KR101944163B1 - 생체모방 콜라겐-히드록시아파타이트 복합재 재료 - Google Patents

생체모방 콜라겐-히드록시아파타이트 복합재 재료 Download PDF

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Abstract

본 발명은 하기에 관한 것이다:
- 원편광 이색성 분광법 (Circular Dichroism Spectroscopy) 에 의해 제시되는 바와 같은 삼중 나선성을 소유하는 성숙한 고유의 콜라겐 섬유를 포함하는 적어도 부분적으로 섬유성인 콜라겐 스캐폴드를 포함하는 생체모방 콜라겐-히드록시아파타이트 복합재 재료로서, 상기 성숙한 고유의 콜라겐 섬유는 나노결정질 히드록시아파타이트의 에피택틱성으로 성장된 결정으로 적어도 부분적으로 피복되고, 이에 의해 에피택틱성으로 성장된 나노결정은 인간 뼈 미네랄과 동일한 형태학 및 인간 뼈 미네랄과 동일한 크기, 즉 30 내지 50 nm 의 길이 및 14 내지 25 nm 의 폭을 갖는, 생체모방 콜라겐-히드록시아파타이트 복합재 재료,
- 하기 단계를 포함하는, 상기 생체모방 콜라겐-히드록시아파타이트 복합재 재료의 제조 방법:
a) 상기 성숙한 고유의 콜라겐 섬유를 포함하는 적어도 부분적으로 섬유성인 콜라겐 스캐폴드를 포화 Ca2+ / HxPO4 (3-x) 의 포화 수용액 중에 침지시켜, 복합재 이식물 재료의 형성 공정을 개시하며, 이에 의해 에피택틱성으로 성장된 나노결정이 상기 성숙한 고유의 콜라겐 섬유 상에 형성될 것이고, 상기 에피택틱성으로 성장된 나노결정이 인간 뼈 미네랄과 동일한 형태학 및 동일한 크기를 갖는 단계,
b) 수용액으로부터 고체 재료를 분리하고, 물로 린스하고 건조시킴으로써 복합재 이식물 재료의 형성 공정을 중단하는 단계, 및
c) 임의로 단계 b) 로부터 유래하는 분리된 재료를 멸균시키는 단계 및
- 인간 대상 또는 동물에서 결함 부위에서의 뼈 형성, 뼈 재생, 뼈 보수 및/또는 뼈 대체를 위한 이식물 또는 보철로서의, 또는 조합된 뼈 및 연골 재생을 위한 이식물로서의, 상기 생체모방 콜라겐-히드록시아파타이트 복합재 재료의 용도.

Description

생체모방 콜라겐-히드록시아파타이트 복합재 재료 {BIOMIMETIC COLLAGEN-HYDROXYAPATITE COMPOSITE MATERIAL}
본 발명은, 콜라겐 섬유가 나노결정질 히드록시아파타이트의 에피택틱성으로 성장된 결정으로 적어도 부분적으로 피복되는, 적어도 부분적으로 섬유성인 콜라겐 스캐폴드 및 히드록시아파타이트를 포함하는 신규한 생체모방 콜라겐-히드록시아파타이트 복합재 재료, 상기 재료의 제조 방법 및 인간 대상 또는 동물에서 결함 부위에서의 뼈 형성, 뼈 재생, 뼈 보수 및/또는 뼈 대체를 지지하기 위한 이식물로서의, 또는 조합된 뼈 및 연골 재생을 위한 이식물로서의 이의 용도에 관한 것이다.
뼈 구조 중의 결함은 다양한 환경, 예컨대 정신적 외상, 질환 및 수술에서 일어나며, 다양한 수술 분야에서 뼈 결함을 위한 효과적인 보수에 대한 필요성이 여전히 있다. 수 많은 천연 및 합성 재료 및 조성물이 뼈 결함 부위에서 치유를 촉진하기 위해 사용되어 왔다.
치주 및 악안면 골성 결함 또는 정형외과 분야에서 골성 결함에서 뼈 성장을 촉진하는 잘-공지된 천연, 골전도성 뼈 치환 재료는, 각각, Geistlich Pharma AG 사에서 시판되는 Geistlich Bio-Oss® 또는 Geistlich Orthoss 이다. 상기 히드록시아파타이트 기재 뼈 미네랄 재료는 천연 뼈의 섬유주 구조물 및 나노결정질 구조의 보존을 가능하게 하는 미국 특허 번호 5,167,961에 기재된 방법에 의해 천연 뼈로부터 제조된다.
히드록시아파타이트 기재 재료는 그러나, 예를 들어, 뼈 몸체 일부 상에 나사로 죌 수 있을 만큼 기계적 응력에 대해 충분히 저항성이 아니고 취약하여, 특히 정형외과에서 큰 뼈 결함의 보수에 항상 채택되는 것은 아니다.
따라서 특히 이의 기계적 응력에 대한 저항성에서, 천연 뼈와 밀접하게 닮도록 제조된 합성 또는 부분적 합성 뼈 그래프트 재료에 대한 필요성이 있다. 이러한 생체모방 합성 또는 부분적 합성 뼈 그래프트 재료는 특정 적용을 위한, 특히 큰 뼈 결함의 보수를 위한 것일 수 있어, 천연 뼈로부터 유래된 뼈 그래프트의 유용한 대체물일 것이다.
천연 뼈는 물 및, 무기 결정, 주로 히드록시아파타이트와 단단하게 조합된, 주로 유형 I 콜라겐으로 이루어지는 콜라겐성 매트릭스로 이루어지는 복합재 재료이다. 콜라겐 유형 I 섬유 및 히드록시아파타이트는 각각, 천연 뼈 건조 중량의 대략 w/w 25 내지 30 % 및 w/w 65 내지 70 % 에 해당한다. 콜라겐성 매트릭스는 뼈에 이의 유연성 및 탄력성을 부여하는 반면, 무기 재료는 이의 힘 및 강직성을 부여하여, 2 가지 상의 조직이 복합재의 높은 정도의 탄성 및 인성을 제공한다. 옹스트롱 수준 (미네랄 결정) 에서 마이크론 수준 (라멜라) 까지의 뼈 구조에 대한 전반적인 리뷰가 문헌 Weiner, S. et al., 1992, FASEB, 6:879-885 에 의해 제시되어 있다.
천연 뼈의 하나의 중요한 특징은 히드록시아파타이트 결정의 형태학 및 매우 작은 크기인데, 이에 대해 인간 뼈 미네랄은 하기와 같다: 6각형 공간 기 P63/m, 약 30 내지 50 nm 길이 (c 축: [0,0,1]) 및 14 내지 25 nm (a 및 b 축: [1,0,0] 및 [0,1,0]). 상기 언급된 Weiner S. et al. 를 참조한다.
N.A. Barrios 등은 문헌 "Density Functional Study of Binding of Glycine, Proline and Hydroxyproline to the Hydroxyapatite (0001) and (0110) Surfaces", 2009, Langmuir 25(9), 5018-5025 및 "Molecular Dynamics Simulation of the Early Stages of Nucleation of Hydroxyapatite at a Collagen Template", Crystal Growth Design, 2012, 12, 756-763 에서, 인체 온도에서 히드록시아파타이트의 콜라겐 섬유에 대한 핵생성 및 커플링이 콜라겐 아미노산 빌딩 블록 글리신, 프롤린 및 히드록시프롤린의 상이한 부위에서, 즉 결정 표면 (0001) 및 (0110) 상에서 일어날 수 있다는, 결정 표면 (0110) 상에서의 커플링이 바람직하다는 것을 보여준다. 이것은 인체에서 콜라겐 섬유 및 이의 아미노산 빌딩 블록의 구조가 히드록시아파타이트의 결정 구조에 정확하게 상응하는 기질을 제공하고, 따라서 뼈 형성이 히드록시아파타이트 결정 및 콜라겐 섬유와 상호연결되는 에피택틱 성장 경로를 따르게 하는 것을 입증한다. 에피택틱 성장 경로는 최저 에너지 배치를 산출하는 것을 열역학적으로 선호한다.
