ましくは、骨芽細胞を含む。生体材料が、大きな及び／又は深い軟骨欠損の処置にインプラントとして使用するためのものである場合、生体材料は、好ましくは、軟骨細胞を含む。生体材料が、骨及び軟骨に影響を与える大きな及び／又は深い欠損（例えば、骨軟骨欠損又は軟骨下骨欠損）の処置にインプラントとして使用するためのものである場合、生体材料は、好ましくは、骨芽細胞及び軟骨細胞の両方を含む。
本発明の好ましい実施態様では、本発明の生体材料は、
－ポリアニオンの層及びポリカチオンの層からなる少なくとも１個の層ペアでコーティングされた足場；並びに
－（前記コーティング足場上に堆積した）コラーゲンヒドロゲル内に場合により含まれる骨芽細胞
を含むか、又はそれらからなり、骨再生に、及び／又は骨欠損（好ましくは、深い及び／又は大きな骨欠損）の処置に使用するためのものである。実際、このような生体材料は、軟骨ではなく骨のみに影響を与える欠損の処置に特によく適切である。
本発明の別の好ましい実施態様では、本発明の生体材料は、
－ポリアニオンの層及びポリカチオンの層からなる少なくとも１個の層ペアでコーティングされた足場；
－（前記コーティング足場上に堆積した）コラーゲンヒドロゲル内に場合により含まれる骨芽細胞；並びに
－（前記コーティング足場上に堆積した）アルギン酸ヒドロゲル内に含まれる軟骨細胞
を含むか、又はそれらからなり、軟骨下骨再生に、骨軟骨再生に、及び／又は軟骨下骨欠損若しくは骨軟骨欠損の処置に使用するためのものである。換言すれば、このような生体材料は、骨及び軟骨の両方に影響を与える欠損の処置に特によく適切である。
本発明のさらに別の好ましい実施態様では、本発明の生体材料は、
－ポリアニオンの層及びポリカチオンの層からなる少なくとも１個の層ペアでコーティングされたポリマーから作られたナノファイバー足場；並びに
－（前記コーティング足場上に堆積した）アルギン酸ヒドロゲル内に含まれる軟骨細胞
を含むか、又はそれらからなり、軟骨再生に、及び／又は軟骨欠損の処置に使用するためのものである。
本発明はまた、顎顔面手術の分野における本発明の生体材料の使用に関する。
本発明はさらに、骨欠損及び／又は軟骨欠損を処置するための方法であって、本発明の生体材料をそれを必要とする個体に埋め込む工程を含む方法を提供する。
本発明の枠組みでは、処置されるべき個体及び／又は患者は、好ましくは、ヒト個体及び／又は患者である。しかしながら、本発明の生体材料はまた、動物用医薬品分野において使用される。
血管新生分子でナノ機能化された第３世代骨代用材。 （Ａ）研究で使用した血管新生ナノリザーバーとヒト間葉系幹細胞と二相性骨代用材との組み合わせ。 （Ｂ～Ｄ）ガラス上への堆積後のＶＥＧＦ（Ｂ）、ＨＥＰ（Ｃ）及びＨＥＰ／ＶＥＧＦ複合体（Ｄ）のＳＥＭ写真。スケールバー：５００nm。 （Ｅ）（Ｃ）に示されているＨＥＰ／ＶＥＧＦ複合体は、スクリーニングした複合体（ｎ＝６）の代表的なものであり、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）を使用して取得した。サイドカラーバーについて、疑似色は深さを示す。 （Ｆ）ＨＥＰ／ＶＥＧＦ複合体の分子モデリング。ＶＥＧＦは相同性モデル（緑色）として表示されている；ＨＥＰはスティックモデルとして表示されている；黄色は硫黄部分を示す。 ＨＥＰ／ＶＥＧＦ－ＮＲによるAnatartik（登録商標）スポンジのナノ機能化及び内皮細胞に対するその効果。 （Ａ～Ｄ）空（ＮＦ－）（Ａ、Ｂ）又はＨＥＰ／ＶＥＧＦ－（Ｃ、Ｄ）ＮＲを堆積させたAntartik（登録商標）スポンジのＳＥＭ写真。ＮＲは、スポンジの鉱物（Ａ、Ｃ）及びタンパク質（Ｂ、Ｄ）成分の両方に見られた。スケールバー：６μm。 （Ｅ）２１日間の培養後のＮＦ－（上の顕微鏡写真）、ＨＥＰ／ＢＳＡ－（中央の顕微鏡写真）及びＨＥＰ／ＶＥＧＦ－ＮＲ（下の顕微鏡写真）を堆積させたAntartik（登録商標）スポンジ上のＧＦＰ－ＨＵＶＥＣの蛍光顕微鏡写真。ＤＡＰＩで対比染色した核。スケールバー：１５０μm。 （Ｆ）ＮＦ－（右）、ＨＥＰ／ＢＳＡ－（中央）及びＨＥＰ／ＶＥＧＦ－ＮＲ（左）の骨代用材上の血管様構造（Ｅにおける赤色のアスタリスク）において組織化されていることが見出されたＧＦＰ－ＨＵＶＥＣの数。バーは平均±ＳＥＭを表す（ｎ＝２０／条件）。＊＊＊：ｐ＜０．００１。 （Ｇ）３、１４及び２１日間の培養後に、ＮＦ－（灰色のバー）又はＨＥＰ／ＶＥＧＦ－ＮＲ（黒色のバー）のいずれかを堆積させた骨代用材上に播種した細胞について、Alamar Blue（登録商標）の減少を評価した（％）。値は平均±ＳＥＭとして表されている（ｎ＝４）。＊：ｐ＜０．１；＊＊＊：ｐ＜０．０１。 ヌードマウスに皮下的に埋め込まれた骨代用材への宿主血管浸潤。 （Ａ～Ｂ）空（ＮＦ－）（Ａ）又はＨＥＰ／ＶＥＧＦ－（Ｂ）ＮＲのいずれかを堆積させた（黄色の枠により区切られた）Antartik（登録商標）二相性スポンジのＨ＆Ｅ染色（１２ｄｐｉ）。白色の矢印は、骨代用材内の血管を示す。 （Ｃ）埋め込まれた骨代用材内に見られる血管の定量分析。外植された骨代用材に見られる血管の平均数（左）及び平均直径（中央）と、血管により覆われた平均表面（右）は、４（左のバー）及び１２ｄｐｉ（右のバー）で示されている。全ての値は、少なくとも５つの画像／切片、４つの切片／サンプルの平均±ＳＥＭとして表されている；＊＊＊：ｐ≦０．０１。Ａ、Ｂにおけるスケールバー：２００μm。 臨界サイズ頭蓋冠骨欠損マウスモデルに埋め込まれた骨代用材への宿主血管系浸潤の定量分析。 （Ａ）ＮＦ－ＮＲ（２ＮＦ）又はＨＥＰ／ＶＥＧＦ－ＮＲ（２Ｆ）のいずれかを堆積させた２つの代表的な骨代用材のマイクロＣＴスキャン。全ての血管が示されている；骨代用材内の血管は赤色で色付けされている。スケールバー：１mm。 （Ｂ）空ＮＦ－ＮＲ（１ＮＦ、２ＮＦ）又はＨＥＰ／ＶＥＧＦ－ＮＲ（１Ｆ、２Ｆ）のいずれかを堆積させた４つの代表的な骨代用材に見られる血管網の三次元再構築。セグメント化された画像の骨格が表されている。