JP2016524964A - バイオミメティックなコラーゲン−ヒドロキシアパタイト複合材料 - Google Patents

Abstract

本発明は、バイオミメティックなコラーゲン−ヒドロキシアパタイト複合材料であって、該複合材料は、少なくとも部分的に繊維状のコラーゲン足場を含み、該コラーゲン足場は、円偏光二色性分光法によって示されると、三重螺旋性を有する成熟天然コラーゲン繊維を含み、該成熟天然コラーゲン繊維は、ナノ結晶ヒドロキシアパタイトのエピタキシャル成長した結晶によって少なくとも部分的に被覆されていることにより、該エピタキシャル成長したナノ結晶は、ヒトの骨塩と同じ形態およびヒトの骨塩と同じサイズ、すなわち、３０〜５０ｎｍの長さおよび１４〜２５ｎｍの幅を有する、バイオミメティックなコラーゲン−ヒドロキシアパタイト複合材料に関する。本発明はさらに、上記のバイオミメティックなコラーゲン−ヒドロキシアパタイト複合材料を調製するプロセスであって、該プロセスは、ａ）上記の成熟天然コラーゲン繊維を含む、少なくとも部分的に繊維状のコラーゲン足場を、飽和Ｃａ２＋／ＨｘＰＯ４（３−ｘ）の飽和水溶液に浸漬して、複合インプラント材料の形成プロセスを開始することにより、該成熟天然コラーゲン繊維上にエピタキシャル成長したナノ結晶を形成するステップを含み、該エピタキシャル成長したナノ結晶は、ヒトの骨塩と同じ形態および同じサイズを有しており、該プロセスはさらに、ｂ）該水溶液から固形物を分離し、水洗し、乾燥させることによって、該複合インプラント材料の形成プロセスを停止するステップと、ｃ）ステップｂ）により得られた分離物を任意に殺菌するステップとを含む、プロセスに関する。本発明はさらに、上記のバイオミメティックなコラーゲン−ヒドロキシアパタイト複合材料の、ヒト対象または動物における欠損部位での骨形成、骨再生、骨修復および／または骨置換のためのインプラントまたはプロテーゼとしての使用、または、骨および軟骨の複合再生のためのインプラントとしての使用に関する。

Description

本発明は、新規のバイオミメティックなコラーゲン−ヒドロキシアパタイト複合材料に関し、該材料は、少なくとも部分的に繊維状のコラーゲン足場とヒドロキシアパタイトとを含み、該コラーゲン繊維は、ナノ結晶ヒドロキシアパタイトのエピタキシャル成長した結晶によって少なくとも部分的に被覆されており、本発明はさらに、該材料を調製するためのプロセスと、ヒト対象または動物における欠損部位での骨形成、骨再生、骨修復および／または骨置換をサポートするためのインプラントとしての該材料の使用、または、骨および軟骨の複合再生のためのインプラントとしての該材料の使用とに関する。

骨格の欠損は、外傷、疾患、および外科手術など、多種多様な状況下で生じる可能性があり、さまざまな外科分野において、骨欠損の効果的な修復が依然として必要とされている。骨欠損の部位における治癒を促すために、数多くの天然材料および合成材料ならびに組成物が使用されてきた。

歯周および顎顔面の骨欠損または整形外科分野の骨欠損における骨成長を促進する、周知の天然骨伝導性骨代用材料として、ガイストリヒ・ファーマ・アーゲー（Geistlich Pharma AG）より市販のGeistlich Bio-Oss（登録商標）またはGeistlich Orthossがそれぞれ挙げられる。このヒドロキシアパタイト系骨塩材料は、米国特許第５，１６７，９６１号に記載されるプロセスによって天然骨から製造されており、該プロセスは、天然骨の海綿構造およびナノ結晶構造を保持することができる。

しかしながら、ヒドロキシアパタイト系材料は、脆く、たとえば身体の骨部分上で、ねじ込み可能となるのに十分な機械的ストレスに対する耐性がないため、とりわけ整形外科において、大きな骨欠損を修復するのに必ずしも適合されていない。

したがって、とりわけ機械的ストレスに対する耐性の面で、天然骨に酷似するよう作製された合成または部分的に合成の骨移植材料の必要性がある。このようなバイオミメティックな合成または部分的に合成の骨移植材料は、特定の用途のため、とりわけ、大きな骨欠損を修復するために、天然骨由来の骨移植片の有用な代替物となるであろう。

天然骨は、水と、主にＩ型コラーゲンからなるコラーゲンマトリクスとからなる複合材料であり、Ｉ型コラーゲンは、ヒドロキシアパタイトを主成分とする無機結晶と密に結合している。コラーゲンＩ型繊維およびヒドロキシアパタイトは、天然骨の乾燥重量のおよそ２５〜３０ｗ／ｗ％および６５〜７０ｗ／ｗ％をそれぞれ占めている。コラーゲンマトリクスは、骨に柔軟性および弾性を付与し、無機材料は、骨に強度および剛性を付与しており、これらの二相の組織が、複合物の高度な弾力性および靱性を与えている。Weiner, S. et al.,1992,FASEB,6:879-885によって、オングストロームレベル（鉱物結晶）からミクロンレベル（ラメラ）までの骨構造の完全な論評が示されている。

天然骨の重要な特徴の一つは、ヒドロキシアパタイト結晶の形態およびその非常に小さいサイズであって、ヒトの骨塩の場合、六方晶系空間群Ｐ６_３／ｍ、長さ約３０〜５０ｎｍ（ｃ軸：［０，０，１］）、（ａおよびｂ軸：［１，０，０］および［０，１，０］）において１４〜２５ｎｍである。上記のWeiner S.et al.を参照されたい。

N.A.Barrios et al.は、"Density Functional Study of Binding of Glycine, Proline and Hydroxyproline to the Hydroxyapatite (0001) and

Surfaces", 2009, Langmuir 25(9), 5018-5025および"Molecular Dynamics Simulation of the Early Stages of Nucleation of Hydroxyapatite at a Collagen Template", Crystal Growth Design, 2012, 12, 756-763において、ヒトの体温では、ヒドロキシアパタイトのコーラゲン繊維への核形成および結合は、コラーゲンアミノ酸構成要素であるグリシン、プロリンおよびヒドロキシプロリンのさまざまな部位、すなわち、結晶面（０００１）および

上で行われ得、結晶面

上での結合が好ましいことを示している。このことは、人体において、コラーゲン繊維およびそのアミノ酸構成要素の構造は、ヒドロキシアパタイトの結晶構造に正確に対応する基質を与えることを証明しているため、骨形成は、エピタキシャル成長経路に従って、ヒドロキシアパタイト結晶とコラーゲン繊維とを相互結合させる。このエピタキシャル成長経路は、熱力学的に有利であり、最も低いエネルギー構成が得られる。

先行技術においては、天然骨に類似したコラーゲン−ヒドロキシアパタイト複合材料を提供するための試みがなされている。

米国特許第５，２３１，１６９号には、コラーゲンをリン酸カルシウム鉱物により石灰化する方法が記載されており、該方法は、１０〜１３の範囲のｐＨを有する塩基性水溶液中に分散されたコラーゲンフィブリルの分散液の存在下で、上記のリン酸カルシウム鉱物を調製することと、上記分散液に、少なくとも１時間かけて、上記リン酸鉱物を生成するために、可溶性カルシウムおよび可溶性リン酸の原料を正しい比率で加えることと、石灰化コラーゲンを回収することとを含む。このようにして、コラーゲンマトリクス中にリン酸カルシウムが安定して分散された石灰化コラーゲンが得られることが教示されている。

米国特許第５，７３９，２８６号には、天然骨に似通った骨増強材料を作製する方法が開示されており、該方法は、二重拡散チャンバ内で７日間かけてコラーゲン繊維を石灰化することによるものであり、該二重拡散チャンバにおいて、一方の貯留槽は、０．０５Ｍトリス緩衝液および０．１Ｍ塩化カルシウムを含有し、他方の貯留槽は、０．０５Ｍトリス緩衝液および０．１Ｍリン酸カリウムを含有する。リン酸カルシウム沈殿物がコラーゲン繊維上に形成されることが教示されており、石灰化コラーゲン繊維の走査型電子顕微鏡写真は、合成血漿中に浸漬された生体ガラス材料上に沈殿して存在するヒドロキシアパタイトの板状凝集体と形態的に類似している。

米国特許第６，３９５，０３６号および第６，５８９，５９０号には、コラーゲン膜に、膜の両側にカルシウムイオンの溶液およびリン酸イオンの溶液を与えることによって、人口骨を作製する方法が記載されており、これらのイオンは、膜を通って拡散し、出会い、コラーゲン膜内部でヒドロキシアパタイト材料として沈殿する。

米国特許第７，５１４，２４９号および第７，５４７，４４９号には、リン酸カルシウムにより石灰化されたバイオミメティックなコラーゲンスポンジを作製する方法が開示されており、該リン酸カルシウムは、６ｍＭ塩化カルシウムの溶液と、ポリ（αβ−ＤＬ−アスパラギン酸）およびポリ（ビニルホスホン酸）の両方の２００μｇ／ｍｌとを使用し、その後、リン酸二アンモニウムを蒸気拡散させることによって、コラーゲンフィブリルの間質空間内に埋め込まれる。

Ficai A. et al., 2010, Chemical Engineering 160, 794-800には、コラーゲンゲルおよびヒドロキシアパタイトの前駆物質から出発してコラーゲン−アパタイト複合材料を調製するプロセスが開示されており、該プロセスにおいては、ヒドロキシアパタイトの沈殿およびフィブリル形成を確実にするために、水酸化ナトリウム溶液を用いてｐＨが約９に調整される。このようにして、ヒドロキシアパタイトの結晶が「数ナノメートルから４０ｎｍまでのナノメートル範囲で」形成される。ヒドロキシアパタイトの核形成は、フィブリル形成の間に行われ、このフィブリル形成の間に、コラーゲン分子の自己集合化により、コラーゲンのアミノ酸構成要素の位置が変化する（したがって、ヒドロキシアパタイトの結晶構造に正確に対応しない）ため、ヒドロキシアパタイト結晶のエピタキシャル成長は一切あり得ない。該刊行物に述べられるように、該結晶は沈殿されている。

特許公報ＵＳ２００９／０２３２８７５号には、コラーゲンを含有する有機マトリクスからなる第１の上層と、ヒドロキシアパタイトおよびコラーゲンを含有する複合マトリクスからなる少なくとも１つの下層とを含む多層構造が記載されている（段落［０００１］）。該複合物は、ｐＨ９〜１１および３５〜４０℃の温度で、自己集合性のコラーゲンフィブリル上へのヒドロキシアパタイトの直接的な核形成プロセスによって得られ、結晶のサイズは、繊維軸に沿って１２〜１５ｎｍである（段落［００８２］および［００８９］）。上記のFicai et al.と同様に、ヒドロキシアパタイトの核形成は、コラーゲン分子の自己集合化の間に行われ（自己集合化により、コラーゲンのアミノ酸構成要素の位置が変化する）、さらに、この核形成には、「無機相の炭酸化、すなわち、ヒドロキシアパタイト格子におけるＣＯ_３ ^２−基の取り込みが行われ」（段落［００７７］、第２５行目〜第２８行目を参照されたい）、炭酸化ヒドロキシアパタイトは、異なる結晶構造を有する（空間群ＰｂまたはＰ２_１／ｂを有する単斜晶系結晶構造：Elliot J.C. 1994: Structure and Chemistry of the Apatites and Other Calcium Phosphates. Studies in inorganic Chemistry 18. Elsevier Science, ISBN 0-444-81582-1を参照されたい）ため、ヒドロキシアパタイト結晶のエピタキシャル成長は一切あり得ない。したがって、該結晶は、「コラーゲンフィブリル内に形成され、フィブリルに平行…ナノ核」上に、沈殿によって成長する（段落［００９０］を参照されたい）。

先行技術のコラーゲン−ヒドロキシアパタイト複合材料においては、ヒドロキシアパタイトは、コラーゲン足場の上または内部に沈殿されており、コラーゲン足場との結合は、たとえば吸着などによる、弱い物理的結合に過ぎない。このように弱い物理的結合は、ヒドロキシアパタイト結晶がコラーゲン繊維上にエピタキシャル成長した天然骨の弾力性、耐トルク性および靱性を材料に与えることが不可能である。