종래 기술에서 천연 뼈와 유사한 콜라겐-히드록시아파타이트 복합재 재료를 제공하기 위한 시도가 있었다.
미국 특허 번호 5,231,169 는 범위 10-13 내의 pH 를 갖는 염기성 수용액 중의 분산된 콜라겐 원섬유의 분산액의 존재 하에서 칼슘 포스페이트 미네랄을 제조하고, 상기 분산액에 1 시간 이상의 기간에 걸쳐 가용성 칼슘 및 가용성 포스페이트의 공급원을 상기 포스페이트 미네랄을 제조하도록 올바른 비로 첨가하고, 미네랄화된 콜라겐을 수집하는 것을 포함하는, 칼슘 포스페이트 미네랄로의 콜라겐의 미네랄화 방법을 기재한다. 따라서 콜라겐 매트릭스 내에 안정하게 분배된 칼슘 포스페이트로 미네랄화된 콜라겐이 수득되는 것으로 교시된다.
미국 특허 번호 5,739,286 은, 0.05 M tris 완충액 및 0.1M 칼슘 클로라이드를 함유하는 하나의 저장소 및 0.05M tris 완충액 및 0.1M 칼륨 포스페이트를 함유하는 다른 저장소의 이중 확산 챔버 내에, 7-일 기간에 걸쳐 콜라겐 섬유를 미네랄화함으로써 천연 뼈를 닮은 뼈 증대 재료의 제조 방법을 기재한다. 칼슘 포스페이트 침전물이 콜라겐 섬유 상에 형성되는 것으로 교시되고, 미네랄화된 콜라겐 섬유의 주사 전자 현미경사진은 합성 혈장에 적셔진 생체유리 재료 상에 침전된 것으로 발견되는 히드록시아파타이트의 플레이트-유사 골재와 형태학적으로 유사하다.
미국 특허 번호 6,395,036 및 6,589,590 은 멤브레인의 반대 면 상에 칼슘 이온 및 포스페이트 이온의 용액이 있는 콜라겐 멤브레인을 제공하고, 상기 이온이 멤브레인을 통해 확산되어, 콜라겐 멤브레인 내의 히드록시아파타이트 재료로서 만나고 침전함에 의한 인공 뼈의 제조 방법을 기술한다.
미국 특허 번호 7,514,249 및 7,547,449 는 6mM 칼슘 클로라이드 및 두 폴리 (알파 베타-DL-아스파르트산) 및 폴리 (비닐 포스폰산) 의 200 ㎍/ml 의 용액을 사용한 후, 암모늄 포스페이트 2염기의 증기 확산에 의해, 칼슘 포스페이트를 콜라겐 원섬유의 사이 공간 내에 포함시키는, 칼슘 포스페이트로 미네랄화된 생체모방 콜라겐 스폰지의 제조 방법을 기술한다.
Ficai A. et al., 2010, Chemical Engineering 160, 794-800 은 예컨대 히드록시아파타이트 침전 및 원섬유형성을 확보하도록 나트륨 히드록시드 용액을 사용하여 pH 를 약 9 에 조정하는, 콜라겐 젤 및 히드록시아파타이트 전구체로부터 시작하는 콜라겐-아파타이트 복합재 재료의 제조 방법을 기술한다. 히드록시아파타이트의 결정은 따라서 "나노미터 범위로, 수 나노미터 내지 40 nm 이하" 로 형성된다. 히드록시아파타이트의 핵생성이 원섬유형성 동안 일어나고, 그 동안 콜라겐 분자의 자가-어셈블링이 콜라겐의 아미노산 빌딩 블록의 위치를 변경하므로 (이것은 그러므로 히드록시아파타이트의 결정 구조에 정확하게 상응하지 않음), 히드록시아파타이트 결정의 임의의 에피택틱 성장이 없을 수 있고: 이들 결정은 공개문헌에 언급된 대로 침전된다.
특허 공개문헌 US 2009/0232875 는 콜라겐을 함유하는 유기 매트릭스로 이루어지는 첫번째 상부 층 및 히드록시아파타이트 및 콜라겐을 함유하는 복합재 매트릭스의 적어도 하부 층을 포함하는 다층 구조를 기술한다 (단락 [0001]). 복합재는 9-11 의 pH 및 35 내지 40℃ 의 온도에서 자가-어셈블링 콜라겐 원섬유 상의 히드록시아파타이트의 직접 핵생성 방법에 의해 수득되며, 결정의 크기는 섬유 축을 따라 12-15 nm 이다 (단락 [0082] 및 [0089]). 상기 Ficai et al. 에서와 같이, 히드록시아파타이트의 핵생성은 콜라겐 분자의 자가-어셈블링 동안 일어나고 (자가-어셈블링은 콜라겐의 아미노산 빌딩 블록의 위치를 변화시킴) 추가로 상기 핵생성이 "무기 상의 탄산화, 즉, 히드록시아파타이트 격자 상의 CO3 2- 기의 도입을 수반하므로" (단락 [0077], 라인 25-28 참조), 상이한 결정 구조를 갖는 탄산화 히드록시아파타이트 (공간 기 Pb 또는 P21/b 를 갖는 단사정계 결정 구조: 참조 Elliot J.C. 1994: Structure and Chemistry of the Apatites and Other Calcium Phosphates. Studies in inorganic Chemistry 18. Elsevier Science, ISBN 0-444-81582-1), 히드록시아파타이트 결정의 임의의 에피택틱 성장이 없을 수 있고: 이들 결정은 따라서 "원섬유와 평행한 콜라겐 원섬유… 내에 형성된 나노-핵" 의 침전에 의해 성장한다 (단락 [0090] 참조).
US-2010/0021552 에는 "자가-어셈블리된 고유의 콜라겐 섬유 내의 나노규모 빈공간은 미네랄이 쉽게 성장할 수 있고 미네랄을 포획하는 크기를 제한하여, 이들이 콜라겐 섬유로부터 확산되어 나가지 못하게 하는" 미네랄화된 섬유 스캐폴드를 포함하는 생체재료 이식물이 기재되어 있고, 언급된 유일한 아파틱 (apatic) 미네랄은 최대 약 1nm×10nm×10nm 이다 ([0044], [0045], [0105], [0113]).
종래 기술의 콜라겐-히드록시아파타이트 복합재 재료에서 히드록시아파타이트는는 콜라겐 스캐폴드 상에 또는 그 내부에 침전되고, 콜라겐 스캐폴드와의 연결은 오직 약한 물리적 연결, 예를 들어, 흡착에 의한 것이다. 이러한 약한 물리적 연결은 히드록시아파타이트 결정이 콜라겐 섬유 상에 에피택틱성으로 성장된, 천연 뼈의 탄성, 토크에 대한 저항성 및 인성을 가진 재료를 제공할 수 없다.
따라서 본 발명의 목적은 콜라겐 스캐폴드와 히드록시아파타이트 결정 사이에 강한 연결이 있는, 생체모방 콜라겐-히드록시아파타이트 복합재를 제공하는 것이다.
종래 기술의 콜라겐-히드록시아파타이트 복합재 재료에서 히드록시아파타이트 결정은 형태학 (결정 면 비 및 격자 파라미터) 및 매우 작은 크기의 천연 뼈 미네랄, 특히 인간 뼈 미네랄을 갖지 않는다.
따라서 본 발명의 또다른 목적은 콜라겐 결정이 인간 뼈 미네랄과 동일한 형태학 및 동일한 크기를 갖는, 생체모방 콜라겐-히드록시아파타이트 복합재를 제공하는 것이다.
