BR112016001093B1 - material compósito de hidroxiapatita-colágeno biomimético - Google Patents
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Abstract
"MATERIAL COMPÓSITO DE HIDROXIAPATITA-COLÁGENO BIOMIMÉTICO". A invenção refere-se a: -um material compósito de hidroxiapatita-colágeno biomimético compreendendo um andaime de colágeno pelo menos parcialmente fibroso incluindo fibras de colágeno nativa maduras gue possuem helicidade tripla como mostrado por Espectroscopia de Dicroísmo circular, em que aquelas fibras de colágeno nativo maduro são pelo menos parcialmente cobertas com cristais crescidos de forma epitáctica de hidroxiapatita nanocristalina, pelo que os nanocristais crescidos de forma epitáctica têm a mesma morfologia que mineral de osso humano e o mesmo tamanho que mineral de osso humano, a saber, um comprimento de 30 a 50 nm e uma largura de 14 a 25 nm, -um processo de preparar o material compósito de hidroxiapatita-colágeno biomimético acima compreendendo as etapas de: a) imergir um andaime de colágeno pelo menos parcialmente fibroso incluindo fibras de colágeno nativo maduras acima em uma solução aquosa saturada de Ca2+ saturado/HxP04(3-x), para começar o processo de formação do material de implante compósito pelo que nanocristais de hidroxiapatita crescidos de forma epitáctica serão formadas nas fibras de colágeno nativo maduras, os nanocristais de hidroxiapatita crescidos de forma epitáctica tendo a mesma morfologia e mesmo tamanho que o mineral (...).
Description
[0001] A invenção se refere a um novo material compósito de hidroxiapatita-colágeno biomimético compreendendo pelo menos um arcabouço de colágeno parcialmente fibroso e hidroxiapatita, em que as fibras de colágeno são pelo menos parcialmente cobertas com cristais epitacticamente crescidos de hidroxiapatita nanocristalina, um processo para preparar esse material e o uso do mesmo como um implante para suportar formação de osso, regeneração de osso, reparo de osso e/ou substituição de osso em um local de defeito em um sujeito humano ou um animal, ou como um implante para regeneração combinada de osso e cartilagem.
[0002] Defeitos em estrutura óssea surgem em uma variedade de circunstâncias, como trauma, doença e cirúrgica e há ainda necessidade de reparo eficaz de defeitos de osso em vários campos cirúrgicos. Inúmeros materiais e composições naturais e sintéticos foram usados para estimular cura no local de um defeito de osso.
[0003] Um material substituto de osso osteocondutivo, natural bem conhecido que promove crescimento de osso em defeitos ósseos periodontais e maxilo-faciais ou defeitos ósseos no campo ortopédico é Geistlich Bio-Oss® ou Geistilich Orthoss, respectivamente, comercialmente disponíveis junto a Geistlich Pharma AG. Esse material mineral de osso à base de hidroxiapatita é fabricado de osso natural por um processo descrito na patente US número 5.167.961, que permite preservação da arquitetura trabecular e estrutura nanocristalina do osso natural.
[0004] Materiais à base de hidroxiapatita, entretanto, nem sempre são adaptados para reparar defeitos ósseos grandes, notadamente em ortopedia, sendo frágeis e não suficientemente resistentes a tensões mecânicas para serem aparafusáveis, por exemplo, em uma parte de corpo ósseo.
[0005] Desse modo, há necessidade de um material de enxerto de osso sintético ou parcialmente sintético feito para lembrar de perto osso natural, notavelmente em sua resistência a tensões mecânicas. Tal material de enxerto de osso sintético ou parcialmente sintético biomimético para certas aplicações, notavelmente para reparar defeitos de osso grande, seria uma substituição útil de enxertos de osso derivados de osso natural.
[0006] Osso natural é um material compósito consistindo em água e uma matriz de colágeno consistindo principalmente de colágeno tipo I, que é intimamente combinado com cristais inorgânicos, principalmente de hidroxiapatita. Fibras de colágeno tipo I e hidroxiapatita respondem aproximadamente por peso/peso 25 a 30% e peso/peso 65 a 70% do peso seco de osso natural, respectivamente. A matriz de colágeno fornece ao osso sua flexibilidade e resiliência enquanto o material inorgânico fornece ao osso sua resistência e rigidez, a organização das duas fases fornecendo um grau elevado de elasticidade e tenacidade do compósito. Um exame completo de estrutura de osso a partir do nivel angstrom (cristal mineral) até o nivel de micron (lamelas) foi apresentado por Weiner, S. e outros, 1992, FASEB, 6:879-885.
[0007] Uma característica importante de osso natural é a morfologia e o tamanho muito pequeno dos cristais de hidroxiapatita, que para mineral de osso humano é: grupo de espaço hexagonal P6a/m, aproximadamente 30 a 50 nm em comprimento (eixo c: [0,0,1]) e 14 a 25 nm é (eixos a e b: [1,0,0] e [0,1,0]). Vide Weiner S. e outros citados acima.
[0008] N.A. Barrios et al. em "Density Functional Study of Binding of Glycine, Proline and Hydroxyproline to the Hydroxyapatite and Surfaces", 2009, Langmuir 25(9), 5018-5025 e "Molecular Dynamics Simulation of the Early Stages of Nucleation of Hydroxyapatite at a Collagen Template", Crystal Growth Design, 2012, 12, 756-763, mostram que na temperatura do corpo humano a nucleação e acoplamento de hidroxiapatita às fibras de colágeno podem ocorrer em locais diferentes dos blocos de construção de aminoácido de colágeno glicina, prolina e hidroxiprolina, a saber na superfície de cristal (0001) e (01 10), acoplamento na superfície de cristal (01 10) sendo preferido. Isso prova que no corpo humano a estrutura da fibra de colágeno e seus blocos de construção de aminoácido fornece um substrato exatamente correspondendo à estrutura de cristal de hidroxiapatita, portanto a formação de osso segue uma via de crescimento epitáctico para interconectar os cristais de hidroxiapatita e as fibras de colágeno. A via de crescimento epitáctico é termodinamicamente favorecida fornecendo a configuração mais baixa de energia.
[0009] Foram feitas tentativas na técnica anterior para fornecer materiais compósitos de hidroxiapatita-colágeno que são similares a osso natural.