したがって、本発明の目的は、コラーゲン足場とヒドロキシアパタイト結晶との間に強い結合があるバイオミメティックなコラーゲン−ヒドロキシアパタイト複合物を提供することである。

先行技術のコラーゲン−ヒドロキシアパタイト複合材料では、ヒドロキシアパタイト結晶は、天然の骨塩、特にヒトの骨塩の形態（結晶面比率および格子定数）および非常に小さいサイズを有さない。

したがって、本発明の別の目的は、コラーゲン結晶がヒトの骨塩と同じ形態および同じサイズを有するバイオミメティックなコラーゲン−ヒドロキシアパタイト複合物を提供することである。

欧州特許第２′４４５′５４３号は、焼結されたα−ＴＣＰコア上でヒドロキシアパタイトのナノ結晶がエピタキシャル成長する条件を教示しており、該ナノ結晶は、ヒトの骨塩と同じ形態および同じサイズを有している。

上記の目的は、コラーゲン繊維上でヒドロキシアパタイトのナノ結晶をエピタキシャル成長させるための、欧州特許第２′４４５′５４３号に記載される条件を適合させることによって達成され得ることがわかっており、該ナノ結晶は、ヒトの骨塩と同じ形態および同じサイズを有している。

このようにして、コラーゲン足場とヒドロキシアパタイト結晶との強いエピタキシャル結合により、優れた機械的特性、とりわけ機械的ストレスに対する高い耐性、特に高い耐トルク性（少なくとも３０Ｎｃｍ、一般的に約６０Ｎｃｍ）を有するバイオミメティックなコラーゲン−ヒドロキシアパタイト複合材料が得られる。とりわけ、ヒドロキシアパタイト結晶がヒトの骨塩と同じ形態および同じサイズを有していることにより、この材料は、人体内に移植されると、骨形成細胞によってコロニー形成され易く、優れた骨伝導性および骨結合特性を示す。

上記の目的は、添付の請求項に規定される発明によって達成される。
したがって、本発明は、新規のバイオミメティックなコラーゲン−ヒドロキシアパタイト複合材料であって、該複合材料は、少なくとも部分的に繊維状のコラーゲン足場を含み、該コラーゲン足場は、円偏光二色性分光法によって示されると、三重螺旋性を有する成熟天然コラーゲン繊維を含み、該成熟天然コラーゲン繊維は、ナノ結晶ヒドロキシアパタイトのエピタキシャル成長した結晶によって少なくとも部分的に被覆されていることにより、該エピタキシャル成長したナノ結晶は、ヒトの骨塩と同じ形態およびヒトの骨塩と同じサイズ、すなわち、３０〜５０ｎｍの長さおよび１４〜２５ｎｍの幅を有する、バイオミメティックなコラーゲン−ヒドロキシアパタイト複合材料に関する。

本発明のバイオミメティックなコラーゲン−ヒドロキシアパタイト複合材料の利点
コラーゲン足場とヒドロキシアパタイトナノ結晶との、天然骨のように強いエピタキシャル結合により、本発明の合成または部分的に合成のバイオミメティックなコラーゲン−ヒドロキシアパタイト複合材料は、優れた機械的特性、とりわけ機械的ストレスに対する高い耐性、特に高い耐トルク性（少なくとも３０Ｎｃｍ、一般的に約６０Ｎｃｍ）、高い圧縮強度および高い弾性を有している。その優れた機械的特性により、本発明のバイオミメティックなコラーゲン−ヒドロキシアパタイト複合材料の成形体は、とりわけ身体の骨部分上で、ねじ込み可能であるとともに、機械的ストレス下で体積を永続的に保つ。このため、大きな骨欠損を修復するのに理想的に適合されている。

１２時間のコーティング反応時間にわたって０．２ＭのＰＢＳ濃度で、実施例３ｂ）に記載されるようにコーティングされた実施例１ｃ）の膜型コラーゲン足場の繊維状側のＳＥＭ顕微鏡写真を示す図である。 ２４時間のコーティング反応時間にわたって０．８ＭのＰＢＳ濃度で、実施例３ｂ）に記載されるようにコーティングされた実施例１ｃ）の膜型コラーゲン足場の繊維状側のＳＥＭ顕微鏡写真を示す図である。 ＭＧ６３骨芽細胞様細胞でコロニー形成された、実施例３ｂ）に記載されるようにコーティングされた実施例１ｃ）の膜型コラーゲン足場の繊維状側のＳＥＭ顕微鏡写真を示す図である。

「ヒトの骨塩と同じ形態」とは、（結晶の外形を決定する）結晶面の寸法関係がヒトの骨塩と同じであることを意味する。ヒトの骨塩では、結晶は、一般的に六方晶系板状結晶である。

上記のN.A. Barrios et al.の刊行物によって示されるように、コラーゲン上でのヒドロキシアパタイトのエピタキシャル成長は、コラーゲンの繊維上でしか生じ得ない。このような繊維は、成熟天然コラーゲン繊維である必要があり、すなわち、（ａ）コラーゲン構成要素の自己集合によってフィブリルが集合している、（ｂ）アルファ１鎖およびアルファ２鎖が形成されている、（ｃ）２つのアルファ１鎖と１つのアルファ２鎖との自然架橋によって三重螺旋が形成されている、コラーゲン繊維である必要がある。このような成熟天然コラーゲン繊維は、円偏光二色性分光法によって示されると、三重螺旋性を有している。成熟天然コラーゲン繊維上では、コラーゲン構成要素であるグリシン、プロリンおよびヒドロキシプロリンのそれぞれの位置が、ヒドロキシアパタイトの構造に正確に対応して固定されているため、ヒドロキシアパタイトと成熟天然コラーゲン繊維とのエピタキシャル相互結合が可能になる。フィブリルが自己集合中である、アルファ１鎖およびアルファ２鎖が形成中である、または三重螺旋が形成中である形成中の繊維は、ヒドロキシアパタイトのエピタキシャル成長に適切ではない。実際に、このような形成中の繊維においては、コラーゲンの構成要素の位置が変化するため、ヒドロキシアパタイトの結晶構造に正確に対応していない。

このため、コラーゲン足場が、その外面上で少なくとも部分的に繊維状であり、円偏光二色性分光法によって示されると、三重螺旋性を有する成熟天然コラーゲン繊維を含むことが必要である。

少なくとも部分的に繊維状のコラーゲン足場は、一般的に、ＳＥＭ顕微鏡写真上の画像分析および円偏光二色性分光法によって決定されると、その外面に、少なくとも２％の成熟天然コラーゲン繊維、好ましくは、少なくとも５％の成熟天然コラーゲン繊維、より好ましくは、少なくとも１０％の成熟天然コラーゲン繊維を含む。

少なくとも部分的に繊維状のコラーゲン足場は、一般的に、Ｉ型コラーゲンからなるが、他の型のコラーゲン、とりわけＩＩ型およびＩＩＩ型コラーゲンをさらに含んでいてもよい。

少なくとも部分的に繊維状のコラーゲン足場は、一般的に、天然材料由来のコラーゲンマトリクス、または半人工もしくは人工コラーゲンマトリクスであり、該半人工もしくは人工コラーゲンマトリクスは、たとえば、コラーゲン粒子の懸濁液または可溶性コラーゲンの溶液からエレクトロスピニングによって調製され、該コラーゲンは、天然材料由来または組換えコラーゲンである。

ナノ結晶ヒドロキシアパタイトのエピタキシャル成長した結晶は、通常、Ｘ線回折分析によって決定されると、少なくとも３０±１５ｎｍの厚さを有する層を形成する。少なくとも３０±１５ｎｍの厚さは、エピタキシャル配向のヒドロキシアパタイトナノ結晶の１つの層に相当する。

ナノ結晶ヒドロキシアパタイトのエピタキシャル成長した層は、コラーゲン繊維基質へのエピタキシャル配向のヒドロキシアパタイトナノ結晶の単層または複数層を含んでいてもよい。ナノ結晶ヒドロキシアパタイトのエピタキシャル成長した層の厚さは、このようなエピタキシャル配向のヒドロキシアパタイトナノ結晶の層の数に関連するが、人体内のインプラントとしての骨代用材料の意図される用途に応じて選択される。

ナノ結晶ヒドロキシアパタイトのエピタキシャル成長した層の厚さは、繊維状コラーゲン足場とナノ結晶ヒドロキシアパタイトのエピタキシャル成長した結晶とのｗ／ｗ比率に関連し、上記比率は、一般的に、５：９５〜９５：５、好ましくは、１０：９０〜９０：１０、より好ましくは、２０：８０〜６０：４０、特に、３０：７０〜７０：３０である。

バイオミメティックなコラーゲン−ヒドロキシアパタイト複合材料は、粒子状または顆粒状であってもよく、粒子または顆粒は、所望のサイズおよび形状を有し得る。一般的に、粒子または顆粒は、ほぼ球形であり、２０〜５０００μｍの直径を有する。

バイオミメティックなコラーゲン−ヒドロキシアパタイト複合材料は、任意の形状、たとえば、立方体または直方体ブロック、平板、円柱、テーパキー、釘、ねじ、ピン、または、とりわけ腰、鎖骨、肋骨、下顎骨、頭蓋骨部分などの身体の骨部分の輪郭を有する構造の成形体であってもよい。このような成形体は、たとえば身体の骨部分上で、ねじ込み可能となるのに十分な耐トルク性、すなわち、乾燥状態で少なくとも３０Ｎｃｍの耐トルク性、好ましくは、乾燥状態で少なくとも５０Ｎｃｍの耐トルク性を有していてもよい。

バイオミメティックなコラーゲン−ヒドロキシアパタイト複合材料は、膜成形体であってもよい。

膜成形体に好適なコラーゲン足場としては、ＥＰ−Ｂ１−１６７６５９２に記載されるプロセスに従って製造されるBio-Gide（登録商標）膜（ガイストリヒ・ファーマ・アーゲー、スイス）が挙げられ、これは、骨形成細胞の内殖を可能にする繊維状側と、非骨形成細胞の内殖に対するバリアとして作用する平滑側とを有している。このような膜は、一般的に、繊維状側のみがエピタキシャル成長したヒドロキシアパタイトナノ結晶によってコーティングされているため、繊維状側に骨形成に非常に有利な条件が与えられている。

本発明のバイオミメティックなコラーゲン−ヒドロキシアパタイト複合材料は、ヒト対象または動物における骨欠損部位、とりわけ大きな骨欠損部位での骨形成、骨再生、骨修復および／または骨置換のためのインプラントまたはプロテーゼとして使用され得る。

したがって、本発明はさらに、
バイオミメティックなコラーゲン−ヒドロキシアパタイト複合材料の、ヒト対象または動物における欠損部位での骨形成、骨再生、骨修復および／または骨置換のためのインプラントまたはプロテーゼとしての使用と、
バイオミメティックなコラーゲン−ヒドロキシアパタイト複合材料を移植することによる、ヒト対象または動物における欠損部位での骨形成、骨再生、および／または骨修復を促進する方法とに関する。

一方側のみがエピタキシャル成長したヒドロキシアパタイトナノ結晶によってコーティングされた本発明のバイオミメティックなコラーゲン−ヒドロキシアパタイト複合材料の膜成形体は、骨および軟骨の複合再生のためのインプラントとして使用されてもよく、コーティングされた側は、骨欠損側に向けられ、コーティングされていない側は、軟骨欠損側に向けられていてもよい。

したがって、本発明はさらに、バイオミメティックなコラーゲン−ヒドロキシアパタイト複合材料の膜成形体の、骨および軟骨の複合再生のためのインプラントとしての使用にも関する。

本発明はさらに、上記のバイオミメティックなコラーゲン−ヒドロキシアパタイト複合材料を調製するためのプロセスであって、該プロセスは、
ａ） 円偏光二色性分光法によって示されると、三重螺旋性を有する成熟天然コラーゲン繊維を含む、少なくとも部分的に繊維状のコラーゲン足場を、飽和Ｃａ^２＋／Ｈ_ｘＰＯ_４ ^{（３−ｘ）}の飽和水溶液に浸漬して、複合インプラント材料の形成プロセスを実施することにより、該成熟天然コラーゲン繊維上にエピタキシャル成長したヒドロキシアパタイトナノ結晶を形成するステップを含み、該エピタキシャル成長したナノ結晶は、ヒトの骨塩と同じ形態および同じサイズを有しており、該プロセスはさらに、
ｂ） 該水溶液から固形物を分離し、水洗し、乾燥させることによって、エピタキシャル成長したヒドロキシアパタイトナノ結晶の形成を停止するステップと、
ｃ） ステップｂ）により得られた、分離し、乾燥させた物質を任意に殺菌するステップとを含む、プロセスに関する。