より明るい色は、より大きなサイズの血管を表す。 （Ｃ）最も近い隣接血管までの平均距離として表されている、Ｂに示されている骨代用材内の宿主血管網の相対密度。 ヒトＭＳＣは、ヌードマウスに皮下的に埋め込まれた骨代用材の血管新生に寄与した。 （Ａ、Ｂ）横断面としてのＨＥＰ／ＶＥＧＦ－ＮＲ骨代用材内に見られる血管の超微細構造図（Ａ）。血管を包む壁細胞（周皮細胞、赤色のアスタリスク）の存在は、活性骨代用材に浸潤した血管の優れた機能性を示唆する（Ａにおける黄色の挿入部分；Ｂ）。Microfil（登録商標）MV-122造影剤（これは、血管の内腔において観察され得る（青色のアスタリスク））を灌流させたので、血液細胞は見られなかった。Ｅ：内皮細胞；ｅＮ：内皮細胞の核；Ｐ：周皮細胞；ｐＮ：周皮細胞の核。スケールバー：Ａでは５μm、Ｂでは２μm。 （Ｃ）ヒトＰＥＣＡＭ１に特異的な抗体を使用して免疫組織化学により、皮下的に埋め込まれたＨＥＰ／ＶＥＧＦ－ＮＲ骨代用材内のヒト起源の細胞の存在を明らかにした（Ｃ、上のパネル）。ヒト及びマウスのＰＥＣＡＭ１の両方に対する交差反応性を有する抗体を使用した免疫組織化学にも同じ検体を供した（Ｃ、中央のパネル）。下のパネルでは、コントロールマウス骨に対して、抗ヒトＰＥＣＡＭ１抗体を使用した（Ｃ、下のパネル）。スケールバー：２００μm。
材料及び方法
ＶＥＧＦ／ＨＥＰ複合体の堆積
ＨＥＰ（２０mM／０．１５mM トリス／ＮａＣｌ、ｐＨ６．８中５００μg/ml）、ＶＥＧＦ（２０mM／０．１５mM トリス／ＮａＣｌ、ｐＨ６．８中２００μg/ml）又はＨＥＰ／ＶＥＧＦ（５００μg/ml／２００μg/ml）溶液（Sigma-Aldrich, Saint-Quentin-Fallavier, France）の液滴をカバーガラス上に置き、乾燥させた。各５分間の２回のすすぎ工程により、緩衝液からの塩結晶を脱イオン水で可溶化した。この堆積手順を６回反復して、材料の量を増加させた。
走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）及び原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）研究
骨代用材上のＨＥＰ／ＶＥＧＦ－ＮＲの形成を分析するために、サンプルを４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で４℃にて１０分間固定した。脱水後、二次電子検出器を有する通常の高真空モードでＳＥＭ（Hitachi TM1000又はFEG Sirion XL; FEIのいずれかによる）により、検体を観察した。市販のスタンドアロン型ＡＦＭ顕微鏡Solver Pro (Nt-Mdt Inc., Moscow, Russia)を使用して、ＡＦＭ画像を取得した。１０５kHzの典型的な共振周波数及び２N/mのばね定数のNSG 10カンチレバーを用いて、タッピングイメージングモードを使用した。画像解像度を５１２×５１２に設定し、スキャン速度は１Hzであった。オープンソースソフトウェアGwyddion 2.24 5 (Necas D, Klapetek P. Gwyddion: Open Physics (ed^(eds) (2012)におけるＳＰＭデータ分析用オープンソースソフトウェア)を使用して、画像を分析した。
骨代用材上へのナノリザーバー堆積
Antartik（登録商標）スポンジ（１０％コラーゲンＩ及びＩＩＩ、９０％セラミック; Medical Biomat, Vaulx-en-Velin, France）を幅 ５mmのフラグメントに切断し、９６ウェルプレートに置いた。それらをＵＶ光（２５４nm、３０Ｗ、距離 ２０cm、３０分間曝露）で滅菌した。前記のように、キトサン－ＨＥＰ－ＶＥＧＦ－ＮＲを層ごとに堆積させて適用した［２９］。簡潔に言えば、骨代用材を、２０mM／０．１５mM トリス／ＮａＣｌ、ｐＨ６．８中の５００μg/mlキトサン溶液（Protasan UP CL 113, Novamatrix, Sandvika, Norway）及び５００μg/ml／２００ng/ml ＨＥＰ／ＶＥＧＦ複合体溶液に交互に浸漬した。各浸漬後、骨代用材をトリス／ＮａＣｌ緩衝液で５分間にわたって３回すすいだ。使用前に、骨代用材を無血清ダルベッコ改変イーグル培地（Ｄ－ＭＥＭ）で平衡化した。
ＨＥＰ－ＶＥＧＦ複合体の分子モデリング
シミュレーションのための開始構造を調製するために、ＨＥＰナトリウム塩（CAS 9041-08-1）及びＶＥＧＦ１６５ヘパリン結合ドメイン座標（pdb id：２ＶＧＨ、５５アミノ酸）をＰＤＢ構造ファイル（Fairbrother WJ, Champe MA, Christinger HW, Keyt BA, Starovasnik MA. Solution structure of the heparin-binding domain of vascular endothelial growth factor. Structure 6, 637-648 (1998)）から抽出した。AmberToolsのアンティチェンバープログラムを使用してＡＭ１－ＢＣＣ法に基づいて、ヘパリンナトリウム塩分子の部分原子電荷を割り当てた。general amber force field (GAFF）（Wang J, Wang W, Kollman PA, Case DA. Automatic atom type and bond type perception in molecular mechanical calculations. J Mol Graph Model 25, 247-260 (2006)）から、ヘパリンのファンデルワールス力及び結合パラメータを取得した。次いで、acpype pythonスクリプトを使用して、これらの分子のAMBERフォーマットファイルをGROMACSフォーマットに変換した。Cluspro及びPatchdockドッキングプログラムを使用して、ヘパリンとＶＥＧＦとの複合体を生成した。分子動力学（ＭＤ）シミュレーションを実行するために、６つの最良の複合体の座標を選択して、各複合体のトポロジーファイルを生成した。
