ES2611202T3

ES2611202T3 - Material compuesto de colágeno-hidroxiapatita biomimético

Info

Publication number: ES2611202T3
Application number: ES14741205.0T
Authority: ES
Inventors: Michael Bufler
Original assignee: Geistlich Pharma AG
Current assignee: Geistlich Pharma AG
Priority date: 2013-07-19
Filing date: 2014-07-18
Publication date: 2017-05-05
Anticipated expiration: 2034-07-18
Also published as: EP3021883B1; EP2826495A1; CN105358189A; RU2016105556A; JP2016524964A; CA2917997A1; RU2662326C2; SG11201600364VA; HUE031178T2; AU2014292503A1; KR101944163B1; CA2917997C; US10029028B2; JP6478993B2; PT3021883T; BR112016001093B1; PL3021883T3; CN105358189B; AU2014292503B2; WO2015007393A1

Abstract

Material compuesto de colágeno-hidroxiapatita biomimético que comprende una estructura de colágeno al menos parcialmente fibroso que incluye fibras maduras nativas de colágeno que poseen triple helicidad como se muestra por espectroscopía de dicroísmo circular, en el que dichas fibras maduras nativas de colágeno están al menos parcialmente cubiertas con cristales cultivados epitácticamente de hidroxiapatita nanocristalina, con lo que los nanocristales cultivados epitácticamente tienen la misma morfología que el mineral óseo humano y son del mismo tamaño que el mineral óseo humano, es decir, una longitud de 30 a 50 nm y una anchura de 14 a 25 nm y en el que los cristales cultivados epitácticamente de hidroxiapatita nanocristalina forman una capa que tiene una espesor de al menos 30 ± 15 nm, determinado por análisis de difracción de rayos X.

Description

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DESCRIPCION

Material compuesto de colageno-hidroxiapatita biomimetico

La invention se refiere a un nuevo material compuesto de colageno-hidroxiapatita biomimetico que comprende una estructura de colageno al menos parcialmente fibroso e hidroxiapatita, en el que las fibras de colageno estan al menos parcialmente cubiertas con cristales cultivados epitacticamente de hidroxiapatita nanocristalina, a un proceso para la preparation de ese material y al uso de los mismos como implante para ayudar en la formation de hueso, la regeneration osea, la reparation osea y/o la sustitucion del hueso en un sitio con un defecto en un sujeto humano o un animal, o como implante para la regeneracion combinada de hueso y cartllago.

Los defectos en la estructura osea surgen en una variedad de circunstancias, tales como traumatismo, enfermedad, y cirugla y todavla hay una necesidad de una reparacion eficaz de defectos oseos en varios campos quirurgicos. Para estimular la curacion en el sitio de un defecto oseo se han utilizado numerosos materiales naturales y sinteticos y composiciones.

Un material natural y osteoconductor sustituto de hueso bien conocido que promueve el crecimiento oseo en defectos oseos periodontales y maxilofaciales o defectos oseos en el campo de la ortopedia es el Geistlich Bio-Oss® o Geistlich Orthoss, respectivamente, disponible en el mercado en Geistlich Pharma AG. Ese material mineral oseo a base de hidroxiapatita se fabrica a partir de hueso natural por un proceso descrito en la patente de Estados Unidos n.° 5.167.961, que permite la conservation de la arquitectura trabecular y la estructura nanocristalina del hueso natural.

Sin embargo, los materiales a base de hidroxiapatita no siempre estan adaptados para la reparacion de defectos de huesos largos, en particular en ortopedia, al ser fragiles y no suficientemente resistentes a esfuerzos mecanicos como para poder atornillarse, por ejemplo, a una parte del cuerpo oseo.

Por tanto, existe una necesidad de un material de injerto oseo sintetico o parcialmente sintetico hecho para asemejarse estrechamente al hueso natural, en particular en su resistencia a tensiones mecanicas. Un material de injerto de hueso sintetico o parcialmente sintetico biomimetico serla un sustituto de injertos oseos derivados de hueso natural util para ciertas aplicaciones, en particular para la reparacion de defectos de huesos largos.

El hueso natural es un material compuesto que consiste en agua y una matriz de colageno que consta principalmente de colageno de tipo I, que esta Intimamente combinado con cristales inorganicos, principalmente de hidroxiapatita. Las fibras de colageno tipo I y la hidroxiapatita suponen aproximadamente del 25 al 30 % en p/p y del 65 al 70 % en p/p del peso seco de hueso natural, respectivamente. La matriz de colageno proporciona su flexibilidad y capacidad de recuperation al hueso, mientras que el material inorganico le proporciona al hueso su fuerza y rigidez, con la organization de las dos fases que proporciona un alto grado de elasticidad y resistencia del material compuesto. Se ha presentado un examen minucioso de la estructura osea a nivel de angstrom (cristal mineral) a nivel de micras (laminillas) por Weiner, S. et al., 1992, FASEB, 6: 879-885.