少なくとも部分的に繊維状のコラーゲン足場は、一般的に、天然材料由来のコラーゲンマトリクス、または半人工もしくは人工コラーゲンマトリクスであり、これは、バイオミメティックな複合材料に所望の最終形状と適合した予備形状を有し、かつ、バイオミメティックな複合材料の所望の機械的特性に十分な架橋度を有する。必要に応じて、このコラーゲン足場の調製は、それに所望の予備形状を付与するステップと、十分な粘着力および靱性を付与する架橋ステップとを含む。

ステップａ）を実施する前に、少なくとも部分的に繊維状のコラーゲン足場は、一般的に、たとえばエタノール、イソプロパノールなどのアルコール、および、たとえばジエチルエーテルなどのエーテルで洗浄される。

飽和Ｃａ^２＋／Ｈ_ｘＰＯ_４ ^{（３−ｘ）}の飽和水溶液は、α―ＴＣＰ、β−ＴＣＰ、ＴＴＣＰ、リン酸八カルシウム五水和物、リン酸二カルシウムまたはリン酸二カルシウム二水和物が微細に分散したリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）であってもよい。このようなＰＢＳ溶液中のリン酸カルシウムの分散液は、Ｃａ^２＋イオンおよびＨ_ｘＰＯ_４ ^{（３−ｘ）}イオンが消費されてヒドロキシアパタイトを形成するとき、該溶液がＣａ^２＋／Ｈ_ｘＰＯ_４ ^{（３−ｘ）}に飽和状態のままとなることを可能にする。

飽和Ｃａ^２＋／Ｈ_ｘＰＯ_４ ^{（３−ｘ）}の飽和水溶液は、ヒドロキシアパタイトを形成する際のこれらのイオンの消費を補償するためにＣａ^２＋イオンおよびＨ_ｘＰＯ_４ ^{（３−ｘ）}イオンが加えられるリン酸緩衝溶液であってもよく、これは、たとえば、該イオンを含有する溶液を反応媒体中に滴加することによって行われる。

リン酸緩衝溶液は、一般的に、０．１〜１．０Ｍ、特に０．２〜０．８Ｍの濃度を有する。

飽和Ｃａ^２＋／Ｈ_ｘＰＯ_４ ^{（３−ｘ）}の飽和水溶液のｐＨは、通常、ステップａ）の間に、５．５〜９．０、好ましくは６．５〜８．０の範囲内のままとなる。

ステップａ）は、一般的に、２５〜４５℃、好ましくは３５〜４２℃の温度で実施される。

ステップａ）は、成熟天然コラーゲン繊維上に多量のヒドロキシアパタイト結晶をエピタキシャル成長させるなどのために十分な時間実施される。エピタキシャル成長は、実際に、熱力学的に有利であり、最も低いエネルギー構成が得られるが、確立されるのに時間がかかる。一般的に、このように十分な時間は、少なくとも約１２時間、好ましくは、少なくとも約２４時間である。

人体の骨形成条件に近いステップａ）の条件は、ヒトの骨塩と同じ形態および同じサイズを有するヒドロキシアパタイトナノ結晶のコラーゲン繊維上でのエピタキシャル成長を可能にする。

ステップａ）は、成熟天然コラーゲン繊維上に、少なくとも１つのヒドロキシアパタイトのナノ結晶層の閉じたコーティングが存在するように、少なくとも十分な時間実施される。この時間は、バイオミメティックなコラーゲン−ヒドロキシアパタイト材料に望ましい特性、特に、ナノ結晶層の所望の数、および、コラーゲン足場とナノ結晶ヒドロキシアパタイトのエピタキシャル成長した層とのｗ／ｗ比率に応じて選択される。

ステップｂ）において、エピタキシャル成長したヒドロキシアパタイトのナノ結晶の形成は、水溶液から固形物を分離し、水洗し、乾燥させることによって停止される。

一般的に、ステップｂ）により得られた、分離し、乾燥させた材料を殺菌する更なる任意のステップｃ）が実施される。

本発明のバイオミメティックなコラーゲン−ヒドロキシアパタイト複合材料は、次の表１によって示されるように、ヒドロキシアパタイトナノ結晶がヒトの骨塩と同じ形態および同じサイズを有することにより、低レベルの細胞毒性（以下の実施例４ｄ）を参照されたい）を有する骨形成細胞によってコロニー形成され易く、かつ、人体内で優れた骨伝導性および骨結合特性を示す。

以下の実施例は、発明の範囲を限定することなく本発明を例示する。
以下の説明は、次の図面を参照されるとよりよく理解されるであろう。

実施例１ 少なくとも部分的に繊維状のコラーゲン足場の調製
ａ） Bio-Gide（登録商標）由来の円柱形繊維状コラーゲン足場の調製
乾燥、圧密させた円柱形片の調製
超遠心ミルを用いて、Bio-Gide（登録商標）膜（ガイストリヒ・ファーマ・アーゲー、スイス）を微細に粉砕し、２．０ｍｍふるいでふるいにかけた。０．２ｇのふるい分けしたコラーゲンを５ｍｌの９９．９％エタノールに入れ、このコラーゲンの塊をピンセットで２４ウェルプレートの１つのウェルに入れ、２．０ｍｍ直径のテフロン（登録商標）シリンダで圧密した後、２．０ｍｍ直径のスエージ工具でウェルから抽出し、化学フード（chemistry hood）内で４時間乾燥させた。これらの操作を並行して６回実施し、乾燥、圧密させたコラーゲンの６つの円柱形片を得た。

乾燥、圧密させたコラーゲンの円柱形片の架橋
３．５７１ｍｌのＥＤＣ（１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド塩酸塩）エタノール溶液を１００ｍｌメスフラスコ内にピペットで移し、容積を９９．９％エタノールで最終的に１００ｍｌにした後、２００ｍｌ抽出フラスコ内に注ぎ入れ、これに上記で得た乾燥コラーゲンの６片を加えた。エタノールを乾燥器中真空下で１分間蒸発させた後、この乾燥器を大気圧に晒した。水平振とう器を用いて、混合物を１１０ｒｐｍで１０分間撹拌下で架橋させた。ＥＤＣ溶液を傾瀉し、コラーゲン円柱形片を２００ｍｌビーカー内に入れ、これに１００ｍｌのＰＢＳ（リン酸緩衝溶液）を加えて、真空下１分間で除去した。コラーゲン円柱形片を１００ｍｌのＰＢＳにより５０ｒｐｍで５分間撹拌下で洗浄し、このＰＢＳを真空下で蒸発させずに傾瀉した。このプロセスを２回繰返した。コラーゲン円柱形片を１００ｍｌの９９．９％エタノールにより５０ｒｐｍで５分間撹拌下で洗浄し、このエタノールを真空下で蒸発させずに傾瀉し、このプロセスを２回繰返した。コラーゲン円柱形片を撹拌なしで１００ｍｌのジエチルエーテルにより洗浄し、化学フード内で１４時間乾燥させた。

架橋反応について、他の実験を異なる時間（２４０分まで）で実施した。
倍率５０００倍のＳＥＭ（走査電子顕微鏡法）顕微鏡写真上でソフトウェアPhenom Pro（オランダ、ディレンバルグ通り９Ｅ、５６５２ ＡＭ アイントホーフェン（Dillenburgstraat 9E, 5652 AM Eindhoven）、フェノムワールド社（Phenom World）より市販のFEI Phenom Pro Tabletop SEM S/N: 0342; Phenom Pro Suite V. 1.1.0.920; Phenom Application System PW-220-001; Phenom Fribremetric PW-210-001）を使用した画像分析によって決定された、円柱形コラーゲン足場の（円偏光二色性分光法によって示される）三重螺旋性を有する成熟天然コラーゲン繊維の％は、約９０％であった。

ｂ）Ｉ型およびＩＩ型コラーゲンのスポンジ由来の、円柱形の部分的に繊維状のスポンジ状コラーゲン足場の調製
コラーゲンスポンジの調製：
ＥＰ−Ｂ１−８１０８８８の実施例１に記載されるように、再吸収可能な細胞外スポンジ状コラーゲンマトリクスを、新たに屠殺したブタの凍結した軟骨から、脱脂後、塩基処理および酸処理を行うことによって調製した。該マトリクスは、免疫学法によって、Ｉ型およびＩＩ型コラーゲンの混合物を含有することが示された。

乾燥、圧密させたスポンジ状コラーゲンの円柱形片の調製
超遠心ミルを用いて、スポンジ状マトリクスを微細に粉砕し、２．０ｍｍふるいでふるいにかけた。０．２ｇのふるい分けしたコラーゲンを５ｍｌの９９．９％エタノールに入れ、このコラーゲン塊をピンセットで２４ウェルプレートの１つのウェルに入れ、２．０ｍｍ直径のテフロンシリンダで圧密した後、２．０ｍｍ直径のスエージ工具でウェルから抽出し、化学フード内で４時間乾燥させた。

乾燥、圧密させたスポンジ状コラーゲンの円柱形片の架橋
上記で得られた乾燥、圧密させたスポンジ状コラーゲンの円柱形片を、繊維状円柱形コラーゲン足場ついてａ）で上に説明した手順と同様に、ＥＤＣにより架橋させ、ＰＢＳ、エタノールおよびジエチルエーテルにより洗浄した。倍率５０００倍のＳＥＭ顕微鏡写真上で画像分析ソフトウェアPhenom Proによって決定された、円柱形の部分的に繊維状のスポンジ状コラーゲン足場において三重螺旋性を有する成熟天然繊維の％は、約５％であった。

ｃ）Bio-Gide（登録商標）由来の膜型繊維状コラーゲン足場の調製
Bio-Gide（登録商標）膜（ガイストリヒ・ファーマ・アーゲー、スイス）を１００ｍｌの９９．９％エタノールにより５０ｒｐｍで５分間撹拌下で洗浄し、このエタノールを真空下で蒸発させずに傾瀉し、このプロセスを２回繰返した。その後、コラーゲン膜を撹拌なしで１００ｍｌのジエチルエーテルにより洗浄し、化学フード内で１４時間乾燥させた。

倍率５０００倍のＳＥＭ顕微鏡写真上で画像分析ソフトウェアPhenom Proによって決定された、繊維状側における三重螺旋性を有する成熟天然繊維の％は、約１００％であった。

実施例２ α−ＴＣＰのバルク焼結材料の調製
５００ｇ（乾燥重量）の混合物のために、３６０ｇの無水リン酸二カルシウム粉末、１４４ｇの炭酸カルシウム粉末および２２０ｍｌの脱イオン水を、実験用撹拌器を用いて５００ｒｐｍで７分間混合した。この混合プロセスによるスラリーを直ちに高温で安定な白金カップに移した。満杯の白金カップを冷えた炉に配置した。毎時６０℃の加熱率を用いることによって炉を１４００℃に加熱した。加熱プロセスは、炉のスイッチを切ることによって７２時間後に停止させた。試料を炉内で室温に冷却した。バルク焼結材料（純相α−Ｃａ_３（ＰＯ_４）_２）を炉および白金カップから取り出した。焼結プロセスによるバルク生成物は、４２０ｇの重量（１６．７％の重量損失）を有していた。

相純度の制御は、粉末Ｘ線回折分析を用いて行った。

実施例３ α−ＴＣＰの微粒子の分散液の存在下でのＰＢＳ溶液中のナノ結晶ヒドロキシアパタイトのエピタキシャル成長した結晶による繊維状コラーゲン足場のコーティング
ａ）実施例１ａ）で得られた繊維状コラーゲンの円柱形片のコーティング
０．５Ｍ ＰＢＳ溶液の調製：３０分間２５０ｒｐｍおよび４時間６００ｒｐｍで撹拌下、室温で６．９ｇのＮａＨ_２ＰＯ_４・Ｈ_２Ｏを無菌脱イオン水に溶解することによって、１００ｍｌの０．５Ｍ ＮａＨ_２ＰＯ_４・Ｈ_２Ｏ溶液（溶液Ａ）を調製した。３０分間２５０ｒｐｍおよび４時間６００ｒｐｍで撹拌下、室温で８．９ｇのＮａ_２ＨＰＯ_４・２Ｈ_２Ｏを無菌脱イオン水に溶解することによって、１００ｍｌの０．５Ｍ Ｎａ_２ＨＰＯ_４・２Ｈ_２Ｏ溶液（溶液Ｂ）を調製した。