유럽 특허 번호 2'445'543 은 히드록시아파타이트의 나노결정이 소결된 α-TCP 코어 상에 에피택틱성으로 성장하는 조건을 교시하며, 상기 나노결정은 인간 뼈 미네랄과 동일한 형태학 및 동일한 크기를 갖는다.
상기 목적은 콜라겐 섬유 상에 히드록시아파타이트의 에피택틱성으로 성장하는 나노결정에 대해 유럽 특허 번호 2'445'543 에 기재된 조건을 채택함으로써 달성될 수 있음이 밝혀졌고, 상기 나노결정은 인간 뼈 미네랄과 동일한 형태학 및 동일한 크기를 갖는다.
따라서 생체모방 콜라겐-히드록시아파타이트 복합재 재료는 콜라겐 스캐폴드와 히드록시아파타이트 결정 사이의 강한 에피택틱 결합 덕분에, 우수한 기계적 특성, 특히 기계적 응력에 대한 높은 저항성, 특히 토크에 대한 강한 저항성 (30 Ncm 이상, 일반적으로 약 60 Ncm) 을 갖고 수득된다. 인체 내에 이식 시 상기 재료는 뼈-형성 세포에 의해 쉽게 콜로니를 형성하고, 특히 히드록시아파타이트 결정이 인간 뼈 미네랄과 동일한 형태학 및 동일한 크기를 갖는다는 사실 덕분에 우수한 골전도성 (osteoconductivity) 및 골융합성 특성을 나타낸다.
상기 목적은 특허청구범위에 정의된 바와 같은 본 발명에 의해 달성된다.
본 발명은 따라서 원편광 이색성 분광법 (Circular Dichroism Spectroscopy) 에 의해 제시되는 바와 같은 삼중 나선성 (helicity) 을 소유하는 성숙한 고유의 콜라겐 섬유를 포함하는 적어도 부분적으로 섬유성인 콜라겐 스캐폴드를 포함하는 신규한 생체모방 콜라겐-히드록시아파타이트 복합재 재료에 관한 것으로, 상기 성숙한 고유의 콜라겐 섬유는 나노결정질 히드록시아파타이트의 에피택틱성으로 성장된 결정으로 적어도 부분적으로 피복되고, 이에 의해 에피택틱성으로 성장된 나노결정은 인간 뼈 미네랄과 동일한 형태학 및 인간 뼈 미네랄과 동일한 크기, 즉 30 내지 50 nm 의 길이 및 14 내지 25 nm 의 폭을 갖는다.
용어 "인간 뼈 미네랄과 동일한 형태학" 은 결정 면 (결정의 외부 형상을 측정함) 의 치수 관계가 인간 뼈 미네랄과 동일한 것을 의미한다. 인간 뼈 미네랄에서 결정은 일반적으로 6각형 혈소판이다.
콜라겐 상의 히드록시아파타이트의 에피택틱 성장은 상기 언급된 N.A. Barrios et al. 의 공개문헌에서 제시되는 바와 같이, 콜라겐 섬유 상에서만 일어날 수 있다. 이러한 섬유는 성숙한 고유의 콜라겐 섬유, 즉, (a) 원섬유가 콜라겐 빌딩 블록의 자가 어셈블링에 의해 어셈블리되고, (b) 알파 1 및 알파 2 사슬이 형성되고, (c) 삼중 나선이 2 개의 알파 1 사슬과 1 개의 알파 2 사슬과의 자연적인 가교연결에 의해 형성되는 콜라겐 섬유이어야만 한다. 이러한 성숙한 고유의 콜라겐 섬유는 원편광 이색성 분광법 (Circular Dichroism Spectroscopy) 에 의해 제시되는 바와 같이 삼중 나선성을 소유한다. 성숙한 고유의 콜라겐 섬유 상에는 콜라겐 빌딩 블록 글리신, 프롤린 및 히드록시프롤린의 각각의 위치가 고정되어, 히드록시아파타이트의 구조에 정확하게 상응하여, 따라서 히드록시아파타이트와 성숙한 고유의 콜라겐 섬유 사이의 에피택틱 상호연결을 가능하게 한다. 원섬유 자가-어셈블링이 형성되고, 알파 1 및 알파 2 사슬이 형성되거나 삼중 나선이 형성되는 섬유는 히드록시아파타이트의 에피택틱 성장에 적합하지 않다. 게다가, 이러한 섬유에서 형성시 콜라겐의 빌딩 블록의 위치가 변경되고, 따라서 히드록시아파타이트의 결정 구조에 정확하게 상응하지 않는다.
따라서 콜라겐 스캐폴드는 이의 외부 표면 상에서 적어도 부분적으로 섬유성이고, 원편광 이색성 분광법 (Circular Dichroism Spectroscopy) 에 의해 제시되는 바와 같은 삼중 나선성을 소유하는 성숙한 고유의 콜라겐 섬유를 포함하는 것이 필수적이다.
적어도 부분적으로 섬유성인 콜라겐 스캐폴드는 일반적으로 이의 외부 표면 상에 SEM 현미경사진 상의 사진 분석 및 원편광 이색성 분광법 (Circular Dichroism Spectroscopy) 에 의해 측정되는 바와 같이, 2 % 이상의 성숙한 고유의 콜라겐 섬유, 바람직하게는 5 % 이상의 성숙한 고유의 콜라겐 섬유, 더욱 바람직하게는 10 % 이상의 성숙한 고유의 콜라겐 섬유를 포함한다.
적어도 부분적으로 섬유성인 콜라겐 스캐폴드는 일반적으로 유형 I 콜라겐으로 구성되나, 또한 다른 유형의 콜라겐, 특히 유형 II 및 유형 III 콜라겐을 포함할 수 있다.
적어도 부분적으로 섬유성인 콜라겐 스캐폴드는 일반적으로 예를 들어, 콜라겐 입자의 현탁액 또는 가용성 콜라겐의 용액으로부터의 전기방사 (electrospinning) 에 의해 제조되는, 천연 재료 유래의 콜라겐 매트릭스 또는 반-인공 또는 인공 콜라겐 매트릭스이고, 콜라겐은 천연 재료로부터 유래되거나 재조합 콜라겐이다.
나노결정질 히드록시아파타이트의 에피택틱성으로 성장된 결정은 통상, X-선 회절 분석에 의해 측정되는 바와 같이, 30 ± 15 nm 이상의 두께를 갖는 층을 형성한다. 30 ± 15 nm 이상의 두께는 에피택틱 방향으로의 히드록시아파타이트 나노결정의 하나의 층에 상응한다.
나노결정질 히드록시아파타이트의 에피택틱성으로 성장된 층은 콜라겐 섬유 기질에 대해 에피택틱 방향으로의 히드록시아파타이트 나노결정의 단일 또는 복합 층을 포함할 수 있다. 에피택틱 방향으로의 히드록시아파타이트 나노결정의 이러한 층의 수와 관련되는, 나노결정질 히드록시아파타이트의 에피택틱성으로 성장된 층의 두께는, 인체 중의 이식물로서 뼈 치환 재료의 의도된 적용에 따라 선택될 것이다.
나노결정질 히드록시아파타이트의 에피택틱성으로 성장된 층의 두께는 섬유성 콜라겐 스캐폴드 대 나노결정질 히드록시아파타이트의 에피택틱성으로 성장된 결정의 w/w 비에 관한 것으로, 상기 비는 일반적으로 5:95 내지 95:5, 바람직하게는 10:90 내지 90:10, 더욱 바람직하게는 20:80 내지 60:40, 특히 30:70 내지 70:30 이다.