Una caracterlstica importante del hueso natural es la morfologla y el tamano muy pequeno de los cristales de hidroxiapatita, que para el mineral oseo humano es: grupo espacial hexagonal P63/m, aproximadamente de 30 a 50 nm de longitud (eje c: [0,0,1]) y de 14 a 25 nm en los (ejes a y b: [1,0,0] y [0,1,0]). Vease Weiner S. et al., citada anteriormente.

N.A. Barrios et al. en "Density Functional Study of Binding of Glycine, Proline and Hydroxyproline to the Hydroxyapatite (0001) and (0110) Surfaces", 2009, Langmuir 25(9), 5018-5025 y "Molecular Dynamics Simulation of the Early Stages of Nucleation of Hydroxyapatite at a Collagen Template", Crystal Growth Design, 2012, 12, 756763, muestran que, a la temperatura del cuerpo humano, la nucleacion y el acoplamiento de la hidroxiapatita a las fibras de colageno pueden tener lugar en diferentes sitios de la bloques de construction del colageno, los aminoacidos glicina, prolina e hidroxiprolina, es decir, sobre la superficie del cristal (0001) y (0110), siendo preferido el acoplamiento sobre la superficie del cristal (0110). Esto demuestra que en el cuerpo humano la estructura de la fibra de colageno y sus bloques de construccion de aminoacidos proporciona un sustrato que corresponde exactamente a la estructura cristalina de la hidroxiapatita, por lo tanto la formacion de hueso sigue una via de crecimiento epitactico para interconectar los cristales de hidroxiapatita y las fibras de colageno. La via de crecimiento epitactico esta favorecida termodinamicamente dando la configuration de energla mas baja.

Se han hecho intentos en la tecnica anterior para proporcionar materiales compuestos de colageno-hidroxiapatita que sean similares al hueso natural.

La patente de Estados Unidos n.° 5.231.169 describe un metodo de mineralization del colageno con un mineral de fosfato de calcio que comprende la preparacion de dicho mineral de fosfato de calcio en presencia de una dispersion de fibrillas de colageno dispersadas en solution acuosa basica que tiene un pH en el intervalo de 10 a 13, anadiendo a dicha dispersion durante un perlodo de al menos una hora una fuente de calcio soluble y el fosfato soluble en la proportion correcta, tal como para producir dicho mineral de fosfato, y recogiendo el colageno

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mineralizado. Se ensena que as! se obtiene colageno mineralizado con fosfato de calcio distribuido de forma estable en la matriz de colageno.

La patente de Estados Unidos n.° 5.739.286 desvela un metodo de fabricacion de un material de aumento oseo que se asemeja al hueso natural por mineralizacion de fibras de colageno durante un periodo de 7 dlas en una camara de difusion doble, un deposito que contiene tampon Tris 0,05 M y cloruro de calcio 0,1 M y el otro deposito que contiene tampon de Tris 0,05 M y fosfato de potasio 0,1 M. Se ensena que se forma un precipitado de fosfato de calcio sobre las fibras de colageno, con las microfotograflas electronicas de barrido de las fibras de colageno mineralizadas que son morfologicamente similares a los agregados de tipo placa de hidroxiapatita que se encuentran precipitados sobre materiales de biovidrio empapados en plasma sangulneo sintetico.

Las patentes de Estados Unidos n.° 6.395.036 y 6.589.590 describen un metodo de fabricacion de hueso artificial, proporcionando una membrana de colageno con soluciones de iones de calcio y de iones fosfato en lados opuestos de la membrana, los iones que se difunden a traves de la membrana, se reunen y precipitan como material de hidroxiapatita en el interior de la membrana de colageno.

Las patentes de Estados Unidos n.° 7.514.249 y 7.547.449 describen un metodo de fabricacion de una esponja de colageno biomimetico mineralizada con fosfato de calcio, en la que el fosfato de calcio se incorpora en los espacios intersticiales de las fibrillas de colageno, usando una solucion de cloruro de calcio 6 mM y 200 gg/ml tanto de poli (acido alfa-beta-DL-aspartico) como de poli (acido vinilfosfonico), seguido de la difusion del vapor de fosfato dibasico de amonio.