[00010] A patente US no. 5.231.169 descreve um método de mineralizar colágeno com um mineral de fosfato de cálcio que compreende preparar o mineral de fosfato de cálcio na presença de uma dispersão de fibrilas de colágeno dispersas em solução aquosa básica tendo um pH na faixa 10-13, adicionar à dispersão durante um periodo de pelo menos uma hora uma fonte de cálcio solúvel e fosfato solúvel na razão correta de modo a produzir o mineral de fosfato, e coletar o colágeno mineralizado. Colágeno mineralizado com fosfato de cálcio estavelmente distribuído na matriz de colágeno é revelado para ser desse modo obtido.
[00011] A patente US no. 5.739.286 revela um método de fazer um material de aumento de osso que lembra osso natural por mineralizar fibras de colágeno durante um periodo de 7 dias em uma câmara de difusão dupla, um reservatório contendo 0.05 M tampão tris e 0.1 M de cloreto de cálcio e o outro reservatório contendo 0.05 M tampão tris e 0.1 M de fosfato de potássio. Um precipitado de fosfato de cálcio é revelado como sendo formado nas fibras de colágeno, varrendo micrografias de elétron das fibras de colágeno mineralizado sendo morfologicamente similares a agregados semelhantes à placa de hidroxiapatita encontrado precipitado em materiais de biovidro embebidos em plasma de sangue sintético.
[00012] As patentes US nos. 6.395.036 e 6.589.590 descrevem um método de fazer osso artificial por fornecer uma membrana de colágeno com soluções de ions de cálcio e de ions de fosfato em lados opostos da membrana, aqueles ions difundindo através da membrana, encontrando e precipitando como um material de hidroxiapatita dentro da membrana de colágeno.
[00013] As patentes US nos. 7.514.249 e 7.547.449 revelam um método de fazer uma esponja de colágeno biomimético mineralizada com fosfato de cálcio, em que o fosfato de cálcio é incorporado nos espaços intersticiais das fibrilas de colágeno, utilizando uma solução de 6 mM de cloreto de cálcio e 200 p.g/ml tanto de poli (alfa beta-DL-ácido aspártico) como poli(ácido vinil fosfônico), seguido por difusão de vapor de fosfato de amónio dibásico.
[00014] Ficai A. e outros, 2010, Chemical Engineering 160, 794-800 revela um processo de preparar um material compósito de apatita-colágeno começando a partir de um gel de colágeno e precursores de hidroxiapatita onde o pH é ajustado em aproximadamente 9 usando uma solução de hidróxido de sódio como para assegurar precipitação de hidroxiapatita e fibrilogênese. Cristais de hidroxiapatita são desse modo formados "na faixa de nanômetro, entre alguns nanômetros e até 40 nm." Uma vez que a nucleação de hidroxiapatita ocorre durante fibrilogênese, durante a qual automontagem das moléculas de colágeno muda as posições dos blocos de construção de aminoácido de colágeno (que consequentemente não correspondem exatamente com a estrutura de cristal de hidroxiapatita), pode não haver qualquer crescimento epitáctico dos cristais de hidroxiapatita: aqueles cristais são precipitados como mencionados naquela publicação.
[00015] A publicação de patente US 2009/0232875 descreve uma estrutura de multicamadas compreendendo uma primeira camada superior consistindo em uma matriz orgânica contendo colágeno e ao menos uma camada inferior de uma material de compósito contendo hidroxiapatita e colágeno (parágrafo [0001]) . O compósito é obtido por um processo de nucleação direta de hidroxiapatita na automontagem de fibrilas de colágeno em um pH de 9-11 e uma temperatura de 35 a 40°C, os tamanhos dos cristais sendo 12-15 nm ao longo do eixo de fibra (parágrafos [0082] e [0089]. Uma vez que, como em Ficai e outros acima, nucleação de hidroxiapatita ocorre durante automontagem das moléculas de colágeno (as últimas mudando as posições dos blocos de colágeno de construção de aminoácido) e além disso essa nucleação "envolve uma carbonatação da fase inorgânica, por exemplo, incorporação de grupos CO32’ na treliça de hidroxiapatita (vide o parágrafo [0077], linhas 25-28), hidroxiapatita carbonatada tendo uma estrutura de cristal diferente (Monoclinic crystal structure with space group Pb or P21/b: vide Elliot J.C. 1994: Structure and Chemistry of the Apatites and Other Calcium Phosphates. Studies in inorganic Chemistry 18. Elsevier Science, ISBN 0-444-81582-1), não pode haver qualquer crescimento epitáctico dos cristais de hidroxiapatita: aqueles cristais crescem portanto por precipitação nos "nano-núcleos formados na fibrila de colágeno.... paralela às fibras" (vide parágrafo [0090]).
[00016] Nos materiais compósitos de hidroxiapatita-colágeno da técnica anterior a hidroxiapatita é precipitada sobre ou dentro do arcabouço de colágeno, a ligação com a última sendo somente uma ligação fisica fraca, por exemplo, por adsorção. Tal ligação física fraca não é capaz de fornecer ao material a elasticidade, resistência a torque e tenacidade de osso natural no qual os cristais de hidroxiapatita são epitacticamente crescidos nas fibras de colágeno.
[00017] Um objetivo da invenção é desse modo fornecer um compósito de hidroxiapatita-colágeno biomimético em que haja uma ligação forte entre o arcabouço de colágeno e os cristais de hidroxiapatita.
[00018] Nos materiais compósitos de hidroxiapatita-colágeno da técnica anterior os cristais de hidroxiapatita não têm a morfologia (parâmetros de treliça e razão de face de cristal) e são de tamanho muito pequeno de mineral de osso natural, em particular mineral de osso humano.
[00019] Outro objetivo da invenção é desse modo fornecer um compósito hidroxiapatita-colágeno biomimético em que os cristais de colágeno têm a mesma morfologia e mesmo tamanho que o mineral de osso humano.
[00020] A patente europeia no. 2.445.543 revela as condições sob as quais nanocristais de hidroxiapatita epitacticamente crescem em um núcleo de oc-TCP sinterizado, aqueles nanocristais tendo a mesma morfologia e mesmo tamanho que mineral de osso humano.
[00021] Descobriu-se que os objetivos acima podem ser obtidos por adaptar as condições descritas na patente europeia no. 2.445.543 para epitacticamente crescer nanocristais de hidroxiapatita em fibras de colágeno, aqueles nanocristais tendo a mesma morfologia e mesmo tamanho que mineral de osso humano.