생체모방 콜라겐-히드록시아파타이트 복합재 재료는 미립자 또는 과립자일 수 있으며, 상기 입자 또는 과립은 원하는 크기 및 형상을 갖는다. 일반적으로 입자 또는 과립은 대략 구형이고, 20 내지 5000 ㎛ 의 직경을 갖는다.
생체모방 콜라겐-히드록시아파타이트 복합재 재료는 또한 임의의 형상의 성형체, 예를 들어, 입방체 또는 평행 6면체 블록, 플레이트, 실린더, 테이퍼 키 (tapered key), 못, 나사, 핀 또는 특히 엉덩이, 쇄골, 갈비뼈, 하악 또는 두개골 부분과 같은 골성 신체 부분의 프로파일을 갖는 구조일 수 있다. 이러한 성형체는 예를 들어, 골성 신체 부분 상에서 나사로 죌 수 있을 토크에 대한 충분한 저항성, 즉, 건조 상태로 30 Ncm 이상의 토크에 대한 저항성, 바람직하게는 건조 상태로 50 Ncm 이상의 토크에 대한 저항성을 가질 수 있다.
생체모방 콜라겐-히드록시아파타이트 복합재 재료는 또한 멤브레인 성형체일 수 있다.
멤브레인 성형체에 대한 적합한 콜라겐 스캐폴드는 뼈-형성 세포 내성장을 허용하는 섬유성 면 및 비-뼈-형성 세포 내성장에 대항하는 장벽으로서 작용하는 평탄 면을 갖는, EP-B1-1676592 에 기재된 방법에 따라 제조되는 Bio-Gide® 멤브레인 (Geistlich Pharma A.G., Switzerland) 이다. 이러한 멤브레인은 일반적으로 에피택틱성으로 성장된 히드록시아파타이트 나노결정으로 섬유성 면 상에만 코팅되어, 이에 의해 해당 면 상에 뼈 형성을 위한 매우 호의적인 조건을 제공할 것이다.
본 발명의 생체모방 콜라겐-히드록시아파타이트 복합재 재료는 인간 대상 또는 동물에서 뼈 결함 부위, 특히 큰 뼈 결함 부위에서의 뼈 형성, 뼈 재생, 뼈 보수 및/또는 뼈 대체를 위한 이식물 또는 보철로서 사용될 수 있다.
따라서 본 발명은 또한 하기에 관한 것이다:
- 인간 대상 또는 동물에서 결함 부위에서의 뼈 형성, 뼈 재생, 뼈 보수 및/또는 뼈 대체를 위한 이식물 또는 보철로서의 생체모방 콜라겐-히드록시아파타이트 복합재 재료의 용도 및
- 생체모방 콜라겐-히드록시아파타이트 복합재 재료를 이식함으로써 인간 대상 또는 동물에서 결함 부위에서의 뼈 형성, 뼈 재생 및/또는 뼈 보수를 촉진시키는 방법.
오직 하나의 면이 에피택틱성으로 성장된 히드록시아파타이트 나노결정으로 코팅된 본 발명의 생체모방 콜라겐-히드록시아파타이트 복합재 재료의 멤브레인-성형체는 조합된 뼈 및 연골 재생을 위한 이식물로서 사용될 수 있고, 코팅된 면은 이것이 뼈 결함을 향하게 하는 식으로 배향되고, 비-코팅된 면은 이것이 연골 결함을 향하게 하는 식으로 배향된다.
따라서 본 발명은 또한 조합된 뼈 및 연골 재생을 위한 이식물로서의 생체모방 콜라겐-히드록시아파타이트 복합재 재료의 멤브레인-성형체의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 추가로 하기 단계를 포함하는 상기 정의된 생체모방 콜라겐-히드록시아파타이트 복합재 재료의 제조 방법에 관한 것이다:
a) 원편광 이색성 분광법 (Circular Dichroism Spectroscopy) 에 의해 제시되는 바와 같은 삼중 나선성을 소유하는 성숙한 고유의 콜라겐 섬유를 포함하는 적어도 부분적으로 섬유성인 콜라겐 스캐폴드를 포화 Ca2+ / HxPO4 (3-x)(X는 0, 1 또는 2) 의 포화 수용액 중에 침지시켜 복합재 이식물 재료의 형성 과정을 수행하며, 이에 의해 에피택틱성으로 성장된 히드록시아파타이트 나노결정이 이들 성숙한 고유의 콜라겐 섬유 상에 형성되고, 상기 에피택틱성으로 성장된 나노결정이 인간 뼈 미네랄과 동일한 형태학 및 동일한 크기를 갖는 단계,
b) 수용액으로부터 고체 재료를 분리하고, 물로 린스하고 건조시킴으로써 에피택틱성으로 성장된 히드록시아파타이트 나노결정의 형성을 중단하는 단계 및
c) 임의로 단계 b) 로부터 유래하는 분리된 건조 재료를 멸균시키는 단계.
적어도 부분적으로 섬유성인 콜라겐 스캐폴드는 일반적으로, 생체모방 복합재 재료에 대한 원하는 최종 형상과 양립성인 사전-형상 및 및 생체모방 복합재 재료의 원하는 기계적 특성에 충분한 가교연결 정도를 갖는, 천연 재료 유래의 콜라겐 매트릭스 또는 반-인공 또는 인공 콜라겐 매트릭스이다. 필요하다면, 상기 콜라겐 스캐폴드의 제조는 그것에 원하는 사전-형상을 제공하는 단계 및 그것에 충분한 응집력 및 인성을 제공하는 가교연결 단계를 포함할 것이다.
단계 a) 를 수행하기 전에 적어도 부분적으로 섬유성인 콜라겐 스캐폴드는 일반적으로 알코올, 예컨대 예를 들어 에탄올 및 이소프로판올 및 에테르, 예컨대 예를 들어 디에틸에테르 중에서 세정된다.
포화 Ca2+ / HxPO4 (3-x)(X는 0, 1 또는 2) 의 포화 수용액은 미세하게 분산된 알파-TCP, 베타-TCP, 테트라칼슘 포스페이트(TTCP), 8칼슘 포스페이트 5수화물, 2칼슘 포스페이트 또는 2칼슘 포스페이트 2수화물을 함유하는 포스페이트 완충액 용액 (PBS) 일 수 있다. PBS 용액 중의 칼슘 포스페이트의 이러한 분산액은 Ca2+ 및 HxPO4 (3-x)(X는 0, 1 또는 2) 이온이 히드록시아파타이트를 형성하기 위해 소모되는 경우 상기 용액이 Ca2+ / HxPO4 (3-x)(X는 0, 1 또는 2) 에 포화되어 남아있도록 한다.
포화 Ca2+ / HxPO4 (3-x)(X는 0, 1 또는 2) 의 포화 수용액은 또한 Ca2+ 및 HxPO4 (3-x)(X는 0, 1 또는 2) 이온이, 예를 들어, 반응 매질 내에 이러한 이온을 함유하는 용액을 점적함으로써, 히드록시아파타이트를 형성하는데 있어 이들의 소모를 상쇄시키기 위해 첨가되는 포스페이트 완충액 용액일 수 있다.
포스페이트 완충액 용액은 일반적으로 0.1 내지 1.0 M, 특히 0.2 내지 0.8 M 의 농도를 갖는다.
포화 Ca2+ / HxPO4 (3-x)(X는 0, 1 또는 2) 의 포화 수용액의 pH 는 통상 단계 a) 동안 5.5 내지 9.0, 바람직하게는 6.5 내지 8.0 의 범위 내에 남아있다.
단계 a) 는 일반적으로 25 내지 45 ℃, 바람직하게는 35℃ 내지 42℃ 의 온도에서 수행된다.