１９ｍｌの溶液Ａを８１ｍｌの溶液Ｂと混合して、７．３〜７．４のｐＨを有する０．５Ｍ ＰＢＳ溶液を得た。

α−ＴＣＰの微粒子への破砕：実施例２によるバルク生成物をジョークラッシャ（スロットサイズ４ｍｍ）を用いることによって破砕した。粗い顆粒は、２ｍｍおよび０．２５ｍｍの網目開口を有するふるい分け機およびふるいインサートを用いることによってふるいにかけた。ふるいにかけた顆粒を１０μｍ未満の最終径まで遊星ミルを用いてさらに粉砕した。

実施例１ａ）で得られた繊維状コラーゲン円柱形片の、ナノ結晶ヒドロキシアパタイトのエピタキシャル成長した結晶によるコーティング
上記のように得られた５ｇのα−ＴＣＰの微粒子および１００ｍｌの０．５Ｍ ＰＢＳ溶液と、実施例１ａ）で得られた繊維状コラーゲン円柱形片とをガラス秤量瓶に加え、これを５分間真空下で乾燥器内に配置し、その後大気圧に晒した。コーティング反応は、サーモスタット室において５〜５０ｒｐｍで作動された水平振とう器上に上記瓶を配置することによって、３日間３７℃の撹拌下で実施された。

目視観測により、コラーゲン足場は円柱形状を保持しているが、白色結晶物質によって被覆されていることがわかった。

実施例１ａ）で得られた繊維状コラーゲン円柱形片のコーティングの他の実験
ａ）の終わりに実施例１で得られた繊維状コラーゲン円柱形片のコーティングの他の実験は、ＰＢＳ溶液の濃度を０．２Ｍ〜０．８Ｍに変えて、コーティング反応時間を１２時間〜４日に変えて実施した。

目視観測により、コラーゲン足場は円柱形状を保持しているが、白色結晶物質によって被覆されていることがわかった。

ＳＥＭ分析により、ヒドロキシアパタイト結晶集合体の結晶成長ならびにサイズ、形態および形質は、ＰＢＳ溶液の濃度およびコーティング反応時間を変えることによって制御され得ることがわかった。

上記の実験において、コーティングされた繊維状コラーゲン円柱形片における繊維状コラーゲン足場とナノ結晶ヒドロキシアパタイトのエピタキシャル成長した結晶とのｗ／ｗ比率は、９０／１０〜３０／７０であった。

ｂ）実施例１）ｂ）において得られた円柱形の部分的に繊維状のスポンジ状コラーゲン足場および実施例１ｃ）において得られた膜型繊維状コラーゲン足場の、ナノ結晶ヒドロキシアパタイトのエピタキシャル成長した結晶によるコーティング
実施例１）ｂ）において得られた円柱形の部分的に繊維状のコラーゲンスポンジ円柱形片のコーティング、または実施例１ｃ）の膜型繊維状コラーゲン足場の繊維状側のコーティングの実験は、ＰＢＳ溶液の濃度を０．２Ｍ〜０．８Ｍに変えて、コーティング反応時間を１２時間〜４日に変えて実施した。

目視観測により、コラーゲン足場はその形状を保持しているが、白色結晶物質によって被覆されていることがわかった。

ＳＥＭ分析により、ヒドロキシアパタイト結晶集合体の結晶成長ならびにサイズ、形態および形質は、ＰＢＳ溶液の濃度およびコーティング反応時間を変えることによって制御され得ることがわかった。

上記の実験において、実施例１）ｂ）において得られたコーティングされた部分的に繊維状のコラーゲンスポンジ円柱形片については、繊維状コラーゲン足場とナノ結晶ヒドロキシアパタイトのエピタキシャル成長した結晶とのｗ／ｗ比率は、９０／１０〜３０／７０であり、コーティングされた膜型コラーゲン足場については、９０／１０〜５０／５０であった。

実施例４ ナノ結晶ヒドロキシアパタイトのエピタキシャル成長した結晶によってコーティングされた少なくとも部分的に繊維状のコラーゲン足場の特性
ａ）物理化学的特性：
測定された孔隙率（細孔容積）は、（架橋条件を変えて）実施例１ａ）で得られた繊維状コラーゲンの円柱形片については９６ｖ／ｖ％であり、実施例３）ａ）で得られたヒドロキシアパタイトによってコーティングされた円柱形片については８５〜９５ｖ／ｖ％であった。

水銀ポロシメトリによって測定された比表面積は、（架橋条件を変えて）実施例１ａ）で得られた繊維状コラーゲンの円柱形片については１．５〜２．５ｍ^２／ｇであり、実施例３）ａ）で得られたヒドロキシアパタイトによってコーティングされた円柱形片については２０〜６０ｍ^２／ｇであった。

測定された孔隙率（細孔容積）は、実施例１ｂ）で調製されたコラーゲンスポンジ円柱形足場については約９６ｖ／ｖ％であり、実施例３ｂ）で得られたヒドロキシアパタイトによってコーティングされたコラーゲンスポンジ円柱形片については８８〜９２％であった。

水銀ポロシメトリによって測定された比表面積は、実施例１ｂ）で調製されたコラーゲンスポンジ円柱形足場については２ｍ^２／ｇであり、実施例３ｂ）で得られたコーティングされたコラーゲンスポンジ円柱形片については２５〜５０ｍ^２／ｇであった。

ｂ）機械的特性：
ｂ１）圧縮強度
圧縮強度（耐圧性）、すなわち、円柱形片が元の高さの５０％まで圧縮するのに加えられる最大圧力を、機械的圧縮試験機（Zwick/Roell社により製造されたProline Z010）を用いて測定した。

湿潤状態で測定した圧縮強度は、（架橋条件を変えて）実施例１ａ）で得られた繊維状コラーゲンの円柱形片については０．３〜０．７ＭＰａであり、実施例３ｂ）で得られたヒドロキシアパタイトによってコーティングされた円柱形片については１．１〜３．５Ｍｐａであり、圧縮強度は、ヒドロキシアパタイトによってコーティングされた円柱形片において存在するヒドロキシアパタイトの％とともに増加した。

ｂ２）弾性
弾性、すなわち、元の高さが圧縮後に５０％または元の高さに回復した％を、機械的圧縮試験機（Zwick/Roell社により製造されたProline Z010）を用いて測定した。

湿潤状態で測定した弾性は、（架橋条件を変えて）実施例１ａ）で得られた繊維状コラーゲンの円柱形片については９５〜９９％であり、実施例３）ａ）得られたヒドロキシアパタイトによってコーティングされた円柱形片については９２〜１００％であり、ヒドロキシアパタイトによってコーティングされた片において存在するヒドロキシアパタイトの％は、弾性には影響がないと考えられた。

ｂ３）耐トルク性
Straumann（登録商標）骨ブロック固定法（http://www.straumann.ch/ch-index/products/products-biologics/products-bone-block-fixation.htmを参照されたい）と類似のプロトコルを使用した。

簡潔に述べると、ドリルを用いて、（ブタの下顎骨と同等の機械的特性を有する）テフロンシリンダ、ならびに、（架橋条件を変えて）実施例１ａ）で得られた繊維状コラーゲンの乾燥させた円柱形片の一部、および実施例３）ａ）、２で得られた乾燥させたヒドロキシアパタイトによってコーティングされた円柱形片の一部に０．９ｍｍ孔を開け、さらに、１．５×１２ｍｍねじを含む磁気スクリュードライバ（メディコン社（Medicon）より市販のKlinge fTi Mikro Schr Kreuzschl, Ref.75.23.19）を用いて、円柱形片が破断せずにテフロンシリンダにねじ込まれ得る最大トルクを測定した。

試験された、実施例１ａで得られた繊維状コラーゲンのコーティングされていない円柱形片はすべて、約２０Ｎｃｍの耐トルク性を示しており、一方、試験された、実施例３）ａ）で得られたヒドロキシアパタイトによってコーティングされた円柱形片はすべて、約６０Ｎｃｍを超える耐トルク性を示しており、ヒドロキシアパタイトによってコーティングされた片において存在するヒドロキシアパタイトの％は、耐トルク性には影響がないと考えられた。一般的に、当該技術分野においては、約３０Ｎｃｍの耐トルク性が、身体の骨部分に片をねじ込むために十分であるとみなされる。

耐トルク性の劇的な増加は、ヒドロキシアパタイトとコラーゲン足場との強いエピタキシャル結合によるものである。

実際に、先行技術の条件に従ってヒドロキシアパタイトをコラーゲン足場上または内部に沈殿させたため、コラーゲン足場に吸着によって弱く結合している架橋コラーゲン足場に対して実施された比較実験においては、耐トルク性は、さほど増加しなかった。

ｃ）ＳＥＭによって決定されたヒドロキシアパタイト結晶集合体形態
図１および図２は、１２時間のコーティング反応時間にわたって０．２ＭのＰＢＳ濃度、および２４時間のコーティング時間にわたって０．８Ｍのコラーゲンで、実施例３ｂ）に記載されるようにコーティングされた実施例１ｃ）の膜型コラーゲン足場の線維状側のＳＥＭ顕微鏡写真を示す図である。

図１では、コラーゲンフィブリルと緻密に相互結合された六方晶系対称を有するナノサイズの板状結晶が微細に分布した小さなヒドロキシアパタイト結晶集合体を観測することができ、図２では、コラーゲン繊維構造を完全に被覆している六方晶系ヒドロキシアパタイト結晶集合体の小さなミクロンサイズのロゼット様凝集体を観測することができる。

ｄ）骨形成細胞によるコロニー形成のアッセイ
ヒトＭＧ６３骨芽細胞様細胞は、実施例３ｂ）で得られたコーティングされた膜型コラーゲン足場の全部位において、高い増殖率でコロニー形成することがわかった。図３を参照されたい。

細胞毒性試験においては、実施例３ｂ）で得られたコーティングされた膜型コラーゲン足場は、Bio-Gide（登録商標）膜により得られた結果と同等の結果を示した。

本発明は、新規のバイオミメティックなコラーゲン−ヒドロキシアパタイト複合材料に関し、該材料は、少なくとも部分的に繊維状のコラーゲン足場とヒドロキシアパタイトとを含み、該コラーゲン繊維は、ナノ結晶ヒドロキシアパタイトのエピタキシャル成長した結晶によって少なくとも部分的に被覆されており、本発明はさらに、該材料を調製するためのプロセスと、ヒト対象または動物における欠損部位での骨形成、骨再生、骨修復および／または骨置換をサポートするためのインプラントとしての該材料の使用、または、骨および軟骨の複合再生のためのインプラントとしての該材料の使用とに関する。

骨格の欠損は、外傷、疾患、および外科手術など、多種多様な状況下で生じる可能性があり、さまざまな外科分野において、骨欠損の効果的な修復が依然として必要とされている。骨欠損の部位における治癒を促すために、数多くの天然材料および合成材料ならびに組成物が使用されてきた。

歯周および顎顔面の骨欠損または整形外科分野の骨欠損における骨成長を促進する、周知の天然骨伝導性骨代用材料として、ガイストリヒ・ファーマ・アーゲー（Geistlich Pharma AG）より市販のGeistlich Bio-Oss（登録商標）またはGeistlich Orthossがそれぞれ挙げられる。このヒドロキシアパタイト系骨塩材料は、米国特許第５，１６７，９６１号に記載されるプロセスによって天然骨から製造されており、該プロセスは、天然骨の海綿構造およびナノ結晶構造を保持することができる。

しかしながら、ヒドロキシアパタイト系材料は、脆く、たとえば身体の骨部分上で、ねじ込み可能となるのに十分な機械的ストレスに対する耐性がないため、とりわけ整形外科において、大きな骨欠損を修復するのに必ずしも適合されていない。