明確な水モデルを使用して、３０nsec間にわたってGROMACS-4.6を使用して、ＭＤシミュレーションを実施した。複合体を周期的なキュービックボックスの中央に置き、ＳＰＣ水分子の追加により溶媒和した。次いで、必要に応じて対イオンを追加することにより、システムの正味電荷を中和した。最急降下アルゴリズムを使用して、エネルギー最小化を行った。v-rescale温度及びParrinello-Rahman圧力結合法を使用して、温度及び圧力を３００Ｋ及び１atmに維持した。２fsec時間工程で生産シミュレーションを３０nsec間実施した。ヘパリン及びＶＥＧＦ複合体の無相互作用エネルギーを計算するために、本発明者らは、ＭＭ／ＰＢＳＡプロトコールを使用した。GROMACSソフトウェアパッケージを使用してMM-PBSAアプローチを実行するg_mmpbsa tool82を使用して、計算を実施した。ＭＤ軌道から抽出した（各複合体の）スナップショット １００個のサンプルから、ＭＭ／ＰＢＳＡエネルギーを取得した。BWUniCluster Karlsruheの計算時間を使用して、全ての計算を行った。
細胞培養
緑色蛍光タンパク質発現ＨＵＶＥＣ（EssenBiotech, France）及び骨髄由来のｈＭＳＣ（PromoCell, Heidelberg, Germany）を、各完全培地（内皮成長培地；間葉系幹細胞成長培地、PromoCell）中、５％ＣＯ２を含む加湿雰囲気で、３７℃にて培養した。ｈＭＳＣ １．５×１０４個を、ＨＥＰ／ＶＥＧＦ－ＮＲを堆積させた又は堆積させていない各Antartik（登録商標）スポンジフラグメント上に播種し、間葉系幹細胞成長培地中で７日間培養した。７日後、ＧＦＰ－ＨＵＶＥＣ ５．５×１０４個を同じサンプル上に播種し、半分のｈＭＳＣ成長培地及び半分の内皮成長培地からなる培地中で培養した。細胞を播種した骨代用材フラグメントを合計２１日間培養し、次いで、下流の用途に応じて処理した。
細胞の生体適合性分析
Alamar Blue（登録商標）（Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA, USA）を使用して、経時的に細胞代謝活性を評価した（ｎ＝４）。ＧＦＰ－ＨＵＶＥＣ播種の３、１４及び２１日後、細胞を、フェノールレッドを含まないＤ－ＭＥＭ中の１０％Alamar Blue（登録商標）(Lonza, Levallois-Perret, France)中、３７℃及び５％ＣＯ２でインキュベーションした。４時間後、上清を９６ウェルプレートに移し、Multiskan FCプレートリーダー（ThermoFischer Scientific, Illkirch-Graffenstaden, France)で５７０及び５９５nmの吸光度を測定して、還元されたAlamar Blue（登録商標）のパーセンテージを決定した。
免疫蛍光
細胞を播種した骨代用材を４％ＰＦＡにより４℃で１０分間固定し、ＰＢＳですすぎ、次いで、脱塩し、４μm連続切片のためにパラフィン包埋した。ウサギ抗ヒトＰＥＣＡＭ１／ＣＤ３１（Microm, Brignais, France）及び非種特異的抗ＰＥＣＡＭ１／ＣＤ３１（Abcam, Paris, France）、次いで、ウサギ抗体に対して生成された二次抗体であって、Alexa 594蛍光色素を結合させた二次抗体（Molecular Probes, Life Technologies, ThermoFisher Scientific）をＰＢＳ１％ＢＳＡで１：２００希釈したものを使用した。ＰＢＳによる複数回のすすぎ後、核対比染色のために、サンプルを２００nM ４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ；Sigma-Aldrich）中で１０分間インキュベーションした。LEICA DM4000B落射蛍光顕微鏡（Leica Microsystems, Nanterre, France）を用いて、検体を観察した。
ヌードマウスへの骨代用材の埋め込み
動物及び組織に関する全ての手順は欧州連合の推奨（2010/63/EU）に準拠して設計され、Prefecture du Bas-Rhinにより認可された調査員により実施された。全ての実験は、French Ministry of Agriculture, Department of Veterinary Scienceを代表するVeterinary Public Health Service of the Prefecture du Bas-Rhinの承認番号C-67-482-35の下でAnimalerie Centrale de la Faculte de Medecine de Strasbourgにおいて実施された。６週齢の雄ヌードマウス（Crl:NIH-Foxn1nu；Charles River, L’arbresle, France）を、１０mg/kgのキシラジン（Rompun（登録商標）２％, VIRBAC Sante Animale; Centravet, Nancy, France）を混合した１００mg/kgのケタミン（VIRBAC Sante Animale; Centravet, Nancy, France）の腹腔内注射で麻酔し、３７℃に維持した加熱プレート上に置いた。埋め込みの５日前に、ｈＭＳＣ １．０×１０５個を各骨代用材に播種した。皮下埋め込みの場合、背側皮膚切開を実施し、骨代用材（直径＝５mm）を皮膚と下の筋肉との間に入れた。切開部を吸収性材料で縫合し、マウスを実験時間全体にわたって観察下で維持した。４（ｎ＝６）又は１２（ｎ＝１２）ｄｐｉのいずれかの後、埋め込まれたマウスを致死用量のケタミンの腹腔内注射で屠殺した。臨界サイズ骨欠損への埋め込みの場合、皮膚切開を実施し、滅菌ラウンドバー（深さ ５００μm及び直径 ５mm）を使用して頭蓋冠（頭蓋骨の頭頂部）を穿孔し、骨代用材（直径＝５mm）を欠損に入れた。切開部を吸収性材料で縫合し、マウスを実験時間全体にわたって観察下で維持した。１２ｄｐｉにマウス（ｎ＝１２）を屠殺し、外植片を組織学的、ＴＥＭ及び／又はマイクロＣＴ評価に供した。