[00022] Um material compósito de hidroxiapatita-colágeno biomimético é desse modo obtido com excelentes propriedades mecânicas, notavelmente elevada resistência à tensão mecânica, em particular elevada resistência a torque (pelo menos 30 Nem, em geral aproximadamente 60 Nem), graças à ligação epitáctica forte entre o arcabouço de colágeno e os cristais de hidroxiapatita. Esse material após implantação em um corpo humano é prontamente colonizado por células de formação de osso e mostra excelentes propriedades de osteocondutividade e osseointegração graças notavelmente ao fato de que os cristais de hidroxiapatita têm a mesma morfologia e mesmo tamanho que mineral de osso humano.
[00023] Os objetivos acima são obtidos pela invenção como definido nas reivindicações apensas.
[00024] A invenção desse modo se refere a um material compósito de hidroxiapatita-colágeno biomimético compreendendo pelo menos um arcabouço de colágeno parcialmente fibroso incluindo fibras de colágeno nativo maduras que possuem helicidade tripla como mostrado por Espectroscopia de Dicroismo circular, em que aquelas fibras de colágeno nativo maduras são pelo menos parcialmente cobertas com cristais epitacticamente crescidos de hidroxiapatita nanocristalina, pelo que os nanocristais epitacticamente crescidos têm a mesma morfologia que mineral de osso humano e o mesmo tamanho que mineral de osso humano, isto é, um comprimento de 30 a 50 nm e uma largura de 15 a 25 nm.
[00025] O termo "a mesma morfologia que mineral de osso humano" significa que a relação dimensional das faces de cristal (que determina os formatos externos de cristais) é igual ao mineral de osso humano, no caso mencionado por último os cristais são plaquetas genericamente hexagonais.
[00026] O crescimento epitáctico de hidroxiapatita sobre colágeno pode somente ocorrer em fibras de colágeno, como mostrado pelas publicações de N.A. Barrios e outros citadas acima. Tais fibras devem ser firas de colágeno nativo maduras, isto é, fibras de colágeno onde (a) as fibrilas foram montadas por automontagem dos blocos de construção de colágeno, (b) as cadeias de alfa 1 e alfa 2 foram formadas e (c) a hélice tripla foi formada por reticulação natural de duas cadeias de alfa 1 com uma cadeia de alfa 2. Tais fibras de colágeno nativo maduras possuem helicidade tripla conforme mostrado por Espectroscopia de Dicroísmo circular. Em fibras de colágeno nativo maduras as respectivas posições dos blocos de construção de colágeno glicina, prolina e hidroxiprolina são fixas, exatamente correspondendo à estrutura de hidroxiapatita, desse modo permitindo a interconexão epitáctica entre hidroxiapatita e as fibras de colágeno nativo maduras. Fibras em formação onde as fibras se automontam, as cadeias alfa 1 e alfa 2 estão formando ou a hélice tripla está formando não são apropriadas para crescimento epitáctico de hidroxiapatita. realmente, em tais fibras em formação as posições dos blocos de construção de colágeno mudam, desse modo correspondendo exatamente à estrutura de cristal de hidroxiapatita.
[00027] Desse modo é necessário que o arcabouço de colágeno seja pelo menos parcialmente fibroso em sua superfície externa e inclua fibras de colágeno nativo maduras possuindo helicidade tripla como mostrado por Espectroscopia de Dicroismo circular.
[00028] O arcaboço de colágeno pelo menos parcialmente fibroso compreende em geral em sua superfície externa pelo menos 2% de fibras de colágeno nativo maduro, preferivelmente pelo menos 5% de fibras de colágeno nativo maduro, mais preferivelmente pelo menos 10% de fibras de colágeno nativo maduro, como determinado por análise de imagem em micrografias SEM e Espectroscopia de dicroismo circular.
[00029] O arcabouço de colágeno pelo menos parcialmente fibroso é geralmente composto de colágeno tipo I, porém também pode incluir outros tipos de colágeno, notavelmente colágeno tipo II e tipo III.
[00030] O arcabouço de colágeno pelo menos parcialmente fibroso é genericamente uma matriz de colágeno derivado de um material natural ou uma matriz de colágeno semiartificial ou artificial, por exemplo, preparada por eletrofiação de uma suspensão de partículas de colágeno ou uma solução de colágeno solúvel, o colágeno sendo derivado de um material natural ou sendo colágeno recombinante.
[00031] Os cristais epitacticamente crescidos de hidroxiapatita nanocristalina normalmente formam uma camada tendo uma espessura de pelo menos 30 ± 15 nm, como determinado por análise de difração de raios X. a espessura de pelo menos 30 ± 15 nm corresponde a uma camada de nanocristais de hidroxiapatita em orientação epitaxial.
[00032] A camada epitacticamente crescida de hidroxiapatita nanocristalina pode compreender uma camada única ou múltiplas camadas de nanocristais de hidroxiapatita em orientação epitaxial para o substrato de fibras de colágeno. A espessura da camada epitacticamente crescida de hidroxiapatita nanocristalina, que é relacionada ao número de tais camadas de nanocristais de hidroxiapatita em orientação epitaxial, será selecionada de acordo com a aplicação pretendida do material substituto de osso como um implante no corpo humano.
[00033] A espessura da camada epitacticamente crescida de hidroxiapatita nanocristalina é relacionada à razão peso/peso do arcabouço de colágeno fibroso para os cristais epitacticamente crescidos de hidroxiapatita nanocristalina, a razão sendo genericamente entre 5:95 e 95:5, preferivelmente entre 10:90 e 90:10, mais preferivelmente entre 20:80 e 60:40, em particular entre 30:70 e 70:30.
[00034] O material compósito de hidroxiapatita-colágeno biomimético pode ser um particulado ou granulado, as partículas ou grânulos tendo um tamanho e formato desejados. Em geral as partículas ou grânulos são aproximadamente esféricos e têm um diâmetro de 20 a 5000 pm.
[00035] O material compósito de hidroxiapatita-colágeno biomimético pode ser também um corpo moldado de qualquer formato, por exemplo, um bloco cúbico ou paralelepipédico, uma placa, um cilindro, uma chave afilada, um prego, um parafuso, um pino ou uma estrutura tendo o perfil de uma parte de corpo óssea como notavelmente um quadril, uma clavícula, uma costela, uma mandíbula ou uma parte do crânio. Tal corpo moldado pode ter uma resistência suficiente a torque para ser aparafusável, por exemplo, em uma parte óssea do corpo, isto é, uma resistência a torque de pelo menos 30 Nem no estado seco, preferivelmente uma resistência a torque de pelo menos 50 Nem no estado seco.