Ficai A. et al., 2010, Chemical Engineering 160, 794-800 desvela un proceso de preparacion de un material compuesto de colageno-apatita a partir de un gel de colageno y precursores de hidroxiapatita en el que el pH se ajusta a aproximadamente 9 usando una solucion de hidroxido de sodio para as! asegurar la precipitacion de la hidroxiapatita y la fibrilogenesis. De este modo, los cristales de hidroxiapatita se forman "en el intervalo nanometrico, entre unos pocos nanometros y hasta 40 nm". Puesto que la nucleacion de la hidroxiapatita tiene lugar durante la fibrilogenesis, durante la cual el auto-ensamblaje de las moleculas de colageno modifica las posiciones de los bloques de construccion de aminoacidos del colageno (que por lo tanto no se corresponden exactamente con la estructura cristalina de la hidroxiapatita), no puede haber ningun crecimiento epitactico de los cristales de hidroxiapatita: Esos cristales se precipitan como se indica en dicha publicacion.

La publicacion de patente Estados Unidos 2009/0232875 describe una estructura multicapa que comprende una primera capa superior que consiste en una matriz organica que contiene colageno y al menos una capa inferior de una matriz compuesta que contiene hidroxiapatita y colageno (parrafo [0001]). El material compuesto se obtiene por un proceso de nucleacion directa de hidroxiapatita en fibrillas de colageno de auto-ensamblaje a un pH de 9 a 11 y una temperatura de 35-40 °C, con los tamanos de los cristales que son de 12 a 15 nm a lo largo de eje de la fibra (parrafos [0082] y [0089]). Puesto que, como en Ficai et al. anteriormente, la nucleacion de la hidroxiapatita tiene lugar durante el auto-ensamblaje de las moleculas de colageno (esto ultimo que modifica las posiciones de los bloques de construccion de aminoacidos del colageno) y ademas esta nucleacion "supone una carbonatacion de la fase inorganica, es decir la incorporacion de grupos CO32' en la reticula de hidroxiapatita" (vease el parrafo [0077], llneas 25-28), la hidroxiapatita carbonatada que tiene una estructura cristalina diferente (estructura cristalina monocllnica con grupo espacial Pb o P21/b: vease Elliot J.C. 1994: Structure and Chemistry of the Apatites and Other Calcium Phosphates. Studies in inorganic Chemistry 18. Elsevier Science, ISBN 0-444-81582-1), no puede haber ningun crecimiento epitactico de los cristales de hidroxiapatita: Esos cristales por lo tanto crecen por precipitacion sobre los "nano-nucleos formados dentro de las fibrillas de colageno... paralelos a las fibrillas" (vease el parrafo [0090]).

El documento US-2010/0021552 desvela un implante de biomaterial que incluye una estructura de fibrillas mineralizadas, en el que "los huecos a escala nanometrica dentro de la fibrilla de colageno nativa auto-ensamblada limita el tamano al cual las mineralitas pueden crecer facilmente y atrapa las mineralitas de modo que no se difunden fuera de las fibrillas de colageno", las unicas mineralitas apaticas que se mencionan tienen como maximo aproximadamente 1 nm X 10 nm X 10 nm ([0044], [0045], [0105], [0113]).

En los materiales compuestos de colageno-hidroxiapatita de la tecnica anterior, la hidroxiapatita se precipita sobre o dentro de la estructura de colageno, la union con este ultimo que es solo una union flsica debil, como por adsorcion. Una union flsica debil de este tipo no es capaz de dotar al material con la elasticidad, la resistencia a la torsion y la resistencia del hueso natural con la que los cristales de hidroxiapatita se cultivan epitacticamente sobre las fibras de colageno.

Un objetivo de la invention, por tanto, es proporcionar un material compuesto de colageno-hidroxiapatita biomimetico en el que existe una union fuerte entre la estructura de colageno y los cristales de hidroxiapatita.

En los materiales compuestos de colageno-hidroxiapatita de la tecnica anterior los cristales de hidroxiapatita no tienen la morfologla (relation de cara del cristal y parametros de red) y el tamano muy pequeno del mineral oseo natural, en particular del mineral oseo humano.

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Otro objetivo de la invencion, por tanto, es proporcionar un material compuesto de colageno-hidroxiapatita biomimetico en el que los cristales de colageno tienen la misma morfologia y el mismo tamano que el mineral oseo humano.

La patente europea n.° 2.445.543 ensena las condiciones en que los nanocristales de hidroxiapatita crecen epitacticamente en un nucleo de a-TCP sinterizado, los nanocristales que tienen la misma morfologia y el mismo tamano que el mineral oseo humano.

Se ha encontrado que los objetivos anteriores se pueden alcanzar mediante la adaptacion de las condiciones descritas en la patente europea n.° 2.445.543 para crecer epitacticamente nanocristales de hidroxiapatita sobre las fibras de colageno, los nanocristales que tienen la misma morfologia y el mismo tamano que el mineral oseo humano.