ヘマトキシリン－エオシン（ＨＥ）組織学的染色
ＨＥ染色のために、皮下外植片を４％ＰＦＡで固定し、脱塩し、７μm連続切片のためにパラフィン包埋した。次いで、サンプルをＨＥ染色に供し、Leica DM4000B顕微鏡（Leica Microsystems）で観察した。血管新生の定量分析のために、imageJソフトウェアを使用した。外植片に見られる血管の数、平均サイズ及び総面積を分析した。少なくとも、切片当たり画像５つ、サンプル当たり切片４つを分析した。
血管系の微小血管造影及び定量分析
皮下埋め込みの１２日後、マウスを深部全身麻酔（ペントバルビタールナトリウム１２０mg/Kg）に供した。胸郭を開いた後、注入針を左心室に入れた。次に、ヘパリン（５０U/ml；心臓血管系をパージするため）、４％ＰＦＡ、ＰＢＳ及び放射線不透過性シリコーンゴム（Microfil（登録商標）MV-122, Flow Tech Inc.）をマウスに灌流（２ml/分の速度）させた。灌流後、心臓をクランプして造影剤の漏れを回避した；次いで、マウスを４℃に一晩置いて造影剤を重合させた。次いで、外植片を４％ＰＦＡで４８時間後固定し、次いで、一定でゆっくりと撹拌しながらエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ、１５％、ＰＨ＝７，４）で３７℃で１週間脱塩した。マイクロＣＴ取得中のサンプルのいかなる動きも回避するために、外植片を１％寒天にマウントした。タングステン透過ターゲットを有する１８０kV－１５Ｗ高出力ナノフォーカスチューブを備えるマイクロＣＴ Ｘ線システムnanotom（登録商標）m (GE Sensing & Inspection Technologies GmbH, Wunstorf, Germany)を使用して、断層撮影実験を行った。５mm2の等方ピクセルサイズ及び約１５．４×１２．０mm2の視野でＸ線マイクロＣＴをそのように実施した。各測定のために、６０kV加速電圧及び３１０mAビーム電流のＸ線をサンプルに照射した。各回転角位置において、画像６つを取得し、平均化して投影した。３６０°を超える１７００回の投影は、約１００分間の総スキャン時間をもたらした。
phoenix datos|x 2.0ソフトウェア（phoenix|x-ray, GE Sensing & Inspection Technologies GmbH, Wunstorf, Germany）を用いて、データの取得及び再構築を実施した。
マイクロＣＴスキャンから得られたグレーレベル画像を２つのクラスにセグメント化して、血管内のボクセルと外部のボクセルとを区別した。各画像について、手動で調整した閾値を強度レベルに適用した。セグメント化のノイズ除去を行うために、幅１０μmの構造エレメントを各画像に適用した。次いで、２０μm3未満のボクセルの連結集合を消去した。セグメント化後、得られた血管を骨格として描画した（骨格は、前述のアルゴリズムについて、血管様形状の中心線及び局所半径の両方を規定する点の順序集合として定義される）。
透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）
マイクロＣＴスキャン後、１２ｄｐｉの外植片を０．１Ｍ カコジル酸緩衝液（ｐＨ７．４）中２．５％グルタルアルデヒド及び２．５％ＰＦＡで固定した。サンプルを１％四酸化オスミウムで後固定し、脱水し、プロピレンオキシドでコンディショニングし、Spurrエポキシ樹脂Epon 812（Electron Microscopy Sciences, Ft. Washington, PA）に包埋した。Leica Ultracut UCTウルトラミクロトーム（Leica Microsystems）で半薄切片（２μm）及び超薄切片（７０nm）を調製し、酢酸ウラニル（Laurylab, Brindas, France）及びクエン酸鉛（Euromedex EMS, Souffelweyersheim, France）で対比させ、Morgagni 268D電子顕微鏡（FEI-Phillips, ThermoFisher Scientific）を用いて７０kvで検査した。Mega View IIIカメラ（Soft Imaging System, Munster, Germany）を使用して、デジタル画像をキャプチャした。
統計分析
BioStatGV (Sentiweb, France）及びPrism5 (GraphPad, La Jolla, CA, USA）を用いて、統計分析を行った。対応のない両側スチューデントｔ検定を用いて、Alamar Blue（登録商標）代謝アッセイ、組織学的データ及び微小血管造影データを分析した。データセット間で分散が異なることが判明した場合、ウェルチ補正を適用した。
実施例１：血管新生複合分子でナノ機能化された骨代用材の設計及びモデリング