[00036] O material compósito de hidroxiapatita-colágeno biomimético pode ser também um corpo no formato de membrana.
[00037] Um arcabouço de colágeno adequado para um corpo no formato de membrana é a membrana Bio-Gide® (Geistlich Pharma A.G., Suíça) fabricada de acordo com o processo descrito em EP-Bl-1676592, que tem um lado fibroso permitindo crescimento interno de células de formação de osso e um lado liso atuando como barreira contra crescimento interno de células não de formação de osso. Tal membrana será em geral revestida somente no lado fibroso com nanocristais de hidroxiapatita epitacticamente crescidos, desse modo fornecendo naquele lado condições muito favoráveis para a formação de osso.
[00038] O material compósito de hidroxiapatita-colágeno biomimético da invenção pode ser usado como um implante ou prótese para formação de osso, regeneração de osso, reparo de osso e/ou substituição de osso em um local de defeito de osso, notavelmente um local de defeito de osso grande, em um sujeito humano ou um animal.
[00039] A invenção desse modo também se refere a: -o uso daquele material compósito de hidroxiapatita-colágeno biomimético como um implante ou prótese para formação de osso, regeneração de osso, reparo de osso e/ou substituição de osso em um local de defeito em um sujeito humano ou um animal e -um método de promover formação de osso, regeneração de osso e/ou reparo de osso em um local de defeito em um sujeito humano ou um animal por implantar um material compósito de hidroxiapatita-colágeno biomimético.
[00040] Um corpo no formato de membrana de material compósito de hidroxiapatita-colágeno biomimético da invenção em que somente um lado é revestido com nanocristais de hidroxiapatita epitacticamente crescidos pode ser usado como um implante para regeneração combinada de osso e cartilagem, o lado revestido sendo orientado de modo que esteja voltado para o defeito de osso e o lado não revestido sendo orientado de modo que esteja voltado para o defeito de cartilagem.
[00041] A invenção desse modo também se refere ao uso de um corpo no formato de membrana de material compósito de hidroxiapatita-colágeno biomimético como um implante para regeneração combinada de osso e cartilagem.
[00042] A invenção se refere ainda a um processo para reparar o material compósito de hidroxiapatita-colágeno biomimético acima definido compreendendo as etapas de: a) Imergir um arcabouço de colágeno pelo menos parcialmente fibroso incluindo fibras de colágeno nativo maduras acima possuindo helicidade tripla como mostrado por Espectroscopia de Dicroismo circular em uma solução aquosa saturada de Ca2+ saturado/HxPCg(3-x), para realizar o processo de formação do material de implante compósito pelo que nanocristais de hidroxiapatita crescidos de forma epitáctica são formados naquelas fibras de colágeno nativo maduras, os nanocristais de hidroxiapatita crescidos de forma epitáctica tendo a mesma morfologia e mesmo tamanho que o mineral de osso humano, b) Parar a formação de nanocristais de hidroxiapatita crescidas de forma epitáctica por separar material sólido a partir da solução aquosa, enxaguar com água e secar, e c) Opcionalmente esterilizar o material separado vindo da etapa b) .
[00043] O arcabouço de colágeno pelo menos parcialmente fibroso é genericamente uma matriz de colágeno derivada de um material natural ou matriz de colágeno semiartificial ou artificial, que tem um pré-formato compatível com o formato final desejado para o material compósito biomimético e um grau de reticulação suficiente para as propriedades mecânicas desejadas do material compósito biomimético. Se necessário, a preparação daquele arcabouço de colágeno incluirá uma etapa para fornecer ao mesmo o pré-formato desejado e uma etapa de reticulação para fornecer ao mesmo uma coesão e tenacidade suficientes.
[00044] Antes de realizar a etapa a) o arcabouço de colágeno pelo menos parcialmente fibroso é genericamente limpo em um álcool como, por exemplo, etanol e isopropanol e um éter como, por exemplo, éter dietilico.
[00045] A solução aquosa saturada de Ca2+ / HxPO4(3-x) saturado pode ser uma solução de tampão de fosfato (PBS) contendo alfa-TCP, beta-TCP, TTCP, pentaidrato de fosfato octocálcio, fosfato de dicálcio, ou diidrato de fosfato de dicálcio finamente dispersos. Tal dispersão de fosfato de cálcio em uma solução de PBS permite que a solução permaneça saturada em Ca2+ / HxPO4(3-xi quando ions de Ca2+ e HxPO4(3-x) são consumidos para formar hidroxiapatita.
[00046] A solução aquosa saturada de Ca2+ / HxPCç(3-x) saturado pode ser também uma solução de tampão de fosfato na qual ions de Ca2+ e HxPOii3-x) são adicionados para compensar por seu consumo na formação de hidroxiapatita, por exemplo, por gotejar uma solução contendo tais ions no meio de reação.
[00047] A solução de tampão de fosfato tem em geral uma concentração de 0.1 a 1.0 M, em particular de 0.2 a 0.8 M.
[00048] 0 pH da solução aquosa satura de Ca2+ / HvPOd3-x saturado normalmente permanece durante a etapa a) em uma faixa de 5.5 a 9.0, preferivelmente 6.5 a 8.0.
[00049] A etapa a) é geralmente realizada na temperatura entre 25 e 45 °C, preferivelmente entre 35°C e 42°C.
[00050] A etapa a) é realizada por um tempo suficiente de modo a permitir crescimento epitáctico de quantidades substantivas de cristais de hidroxiapatita sobre as fibras de colágeno nativo maduras. Crescimento epitáctico é realmente termodinamicamente favorecido fornecendo a configuração mais baixa de energia porém demora para ser estabelecido. Em geral, tal tempo suficiente é pelo menos aproximadamente 12 horas, preferivelmente pelo menos aproximadamente 24 horas.
[00051] Essas condições da etapa a), próximas às condições de formação de osso no corpo humano, permitem crescimento epitáctico sobre as fibras de colágeno de nanocristais de hidroxiapatita tendo a mesma morfologia e tamanho que o mineral de osso humano.
[00052] A etapa a) é geralmente realizada por um tempo pelo menos suficiente de modo que um revestimento fechado de pelo menos uma camada nanocristalina de hidroxiapatita esteja presente nas fibras de colágeno nativo maduras: esse tempo é escolhido de acordo com as propriedades desejadas para o material de hidroxiapatita-colágeno biomimético, em particular o número desejado de camadas nanocristalinas e razão de peso/peso do arcabouço de colágeno para as camadas crescida de modo epitáctica de hidroxiapatita nanocristalina.