단계 a) 는 예컨대 성숙한 고유의 콜라겐 섬유 상에 상당한 양의 히드록시아파타이트 결정의 에피택틱 성장을 허용하도록 충분한 시간 동안 수행된다. 에피택틱 성장은 게다가 최저 에너지 배치를 산출하는 것을 열역학적으로 선호하나, 달성하기에 시간이 걸린다. 일반적으로 이러한 충분한 시간은 적어도 약 12 시간, 바람직하게는 적어도 약 24 시간이다.
인체 내의 뼈-형성 조건과 가까운 단계 a) 의 상기 조건은 인간 뼈 미네랄과 동일한 형태학 및 크기를 갖는 히드록시아파타이트 나노결정의 콜라겐 섬유 상의 에피택틱 성장을 허용한다.
단계 a) 는 일반적으로 히드록시아파타이트의 하나 이상의 나노결정질 층의 폐쇄된 코팅이 성숙한 고유의 콜라겐 섬유 상에 존재하는 식으로 적어도 충분한 시간 동안 실시되며: 상기 시간은 특히 나노결정질 층의 원하는 수의 및 콜라겐 스캐폴드 대 나노결정질 히드록시아파타이트의 에피택틱성으로 성장된 층의 w/w 비에 있어서, 생체모방 콜라겐-히드록시아파타이트 재료에 대해 원하는 특성에 따라 선택된다.
단계 b) 에서 에피택틱성으로 성장된 히드록시아파타이트 나노결정의 형성은 수용액으로부터 고체 재료를 분리하고, 물로 린스하고 건조시킴으로써 중단된다.
일반적으로 단계 b) 로부터 유래하는 분리된 건조 재료의 멸균의 추가의 임의의 단계 c) 가 수행된다.
본 발명의 생체모방 콜라겐-히드록시아파타이트 복합재 재료의 장점
천연 뼈에서와 같이, 콜라겐 스캐폴드와 히드록시아파타이트 나노결정 사이의 강한 에피택틱성 연결 덕분에, 본 발명의 합성 또는 부분적 합성 생체모방 콜라겐-히드록시아파타이트 복합재 재료는 우수한 기계적 특성, 특히 기계적 응력에 대한 높은 저항성, 특히 토크에 대한 높은 저항성 (적어도 30 Ncm, 일반적으로 약 60 Ncm), 높은 압축 강도 및 높은 탄력성을 갖는다. 이들의 우수한 기계적 특성 덕분에, 본 발명의 생체모방 콜라겐-히드록시아파타이트 복합재 재료의 성형체는 특히 골성 신체 부분 상에 나사로 죌 수 있고, 또한 기계적 응력 하에서 부피를 영구적으로 유지하며: 따라서 이들은 큰 뼈 결함을 복구하기 위해 이상적으로 채택된다.
본 발명의 생체모방 콜라겐-히드록시아파타이트 복합재 재료는 낮은 수준의 세포독성을 가진 뼈 형성 세포에 의해 쉽게 콜로니를 형성하고 (하기 실시예 4 d) 참조), 하기 표 1 에 제시되는 바와 같이, 특히 히드록시아파타이트 나노결정이 인간 뼈 미네랄과 동일한 형태학 및 동일한 크기를 갖는다는 사실 덕분에, 인체 내에서 우수한 골전도성 및 골융합성 특성을 나타낸다:
표 1
본 발명의 생체모방 복합재 이식물 재료 및 인간 뼈 미네랄에 대한 히드록시아파타이트 결정 크기 및 형태학의 비교
Figure 112016005349743-pct00001
하기 실시예는 본 발명을 이의 범주를 제한하지 않고 설명한다.
하기 설명이 하기를 언급함으로써 더욱 잘 이해될 것이다:
- 12 시간의 코팅 반응 시간 동안 0.2M 의 PBS 농도로 실시예 3 b) 에서 기재된 바와 같이 코팅된 실시예 1c) 의 멤브레인-형상의 콜라겐 스캐폴드의 섬유성 면의 SEM 현미경사진을 나타내는 도 1,
- 24 시간의 코팅 반응 시간 동안 0.8M 의 PBS 농도로 실시예 3 b) 에서 기재된 바와 같이 코팅된 실시예 1c) 의 멤브레인-형상의 콜라겐 스캐폴드의 섬유성 면의 SEM 현미경사진을 나타내는 도 2, 및
- MG63 골모세포-유사 세포로 콜로니를 형성하였던, 실시예 3 b) 에서 기재된 바와 같이 코팅된 실시예 1c) 의 멤브레인-형상의 콜라겐 스캐폴드의 섬유성 면의 SEM 현미경사진을 나타내는 도 3.
실시예 1 적어도 부분적으로 섬유성인 콜라겐 스캐폴드의 제조
a) Bio-Gide® 로부터 유래된 실린더형 섬유성 콜라겐 스캐폴드의 제조
건조 압착된 콜라겐의 실린더 조각의 제조
Bio-Gide® 멤브레인 (Geistlich Pharma A.G., Switzerland) 을 초원심 밀 (ultracentifugal mill) 을 사용하여 미세하게 분쇄하고 2.0 mm 체 상에서 체질하였다. 0.2 g 의 체질된 콜라겐을 5 ml 의 99.9 % 에탄올에 넣고 콜라겐 덩어리를 핀셋을 이용해 24-웰 플레이트의 웰 내에 넣고 2.0 mm 직경 Teflon 실린더로 압착한 다음, 2.0 mm 직경 스웨이지 (swage) 연장을 이용해 웰로부터 추출하고, 4 시간 동안 화학 후드 내에서 건조시켰다. 상기 작업을 건조 압착된 콜라겐의 6 개의 실린더 조각을 수득하도록 동시에 6 회 수행하였다.
건조 압착된 콜라겐의 실린더 조각의 가교연결
3.571 ml 의 EDC (1-에틸-3-[3-디메틸아미노프로필]카르보디이미드 히드로클로라이드) 에탄올 용액을 100 ml 부피측정 플라스크 내에 파이펫팅하고 부피를 99.9 % 에탄올을 이용해 100 ml 로 채운 다음, 200 ml 추출 플라스크 내로 붓고, 여기에 상기 수득된 건조된 콜라겐의 6 개의 조각을 첨가하였다. 에탄올을 1 분 동안 데시케이터에서 진공 하에 증발시킨 다음, 데시케이터를 대기압에 두었다. 상기 혼합물을 수평 진탕기를 사용하여 10 분 동안 110 rpm 에서 교반 하에 가교연결시켰다. EDC 용액을 경사분리하고, 콜라겐 실린더를 200 ml 비이커 내에 넣고, 여기에 100 ml PBS (포스페이트 완충액 용액) 를 첨가하고, 1 분 동안 진공 하에 제거하였다. 콜라겐 실린더를 50 rpm 에서 5 분 동안 교반 하에 100ml PBS 로 세정하였고, PBS 는 진공 하에 증발 없이 경사분리된다. 상기 과정을 2 회 반복하였다. 콜라겐 실린더를 50 rpm 에서 5 분 동안 교반 하에 100 ml 99.9 % 에탄올로 세정하고, 에탄올은 진공 하에 증발 없이 경사분리하고, 상기 과정을 2 회 반복한다. 콜라겐 실린더를 100 ml 디에틸에테르로 교반 없이 세정하고, 14 시간 동안 화학 후드 내에서 건조시켰다.
다른 실험을 가교연결 반응을 위해 상이한 시간 (240 분 이하) 으로 수행하였다.