移植された骨代用材の血管新生を促進するために、本発明者らは、ＮＲ技術（図１Ａ）（Mendoza-Palomares C, et al. Smart hybrid materials equipped by nanoreservoirs of therapeutics. ACS Nano 6, 483-490 (2012); Eap S, et al. Collagen implants equipped with ’fish scale’-like nanoreservoirs of growth factors for bone regeneration. Nanomedicine (Lond) 9, 1253-1261 (2014); Schiavi J, et al. Active implant combining human stem cell microtissues and growth factors for bone-regenerative nanomedicine. Nanomedicine (Lond) 10, 753-763 (2015);及びEap S, et al. A living thick nanofibrous implant bifunctionalized with active growth factor and stem cells for bone regeneration. Int J Nanomedicine 10, 1061-1075 (2015)）でＦＤＡ承認のAntartik（登録商標）スポンジを機能化した。ヘパリンはＶＥＧＦの血管新生活性に重要であり、そのカルボキシ末端ドメインに位置するヘパリン結合ドメインを介して成長因子に結合する（Fairbrother WJ, Champe MA, Christinger HW, Keyt BA, Starovasnik MA. Solution structure of the heparin-binding domain of vascular endothelial growth factor. Structure 6, 637-648 (1998); Krilleke D, Ng Y-Shan E, Shima David T. The heparin-binding domain confers diverse functions of VEGF-A in development and disease: a structure-function study. Biochemical Society Transactions 37, 1201-1206 (2009)）。ＮＲ媒介性細胞接触依存性送達を介して血管新生効果を最大化するために、本発明者らは、最初に、骨代用材を機能化するためのＨＥＰ／ＶＥＧＦ１６５複合体の適合性を調査した。ヘパリン、ＶＥＧＦ又はそれらの複合体をガラスカバースリップ上に滴下して堆積させ、走査型電子顕微鏡により可視化した（図１Ｂ～Ｄ）。ＡＦＭイメージングにより確認されたように、複合体化ＨＥＰ／ＶＥＧＦ１６５は大きな凝集体（６０．０±１５．４nm）を形成した（図１Ｅ）。
複合体化ＨＥＰ／ＶＥＧＦ凝集体がこのような大きなサイズを有する理由を理解するために、本発明者らは、分子動力学シミュレーションを使用して、ＨＥＰとＶＥＧＦ１６５との間の分子相互作用をモデリングした。ヘパリンは、高い負電荷を有する線状硫酸化多糖であるが、ＶＥＧＦ１６５のＨＥＰ結合ドメインの表面静電ポテンシャルは正に帯電している（Ono K, Hattori H, Takeshita S, Kurita A, Ishihara M. Structural features in heparin that interact with VEGF165 and modulate its biological activity. Glycobiology 9, 705-711 (1999)）。したがって、分子相互作用をモデリングするためのガイドとして、ＨＥＰの硫酸アニオン及びＶＥＧＦのアルギニン（Ａｒｇ）残基を使用して、ＶＥＧＦ１６５のＮＭＲモデルへのＨＥＰモデルのドッキングシミュレーションを実施した。正のＡｒｇ残基のほとんどは、ＶＥＧＦ１６５の中央ドメイン中で（Ａｒｇ３５、Ａｒｇ３９、Ａｒｇ４６、Ａｒｇ４９）又はそのＮ末端ドメインのループ内で（Ａｒｇ１３、Ａｒｇ１４）クラスタ化されている。溶媒にアクセス可能な表面の計算静電ポテンシャルによれば、これらの領域は、高い負電荷の分子、例えばＨＥＰの結合部位に相当する。分子ドッキングを使用して生成したＨＥＰ／ＶＥＧＦ複合体モデルを最急降下エネルギー最小化に供し、続いて平衡化し、３０nsecの分子動力学生成を実行した。次いで、分子力学ポアソン－ボルツマン表面積（ＭＭ／ＰＢＳＡ）法により、それらのエネルギーに従って、複合体モデルをランク付けした。最も低いエネルギーを有する得られたＨＥＰ／ＶＥＧＦ複合体構造（図１Ｆ）は、正味電荷が、ＶＥＧＦ１６５（図１Ｆにおける相同性モデル）へのＨＥＰ（図１Ｆにおけるスティックモデル）の親和性において重要な役割を果たすことを明確に示している。ＨＥＰの硫酸基（図１Ｆにおける黄色）は、ＶＥＧＦ１６５の上記Ａｒｇ残基並びにロイシン１７及びトレオニン４７残基の両方の側鎖と強く相互作用してＨＥＰ／ＶＥＧＦ複合体を安定化し、おそらくは大きな凝集体の形成を促進する。
実施例２：ＨＥＰ／ＶＥＧＦ－ＮＲでナノ機能化された骨代用材は、in vitroで内皮細胞の組織化を改善する
ヘパリン／ＶＥＧＦ複合体をキトサンＮＲに組み込み、Antartik（登録商標）スポンジ上に堆積させた。機能化骨代用材をＳＥＭで観察し、キトサンのみ－ＮＲ（非機能化ＮＲ：ＮＦ－ＮＲ）と比較した。６サイクルの堆積後、本発明者らは、骨代用材の鉱物（図２Ａ、Ｃ）及びコラーゲン（図２Ｂ、Ｄ）部分の両方において、ＨＥＰ／ＶＥＧＦ－又はＮＦ－ＮＲのいずれかの均一な分布を観察した。ナノ機能化Antartik（登録商標）骨代用材の血管新生促進効果を調査するために、ＨＥＰ／ＶＥＧＦ－ＮＲ、ＨＥＰ／ＢＳＡ－ＮＲ又はＮＦ－ＮＲのいずれかを骨代用材のフラグメント上に堆積させ、そして、これにｈＭＳＣ及び緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）発現ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＧＦＰ－ＨＵＶＥＣ）を播種した。２１日間の培養後、内皮細胞の組織化をモニタリングした。ＨＥＰ／ＶＥＧＦ－ＮＲの存在下では、ＧＦＰ－ＨＵＶＥＣは細胞のストレッチで組織化され、血管様構造（図２Ｅにおける赤色のアスタリスク）に似ており、多くの場合、これは内腔を示していた。反対に、ＮＦ－ＮＲ又はＨＥＰ／ＢＳＡ－ＮＲのいずれかの存在下では（図２Ｅ）、内皮細胞は依然として、移植片上に単一細胞として主に分布していた。