[00053] Na etapa b) a formação de nanocristais de hidroxiapatita crescidos de forma epitáctica é parada por separar material sólido a partir da solução aquosa, enxaguando como água e secagem.
[00054] Em geral uma etapa c) opcional adicional de esterilizar o material seco separado vindo da etapa b) é realizada.
[00055] Vantagens do material compósito de hidroxiapatita-colágeno biomimético da invenção
[00056] Graças à ligação epitáctica forte, como em osso natural, entre o arcabouço de colágeno e os nanocristais de hidroxiapatita, o material compósito de hidroxiapatita-colágeno biomimético sintético ou parcialmente sintético da invenção tem excelentes propriedades mecânicas, notavelmente uma elevada resistência à tensão mecânica, em particular uma resistência elevada a torque (pelo menos 30 Nem, em geral aproximadamente 60 Nem), uma resistência compressiva elevada e uma resiliência elevada. Graças àquelas propriedades mecânicas excelentes, corpos moldados do material compósito de hidroxiapatita-colágeno biomimético da invenção são aparafusáveis, notavelmente em partes ósseas do corpo, e também mantêm permanentemente volume sob tensão mecânica: são desse modo idealmente adaptados para reparar defeitos grandes de osso.
[00057] O material compósito de hidroxiapatita-colágeno biomimético da invenção é prontamente colonizado por células de formação de osso com um baixo nivel de citotoxicidade (vide o exemplo 4d) abaixo) e mostra excelentes propriedades de osteocondutividade e osseointegração no corpo humano, graças notavelmente ao fato de que os nanocristais de hidroxiapatita têm a mesma morfologia e o mesmo tamanho que mineral de osso humano, como mostrado pela seguinte tabela 1: Tabela 1
[00058] Comparação do tamanho de cristal de hidroxiapatita e morfologia para o material de implante compósito biomimético da invenção e mineral de osso humano
[00059] Análise de tamanho de cristal foi realizada utilizando TEM (microscopia de elétron de transmissão) bem como refinamento de dados de difração de raios-X usando o método Bragg e a técnica Warren-Averbach.
[00060] Os seguintes exemplos ilustram a invenção sem limitar seu escopo.
[00061] A seguinte descrição será entendida melhor com referência à:
[00062] A figura 1 que representa uma micrografia SEM do lado fibroso do arcabouço de colágeno no formato de membrana do exemplo 1c) revestido como descrito no exemplo 3b) com uma concentração de BBS de 0.2M para um tempo de reação de revestimento de 12 horas,
[00063] A figura 2 que representa uma micrografia SEM do lado fibroso do arcabouço de colágeno no formato de membrana do exemplo 1c) revestido como descrito no exemplo 3b) com uma concentração PBS de 0.8M para um tempo de reação de revestimento de 24 horas, e
[00064] A figura 3 que representa uma micrografia SEM do lado fibroso do arcabouço de colágeno no formato de membrana do exemplo 1c) revestido como descrito no exemplo 3b), que foi colonizado com células semelhantes a osteoblasto MG63 .
[00065] Exemplo 1. Preparação de arcabouço de colágeno pelo menos parcialmente fibroso. a) Preparação de um arcabouço de colágeno fibroso cilíndrico derivado de Bio-Gide®
[00066] Preparação de pedaços cilíndricos de colágeno compactado seco
[00067] Uma membrana de Bio-Gide® (Geistilich Pharma A.G., Suiça) foi finamente moida utilizando um moinho ultracentrifuge e peneirada em uma peneira de 2,0 mm. 0,2 g do colágeno peneirado foram colocados em 5 ml de 99,9% etanol e a massa de colágeno foi colocada com pinça em uma cavidade de uma placa de 24 cavidades e compactada com um cilindro de Teflon de 2,0 mm de diâmetro, a seguir extraída a partir da cavidade com uma ferramenta de recalque de 2,0 mm de diâmetro e seca por 4 horas em um exaustor de quimica. Aquelas operações foram realizadas em paralelo 6 vezes de modo a obter 6 pedaços cilíndricos de colágeno compactado seco.
[00068] Reticulação dos pedaços cilíndricos de colágeno compactado seco
[00069] 3,571 ml de uma solução de EDC (cloridrato de l-etil-3-[3-dimetil aminopropil]carbodiimida) etanol foram pipetados em um frasco volumétrico de 100 ml e o volume foi completado até 100 ml com 99,9% etanol, a seguir derramado em um frasco de extração de 200 ml ao qual os 6 pedaços de colágeno seco obtidos acima foram adicionados. O etanol foi evaporado durante 1 minuto a vácuo em um dessecador, a seguir o dessecador foi colocado em pressão atmosférica. A mistura foi reticulada sob agitação a 110 rpm por 10 minutos utilizando um agitador horizontal. A solução EDC foi decantada e os cilindros de colágeno foram colocados em um béquer de 200 ml ao qual 100 ml de PBS (solução de tampão de fosfato) foram adicionados e eliminados por 1 minuto a vácuo. Os cilindros de colágeno foram limpos com 100 ml de PBS sob agitação a 50 rpm por 5 minutos, o PBS sendo decantado sem evaporação a vácuo. Esse processo foi repetido 2 vezes. Os cilindros de colágeno foram limpos com 100 ml de etanol a 99, 9% em agitação a 50 rpm por 5 minutos e o etanol sendo decantado sem evaporação a vácuo, o processo sendo repetido duas vezes. Os cilindros de colágeno foram limpos com 100 ml de éter dietilico sem agitação e seco por 14 horas em um exaustor de quimica.
[00070] Outros experimentos foram realizados com um tempo diferente (até 240 minutos) para a reação de reticulação.