실린더 콜라겐 스캐폴드의 삼중 나선성 (원편광 이색성 분광법 (Circular Dichroism Spectroscopy) 에 의해 제시되는 바와 같은) 을 소유하는 성숙한 고유의 콜라겐 섬유의 % 는, 5000 배율의 SEM (Scanning Electron Microscopy) 현미경사진에 대해, 소프트웨어 Phenom Pro (FEI Phenom Pro Tabletop SEM S/N: 0342; Phenom Pro Suite V. 1.1.0.920; Phenom Application System PW-220-001; Phenom Fribremetric PW-210-001, Phenom World, Dillenburgstraat 9E, 5652 AM Eindhoven, Netherlands 에서 이용가능) 를 사용하는 사진 분석에 의해 측정된 바와 같이, 약 90 % 였다.
b) 유형 I 및 유형 II 콜라겐의 스폰지로부터 유래된 실린더형 부분적으로 섬유성인 스폰지성 콜라겐 스캐폴드의 제조
콜라겐 스폰지의 제조:
EP-B1-810888 의 실시예 1 에 기재된 바와 같은 염기성 및 산성 처리에 따른 탈지에 의해, 새롭게 도살된 돼지의 동결된 연골로부터 재흡수성 (resorbable) 세포외 스폰지성 콜라겐 매트릭스를 제조하였다. 상기 매트릭스는 유형 I 및 유형 II 콜라겐의 혼합물을 함유하기 위한 면역학적 방법에 의해 제시되었다.
건조 압착된 스폰지성 콜라겐의 실린더형 조각의 제조
스폰지성 매트릭스를 초원심 밀을 사용하여 미세하게 분쇄하고 2.0 mm 체 상에서 체질하였다. 0.2 g 의 체질된 콜라겐을 5 ml 의 99.9 % 에탄올에 넣고 콜라겐 덩어리를 핀셋을 이용해 24-웰 플레이트의 웰 내에 넣고 2.0 mm 직경 Teflon 실린더로 압착한 다음, 2.0 mm 직경 스웨이지 연장을 이용해 웰로부터 추출하고, 4 시간 동안 화학 후드 내에서 건조시켰다.
건조 압착된 스폰지성 콜라겐의 실린더형 조각의 가교연결
상기 수득된 건조 압착된 스폰지성 콜라겐의 실린더형 조각을 섬유성 실린더형 콜라겐 스캐폴드에 대해 상기 a) 에 기재된 절차와 유사하게, EDC 로 가교연결하고, PBS, 에탄올 및 디에틸에테르로 세정하였다.
실린더형 부분적으로 섬유성인 스폰지성 콜라겐 스캐폴드 내에 삼중 나선성을 소유하는 성숙한 고유의 섬유의 % 는, 5000 배율의 SEM 현미경사진에 대해 사진 분석 소프트웨어 Phenom Pro 에 의해 측정된 바와 같이, 약 5 % 였다.
c) Bio-Gide® 로부터 유래되는 멤브레인-형상의 섬유성 콜라겐 스캐폴드의 제조
Bio-Gide® 멤브레인 (Geistlich Pharma A.G., Switzerland) 을 50 rpm 에서 5 분 동안 교반 하에 100 ml 99.9 % 에탄올로 세정하고, 에탄올은 진공 하에 증발 없이 경사분리하고, 상기 과정을 2 회 반복한다. 콜라겐 멤브레인을 이후 100 ml 디에틸에테르로 교반 없이 세정하고, 14 시간 동안 화학 후드 내에서 건조시켰다.
섬유성 면 내에 삼중 나선성을 소유하는 성숙한 고유의 섬유의 % 는, 5000 배율의 SEM 현미경사진에 대해 사진 분석 소프트웨어 Phenom Pro 에 의해 측정된 바와 같이, 약 100 % 였다.
실시예 2 α-TCP 의 벌크 소결된 재료의 제조
500 g (건조 중량) 의 혼합물을 위해, 360 g 2칼슘 포스페이트 무수 분말, 144 g 칼슘 카보네이트 분말 및 220 ml 탈이온수를 7 분 동안 500 rpm 에서 실험실 교반기를 사용하여 혼합하였다. 혼합 과정으로부터 슬러리를 즉시 고온 안정한 백금 컵 내로 옮겼다. 여과된 백금 컵을 차가운 용광로 (furnace) 에 두었다. 용광로를 시간 당 60℃ 의 가열 속도를 사용함으로써 1400℃ 로 가열하였다. 가열 공정을 용광로를 바꿈으로서 72 시간 후에 중지시켰다. 샘플을 용광로 내에서 실온까지 냉각시켰다. 벌크 소결된 재료 (상 순수 α-Ca3(PO4)2) 를 용광로 및 백금 컵으로부터 제거하였다. 소결 공정으로부터의 벌크 생성물은 420 g 의 중량 (중량 손실 16.7%) 을 가졌다.
상 순도의 조절은 분말 X-선 회절 분석을 사용하여 수행하였다.
실시예 3 α-TCP 의 미세 입자의 분산액의 존재 하에서 PBS 용액 중의 나노결정질 히드록시아파타이트의 에피택틱성으로 성장된 결정으로의 섬유성 콜라겐 스캐폴드의 코팅.
a) 실시예 1 a) 에서 수득된 섬유성 콜라겐의 실린더형 조각의 코팅
0.5 M PBS 용액의 제조: 100 ml 의 0.5 M NaH2PO4 · H2O 용액 (용액 A) 을 250 rpm 에서 30 분 동안 및 600 rpm 에서 4 시간 동안 교반 하에, 실온에서 멸균 탈이온수에 6.9 g 의 NaH2PO4 · H2O 를 용해함으로써 제조하였다. 100 ml 의 0.5 M Na2HPO4 · 2H2O 용액 (용액 B) 을 250 rpm 에서 30 분 동안 및 600 rpm 에서 4 시간 동안 교반 하에, 실온에서 멸균 탈이온수에 8.9 g 의 Na2HPO4 · 2H2O 를 용해함으로써 제조하였다.
19 ml 의 용액 A 를, 7.3 내지 7.4 의 pH 를 갖는 0.5 M PBS 용액을 산출하도록 81 ml 의 용액 B 와 혼합하였다.
α-TCP 의 미세 입자로의 파쇄: 실시예 2 로부터의 벌크 생성물을 조 크러셔 (jaw crusher) (슬롯 크기 4 mm) 를 사용하여 파쇄하였다. 거친 과립을 체질 기계 및 메쉬 장치 2 mm 및 0.25 mm 를 가진 체 삽입물을 사용함으로써 체질하였다. 체질된 과립을 추가로 플레닛 밀 (planet mill) 을 사용하여 10 ㎛ 미만의 최종 크기로 밀링하였다.
실시예 1 a) 에서 수득된 섬유성 콜라겐 실린더의 나노결정질 히드록시아파타이트의 에피택틱성으로 성장된 결정으로의 코팅:
상기 기재된 바와 같이 수득된 5 g 의 α-TCP 의 미세 입자 및 100 ml 의 0.5 M PBS 용액 및 실시예 1 a) 에서 수득된 섬유성 콜라겐 실린더를 유리 칭량 병에 첨가하고, 이것을 데시케이터 내에 진공 하에 5 분 동안, 이후 대기압에 두었다. 코팅 반응은 항온 구획 내에 5-50 rpm 으로 작동되는 수평 진탕기 상에 병을 놓음으로써 3 일 동안 37 ℃ 에서 진탕 하에 수행하였다.
시각적인 관찰은 콜라겐 스캐폴드가 이의 실린더 형상을 보유하였으나 백색 결정 성분으로 피복되었음을 나타내었다.
실시예 1 a) 에서 수득된 섬유성 콜라겐 실린더 코팅의 다른 실험
a) 의 종료시 실시예 1 에서 수득된 섬유성 콜라겐 실린더의 코팅의 다른 실험은 PBS 용액의 농도를 0.2 M 에서 0.8 M 및 코팅 반응 시간을 12 시간에서 4 일로 변형하여 수행하였다.
시각적인 관찰은 콜라겐 스캐폴드가 이의 실린더 형상을 보유하였으나 백색 결정 성분으로 피복되었음을 나타내었다.