連続ストレッチにおける整列したＧＦＰ－ＨＵＶＥＣの数により、血管様構造を評価した。ナノ活性足場では、これらは平均３．４±０．５細胞長であったが、非機能化足場又は非血管新生ＨＥＰ／ＢＳＡで機能化された足場では、これらはそれぞれ１．２±０．１及び１．４±０．２細胞長であった（ｐ≦０．００１）（図２Ｆ）。ＨＥＰ／ＢＳＡ－ＮＲの存在は、ＮＦ－ＮＲで見られるものと同様の結果をもたらしたので、本発明者らは、in vitroで内皮細胞の組織化を促進するナノ活性骨代用材の能力がＨＥＰ／ＶＥＧＦ複合体の存在及び細胞アベイラビリティに依存すると結論付けた。本発明者らはまた、非機能化足場上に播種した細胞の代謝活性を評価し、alamar blue（登録商標）アッセイにより、ＨＥＰ／ＶＥＧＦ－ＮＲの存在下で播種した細胞のものと比較した。両条件において、０日目から２１日目までalamar blue（登録商標）の減少は増加したが（図２Ｇ）、これは、細胞毒性のキューが細胞に影響を与えなかったことを示唆している。検討した培養期間中、ＮＦ－及びＨＥＰ／ＶＥＧＦ－ＮＲの間では有意差は観察されなかった。しかしながら、ＮＦ－ＮＲと共に培養した細胞は、３日目～１４日目に急激な代謝増加を示したが（ｐ≦０．１）、ＨＥＰ／ＶＥＧＦ－ＮＲの存在下で培養した細胞は、より一定の代謝率を示した（３～１４日目及び１４～２１日目について、それぞれｐ≦０．０５及びｐ≦０．０１）。これらのデータは、非機能化足場では、ＨＥＰ／ＶＥＧＦ－ＮＲの存在下よりも細胞が増殖し得ることを示唆している。
実施例３：皮下的に埋め込まれたナノ活性骨代用材は宿主血管系をリクルートした
ＨＥＰ／ＶＥＧＦ－ＮＲで機能化された骨代用材は、in vitroで内皮細胞の組織化を改善し、血管様構造の形成を誘発した。したがって、本発明者らは、血管新生ナノ活性骨代用材がin vivoで血管新生を有効に引き起こし得るか及びどのようにして引き起こし得るかを評価した。本発明者らは、ＨＥＰ／ＶＥＧＦ－ＮＲ又はＮＦ－ＮＲ骨代用材のいずれかをヌードマウスの背部に皮下的に埋め込んだ。埋め込み前に、ｈＭＳＣを全ての骨代用材に播種し、７日間培養した。埋め込みの４又は１２日後（ｄｐｉ）にマウスから骨代用材を外植し、それらの血管新生の程度を組織学的レベルで評価した。一般に、外植されたナノ活性骨代用材は、ＮＦのものと比較して良好な宿主血管のリクルートを示した（図３Ａ、Ｂにおける白色の矢印）。骨代用材のコアに見られる血管の定量は、ＨＥＰ／ＶＥＧＦ－ＮＲの存在下（４及び２１ｄｐｉにおいて、それぞれ１４．８±１．７mm-1及び６１．０±１２．９mm-1；ｐ＝０．００２）においてのみ、ＮＦ骨代用材（４及び１２ｄｐｉにおいて、それぞれ１３．２±２．７４mm-1及び２２．６±８．０mm-1）と比較して有意な増加を示した（図３Ｃ）。４ｄｐｉにおいて、リクルートされた血管の直径（ＨＥＰ／ＶＥＧＦ－ＮＲ及びＮＦ－ＮＲ骨代用材において、それぞれ１７±１μm対１８±２μm）（図３Ｅ）及び相対血管面積（いずれの条件においても１％未満）（図３Ｅ）に有意差は観察されなかった。ＨＥＰ／ＶＥＧＦ－ＮＲ骨代用材に見られる宿主血管のサイズ及び相対面積の両方がそれぞれ１．５倍（ｐ＝０．００２）及び８倍（ｐ＝０．０００３）増加すると、１２ｄｐｉにおいて画像は非常に劇的に変化したが、ＮＦ－ＮＲ骨代用材では差異は観察されなかった（図３Ｅ）。
これらの結果は、ＮＲ技術によるＨＥＰ／ＶＥＧＦ複合体の存在及び長期アベイラビリティが、骨代用材のコアにおいて宿主からリクルートされる血管の数及びサイズをどのようにして増加させたかを示しており、移植片のより良好な機能性が予想され得ることを示唆している。
実施例４：ナノ活性骨代用材は、臨界サイズ頭蓋冠骨欠損マウスモデルにおいて血管新生を促進した
最後に、本発明者らは、臨界サイズ骨欠損のマウスモデルにおいてナノ活性ＨＥＰ／ＶＥＧＦ骨代用材の効果を試験した。マウスにおいて頭蓋冠の一部を穿孔し（頭蓋冠骨欠損を誘導し）、ＨＥＰ／ＶＥＧＦ－ＮＲ又はＮＦ－ＮＲ骨代用材を充填した。１２ｄｐｉにおいて、埋め込まれた動物に放射線不透過性ゴム造影剤を灌流させ、次いで、骨代用材を外植し、マイクロＣＴスキャンに供した。空ＮＲと比較して、宿主血管系のリクルートに対するナノ活性ＨＥＰ／ＶＥＧＦ複合体の存在により誘発される影響を示すために、移植されたマウスの３Ｄ微小血管造影（マイクロＣＴスキャン画像の３Ｄレンダリング）を作成した（図４Ａ）。新たに形成された血管はＨＥＰ／ＶＥＧＦ－ＮＲ骨代用材に密接に浸透し、インプラントの実質的に全体積をカバーしていた（図４Ｂ、左のパネル）。反対に、宿主血管系はＮＦ－ＮＲ骨代用材で低密度にコロニー形成した（図４Ｂ、右のパネル）。注目すべきことに、標準オイラー距離を使用して、セグメント化画像中の最も近い隣接血管までの距離マップを生成すると、曲線の傾向（図４Ｃ）及び分布の様式（１ＮＦ、２ＮＦ及び３ＮＦについて、それぞれ０．３２、０．２５及び０．０５mm；１Ｆ、２Ｆ及び３Ｆについて、それぞれ０．０６、０．０２及び０．０５mm）はともに、最も近い隣接血管までの任意の点の平均距離が、ナノ活性骨代用材ではＮＦのものと比較して小さいことを明確に示す（ｐ＝０．０４２３）ことが分かった。分析はまた、ＮＦ骨代用材中の血管密度が０．７５±０．９９％であり、ＨＥＰ／ＶＥＧＦ－ＮＲ骨代用材では２．８±０．７６％（ｐ＝０．０１６７）であり、これはほぼ４倍高いことを明らかにした。
要約すれば、これらのデータは、骨代用材のナノ機能化が、処置された頭蓋冠骨欠損の内部に形成されたより高密度の新たな血管群をもたらしたことを示したが、これは、骨再生のための必須の前提条件である。
鉱物ブロックの存在下では、血管は停止するか又は細かく切断され、図４に示されているように多数の非常に小さな血管が生じる。血管網を可視化するために、前記ブロックは予め脱塩されていたことに留意しなければならず、これは、その鉱物成分が排除されていたことを意味する。
図４に示されているように、本発明の革新的な技術を使用すれば、血管はもはや障害物に遭遇しないので、それらの経路を進むことができる。