[00071] A % de fibras de colágeno nativo maduras possuindo helicidade tripla (como mostrado por espectroscopia de dicroismo circular) do arcabouço de colágeno cilíndrico, como determinado por análise de imagem usando software Phenom Pro (FEI Phenom Pro Tabletop SEM S/N: 0342; Phenom Pro Suite V. 1.1.0.920; Phenom Application System PW-220-001; Phenom Fribremetric PW-210-001, disponivel junto a Phenom World, Dillenburgstraat 9E, 5652 AM Eindhoven, Holanda) em micrografias de SEM (Microscopia de elétron de varredura) de 5000 de ampliação, foi aproximadamente 90%. b) Preparação de um arcabouço de colágeno esponjoso parcialmente fibroso cilíndrico derivado de uma esponja de colágeno tipo I e tipo II
[00072] Preparação de uma esponja de colágeno:
[00073] Uma matriz de colágeno esponjoso extracelular ressorvivel foi preparada a partir de cartilagem congelada de porcos recentemente abatidos por retirar gordura seguido por tratamento ácido e básico como descrito no exemplo 1 de EP-Bl-810888. Essa matriz foi mostrada por métodos imunológicos como tendo uma mistura de colágeno tipo I e tipo II.
[00074] Preparação de pedaços cilíndricos de colágeno esponjoso compactado, seco
[00075] A matriz esponjosa foi finamente moída utilizando um moinho ultracentrífugo e peneirada em uma peneira de 2,0 mm, 0,2 g do colágeno peneirado foi colocado em 5 ml de etanol a 99,9% e a massa de colágeno foi colocada com pinça em uma cavidade de uma placa de 24 cavidades e compactada com um cilindro de Teflon de 2,0 mm de diâmetro, a seguir extraída a partir da cavidade com uma ferramenta de recalque de 2,0 mm de diâmetro e seca por 4 horas em um exaustor de química.
[00076] Reticulação dos pedaços cilíndricos de colágeno esponjoso compactado seco
[00077] Os pedaços cilíndricos de colágeno esponjoso compactados secos obtidos acima foram reticulados com EDO, limpos com PBS, etanol e éter dietílico, analogamente ao procedimento descrito acima em a) para o arcabouço de colágeno cilíndrico fibroso. A % de fibras nativas maduras que possuem helicidade tripla no arcabouço de colágeno esponjoso parcialmente fibroso cilíndrico, como determinado por software de análise de imagem Phenom Pro em micrografias de ampliação de 50000, era aproximadamente 5%. c) Preparação de um arcabouço de colágeno fibroso no formato de membrana derivado de Bio-Gide®
[00078] Uma membrana Bio-Gide® (Geistlich Pharma A.G., Suiça) foi limpa com 100 ml de etanol a 99, 9% em agitação a 50 rpm por 5 minutos e o etanol sendo decantado sem evaporação a vácuo, o processo sendo repetido duas vezes. A membrana de colágeno foi então limpa com 100 ml de éter dietilico sem agitação e seco por 14 horas em um exaustor de quimica.
[00079] A % de fibras nativas maduras possuindo helicidade tripla no lado fibroso, como determinado por software de análise de imagem Phenom Pro em micrografias SEM de ampliação de 5000, foi aproximadamente 100%.
[00080] Exemplo 2. Preparação de um material sinterizado a granel de a-TCP
[00081] Para uma mistura de 500 g (peso seco), 360 g de pó anidro de fosfato de dicálcio, 144 g de pó de carbonato de cálcio e 220 ml de água deionizada foram misturados por 7 minutos a 500 rpm utilizando um agitador de laboratório. A pasta a partir do processo de mistura foi imediatamente transferida para um copo de platina estável em temperatura elevada. 0 copo de platina cheio foi colocado em um forno frio. O forno foi aquecido a 1400°C utilizando uma taxa de aquecimento de 60°C por hora. O processo de aquecimento foi parado após 72 horas por desligar o forno. A amostra foi resfriada até a temperatura ambiente no forno. O material sinterizado a granel (a-Ca3 (P04) 2) de fase pura) foi removido do forno e copo de platina. 0 produto a granel a partir do processo de sinterização tinha um peso de 420 g (perda de peso 16,7%).
[00082] O controle de pureza de fase foi realizado utilizando análise de difração de raios X.
[00083] Exemplo 3. Revestimento de um arcabouço de colágeno fibroso com cristais crescidos de forma epitáctica de hidroxiapatita nanocristalina em uma solução de PBS na presença de uma dispersão de partículas finas de oc-TCP. a) Revestimento dos pedaços cilíndricos de colágeno fibroso obtidos no exemplo 1 a)
[00084] Preparação de uma solução de PBS 0.5 M: 100 ml de uma solução de 0.5 M NaH2PO4.H2O (solução A) foram preparados por dissolver 6,9 g de NaH2PO4.H2O em água deionizada estéril em temperatura ambiente sob agitação a 250 rpm por 30 minutos e a 600 rpm por 4 horas. 100 ml de uma solução de 0.5 M Na2HPO4.2H2O (solução B) foram preparados por dissolver 8,9 g de Na2HPO4.2H2O em água deionizada estéril em temperatura ambiente sob agitação a 250 rpm por 30 minutos e a 600 rpm por 4 horas.
[00085] 19 ml de solução A foram misturados com 81 ml de solução B de modo a fornecer uma solução de 0.5 M PBS tendo urn pH entre 7.3 e 7.4.
[00086] Trituração de oc-TCP em partículas finas: o produto a granel do exemplo 2 foi triturado utilizando um triturador de garra (tamanho de fenda de 4 mm). Os grânulos grossos foram peneirados por utilizar uma máquina de peneirar e inserções de peneira com abertura de malha de 2 mm e 0,25 mm. Os grânulos peneirados foram adicionalmente moidos utilizando um moinho planeta até um tamanho final menor que 10 pm.
[00087] Revestimento dos cilindros de colágeno fibroso obtidos no exemplo 1 a)com cristais crescidos de forma epitáctica de hidroxiapatita nanocristalina:
[00088] 5 g de partículas finas de o-TCP e 100 ml de uma solução de 0.5 M PBS obtida como descrito acima e os cilindros de colágeno fibroso obtidos no exemplo 1 a) foram adicionados a um frasco de pesagem de vidro que foi colocado em um dessecador a vácuo por 5 minutos, a seguir em pressão atmosférica. A reação de revestimento foi realizada sob agitação a 37°C durante 3 dias por colocar o frasco em um agitador horizontal operado a 5-50 rpm em um compartimento termostático.
[00089] A observação visual mostrou que o arcabouço de colágeno reteve seu formato cilindrico, porém foi coberto com uma substância cristalina branca.
[00090] Outros experimentos de revestir os cilindros de colágeno fibroso obtidos no exemplo 1 a).
[00091] Outros experimentos de revestimento dos cilindros de colágeno fibroso obtidos no exemplo 1 ao término de a) foram realizados variando a concentração da solução PBS a partir de0.2Ma0.8Meo tempo de reação de revestimento de 12 horas a 4 dias.