したがって、とりわけ機械的ストレスに対する耐性の面で、天然骨に酷似するよう作製された合成または部分的に合成の骨移植材料の必要性がある。このようなバイオミメティックな合成または部分的に合成の骨移植材料は、特定の用途のため、とりわけ、大きな骨欠損を修復するために、天然骨由来の骨移植片の有用な代替物となるであろう。

天然骨は、水と、主にＩ型コラーゲンからなるコラーゲンマトリクスとからなる複合材料であり、Ｉ型コラーゲンは、ヒドロキシアパタイトを主成分とする無機結晶と密に結合している。コラーゲンＩ型繊維およびヒドロキシアパタイトは、天然骨の乾燥重量のおよそ２５〜３０ｗ／ｗ％および６５〜７０ｗ／ｗ％をそれぞれ占めている。コラーゲンマトリクスは、骨に柔軟性および弾性を付与し、無機材料は、骨に強度および剛性を付与しており、これらの二相の組織が、複合物の高度な弾力性および靱性を与えている。Weiner, S. et al.,1992,FASEB,6:879-885によって、オングストロームレベル（鉱物結晶）からミクロンレベル（ラメラ）までの骨構造の完全な論評が示されている。

天然骨の重要な特徴の一つは、ヒドロキシアパタイト結晶の形態およびその非常に小さいサイズであって、ヒトの骨塩の場合、六方晶系空間群Ｐ６_３／ｍ、長さ約３０〜５０ｎｍ（ｃ軸：［０，０，１］）、（ａおよびｂ軸：［１，０，０］および［０，１，０］）において１４〜２５ｎｍである。上記のWeiner S.et al.を参照されたい。

N.A.Barrios et al.は、"Density Functional Study of Binding of Glycine, Proline and Hydroxyproline to the Hydroxyapatite (0001) and

Surfaces", 2009, Langmuir 25(9), 5018-5025および"Molecular Dynamics Simulation of the Early Stages of Nucleation of Hydroxyapatite at a Collagen Template", Crystal Growth Design, 2012, 12, 756-763において、ヒトの体温では、ヒドロキシアパタイトのコーラゲン繊維への核形成および結合は、コラーゲンアミノ酸構成要素であるグリシン、プロリンおよびヒドロキシプロリンのさまざまな部位、すなわち、結晶面（０００１）および

上で行われ得、結晶面

上での結合が好ましいことを示している。このことは、人体において、コラーゲン繊維およびそのアミノ酸構成要素の構造は、ヒドロキシアパタイトの結晶構造に正確に対応する基質を与えることを証明しているため、骨形成は、エピタキシャル成長経路に従って、ヒドロキシアパタイト結晶とコラーゲン繊維とを相互結合させる。このエピタキシャル成長経路は、熱力学的に有利であり、最も低いエネルギー構成が得られる。

先行技術においては、天然骨に類似したコラーゲン−ヒドロキシアパタイト複合材料を提供するための試みがなされている。

米国特許第５，２３１，１６９号には、コラーゲンをリン酸カルシウム鉱物により石灰化する方法が記載されており、該方法は、１０〜１３の範囲のｐＨを有する塩基性水溶液中に分散されたコラーゲンフィブリルの分散液の存在下で、上記のリン酸カルシウム鉱物を調製することと、上記分散液に、少なくとも１時間かけて、上記リン酸鉱物を生成するために、可溶性カルシウムおよび可溶性リン酸の原料を正しい比率で加えることと、石灰化コラーゲンを回収することとを含む。このようにして、コラーゲンマトリクス中にリン酸カルシウムが安定して分散された石灰化コラーゲンが得られることが教示されている。

米国特許第５，７３９，２８６号には、天然骨に似通った骨増強材料を作製する方法が開示されており、該方法は、二重拡散チャンバ内で７日間かけてコラーゲン繊維を石灰化することによるものであり、該二重拡散チャンバにおいて、一方の貯留槽は、０．０５Ｍトリス緩衝液および０．１Ｍ塩化カルシウムを含有し、他方の貯留槽は、０．０５Ｍトリス緩衝液および０．１Ｍリン酸カリウムを含有する。リン酸カルシウム沈殿物がコラーゲン繊維上に形成されることが教示されており、石灰化コラーゲン繊維の走査型電子顕微鏡写真は、合成血漿中に浸漬された生体ガラス材料上に沈殿して存在するヒドロキシアパタイトの板状凝集体と形態的に類似している。

米国特許第６，３９５，０３６号および第６，５８９，５９０号には、コラーゲン膜に、膜の両側にカルシウムイオンの溶液およびリン酸イオンの溶液を与えることによって、人口骨を作製する方法が記載されており、これらのイオンは、膜を通って拡散し、出会い、コラーゲン膜内部でヒドロキシアパタイト材料として沈殿する。

米国特許第７，５１４，２４９号および第７，５４７，４４９号には、リン酸カルシウムにより石灰化されたバイオミメティックなコラーゲンスポンジを作製する方法が開示されており、該リン酸カルシウムは、６ｍＭ塩化カルシウムの溶液と、ポリ（αβ−ＤＬ−アスパラギン酸）およびポリ（ビニルホスホン酸）の両方の２００μｇ／ｍｌとを使用し、その後、リン酸二アンモニウムを蒸気拡散させることによって、コラーゲンフィブリルの間質空間内に埋め込まれる。

Ficai A. et al., 2010, Chemical Engineering 160, 794-800には、コラーゲンゲルおよびヒドロキシアパタイトの前駆物質から出発してコラーゲン−アパタイト複合材料を調製するプロセスが開示されており、該プロセスにおいては、ヒドロキシアパタイトの沈殿およびフィブリル形成を確実にするために、水酸化ナトリウム溶液を用いてｐＨが約９に調整される。このようにして、ヒドロキシアパタイトの結晶が「数ナノメートルから４０ｎｍまでのナノメートル範囲で」形成される。ヒドロキシアパタイトの核形成は、フィブリル形成の間に行われ、このフィブリル形成の間に、コラーゲン分子の自己集合化により、コラーゲンのアミノ酸構成要素の位置が変化する（したがって、ヒドロキシアパタイトの結晶構造に正確に対応しない）ため、ヒドロキシアパタイト結晶のエピタキシャル成長は一切あり得ない。該刊行物に述べられるように、該結晶は沈殿されている。

特許公報ＵＳ２００９／０２３２８７５号には、コラーゲンを含有する有機マトリクスからなる第１の上層と、ヒドロキシアパタイトおよびコラーゲンを含有する複合マトリクスからなる少なくとも１つの下層とを含む多層構造が記載されている（段落［０００１］）。該複合物は、ｐＨ９〜１１および３５〜４０℃の温度で、自己集合性のコラーゲンフィブリル上へのヒドロキシアパタイトの直接的な核形成プロセスによって得られ、結晶のサイズは、繊維軸に沿って１２〜１５ｎｍである（段落［００８２］および［００８９］）。上記のFicai et al.と同様に、ヒドロキシアパタイトの核形成は、コラーゲン分子の自己集合化の間に行われ（自己集合化により、コラーゲンのアミノ酸構成要素の位置が変化する）、さらに、この核形成には、「無機相の炭酸化、すなわち、ヒドロキシアパタイト格子におけるＣＯ_３ ^２−基の取り込みが行われ」（段落［００７７］、第２５行目〜第２８行目を参照されたい）、炭酸化ヒドロキシアパタイトは、異なる結晶構造を有する（空間群ＰｂまたはＰ２_１／ｂを有する単斜晶系結晶構造：Elliot J.C. 1994: Structure and Chemistry of the Apatites and Other Calcium Phosphates. Studies in inorganic Chemistry 18. Elsevier Science, ISBN 0-444-81582-1を参照されたい）ため、ヒドロキシアパタイト結晶のエピタキシャル成長は一切あり得ない。したがって、該結晶は、「コラーゲンフィブリル内に形成され、フィブリルに平行…ナノ核」上に、沈殿によって成長する（段落［００９０］を参照されたい）。

ＵＳ２０１０／００２１５５２（US-2010/0021552）には、石灰化されたフィブリル足場を含む生体材料インプラントが開示されており、該インプラントにおいては、「自己集合した天然コラーゲンフィブリル内のナノスケール空隙は、ミネラライト（mineralites）が容易に成長可能なサイズを限定し、コラーゲンフィブリルから離れて拡散しないようにミネラライトを捕捉」するが、唯一記載されているアパタイト（apatic）ミネラライトは、せいぜい約１ｎｍ×１０ｎｍ×１０ｎｍである（［００４４］、［００４５］、［０１０５］、［０１１３］）。

先行技術のコラーゲン−ヒドロキシアパタイト複合材料においては、ヒドロキシアパタイトは、コラーゲン足場の上または内部に沈殿されており、コラーゲン足場との結合は、たとえば吸着などによる、弱い物理的結合に過ぎない。このように弱い物理的結合は、ヒドロキシアパタイト結晶がコラーゲン繊維上にエピタキシャル成長した天然骨の弾力性、耐トルク性および靱性を材料に与えることが不可能である。

したがって、本発明の目的は、コラーゲン足場とヒドロキシアパタイト結晶との間に強い結合があるバイオミメティックなコラーゲン−ヒドロキシアパタイト複合物を提供することである。

先行技術のコラーゲン−ヒドロキシアパタイト複合材料では、ヒドロキシアパタイト結晶は、天然の骨塩、特にヒトの骨塩の形態（結晶面比率および格子定数）および非常に小さいサイズを有さない。

したがって、本発明の別の目的は、コラーゲン結晶がヒトの骨塩と同じ形態および同じサイズを有するバイオミメティックなコラーゲン−ヒドロキシアパタイト複合物を提供することである。

欧州特許第２′４４５′５４３号は、焼結されたα−ＴＣＰコア上でヒドロキシアパタイトのナノ結晶がエピタキシャル成長する条件を教示しており、該ナノ結晶は、ヒトの骨塩と同じ形態および同じサイズを有している。

上記の目的は、コラーゲン繊維上でヒドロキシアパタイトのナノ結晶をエピタキシャル成長させるための、欧州特許第２′４４５′５４３号に記載される条件を適合させることによって達成され得ることがわかっており、該ナノ結晶は、ヒトの骨塩と同じ形態および同じサイズを有している。

このようにして、コラーゲン足場とヒドロキシアパタイト結晶との強いエピタキシャル結合により、優れた機械的特性、とりわけ機械的ストレスに対する高い耐性、特に高い耐トルク性（少なくとも３０Ｎｃｍ、一般的に約６０Ｎｃｍ）を有するバイオミメティックなコラーゲン−ヒドロキシアパタイト複合材料が得られる。とりわけ、ヒドロキシアパタイト結晶がヒトの骨塩と同じ形態および同じサイズを有していることにより、この材料は、人体内に移植されると、骨形成細胞によってコロニー形成され易く、優れた骨伝導性および骨結合特性を示す。

上記の目的は、添付の請求項に規定される発明によって達成される。
したがって、本発明は、新規のバイオミメティックなコラーゲン−ヒドロキシアパタイト複合材料であって、該複合材料は、少なくとも部分的に繊維状のコラーゲン足場を含み、該コラーゲン足場は、円偏光二色性分光法によって示されると、三重螺旋性を有する成熟天然コラーゲン繊維を含み、該成熟天然コラーゲン繊維は、ナノ結晶ヒドロキシアパタイトのエピタキシャル成長した結晶によって少なくとも部分的に被覆されていることにより、該エピタキシャル成長したナノ結晶は、ヒトの骨塩と同じ形態およびヒトの骨塩と同じサイズ、すなわち、３０〜５０ｎｍの長さおよび１４〜２５ｎｍの幅を有する、バイオミメティックなコラーゲン−ヒドロキシアパタイト複合材料に関する。

本発明のバイオミメティックなコラーゲン−ヒドロキシアパタイト複合材料の利点
コラーゲン足場とヒドロキシアパタイトナノ結晶との、天然骨のように強いエピタキシャル結合により、本発明の合成または部分的に合成のバイオミメティックなコラーゲン−ヒドロキシアパタイト複合材料は、優れた機械的特性、とりわけ機械的ストレスに対する高い耐性、特に高い耐トルク性（少なくとも３０Ｎｃｍ、一般的に約６０Ｎｃｍ）、高い圧縮強度および高い弾性を有している。その優れた機械的特性により、本発明のバイオミメティックなコラーゲン−ヒドロキシアパタイト複合材料の成形体は、とりわけ身体の骨部分上で、ねじ込み可能であるとともに、機械的ストレス下で体積を永続的に保つ。このため、大きな骨欠損を修復するのに理想的に適合されている。