実施例５：骨代用材上に播種されたヒトＭＳＣは血管新生に寄与した
微小血管造影において骨代用材内で観察された血管は、周囲の血管と十分に接続しているように見える。また、埋め込まれた動物は出血を起こさず、造影剤を灌流させると、それらは、周囲の骨において薬剤のいかなる漏出（これは機能不全（sub-functional）血管系を示し得る）も示さなかった。新たに形成された血管の形態を詳細に調べるために、本発明者らは、超微細構造レベルでそれらを分析した。骨代用材内に見られる血管は、構造的安定性を血管に提供する壁細胞により囲まれた正常形態の緊密に結合した内皮細胞の存在を特徴としていた（図５Ａ及び５Ｂ）。埋め込み後の骨代用材内に見られる血管の機能性は、それらが形成する速度と共に、移植された骨代用材の細胞成分の壊死を回避するために両方とも非常に重要である。失われた骨を再成長させるために、埋め込み前にｈＭＳＣを機能化及び非機能化骨代用材の両方に播種した。間葉系幹細胞は、骨芽細胞、脂肪細胞、軟骨細胞及びさらにはニューロンのような多くの細胞タイプで分化することができることが公知の多能性幹細胞である。研究はまた、ＭＳＣが、少なくともin vitroにおいて内皮細胞で効率的に分化し得ることを示唆していた。したがって、本発明者らは、骨代用材上に播種されたｈＭＳＣが、インプラント内に見られる血管の形成に寄与するかを調査した。免疫組織化学により、本発明者らは、抗ヒトＰＥＣＡＭ１抗体に陽性のいくつかの内皮細胞（図５Ｃ、上のパネル）を検出し、これらは、骨代用材内で新たに形成された血管の内皮の一部であった（図５Ｃにおける白色のアスタリスク）。ヒト及びマウスのＰＥＣＡＭ１の両方と交差反応した抗体を使用した免疫組織化学により示されているように、これらの細胞の一部のみが移植ｈＭＳＣに由来していた（図５Ｃ、中央のパネル）。予想通り、コントロールマウス骨に対して抗ヒトＰＥＣＡＭ１抗体を使用した場合、シグナルは検出されなかった（図５Ｃ、下のパネル）。これらの結果は、埋め込まれた骨代用材内の新たな血管の形成が、ＮＲ及びｈＭＳＣの両方の同時存在に依存することを示している。したがって、長期間にわたる血管新生成長因子の細胞接触依存性放出は、内皮の細胞におけるｈＭＳＣの活発な分化と協調して、ナノ機能化骨代用材に浸潤する機能的血管新生に相乗的に寄与すると結論付けられた。
本発明は、ＶＥＧＦの細胞接触依存性放出を可能にする骨代用材料のナノ機能化に基づく。血管新生効果を最大化するために、ＶＥＧＦ１６５をＨＥＰと複合体形成させた。収集した証拠は、コンピューターモデリングにより予想されるように（図１Ｆ）、ＨＥＰとの化学物理的相互作用の結果として、ＨＥＰ／ＶＥＧＦ複合体がＶＥＧＦ単独よりも大きな凝集体を形成することを示した（図１Ｂ～Ｅ）。骨代用材のナノリザーバー媒介性機能化は、局所高用量のＶＥＧＦに関連する副作用を有効に克服するので極めて有利である。また、ＶＥＧＦ１６５は、細胞外環境に曝露された場合には約９０分間の短い半減期を有するため、キトサンＮＲ内では、それは分解を受けないので細胞にとって長時間利用可能である。この研究では、本発明者らは、ＨＥＰ／ＶＥＧＦ－ＮＲがどのようにして、in vitroで血管様構造中の内皮細胞の組織化を誘導し（図２Ｅ、Ｆ）、皮下的に（図３Ａ～Ｃ）又は臨界サイズ頭蓋冠骨欠損に（図４Ａ～Ｃ）埋め込まれた臨床的に使用される二相性骨代用材の血管新生を改善し得るかを示した。頭蓋冠欠損に埋め込まれた１つのＮＦ－ＮＲ骨代用材における宿主血管の空間分布は、ＨＥＰ／ＶＥＧＦ－ＮＲ骨代用材に見られるものと同様であることが見出されたが、血管密度は、ナノ活性骨代用材（２．８％）と比較して低かった（１．９％）。これらの結果はおそらくは血管の平均直径によるものであり、いくつかの組織学的検体で観察されるように、血管の成熟度の差異により説明され得る。
埋め込み前に、ＨＥＰ／ＶＥＧＦ－ＮＲと一緒にｈＭＳＣをAntartik（登録商標）二相性スポンジに播種した。最近、第３世代生体材料の出現により、治療剤としての成体間葉系幹細胞の使用が臨床応用の大きな関心を集めている。これらの細胞は、栄養因子の分泌により、成熟組織に分化することができるだけではなく、免疫反応をモデュレーションし、アポトーシスを防止し、血管新生を促進することもできる。また、間葉系幹細胞は、壁細胞及び内皮細胞の両方で分化することにより、新たに形成された血管を安定化することが示された。ｈＭＳＣ、内皮細胞及び３Ｄ生体材料の併用は、血管網及び新たな骨組織の両方の形成を特に増加させることが示された。
したがって、本発明者らは、臨床的に使用される二相性スポンジに対して血管新生ＮＲの存在をｈＭＳＣと組み合わせ、これら２つのプレーヤーがどのようにして、in vivoでAntartik（登録商標）骨代用材における血管新生を相乗的に促進し得るかを観察した。骨代用材にコロニー形成した血管系では、ヒト起源のいくつかの内皮細胞が見られたので、本発明者らは、宿主からの内皮細胞の改善されたリクルートに加えて、ｈＭＳＣが血管の形成に積極的に寄与することを示した（図５Ｃ）。
要約すれば、Antartik（登録商標）骨代用材上の同時に存在する血管新生因子及びｈＭＳＣの細胞接触依存性持続放出により、以下の観察がなされた：１）壁細胞が大きな移植片のコアにも存在することにより証明された機能的血管系の形成（図５Ａ、Ｂ）；２）ＶＥＧＦ／ＨＥＰ－ＮＲ及びｈＭＳＣの存在下で見られる血管の数、サイズ及び相対面積の観点から、皮下的に埋め込まれた骨代用材のより良好な血管新生（図３Ａ～Ｃ）；３）大きな頭蓋冠骨欠損に埋め込まれた骨代用材におけるより高密度の血管網（図４Ａ～Ｃ）；並びに４）血管新生へのｈＭＳＣの積極的な寄与（図５Ｃ）。