[00092] A observação visual mostrou que o arcabouço de colágeno reteve seu formato cilindrico, porém foi coberto com uma substância cristalina branca.
[00093] A análise de SEM mostrou que o crescimento de cristal bem como o tamanho, morfologia e usos das montagens de cristal de hidroxiapatita poderiam ser controlados por variar a concentração da solução de PBS e o tempo de reação de revestimento.
[00094] Nos experimentos acima a razão de peso/peso do arcabouço de colágeno fibroso para os cristais crescidos de forma epitáctica de hidroxiapatita nanocristalina nos cilindros de colágeno fibroso revestido foi de 90/10 a 30/70. b) Revestimento do arcabouço de colágeno esponjoso parcialmente fibroso cilindrico obtido no exemplo l)b) e o arcabouço de colágeno fibroso no formato de membrana obtido no exemplo l)c) com cristais crescidos de modo epitáctico de hidroxiapatita nanocristalina:
[00095] Os experimentos de revestimento dos cilindros de esponja de colágeno parcialmente fibroso cilíndricos obtidos no exemplo 1 b) ou revestimento do lado fibroso do arcabouço de colágeno fibroso no formato de membrana do exemplo 1c) , foram realizados variando a concentração da solução de PBS de 0.2 M a 0.8M e o tempo de reação de revestimento de 12 horas a 4 dias.
[00096] A observação visual mostrou que o arcabouço de colágeno reteve seu formato, porém foi coberto com uma substância cristalina branca.
[00097] A análise de SEM mostrou que o crescimento de cristal bem como o tamanho, morfologia e usos das montagens de cristal de hidroxiapatita podem ser controlados por variar a concentração da solução de PBS e o tempo de reação de revestimento.
[00098] Nos experimentos acima a razão de peso/peso do arcabouço de colágeno fibroso para os cristais crescidos de forma epitáctica de hidroxiapatita nanocristalina foi de 90/10 a 30/70 para os cilindros de esponja de colágeno parcialmente fibroso revestidos obtidos no exemplo 1b) e de 90/10 a 50/50 para o arcabouço de colágeno no formato de membrana revestido.
[00099] Exemplo 4 -Propriedades do arcabouço de colágeno pelo menos parcialmente fibroso revestido com cristais crescidos de modo epitáctico de hidroxiapatita nanocristalina. a) Propriedades fisico-quimicas:
[000100] A porosidade medida (volume de poro) foi de 96 v/v % para os pedaços cilíndricos de colágeno fibroso obtido no exemplo la) (variando as condições de reticulação) e 85 a 95% v/v para os pedaços cilíndricos revestidos de hidroxiapatita obtidos no exemplo 3)a).
[000101] A superficie especifica medida por porosimetria de mercúrio era 1,5 a 2,5 m2/g para os pedaços cilíndricos de colágeno fibroso obtido no exemplo la) (variando as condições de reticulação) e de 20 a 60 m2/g para os pedaços cilíndricos revestidos de hidroxiapatita obtidos no exemplo 3)a).
[000102] A porosidade medida (volume de poro) foi aproximadamente 96% v/v % para o arcabouço cilíndrico de esponja de colágeno preparado no exemplo 1 b) e de 88 a 92%. para os cilindros de esponja de colágeno revestidos com hidroxiapatita obtidos no exemplo 3b).
[000103] A superfície especifica medida por porosimetria de mercúrio foi 2 m2/g para o arcabouço cilíndrico de esponja de colágeno preparado no exemplo 1b) e de 25 a 50 m2/g para os cilindros de esponja de colágeno revestido obtidos no exemplo 3b).
[000104] A resistência compressiva (resistência à pressão), isto é, a pressão máxima a ser aplicada para uma compressão dos cilindros até 50% de sua altura original, foi medida usando uma máquina de teste de compressão mecânica (Proline Z010 fabricado por Swick/Roell).
[000105] A resistência compressiva medida no estado úmido foi de 0.3 a 0.7 Mpa para os pedaços cilíndricos de colágeno fibroso obtido no exemplo la) (variando as condições de reticulação e de 1.1 a 3.5 Mpa para os pedaços cilíndricos revestidos de hidroxiapatita obtidos no exemplo 3) a), a resistência compressiva aumentando com a % de hidroxiapatita presente nos pedaços cilíndricos revestidos com hidroxiapatita.
[000106] A resiliência, isto é, a % de altura original recuperada após compressão até 50% ou altura original, foi medida usando uma máquina de teste de compressão mecânica (Proline Z010 fabricado por Swick/Roell).
[000107] A resiliência medida no estado úmido foi de 95 a 99% para os pedaços cilíndricos de colágeno fibroso obtidos no exemplo la) (variando as condições de reticulação) e 92 a 100% para os pedaços cilíndricos revestidos de hidroxiapatita obtidos no exemplo 3)a), a % de hidroxiapatita presente naqueles pedaços revestidos com hidroxiapatita parecendo não influenciar a resiliência.
[000108] Um protocolo similar ao Método de Fixação de Bloco de osso Straumann® (cf. http://www.straumann.ch/ch-index/products/products-biologics/products-bone-block-fixation.htm) foi usado.
[000109] Em resumo, usando um perfurador para perfurar um furo de 0,9 mm em um cilindro de Teflon (tendo propriedades mecânicas comparáveis àquelas de osso de mandíbula de porco) e em alguns pedaços cilíndricos secos de colágeno fibroso obtido no exemplo la) (variando as condições de reticulação e alguns dos pedaços cilíndricos revestidos de hidroxiapatita secos obtidos no exemplo 3)a), 2, e uma chave de fenda magnético (Klinge fTi Mikro Schr Kreuzschl, Ref. 75.23.19 disponível junto a Medicon) compreendendo um parafuso de 1,5 x 12 mm, o torque máximo no qual os pedaços cilíndricos puderam ser aparafusados no cilindro de Teflon sem quebrar foi medido.
[000110] Todos os pedaços cilíndricos não revestidos testados de colágeno fibroso obtidos no exemplo la mostraram uma resistência a torque de aproximadamente 20 Nem, ao passo que todos os pedaços cilíndricos revestidos de hidroxiapatita testados obtidos no exemplo 3)a) mostraram uma Resistência a torque de mais de aproximadamente 60 Nem, a % de hidroxiapatita presente naqueles pedaços revestidos de hidroxiapatita parecendo não influenciar a resistência a torque. Uma resistência a torque de aproximadamente 30 Nem é genericamente considerada na técnica como suficiente para aparafusar um pedaço em uma parte óssea do corpo.