１２時間のコーティング反応時間にわたって０．２ＭのＰＢＳ濃度で、実施例３ｂ）に記載されるようにコーティングされた実施例１ｃ）の膜型コラーゲン足場の繊維状側のＳＥＭ顕微鏡写真を示す図である。 ２４時間のコーティング反応時間にわたって０．８ＭのＰＢＳ濃度で、実施例３ｂ）に記載されるようにコーティングされた実施例１ｃ）の膜型コラーゲン足場の繊維状側のＳＥＭ顕微鏡写真を示す図である。 ＭＧ６３骨芽細胞様細胞でコロニー形成された、実施例３ｂ）に記載されるようにコーティングされた実施例１ｃ）の膜型コラーゲン足場の繊維状側のＳＥＭ顕微鏡写真を示す図である。

「ヒトの骨塩と同じ形態」とは、（結晶の外形を決定する）結晶面の寸法関係がヒトの骨塩と同じであることを意味する。ヒトの骨塩では、結晶は、一般的に六方晶系板状結晶である。

上記のN.A. Barrios et al.の刊行物によって示されるように、コラーゲン上でのヒドロキシアパタイトのエピタキシャル成長は、コラーゲンの繊維上でしか生じ得ない。このような繊維は、成熟天然コラーゲン繊維である必要があり、すなわち、（ａ）コラーゲン構成要素の自己集合によってフィブリルが集合している、（ｂ）アルファ１鎖およびアルファ２鎖が形成されている、（ｃ）２つのアルファ１鎖と１つのアルファ２鎖との自然架橋によって三重螺旋が形成されている、コラーゲン繊維である必要がある。このような成熟天然コラーゲン繊維は、円偏光二色性分光法によって示されると、三重螺旋性を有している。成熟天然コラーゲン繊維上では、コラーゲン構成要素であるグリシン、プロリンおよびヒドロキシプロリンのそれぞれの位置が、ヒドロキシアパタイトの構造に正確に対応して固定されているため、ヒドロキシアパタイトと成熟天然コラーゲン繊維とのエピタキシャル相互結合が可能になる。フィブリルが自己集合中である、アルファ１鎖およびアルファ２鎖が形成中である、または三重螺旋が形成中である形成中の繊維は、ヒドロキシアパタイトのエピタキシャル成長に適切ではない。実際に、このような形成中の繊維においては、コラーゲンの構成要素の位置が変化するため、ヒドロキシアパタイトの結晶構造に正確に対応していない。

このため、コラーゲン足場が、その外面上で少なくとも部分的に繊維状であり、円偏光二色性分光法によって示されると、三重螺旋性を有する成熟天然コラーゲン繊維を含むことが必要である。

少なくとも部分的に繊維状のコラーゲン足場は、一般的に、ＳＥＭ顕微鏡写真上の画像分析および円偏光二色性分光法によって決定されると、その外面に、少なくとも２％の成熟天然コラーゲン繊維、好ましくは、少なくとも５％の成熟天然コラーゲン繊維、より好ましくは、少なくとも１０％の成熟天然コラーゲン繊維を含む。

少なくとも部分的に繊維状のコラーゲン足場は、一般的に、Ｉ型コラーゲンからなるが、他の型のコラーゲン、とりわけＩＩ型およびＩＩＩ型コラーゲンをさらに含んでいてもよい。

少なくとも部分的に繊維状のコラーゲン足場は、一般的に、天然材料由来のコラーゲンマトリクス、または半人工もしくは人工コラーゲンマトリクスであり、該半人工もしくは人工コラーゲンマトリクスは、たとえば、コラーゲン粒子の懸濁液または可溶性コラーゲンの溶液からエレクトロスピニングによって調製され、該コラーゲンは、天然材料由来または組換えコラーゲンである。

ナノ結晶ヒドロキシアパタイトのエピタキシャル成長した結晶は、通常、Ｘ線回折分析によって決定されると、少なくとも３０±１５ｎｍの厚さを有する層を形成する。少なくとも３０±１５ｎｍの厚さは、エピタキシャル配向のヒドロキシアパタイトナノ結晶の１つの層に相当する。

ナノ結晶ヒドロキシアパタイトのエピタキシャル成長した層は、コラーゲン繊維基質へのエピタキシャル配向のヒドロキシアパタイトナノ結晶の単層または複数層を含んでいてもよい。ナノ結晶ヒドロキシアパタイトのエピタキシャル成長した層の厚さは、このようなエピタキシャル配向のヒドロキシアパタイトナノ結晶の層の数に関連するが、人体内のインプラントとしての骨代用材料の意図される用途に応じて選択される。

ナノ結晶ヒドロキシアパタイトのエピタキシャル成長した層の厚さは、繊維状コラーゲン足場とナノ結晶ヒドロキシアパタイトのエピタキシャル成長した結晶とのｗ／ｗ比率に関連し、上記比率は、一般的に、５：９５〜９５：５、好ましくは、１０：９０〜９０：１０、より好ましくは、２０：８０〜６０：４０、特に、３０：７０〜７０：３０である。

バイオミメティックなコラーゲン−ヒドロキシアパタイト複合材料は、粒子状または顆粒状であってもよく、粒子または顆粒は、所望のサイズおよび形状を有し得る。一般的に、粒子または顆粒は、ほぼ球形であり、２０〜５０００μｍの直径を有する。

バイオミメティックなコラーゲン−ヒドロキシアパタイト複合材料は、任意の形状、たとえば、立方体または直方体ブロック、平板、円柱、テーパキー、釘、ねじ、ピン、または、とりわけ腰、鎖骨、肋骨、下顎骨、頭蓋骨部分などの身体の骨部分の輪郭を有する構造の成形体であってもよい。このような成形体は、たとえば身体の骨部分上で、ねじ込み可能となるのに十分な耐トルク性、すなわち、乾燥状態で少なくとも３０Ｎｃｍの耐トルク性、好ましくは、乾燥状態で少なくとも５０Ｎｃｍの耐トルク性を有していてもよい。

バイオミメティックなコラーゲン−ヒドロキシアパタイト複合材料は、膜成形体であってもよい。

膜成形体に好適なコラーゲン足場としては、ＥＰ−Ｂ１−１６７６５９２に記載されるプロセスに従って製造されるBio-Gide（登録商標）膜（ガイストリヒ・ファーマ・アーゲー、スイス）が挙げられ、これは、骨形成細胞の内殖を可能にする繊維状側と、非骨形成細胞の内殖に対するバリアとして作用する平滑側とを有している。このような膜は、一般的に、繊維状側のみがエピタキシャル成長したヒドロキシアパタイトナノ結晶によってコーティングされているため、繊維状側に骨形成に非常に有利な条件が与えられている。

本発明のバイオミメティックなコラーゲン−ヒドロキシアパタイト複合材料は、ヒト対象または動物における骨欠損部位、とりわけ大きな骨欠損部位での骨形成、骨再生、骨修復および／または骨置換のためのインプラントまたはプロテーゼとして使用され得る。

したがって、本発明はさらに、
バイオミメティックなコラーゲン−ヒドロキシアパタイト複合材料の、ヒト対象または動物における欠損部位での骨形成、骨再生、骨修復および／または骨置換のためのインプラントまたはプロテーゼとしての使用と、
バイオミメティックなコラーゲン−ヒドロキシアパタイト複合材料を移植することによる、ヒト対象または動物における欠損部位での骨形成、骨再生、および／または骨修復を促進する方法とに関する。

一方側のみがエピタキシャル成長したヒドロキシアパタイトナノ結晶によってコーティングされた本発明のバイオミメティックなコラーゲン−ヒドロキシアパタイト複合材料の膜成形体は、骨および軟骨の複合再生のためのインプラントとして使用されてもよく、コーティングされた側は、骨欠損側に向けられ、コーティングされていない側は、軟骨欠損側に向けられていてもよい。

したがって、本発明はさらに、バイオミメティックなコラーゲン−ヒドロキシアパタイト複合材料の膜成形体の、骨および軟骨の複合再生のためのインプラントとしての使用にも関する。

本発明はさらに、上記のバイオミメティックなコラーゲン−ヒドロキシアパタイト複合材料を調製するためのプロセスであって、該プロセスは、
ａ） 円偏光二色性分光法によって示されると、三重螺旋性を有する成熟天然コラーゲン繊維を含む、少なくとも部分的に繊維状のコラーゲン足場を、飽和Ｃａ^２＋／Ｈ_ｘＰＯ_４ ^{（３−ｘ）}の飽和水溶液に浸漬して、複合インプラント材料の形成プロセスを実施することにより、該成熟天然コラーゲン繊維上にエピタキシャル成長したヒドロキシアパタイトナノ結晶を形成するステップを含み、該エピタキシャル成長したナノ結晶は、ヒトの骨塩と同じ形態および同じサイズを有しており、該プロセスはさらに、
ｂ） 該水溶液から固形物を分離し、水洗し、乾燥させることによって、エピタキシャル成長したヒドロキシアパタイトナノ結晶の形成を停止するステップと、
ｃ） ステップｂ）により得られた、分離し、乾燥させた物質を任意に殺菌するステップとを含む、プロセスに関する。

少なくとも部分的に繊維状のコラーゲン足場は、一般的に、天然材料由来のコラーゲンマトリクス、または半人工もしくは人工コラーゲンマトリクスであり、これは、バイオミメティックな複合材料に所望の最終形状と適合した予備形状を有し、かつ、バイオミメティックな複合材料の所望の機械的特性に十分な架橋度を有する。必要に応じて、このコラーゲン足場の調製は、それに所望の予備形状を付与するステップと、十分な粘着力および靱性を付与する架橋ステップとを含む。

ステップａ）を実施する前に、少なくとも部分的に繊維状のコラーゲン足場は、一般的に、たとえばエタノール、イソプロパノールなどのアルコール、および、たとえばジエチルエーテルなどのエーテルで洗浄される。

飽和Ｃａ^２＋／Ｈ_ｘＰＯ_４ ^{（３−ｘ）}の飽和水溶液は、α―ＴＣＰ、β−ＴＣＰ、ＴＴＣＰ、リン酸八カルシウム五水和物、リン酸二カルシウムまたはリン酸二カルシウム二水和物が微細に分散したリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）であってもよい。このようなＰＢＳ溶液中のリン酸カルシウムの分散液は、Ｃａ^２＋イオンおよびＨ_ｘＰＯ_４ ^{（３−ｘ）}イオンが消費されてヒドロキシアパタイトを形成するとき、該溶液がＣａ^２＋／Ｈ_ｘＰＯ_４ ^{（３−ｘ）}に飽和状態のままとなることを可能にする。

飽和Ｃａ^２＋／Ｈ_ｘＰＯ_４ ^{（３−ｘ）}の飽和水溶液は、ヒドロキシアパタイトを形成する際のこれらのイオンの消費を補償するためにＣａ^２＋イオンおよびＨ_ｘＰＯ_４ ^{（３−ｘ）}イオンが加えられるリン酸緩衝溶液であってもよく、これは、たとえば、該イオンを含有する溶液を反応媒体中に滴加することによって行われる。

リン酸緩衝溶液は、一般的に、０．１〜１．０Ｍ、特に０．２〜０．８Ｍの濃度を有する。

飽和Ｃａ^２＋／Ｈ_ｘＰＯ_４ ^{（３−ｘ）}の飽和水溶液のｐＨは、通常、ステップａ）の間に、５．５〜９．０、好ましくは６．５〜８．０の範囲内のままとなる。

ステップａ）は、一般的に、２５〜４５℃、好ましくは３５〜４２℃の温度で実施される。

ステップａ）は、成熟天然コラーゲン繊維上に多量のヒドロキシアパタイト結晶をエピタキシャル成長させるなどのために十分な時間実施される。エピタキシャル成長は、実際に、熱力学的に有利であり、最も低いエネルギー構成が得られるが、確立されるのに時間がかかる。一般的に、このように十分な時間は、少なくとも約１２時間、好ましくは、少なくとも約２４時間である。