SEM 분석은 결정 성장 뿐 아니라 히드록시아파타이트 결정 어셈블리의 크기, 형태학 및 습성이 PBS 용액의 농도 및 코팅 반응 시간을 달리함으로써 조절될 수 있었음을 보여주었다.
상기 실험에서 코팅된 섬유성 콜라겐 실린더 중의 섬유성 콜라겐 스캐폴드 대 나노결정질 히드록시아파타이트의 에피택틱성으로 성장된 결정의 w/w 비는 90/10 내지 30/70 였다.
b) 실시예 1) b) 에서 수득된 실린더형 부분적으로 섬유성인 스폰지성 콜라겐 스캐폴드 및 실시예 1 c) 에서 수득된 멤브레인 형상의 섬유성 콜라겐 스캐폴드의 나노결정질 히드록시아파타이트의 에피택틱성으로 성장된 결정으로의 코팅:
실시예 1 b) 에서 수득된 실린더형 부분적으로 섬유성인 콜라겐 스폰지 실린더의 코팅 실험 또는 실시예 1c) 의 멤브레인-형상 섬유성 콜라겐 스캐폴드의 섬유성 면의 코팅 실험을, PBS 용액의 농도를 0.2 M 에서 0.8 M 및 코팅 반응 시간을 12 시간에서 4 일로 변형하여 수행하였다.
시각적인 관찰은 콜라겐 스캐폴드가 이의 형상을 보유하였으나 백색 결정 성분으로 피복되었음을 나타내었다.
SEM 분석은 결정 성장 뿐 아니라 히드록시아파타이트 결정 어셈블리의 크기, 형태학 및 습성이 PBS 용액의 농도 및 코팅 반응 시간을 달리함으로써 조절될 수 있었음을 보여주었다.
상기 실험에서 섬유성 콜라겐 스캐폴드 대 나노결정질 히드록시아파타이트의 에피택틱성으로 성장된 결정의 w/w 비는, 실시예 1b) 에서 수득된 코팅된 부분적으로 섬유성인 콜라겐 스폰지 실린더에 대해서는 90/10 내지 30/70 및 코팅된 멤브레인-형상의 콜라겐 스캐폴드에 대해서는 90/10 내지 50/50 였다.
실시예 4 나노결정질 히드록시아파타이트의 에피택틱성으로 성장된 결정으로 코팅된 적어도 부분적으로 섬유성인 콜라겐 스캐폴드의 특성
a) 물리화학적 특성:
측정된 다공성 (공극 부피) 은 실시예 1a) 에서 수득된 섬유성 콜라겐의 실린더형 조각의 경우 96 v/v % (가교연결 조건을 달리함) 및 실시예 3)a) 에서 수득된 히드록시아파타이트 코팅된 실린더형 조각의 경우 85 내지 95 % v/v 였다.
수은 다공측정 (porosimetry) 에 의해 측정된 비표면적은 실시예 1a) 에서 수득된 섬유성 콜라겐의 실린더형 조각의 경우 (가교연결 조건을 달리함) 1.5 내지 2.5 ㎡/g 및 실시예 3)a) 에서 수득된 히드록시아파타이트 코팅된 실린더형 조각의 경우 20 내지 60 ㎡/g 였다.
측정된 다공성 (공극 부피) 은 실시예 1 b) 에서 제조된 콜라겐 스폰지 실린더형 스캐폴드의 경우 약 96 v/v % 및 실시예 3) b) 에서 수득된 히드록시아파타이트 코팅된 콜라겐 스폰지 실린더의 경우 88 내지 92 % v/v 였다.
수은 다공측정에 의해 측정된 비표면적은 실시예 1 b) 에서 제조된 콜라겐 스폰지 실린더형 스캐폴드의 경우 2 ㎡/g 및 실시예 3 b) 에서 수득된 코팅된 콜라겐 스폰지 실린더의 경우 25 내지 50 ㎡/g 였다.
b) 기계적 특성:
b1) 압착 강도
압착 강도 (압력에 대한 저항성), 즉, 이들의 본래 높이의 50 % 까지 실린더의 압착을 위해 적용하게 되는 최대 압력을, 기계적 압착 시험 기계 (Zwick/Roell 에 의해 제조된 Proline Z010) 를 사용하여 측정하였다.
습윤 상태에서 측정된 압착 강도는 실시예 1a) 에서 수득된 섬유성 콜라겐의 실린더 조각의 경우 0.3 내지 0.7 MPa (가교연결 조건을 달리함) 및 실시예 3)a) 에서 수득된 히드록시아파타이트 코팅된 실린더 조각의 경우 1.1 내지 3.5 Mpa 였고, 압착 강도는 히드록시아파타이트 코팅된 실린더형 조각에 존재하는 히드록시아파타이트의 % 와 함께 증가한다.
b2) 탄력성
탄력성, 즉, 본래 높이의 50 % 까지 압착 후 회복되는 본래 높이의 % 를, 기계적 압착 시험 기계 (Zwick/Roell 에 의해 제조된 Proline Z010) 를 사용하여 측정하였다.
습윤 상태에서 측정된 탄력성은 실시예 1a) 에서 수득된 섬유성 콜라겐의 실린더 조각의 경우 95 내지 99 % (가교연결 조건을 달리함) 및 실시예 3)a) 에서 수득된 히드록시아파타이트 코팅된 실린더 조각의 경우 92 내지 100 % 였고, 상기 히드록시아파타이트 코팅된 조각 내에 존재하는 히드록시아파타이트의 % 는 탄력성에 영향을 주지 않는 것으로 보인다.
b3) 토크에 대한 저항성
Straumann® Bone Block Fixation Method (참조, http://www.straumann.ch/ch-index/products/products-biologics/products-bone-block-fixation.htm) 과 유사한 프로토콜을 사용하였다.
간략하게는, Teflon 실린더 (돼지 하악골의 것에 필적하는 기계적 특성을 가짐) 및 일부 실시예 1a) 에서 수득된 섬유성 콜라겐의 건조된 실린더형 조각 (가교연결 조건을 달리함) 및 실시예 3)a), 2 에서 수득된 건조된 히드록시아파타이트 코팅된 실린더형 조각의 일부 내에 0.9 mm 구멍을 뚫기 위한 드릴러 (driller), 및 1.5X12 mm 나사를 포함하는 자석 나사 드라이버 (Klinge fTi Mikro Schr Kreuzschl, Ref. 75.23.19, Medicon 에서 이용가능) 를 사용하여, 실린더형 조각이 파괴되지 않으면서 Teflon 실린더에 나사로 죌 수 있을 최대 토크를 측정하였다.
실시예 1a 에서 수득된 섬유성 콜라겐의 모든 시험된 비코팅된 실린더형 조각은 약 20 Ncm 의 토크에 대한 저항성을 나타내는 반면, 실시예 3)a) 에서 수득된 모든 시험된 히드록시아파타이트 코팅된 실린더형 조각은 약 60 Ncm 초과의 토크에 대한 저항성을 나타내었고, 상기 히드록시아파타이트 코팅된 조각 내에 존재하는 히드록시아파타이트의 % 는 토크에 대한 저항성에 영향을 주지 않는 것으로 보인다. 약 30 Ncm 의 토크에 대한 저항성은 일반적으로 골성 신체 부분에 대해 조각을 나사로 죄기에 충분한 것으로 당업계에서 고려된다.
토크에 대한 저항성의 현저한 증가는 히드록시아파타이트와 콜라겐 스캐폴드 사이의 강한 에피택틱성 결합으로 인한 것이다.