今日の時点で、自家骨移植（自家移植）は、大きな骨欠損の処置におけるゴールドスタンダードである。世界中で年間２００万件以上の手術があり、それは、輸血に次いで２番目に多い組織移植である。しかしながら、それは欠点を有する。骨自家移植片は、感染症の点で合成骨代用材の使用よりも多くの合併症を示し、それらはより高いコストを有する。同種骨移植片は、臨床使用前に適切に処置されなければならないので、自家移植片よりもさらに費用がかかる（expansive）。しかしながら、自家移植片は、この技術の全体的コストの増加に寄与する第２の手術部位、より長い手術室時間及びより長い術後慢性疼痛を必然的に導入する。したがって、現在の制限（宿主組織からの血管リクルートの欠如、及び埋め込まれた骨代用材のコアで誘導される壊死）を克服するために、及び埋め込まれた骨代用材の血管新生を誘導するために（これは、機能的骨組織の再生のための基盤である）、高度な機能化材料が必要である。
したがって、本発明は、臨界サイズ骨欠損における血管新生を改善することを目的とする、血管新生ナノリザーバー及び間葉系幹細胞の同時存在に基づくナノ機能化骨代用材に関する。本明細書に提示されている結果は、生物医学及び公衆衛生の両方の観点から大きな関連性を有する。本発明者らは、臨床で既に使用されている骨代用材に適用されるこの革新的な戦略が、１）in vitroで血管様構造中の内皮細胞を組織化することができること、２）皮下インプラントにおける新たな血管形成に寄与することができること、及び３）臨界骨欠損マウスモデルにおける血管新生を改善することができることを示した。今や、本発明のナノ機能化骨代用材は、大きな骨欠損の処置において自家移植片及び同種移植片を置き換えることができ、活性プレーヤー（細胞及び成長因子）の組成を適切に改変することにより、他の組織の再生のためにも使用され得る。

Claims (14)

  1. 鉱物成分を含有する足場を含む生体材料であって、
    前記鉱物成分が少なくとも１つのリン酸カルシウム化合物を含み、
    前記足場が、多層液滴から作られた断続的コーティングでコーティングされた表面を有し、前記多層液滴が、ポリアニオンの層及びポリカチオンの層からなる少なくとも１個の層ペアから構成される液滴である、生体材料。
  2. 前記足場がポリマー成分をさらに含有する、請求項１に記載の生体材料。
  3. 少なくとも１つの多層液滴内に治療用分子をさらに含むか、又は前記治療用分子が帯電している場合には少なくとも１つの多層液滴を形成する、請求項１又は２に記載の生体材料。
  4. 前記治療用分子が、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、それらをコードする核酸及びそれらの混合物からなる群より選択される成長因子である、請求項３に記載の生体材料。
  5. 前記リン酸カルシウム化合物が、ヒドロキシアパタイト（ＨＡ）、非晶質リン酸カルシウム（ＡＣＰ）、無水リン酸一カルシウム（ＭＣＰＡ）、リン酸一カルシウム一水和物（ＭＣＰＭ）、リン酸二カルシウム二水和物（ＤＣＰＤ）、無水リン酸二カルシウム（ＤＣＰＡ）、沈殿又はカルシウム欠乏アパタイト（ＣＤＡ）、β－リン酸三カルシウム（β－ＴＣＰ）、リン酸四カルシウム（ＴＴＣＰ）及びそれらの混合物からなる群より選択される、請求項１～４のいずれか一項に記載の生体材料。
  6. 前記ポリマー成分が、ポリ（ε－カプロラクトン）、コラーゲン、フィブリン、ポリ（乳酸）、ポリ（グリコール酸）、ポリ（エチレングリコール）－テレフタラート、ポリ（ブチレンテレフタラート）又はそれらのコポリマー及びそれらの混合物からなる群より選択されるポリマーから作られる、請求項２～５のいずれか一項に記載の生体材料。
  7. 前記ポリカチオンが、ポリ（リシン）ポリペプチド（ＰＬＬ）、共有結合シクロデキストリン－ポリ（リシン）（ＰＬＬ－ＣＤ）、ポリ（アルギニン）ポリペプチド、ポリ（ヒスチジン）ポリペプチド、ポリ（オルニチン）ポリペプチド、デンドリ－グラフトポリリシン（例えば、デンドリ－グラフトポリ－Ｌ－リシン）、キトサン及びそれらの混合物からなる群より選択される、請求項１～６のいずれか一項に記載の生体材料。
  8. 前記ポリアニオンが、ポリ（グルタミン酸）ポリペプチド（ＰＧＡ）、ポリ（アスパラギン酸）ポリペプチド及びそれらの混合物からなる群より選択される、請求項１～７のいずれか一項に記載の生体材料。
  9. 生細胞をさらに含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の生体材料。
  10. 請求項１～９のいずれか一項に記載の生体材料を調製するための方法であって、鉱物成分及び任意選択のポリマー成分を含有する足場を、ポリアニオンの層及びポリカチオンの層からなる少なくとも１個の層ペアでコーティングする工程を含む、方法。
  11. 少なくとも１個の層ペアでコーティングする前記工程が、以下：
    ｖｉｉ．前記足場を、前記ポリカチオンを含む溶液に浸漬する工程；
    ｖｉｉｉ．工程（ｉ）の終了時に得られた足場をすすぐ工程；
    ｉｘ．工程（ｉｉ）の終了時に得られた足場を、前記ポリアニオンを含む溶液に浸漬する工程；
    ｘ．工程（ｉｉｉ）の終了時に得られた足場をすすぐ工程；及び場合により；
    ｘｉ．工程（ｉ）～（ｉｖ）を少なくとも２回反復する工程；及び場合により；
    ｘｉｉ．工程（ｉｖ）又は（ｖ）の終了時に得られた足場を滅菌する工程
    を含む、請求項１０に記載の方法。
  12. 骨代用材としての、請求項１～９のいずれか一項に記載の生体材料の使用。
  13. 骨及び／若しくは軟骨欠損充填材料として使用するための、又は骨及び／若しくは軟骨再生において使用するための、請求項１～９のいずれか一項に記載の生体材料。
  14. 骨及び／又は軟骨欠損の処置において使用するための、請求項１～９のいずれか一項に記載の生体材料。
JP2021547379A 2019-02-13 2020-02-13 鉱物化合物を含有する足場を含む生体材料及び骨代用材としてのその使用 Pending JP2022520434A (ja)

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