人体の骨形成条件に近いステップａ）の条件は、ヒトの骨塩と同じ形態および同じサイズを有するヒドロキシアパタイトナノ結晶のコラーゲン繊維上でのエピタキシャル成長を可能にする。

ステップａ）は、成熟天然コラーゲン繊維上に、少なくとも１つのヒドロキシアパタイトのナノ結晶層の閉じたコーティングが存在するように、少なくとも十分な時間実施される。この時間は、バイオミメティックなコラーゲン−ヒドロキシアパタイト材料に望ましい特性、特に、ナノ結晶層の所望の数、および、コラーゲン足場とナノ結晶ヒドロキシアパタイトのエピタキシャル成長した層とのｗ／ｗ比率に応じて選択される。

ステップｂ）において、エピタキシャル成長したヒドロキシアパタイトのナノ結晶の形成は、水溶液から固形物を分離し、水洗し、乾燥させることによって停止される。

一般的に、ステップｂ）により得られた、分離し、乾燥させた材料を殺菌する更なる任意のステップｃ）が実施される。

本発明のバイオミメティックなコラーゲン−ヒドロキシアパタイト複合材料は、次の表１によって示されるように、ヒドロキシアパタイトナノ結晶がヒトの骨塩と同じ形態および同じサイズを有することにより、低レベルの細胞毒性（以下の実施例４ｄ）を参照されたい）を有する骨形成細胞によってコロニー形成され易く、かつ、人体内で優れた骨伝導性および骨結合特性を示す。

以下の実施例は、発明の範囲を限定することなく本発明を例示する。
以下の説明は、次の図面を参照されるとよりよく理解されるであろう。

実施例１ 少なくとも部分的に繊維状のコラーゲン足場の調製
ａ） Bio-Gide（登録商標）由来の円柱形繊維状コラーゲン足場の調製
乾燥、圧密させた円柱形片の調製
超遠心ミルを用いて、Bio-Gide（登録商標）膜（ガイストリヒ・ファーマ・アーゲー、スイス）を微細に粉砕し、２．０ｍｍふるいでふるいにかけた。０．２ｇのふるい分けしたコラーゲンを５ｍｌの９９．９％エタノールに入れ、このコラーゲンの塊をピンセットで２４ウェルプレートの１つのウェルに入れ、２．０ｍｍ直径のテフロン（登録商標）シリンダで圧密した後、２．０ｍｍ直径のスエージ工具でウェルから抽出し、化学フード（chemistry hood）内で４時間乾燥させた。これらの操作を並行して６回実施し、乾燥、圧密させたコラーゲンの６つの円柱形片を得た。

乾燥、圧密させたコラーゲンの円柱形片の架橋
３．５７１ｍｌのＥＤＣ（１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド塩酸塩）エタノール溶液を１００ｍｌメスフラスコ内にピペットで移し、容積を９９．９％エタノールで最終的に１００ｍｌにした後、２００ｍｌ抽出フラスコ内に注ぎ入れ、これに上記で得た乾燥コラーゲンの６片を加えた。エタノールを乾燥器中真空下で１分間蒸発させた後、この乾燥器を大気圧に晒した。水平振とう器を用いて、混合物を１１０ｒｐｍで１０分間撹拌下で架橋させた。ＥＤＣ溶液を傾瀉し、コラーゲン円柱形片を２００ｍｌビーカー内に入れ、これに１００ｍｌのＰＢＳ（リン酸緩衝溶液）を加えて、真空下１分間で除去した。コラーゲン円柱形片を１００ｍｌのＰＢＳにより５０ｒｐｍで５分間撹拌下で洗浄し、このＰＢＳを真空下で蒸発させずに傾瀉した。このプロセスを２回繰返した。コラーゲン円柱形片を１００ｍｌの９９．９％エタノールにより５０ｒｐｍで５分間撹拌下で洗浄し、このエタノールを真空下で蒸発させずに傾瀉し、このプロセスを２回繰返した。コラーゲン円柱形片を撹拌なしで１００ｍｌのジエチルエーテルにより洗浄し、化学フード内で１４時間乾燥させた。

架橋反応について、他の実験を異なる時間（２４０分まで）で実施した。
倍率５０００倍のＳＥＭ（走査電子顕微鏡法）顕微鏡写真上でソフトウェアPhenom Pro（オランダ、ディレンバルグ通り９Ｅ、５６５２ ＡＭ アイントホーフェン（Dillenburgstraat 9E, 5652 AM Eindhoven）、フェノムワールド社（Phenom World）より市販のFEI Phenom Pro Tabletop SEM S/N: 0342; Phenom Pro Suite V. 1.1.0.920; Phenom Application System PW-220-001; Phenom Fribremetric PW-210-001）を使用した画像分析によって決定された、円柱形コラーゲン足場の（円偏光二色性分光法によって示される）三重螺旋性を有する成熟天然コラーゲン繊維の％は、約９０％であった。

ｂ）Ｉ型およびＩＩ型コラーゲンのスポンジ由来の、円柱形の部分的に繊維状のスポンジ状コラーゲン足場の調製
コラーゲンスポンジの調製：
ＥＰ−Ｂ１−８１０８８８の実施例１に記載されるように、再吸収可能な細胞外スポンジ状コラーゲンマトリクスを、新たに屠殺したブタの凍結した軟骨から、脱脂後、塩基処理および酸処理を行うことによって調製した。該マトリクスは、免疫学法によって、Ｉ型およびＩＩ型コラーゲンの混合物を含有することが示された。

乾燥、圧密させたスポンジ状コラーゲンの円柱形片の調製
超遠心ミルを用いて、スポンジ状マトリクスを微細に粉砕し、２．０ｍｍふるいでふるいにかけた。０．２ｇのふるい分けしたコラーゲンを５ｍｌの９９．９％エタノールに入れ、このコラーゲン塊をピンセットで２４ウェルプレートの１つのウェルに入れ、２．０ｍｍ直径のテフロンシリンダで圧密した後、２．０ｍｍ直径のスエージ工具でウェルから抽出し、化学フード内で４時間乾燥させた。

乾燥、圧密させたスポンジ状コラーゲンの円柱形片の架橋
上記で得られた乾燥、圧密させたスポンジ状コラーゲンの円柱形片を、繊維状円柱形コラーゲン足場ついてａ）で上に説明した手順と同様に、ＥＤＣにより架橋させ、ＰＢＳ、エタノールおよびジエチルエーテルにより洗浄した。倍率５０００倍のＳＥＭ顕微鏡写真上で画像分析ソフトウェアPhenom Proによって決定された、円柱形の部分的に繊維状のスポンジ状コラーゲン足場において三重螺旋性を有する成熟天然繊維の％は、約５％であった。

ｃ）Bio-Gide（登録商標）由来の膜型繊維状コラーゲン足場の調製
Bio-Gide（登録商標）膜（ガイストリヒ・ファーマ・アーゲー、スイス）を１００ｍｌの９９．９％エタノールにより５０ｒｐｍで５分間撹拌下で洗浄し、このエタノールを真空下で蒸発させずに傾瀉し、このプロセスを２回繰返した。その後、コラーゲン膜を撹拌なしで１００ｍｌのジエチルエーテルにより洗浄し、化学フード内で１４時間乾燥させた。

倍率５０００倍のＳＥＭ顕微鏡写真上で画像分析ソフトウェアPhenom Proによって決定された、繊維状側における三重螺旋性を有する成熟天然繊維の％は、約１００％であった。

実施例２ α−ＴＣＰのバルク焼結材料の調製
５００ｇ（乾燥重量）の混合物のために、３６０ｇの無水リン酸二カルシウム粉末、１４４ｇの炭酸カルシウム粉末および２２０ｍｌの脱イオン水を、実験用撹拌器を用いて５００ｒｐｍで７分間混合した。この混合プロセスによるスラリーを直ちに高温で安定な白金カップに移した。満杯の白金カップを冷えた炉に配置した。毎時６０℃の加熱率を用いることによって炉を１４００℃に加熱した。加熱プロセスは、炉のスイッチを切ることによって７２時間後に停止させた。試料を炉内で室温に冷却した。バルク焼結材料（純相α−Ｃａ_３（ＰＯ_４）_２）を炉および白金カップから取り出した。焼結プロセスによるバルク生成物は、４２０ｇの重量（１６．７％の重量損失）を有していた。

相純度の制御は、粉末Ｘ線回折分析を用いて行った。

実施例３ α−ＴＣＰの微粒子の分散液の存在下でのＰＢＳ溶液中のナノ結晶ヒドロキシアパタイトのエピタキシャル成長した結晶による繊維状コラーゲン足場のコーティング
ａ）実施例１ａ）で得られた繊維状コラーゲンの円柱形片のコーティング
０．５Ｍ ＰＢＳ溶液の調製：３０分間２５０ｒｐｍおよび４時間６００ｒｐｍで撹拌下、室温で６．９ｇのＮａＨ_２ＰＯ_４・Ｈ_２Ｏを無菌脱イオン水に溶解することによって、１００ｍｌの０．５Ｍ ＮａＨ_２ＰＯ_４・Ｈ_２Ｏ溶液（溶液Ａ）を調製した。３０分間２５０ｒｐｍおよび４時間６００ｒｐｍで撹拌下、室温で８．９ｇのＮａ_２ＨＰＯ_４・２Ｈ_２Ｏを無菌脱イオン水に溶解することによって、１００ｍｌの０．５Ｍ Ｎａ_２ＨＰＯ_４・２Ｈ_２Ｏ溶液（溶液Ｂ）を調製した。

１９ｍｌの溶液Ａを８１ｍｌの溶液Ｂと混合して、７．３〜７．４のｐＨを有する０．５Ｍ ＰＢＳ溶液を得た。

α−ＴＣＰの微粒子への破砕：実施例２によるバルク生成物をジョークラッシャ（スロットサイズ４ｍｍ）を用いることによって破砕した。粗い顆粒は、２ｍｍおよび０．２５ｍｍの網目開口を有するふるい分け機およびふるいインサートを用いることによってふるいにかけた。ふるいにかけた顆粒を１０μｍ未満の最終径まで遊星ミルを用いてさらに粉砕した。

実施例１ａ）で得られた繊維状コラーゲン円柱形片の、ナノ結晶ヒドロキシアパタイトのエピタキシャル成長した結晶によるコーティング
上記のように得られた５ｇのα−ＴＣＰの微粒子および１００ｍｌの０．５Ｍ ＰＢＳ溶液と、実施例１ａ）で得られた繊維状コラーゲン円柱形片とをガラス秤量瓶に加え、これを５分間真空下で乾燥器内に配置し、その後大気圧に晒した。コーティング反応は、サーモスタット室において５〜５０ｒｐｍで作動された水平振とう器上に上記瓶を配置することによって、３日間３７℃の撹拌下で実施された。

目視観測により、コラーゲン足場は円柱形状を保持しているが、白色結晶物質によって被覆されていることがわかった。

実施例１ａ）で得られた繊維状コラーゲン円柱形片のコーティングの他の実験
ａ）の終わりに実施例１で得られた繊維状コラーゲン円柱形片のコーティングの他の実験は、ＰＢＳ溶液の濃度を０．２Ｍ〜０．８Ｍに変えて、コーティング反応時間を１２時間〜４日に変えて実施した。

目視観測により、コラーゲン足場は円柱形状を保持しているが、白色結晶物質によって被覆されていることがわかった。

ＳＥＭ分析により、ヒドロキシアパタイト結晶集合体の結晶成長ならびにサイズ、形態および形質は、ＰＢＳ溶液の濃度およびコーティング反応時間を変えることによって制御され得ることがわかった。

上記の実験において、コーティングされた繊維状コラーゲン円柱形片における繊維状コラーゲン足場とナノ結晶ヒドロキシアパタイトのエピタキシャル成長した結晶とのｗ／ｗ比率は、９０／１０〜３０／７０であった。