[000111] O aumento dramático na Resistência a torque é devido à ligação epitáctica forte entre hidroxiapatita e o arcabouço de colágeno.
[000112] Realmente, em experimentos comparativos realizados naqueles arcabouços de colágeno reticulados onde de acordo com condições do hidroxiapatita da técnica anterior foi precipitado sobre ou no interior do arcabouço de colágeno e desse modo fracamente ligado ao ultimo por adsorção, a resistência a torque não foi significativamente aumentada.
[000113] As figuras 1 e 2 representam micrografias SEM do lado fibroso do arcabouço de colágeno no formato de membrana do exemplo 1c) revestido como descrito no exemplo 3b) com uma concentração PBS de 0.2M para um tempo de reação de revestimento de 12 horas e 0,8 M colágeno para um tempo de revestimento de 24 horas.
[000114] Pode-se observar na figura 1 pequenos conjuntos de cristal de hidroxiapatita de plaquetas de cristal de nano-tamanho finamente distribuídas com simetria hexagonal estreitamente interconectada com fibrilas de colágeno e na figura 2 pequenos agregados semelhantes à roseta de tamanho micron de conjuntos de cristais de hidroxiapatita hexagonal que cobre totalmente a estrutura de fibra de colágeno.
[000115] Foi mostrado que as células semelhantes a osteoblasto MG63 humanas colonizam com uma taxa de proliferação elevada todos os locais do arcabouço de colágeno no formato de membrana revestida obtido no exemplo 3 b). Vide a figura 3.
[000116] Em testes de citotoxicidade o arcabouço de colágeno no formato de membrana revestido no exemplo 3 b) mostrou resultados comparáveis com aqueles obtidos com a membrana Bio-Gide®.
Claims (15)
1. Material compósito de hidroxiapatita-colágeno biomimético caracterizado pelo fato de que compreende um arcabouço de colágeno pelo menos parcialmente fibroso incluindo fibras de colágeno nativo maduro que possuem helicidade tripla como mostrado por Espectroscopia de Dicroismo circular, em que aquelas fibras de colágeno nativo maduro são pelo menos parcialmente cobertas com cristais crescidos de forma epitáctica de hidroxiapatita nanocristalina, pelo que os nanocristais crescidos de forma epitáctica têm a mesma morfologia que o mineral de osso humano e o mesmo tamanho que o mineral de osso humano, a saber, um comprimento de 30 a 50 nm e uma largura de 14 a 25 nm e em que os cristais crescidos de forma epitáctica de hidroxiapatita nanocristalino formam uma camada tendo uma espessura de pelo menos 30 ± 15 nm, como determinado por análise de difração de raios-x.
2. Material compósito de hidroxiapatita-colágeno biomimético, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o arcabouço de colágeno pelo menos parcialmente fibroso compreende em sua superficie externa pelo menos 2% de fibras de colágeno nativo maduro como determinado por análise de imagem em micrografias SEM e Espectroscopia de Dicroismo circular.
3. Material compósito de hidroxiapatita-colágeno biomimético, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o arcabouço de colágeno pelo menos parcialmente fibroso compreende em sua superfície externa pelo menos 10% de fibras de colágeno nativo maduro como determinado por análise de imagem em micrografias SEM e Espectroscopia de Dicroismo circular.
4. Material compósito de hidroxiapatita-colágeno biomimético, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a razão de peso/peso do arcabouço de colágeno fibroso para os cristais crescidos de forma epitáctica de hidroxiapatita nanocristalina está entre 5:95 e 95:5, preferivelmente entre 10:90 e 90:10.
5. Material compósito de hidroxiapatita-colágeno biomimético, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que é um corpo moldado.
6. Corpo moldado conforme definido na reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que é um material substituto de osso cuja estrutura tem o perfil de uma parte de corpo ósseo.
7. Corpo moldado, de acordo com a reivindicação 5 ou 7, caracterizado pelo fato de ter uma resistência a torque de pelo menos 30 Nem no estado seco.
8. Material compósito de hidroxiapatita-colágeno biomimético, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que é no formato de membrana.
9. Processo de preparar o material compósito de hidroxiapatita-colágeno biomimético conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de compreender as etapas de: a) imergir um arcabouço de colágeno pelo menos parcialmente fibroso incluindo fibras de colágeno nativo maduras possuindo helicidade tripla como mostrado por Espectroscopia de Dicroismo Circular em uma solução aquosa saturada de Ca2+ saturado/HxP04 (3-x), que é uma solução de tampão de fosfato (PBS) contendo alfa-TCP finamente disperso, beta-TCP, TTCP, pentaidrato de fosfato de octacálcio, fosfato de dicálcio, ou diidrato de fosfato de dicálcio, para realizar o processo de formação do material compósito de implante pelo que nanocristais de hidroxiapatita crescidos de forma epitáctica são formados naquelas fibras de colágeno nativo maduras, aqueles nanocristais de hidroxiapatita crescidos de forma epitáctica tendo a mesma morfologia e mesmo tamanho que o mineral de osso humano, b) parar o processo de formação do material compósito de implante por separar material sólido a partir da solução aquosa, enxaguar com água e secar, e c) opcionalmente esterilizar o material separado vindo da etapa b).
10. Processo, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que na etapa a) o pH da solução aquosa permanece compreendido em uma faixa de 5.5 a 9.0.
11. Processo, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que na etapa a) o pH da solução aquosa permanece compreendido em uma faixa de 6.5 a 8.0.
12. Processo, de acordo com a reivindicação 9 ou 10, caracterizado pelo fato de que a temperatura na etapa a) está entre 25 e 45°C.
13. Processo, de acordo com a reivindicação 9 ou 10, caracterizado pelo fato de que a temperatura na etapa a) está entre 35°C e 42°C.
14. Material compósito de hidroxiapatita-colágeno biomimético, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de ser para uso como um implante ou prótese para formação de osso, regeneração de osso, reparo de osso e/ou substituição de osso em um local de defeito em um sujeito humano ou um animal.
15. Material compósito de hidroxiapatita-colágeno biomimético no formato de membrana conforme definido na reivindicação 8, caracterizado pelo fato de ser para uso como um implante para regeneração combinada de cartilagem e osso.
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