게다가, 종래 기술의 조건에 따라 히드록시아파타이트가 콜라겐 스캐폴드 상에 또는 내부에 침전되었고 따라서 흡착에 의해 콜라겐 스캐폴드에 약하게 연결되는 이들 가교연결된 콜라겐 스캐폴드 상에 수행된 비교 실험에서, 토크에 대한 저항성은 상당히 증가하지 않았다.
c) SEM 에 의해 측정되는 히드록시아파타이트 결정 어셈블리 형태학
도 1 및 2 는 0.2M 의 PBS 농도로 12 시간의 코팅 반응 시간 동안 O,8M 콜라겐 및 24 시간의 코팅 시간 동안 실시예 3 b) 에 기재된 바와 같이 코팅된 실시예 1c) 의 멤브레인-형상의 콜라겐 스캐폴드의 섬유성 면의 SEM 현미경사진을 나타낸다.
도 1 에서 콜라겐 원섬유와 밀접하게 상호연결된 6각형 대칭을 가진 미세하게 분배된 나노-크기 결정 판상체의 작은 히드록시아파타이트 결정 어셈블리 및 도 2 에서 콜라겐 섬유 구조를 완전하게 피복하는 6각형 히드록시아파타이트 결정 어셈블리의 작은 마이크론-크기 장미모양 (rosette: 로제트)-유사 응집체를 관찰할 수 있다.
d) 뼈 형성 세포에 의한 콜로니화의 어세이
인간 MG63 골모세포-유사 세포는 실시예 3 b) 에서 수득된 코팅된 멤브레인-형상의 콜라겐 스캐폴드의 모든 부위에 높은 증식 속도로 콜로니화된 것으로 제시되었다. 도 3 을 참조한다.
세포독성 시험에서, 실시예 3 b) 에서 수득된 코팅된 멤브레인-형상의 콜라겐 스캐폴드는 Bio-Gide® 멤브레인으로 수득된 것에 필적하는 결과를 나타냈다.

Claims (16)

  1. 적어도 부분적으로 섬유성인 콜라겐 스캐폴드를 포함하는 생체모방 콜라겐-히드록시아파타이트 복합재 재료로서, 상기 적어도 부분적으로 섬유성인 콜라겐 스캐폴드는 원편광 이색성 분광법 (Circular Dichroism Spectroscopy) 에 의해 나타나면, 삼중 나선성 (helicity) 을 갖는 성숙한 고유의 콜라겐 섬유를 포함하고, 상기 성숙한 고유의 콜라겐 섬유는 나노결정질 히드록시아파타이트의 에피택틱성으로 성장된 결정으로 피복되고, 상기 에피택틱성으로 성장된 나노결정은 30 내지 50 nm 의 길이 및 14 내지 25 nm 의 폭을 갖고, 나노결정질 히드록시아파타이트의 에피택틱성으로 성장된 결정이 X-선 회절 분석에 의해 측정되면, 30 ± 15 nm 이상의 두께를 갖는 층을 형성하는, 생체모방 콜라겐-히드록시아파타이트 복합재 재료.
  2. 제 1 항에 있어서, 적어도 부분적으로 섬유성인 콜라겐 스캐폴드가 SEM 현미경사진 상의 사진 분석 및 원편광 이색성 분광법 (Circular Dichroism Spectroscopy) 에 의해 측정되면, 이의 외부 표면 상에 2 % 이상의 성숙한 고유의 콜라겐 섬유를 포함하는, 생체모방 콜라겐-히드록시아파타이트 복합재 재료.
  3. 제 1 항에 있어서, 적어도 부분적으로 섬유성인 콜라겐 스캐폴드가 SEM 현미경사진 상의 사진 분석 및 원편광 이색성 분광법 (Circular Dichroism Spectroscopy) 에 의해 측정되면, 이의 외부 표면 상에 10 % 이상의 성숙한 고유의 콜라겐 섬유를 포함하는, 생체모방 콜라겐-히드록시아파타이트 복합재 재료.
  4. 제 1 항에 있어서, 섬유성 콜라겐 스캐폴드 대 나노결정질 히드록시아파타이트의 에피택틱성으로 성장된 결정의 w/w 비가 5:95 내지 95:5, 또는 10:90 내지 90:10 인, 생체모방 콜라겐-히드록시아파타이트 복합재 재료.
  5. 제 1 항에 있어서, 생체모방 콜라겐-히드록시아파타이트 복합재 재료가 성형체인, 생체모방 콜라겐-히드록시아파타이트 복합재 재료.
  6. 제 5 항에 있어서, 성형체가, 그 구조가 골성 신체 부분의 프로파일을 갖는 뼈 대체 재료인, 생체모방 콜라겐-히드록시아파타이트 복합재 재료.
  7. 제 5 항에 있어서, 성형체가 건조 상태로 30 Ncm 이상의 토크에 대한 저항성을 갖는, 생체모방 콜라겐-히드록시아파타이트 복합재 재료.
  8. 제 1 항에 있어서, 생체모방 콜라겐-히드록시아파타이트 복합재 재료가 멤브레인인, 생체모방 콜라겐-히드록시아파타이트 복합재 재료.
  9. 하기 단계를 포함하는, 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항의 생체모방 콜라겐-히드록시아파타이트 복합재 재료의 제조 방법:
    a) 적어도 부분적으로 섬유성인 콜라겐 스캐폴드는 원편광 이색성 분광법 (Circular Dichroism Spectroscopy) 에 의해 나타나면, 삼중 나선성을 갖는 성숙한 고유의 콜라겐 섬유를 포함하고, 상기 적어도 부분적으로 섬유성인 콜라겐 스캐폴드를, 알파-TCP, 베타-TCP, 테트라칼슘 포스페이트(TTCP), 8칼슘 포스페이트 5수화물, 2칼슘 포스페이트 또는 2칼슘 포스페이트 2수화물을 함유하는 포스페이트 완충액 (PBS) 인 포화 Ca2+ / HxPO4 (3-x)(X는 0, 1 또는 2) 의 포화 수용액 중에 침지시켜 복합재 이식물 재료의 형성 공정을 수행하며, 이에 의해 에피택틱성으로 성장된 히드록시아파타이트 나노결정이 상기 성숙한 고유의 콜라겐 섬유 상에 형성되고, 상기 에피택틱성으로 성장된 히드록시아파타이트 나노결정이 30 내지 50 nm 의 길이 및 14 내지 25 nm 의 폭을 갖는 단계, 및
    b) 수용액으로부터 고체 재료를 분리하고, 물로 린스하고 건조시킴으로써 복합재 이식물 재료의 형성 공정을 중단하는 단계.
  10. 제 9 항에 있어서, 단계 a) 에서 수용액의 pH 가 5.5 내지 9.0 의 범위 내에 남아있는 제조 방법.
  11. 제 9 항에 있어서, 단계 a) 에서 수용액의 pH 가 6.5 내지 8.0 의 범위 내에 남아있는 제조 방법.
  12. 제 9 항에 있어서, 단계 a) 에서의 온도가 25 내지 45 ℃ 인 제조 방법.
  13. 제 9 항에 있어서, 단계 a) 에서의 온도가 35℃ 내지 42℃ 인 제조 방법.
  14. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 대상 또는 동물에서 결함 부위에서의 뼈 형성, 뼈 재생, 뼈 보수 및 뼈 대체 중 하나 이상을 위한 이식물 또는 보철로서 사용하기 위한, 생체모방 콜라겐-히드록시아파타이트 복합재 재료.
  15. 제 8 항에 있어서, 조합된 뼈 및 연골 재생을 위한 이식물로서 사용하기 위한, 생체모방 콜라겐-히드록시아파타이트 복합재 재료가 멤브레인인, 생체모방 콜라겐-히드록시아파타이트 복합재 재료.
  16. 제 9 항에 있어서, 하기 c) 단계를 추가로 포함하는, 제조 방법:
    c) 상기 단계 b) 로부터 유래하는 분리된 재료를 멸균시키는 단계.
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