ｂ）実施例１）ｂ）において得られた円柱形の部分的に繊維状のスポンジ状コラーゲン足場および実施例１ｃ）において得られた膜型繊維状コラーゲン足場の、ナノ結晶ヒドロキシアパタイトのエピタキシャル成長した結晶によるコーティング
実施例１）ｂ）において得られた円柱形の部分的に繊維状のコラーゲンスポンジ円柱形片のコーティング、または実施例１ｃ）の膜型繊維状コラーゲン足場の繊維状側のコーティングの実験は、ＰＢＳ溶液の濃度を０．２Ｍ〜０．８Ｍに変えて、コーティング反応時間を１２時間〜４日に変えて実施した。

目視観測により、コラーゲン足場はその形状を保持しているが、白色結晶物質によって被覆されていることがわかった。

ＳＥＭ分析により、ヒドロキシアパタイト結晶集合体の結晶成長ならびにサイズ、形態および形質は、ＰＢＳ溶液の濃度およびコーティング反応時間を変えることによって制御され得ることがわかった。

上記の実験において、実施例１）ｂ）において得られたコーティングされた部分的に繊維状のコラーゲンスポンジ円柱形片については、繊維状コラーゲン足場とナノ結晶ヒドロキシアパタイトのエピタキシャル成長した結晶とのｗ／ｗ比率は、９０／１０〜３０／７０であり、コーティングされた膜型コラーゲン足場については、９０／１０〜５０／５０であった。

実施例４ ナノ結晶ヒドロキシアパタイトのエピタキシャル成長した結晶によってコーティングされた少なくとも部分的に繊維状のコラーゲン足場の特性
ａ）物理化学的特性：
測定された孔隙率（細孔容積）は、（架橋条件を変えて）実施例１ａ）で得られた繊維状コラーゲンの円柱形片については９６ｖ／ｖ％であり、実施例３）ａ）で得られたヒドロキシアパタイトによってコーティングされた円柱形片については８５〜９５ｖ／ｖ％であった。

水銀ポロシメトリによって測定された比表面積は、（架橋条件を変えて）実施例１ａ）で得られた繊維状コラーゲンの円柱形片については１．５〜２．５ｍ^２／ｇであり、実施例３）ａ）で得られたヒドロキシアパタイトによってコーティングされた円柱形片については２０〜６０ｍ^２／ｇであった。

測定された孔隙率（細孔容積）は、実施例１ｂ）で調製されたコラーゲンスポンジ円柱形足場については約９６ｖ／ｖ％であり、実施例３ｂ）で得られたヒドロキシアパタイトによってコーティングされたコラーゲンスポンジ円柱形片については８８〜９２％であった。

水銀ポロシメトリによって測定された比表面積は、実施例１ｂ）で調製されたコラーゲンスポンジ円柱形足場については２ｍ^２／ｇであり、実施例３ｂ）で得られたコーティングされたコラーゲンスポンジ円柱形片については２５〜５０ｍ^２／ｇであった。

ｂ）機械的特性：
ｂ１）圧縮強度
圧縮強度（耐圧性）、すなわち、円柱形片が元の高さの５０％まで圧縮するのに加えられる最大圧力を、機械的圧縮試験機（Zwick/Roell社により製造されたProline Z010）を用いて測定した。

湿潤状態で測定した圧縮強度は、（架橋条件を変えて）実施例１ａ）で得られた繊維状コラーゲンの円柱形片については０．３〜０．７ＭＰａであり、実施例３ｂ）で得られたヒドロキシアパタイトによってコーティングされた円柱形片については１．１〜３．５Ｍｐａであり、圧縮強度は、ヒドロキシアパタイトによってコーティングされた円柱形片において存在するヒドロキシアパタイトの％とともに増加した。

ｂ２）弾性
弾性、すなわち、元の高さが圧縮後に５０％または元の高さに回復した％を、機械的圧縮試験機（Zwick/Roell社により製造されたProline Z010）を用いて測定した。

湿潤状態で測定した弾性は、（架橋条件を変えて）実施例１ａ）で得られた繊維状コラーゲンの円柱形片については９５〜９９％であり、実施例３）ａ）得られたヒドロキシアパタイトによってコーティングされた円柱形片については９２〜１００％であり、ヒドロキシアパタイトによってコーティングされた片において存在するヒドロキシアパタイトの％は、弾性には影響がないと考えられた。

ｂ３）耐トルク性
Straumann（登録商標）骨ブロック固定法（http://www.straumann.ch/ch-index/products/products-biologics/products-bone-block-fixation.htmを参照されたい）と類似のプロトコルを使用した。

簡潔に述べると、ドリルを用いて、（ブタの下顎骨と同等の機械的特性を有する）テフロンシリンダ、ならびに、（架橋条件を変えて）実施例１ａ）で得られた繊維状コラーゲンの乾燥させた円柱形片の一部、および実施例３）ａ）、２で得られた乾燥させたヒドロキシアパタイトによってコーティングされた円柱形片の一部に０．９ｍｍ孔を開け、さらに、１．５×１２ｍｍねじを含む磁気スクリュードライバ（メディコン社（Medicon）より市販のKlinge fTi Mikro Schr Kreuzschl, Ref.75.23.19）を用いて、円柱形片が破断せずにテフロンシリンダにねじ込まれ得る最大トルクを測定した。

試験された、実施例１ａで得られた繊維状コラーゲンのコーティングされていない円柱形片はすべて、約２０Ｎｃｍの耐トルク性を示しており、一方、試験された、実施例３）ａ）で得られたヒドロキシアパタイトによってコーティングされた円柱形片はすべて、約６０Ｎｃｍを超える耐トルク性を示しており、ヒドロキシアパタイトによってコーティングされた片において存在するヒドロキシアパタイトの％は、耐トルク性には影響がないと考えられた。一般的に、当該技術分野においては、約３０Ｎｃｍの耐トルク性が、身体の骨部分に片をねじ込むために十分であるとみなされる。

耐トルク性の劇的な増加は、ヒドロキシアパタイトとコラーゲン足場との強いエピタキシャル結合によるものである。

実際に、先行技術の条件に従ってヒドロキシアパタイトをコラーゲン足場上または内部に沈殿させたため、コラーゲン足場に吸着によって弱く結合している架橋コラーゲン足場に対して実施された比較実験においては、耐トルク性は、さほど増加しなかった。

ｃ）ＳＥＭによって決定されたヒドロキシアパタイト結晶集合体形態
図１および図２は、１２時間のコーティング反応時間にわたって０．２ＭのＰＢＳ濃度、および２４時間のコーティング時間にわたって０．８Ｍのコラーゲンで、実施例３ｂ）に記載されるようにコーティングされた実施例１ｃ）の膜型コラーゲン足場の線維状側のＳＥＭ顕微鏡写真を示す図である。

図１では、コラーゲンフィブリルと緻密に相互結合された六方晶系対称を有するナノサイズの板状結晶が微細に分布した小さなヒドロキシアパタイト結晶集合体を観測することができ、図２では、コラーゲン繊維構造を完全に被覆している六方晶系ヒドロキシアパタイト結晶集合体の小さなミクロンサイズのロゼット様凝集体を観測することができる。

ｄ）骨形成細胞によるコロニー形成のアッセイ
ヒトＭＧ６３骨芽細胞様細胞は、実施例３ｂ）で得られたコーティングされた膜型コラーゲン足場の全部位において、高い増殖率でコロニー形成することがわかった。図３を参照されたい。

細胞毒性試験においては、実施例３ｂ）で得られたコーティングされた膜型コラーゲン足場は、Bio-Gide（登録商標）膜により得られた結果と同等の結果を示した。

Claims (15)

1. バイオミメティックなコラーゲン−ヒドロキシアパタイト複合材料であって、前記複合材料は、少なくとも部分的に繊維状のコラーゲン足場を含み、前記コラーゲン足場は、円偏光二色性分光法によって示されると、三重螺旋性を有する成熟天然コラーゲン繊維を含み、前記成熟天然コラーゲン繊維は、ナノ結晶ヒドロキシアパタイトのエピタキシャル成長した結晶によって少なくとも部分的に被覆されていることにより、前記エピタキシャル成長したナノ結晶は、ヒトの骨塩と同じ形態およびヒトの骨塩と同じサイズ、すなわち、３０〜５０ｎｍの長さおよび１４〜２５ｎｍの幅を有する、バイオミメティックなコラーゲン−ヒドロキシアパタイト複合材料。
2. 前記少なくとも部分的に繊維状のコラーゲン足場は、ＳＥＭ顕微鏡写真上の画像分析および円偏光二色性分光法によって決定されると、その外面に、少なくとも２％の成熟天然コラーゲン繊維、好ましくは、少なくとも１０％の成熟天然コラーゲン繊維を含む、請求項１に記載のバイオミメティックなコラーゲン−ヒドロキシアパタイト複合材料。
3. 前記ナノ結晶ヒドロキシアパタイトのエピタキシャル成長した結晶は、Ｘ線回折分析によって決定されると、少なくとも３０±１５ｎｍの厚さを有する層を形成する、請求項１または２に記載のバイオミメティックなコラーゲン−ヒドロキシアパタイト複合材料。
4. 前記繊維状コラーゲン足場と前記ナノ結晶ヒドロキシアパタイトのエピタキシャル成長した結晶とのｗ／ｗ比率は、５：９５〜９５：５であり、好ましくは、１０：９０〜９０：１０である、請求項１〜３のいずれか一項に記載のバイオミメティックなコラーゲン−ヒドロキシアパタイト複合材料。
5. 成形体である、請求項１〜４のいずれか一項に記載のバイオミメティックなコラーゲン−ヒドロキシアパタイト複合材料。
6. 身体の骨部分の輪郭を有する構造の骨代用材料である、請求項５に記載の成形体。
7. 乾燥状態で少なくとも３０Ｎｃｍの耐トルク性を有する、請求項５または６に記載の成形体。
8. 膜型である、請求項１〜５のいずれか一項に記載のバイオミメティックなコラーゲン−ヒドロキシアパタイト複合材料。
9. 請求項１〜８のいずれか一項に記載のバイオミメティックなコラーゲン−ヒドロキシアパタイト複合材料を調製するプロセスであって、前記プロセスは、
   ａ） 円偏光二色性分光法によって示されると、三重螺旋性を有する成熟天然コラーゲン繊維を含む、少なくとも部分的に繊維状のコラーゲン足場を、飽和Ｃａ^２＋／Ｈ_ｘＰＯ_４ ^{（３−ｘ）}の飽和水溶液に浸漬して、複合インプラント材料の形成プロセスを実施することにより、前記成熟天然コラーゲン繊維上にエピタキシャル成長したヒドロキシアパタイトナノ結晶を形成するステップを含み、前記エピタキシャル成長したヒドロキシアパタイトナノ結晶は、ヒトの骨塩と同じ形態および同じサイズを有しており、前記プロセスはさらに、
   ｂ） 前記水溶液から固形物を分離し、水洗し、乾燥させることによって、前記複合インプラント材料の形成プロセスを停止するステップと、
   ｃ） ステップｂ）により得られた前記分離物を任意に殺菌するステップとを含む、
   プロセス。
10. 前記飽和Ｃａ^２＋／Ｈ_ｘＰＯ_４ ^{（３−ｘ）}の飽和水溶液は、α−ＴＣＰ、β−ＴＣＰ、ＴＴＣＰ、リン酸八カルシウム五水和物、リン酸二カルシウムまたはリン酸二カルシウム二水和物が微細に分散したリン酸緩衝液の溶液である、請求項９に記載のプロセス。
11. ステップｂ）において、前記水溶液のｐＨは、５．５〜９．０の範囲内、好ましくは、６．５〜８．０の範囲内のままである、請求項９または１０に記載のプロセス。
12. ステップｂ）における温度は、２５〜４５℃、好ましくは、３５℃〜４２℃である、請求項１０または１１に記載のプロセス。
13. 請求項１〜８のいずれか一項に記載のバイオミメティックなコラーゲン−ヒドロキシアパタイト複合材料の、ヒト対象または動物における欠損部位での骨形成、骨再生、骨修復および／または骨置換のためのインプラントまたはプロテーゼとしての使用。
14. 請求項８に記載の膜型のバイオミメティックなコラーゲン−ヒドロキシアパタイト複合材料の、骨および軟骨の複合再生のためのインプラントとしての使用。
15. 請求項１〜８のいずれか一項に記載のバイオミメティックなコラーゲン−ヒドロキシアパタイト複合材料を移植することによる、ヒト対象または動物における欠損部位での骨形成、骨再生、および／または骨修復を促進する方法。
    
    

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