De este modo se obtiene un material compuesto de colageno-hidroxiapatita biomimetico con excelentes propiedades mecanicas, en particular una alta resistencia a la tension mecanica, en particular una alta resistencia al par de torsion (al menos 30 Ncm, en general aproximadamente 60 Ncm), gracias a la fuerte union epitactica entre la estructura de colageno y los cristales de hidroxiapatita. Este material despues de la implantacion en un cuerpo humano es colonizado facilmente por las celulas formadoras de hueso y muestra propiedades de osteoconductividad y osteointegracion excelentes gracias en particular a que los cristales de hidroxiapatita tienen la misma morfologia y el mismo tamano que el mineral oseo humano.

Los objetivos anteriores se consiguen mediante la invencion tal como se define en las reivindicaciones adjuntas.

La invencion por lo tanto se refiere a un nuevo material compuesto de colageno-hidroxiapatita biomimetico que comprende una estructura de colageno al menos parcialmente fibroso que incluye fibras maduras nativas de colageno que poseen triple helicidad como se muestra por espectroscopia de dicroismo circular, en el que dichas fibras maduras nativas de colageno estan al menos parcialmente cubiertas con cristales cultivados epitacticamente de hidroxiapatita nanocristalina, en el que los nanocristales cultivados epitacticamente tienen la misma morfologia que el mineral oseo humano y son del mismo tamano que el mineral oseo humano, es decir, de una longitud de 30 a 50 nm y una anchura de 14 a 25 nm.

El termino "la misma morfologia que el mineral oseo humano" significa que la relacion dimensional de las caras del cristal (que determina las formas externas de los cristales) es la misma que en el mineral oseo humano. En este ultimo los cristales generalmente son plaquetas hexagonales.

El crecimiento epitactico de la hidroxiapatita sobre el colageno solo puede tener lugar en las fibras de colageno, como se muestra por las publicaciones de N.A. Barrios et al., antes citadas. Estas fibras deben ser fibras maduras nativas de colageno, es decir, fibras de colageno en las que (a) las fibrillas se han ensamblado por autoensamblaje de los bloques de construccion de colageno, (b) se han formado las cadenas alfa 1 y alfa 2 y (c) se ha formado la triple helice por reticulacion natural de dos cadenas alfa 1 con una cadena alfa 2. Dichas fibras maduras nativas de colageno poseen triple helicidad como se muestra mediante espectroscopia de dicroismo circular. En las fibras maduras nativas de colageno las respectivas posiciones de los bloques de construccion del colageno, glicina, prolina e hidroxiprolina, son fijos, que corresponde exactamente a la estructura de la hidroxiapatita, lo que permite la interconexion epitactica entre la hidroxiapatita y las fibras maduras nativas de colageno. Las fibras en formacion en las que las fibrillas se autoensamblan, las cadenas alfa 1 y alfa 2 se estan formando o la triple helice se esta formando, no son apropiadas para el crecimiento epitactico de hidroxiapatita. En efecto, en dichas fibras en formacion, las posiciones de los bloques de construccion del colageno cambian, por lo que no se corresponden exactamente con la estructura cristalina de la hidroxiapatita.

Por tanto, es necesario que la estructura de colageno sea al menos parcialmente fibroso en su superficie externa e incluya fibras maduras nativas de colageno que posean triple helicidad como se muestra por espectroscopia de dicroismo circular.

La estructura de colageno al menos parcialmente fibroso generalmente comprende en su superficie externa al menos el 2 % de fibras maduras nativas de colageno, preferentemente al menos el 5 % de fibras maduras nativas de colageno, mas preferentemente al menos el 10 % de fibras maduras nativas de colageno, segun lo determinado por analisis de imagen en microfotografias de MEB y espectroscopia de dicroismo circular.

La estructura de colageno al menos parcialmente fibroso generalmente esta compuesta de colageno de tipo I, pero tambien puede incluir otros tipos de colageno, en particular colageno de tipo II y de tipo III.

La estructura de colageno al menos parcialmente fibroso generalmente es una matriz de colageno derivado de un material natural o una matriz de colageno semi-artificial o artificial, por ejemplo, preparada por electrohilado de una suspension de particulas de colageno o una solucion de colageno soluble, el colageno que procede de un material natural o que es colageno recombinante.

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Los cristales cultivados epitacticamente de hidroxiapatita nanocristalina generalmente forman una capa que tiene un espesor de al menos 30 ± 15 nm, determinado por analisis de difraccion de rayos X. El espesor de al menos 30 ± 15 nm corresponde a una capa de nanocristales de hidroxiapatita en orientacion epitaxial.

La capa crecida epitacticamente de hidroxiapatita nanocristalina puede comprender una o varias capas de nanocristales de hidroxiapatita en orientacion epitaxial al sustrato fibras de colageno. El espesor de la capa crecida epitacticamente de hidroxiapatita nanocristalina, que esta relacionado con el numero de dichas capas de nanocristales de hidroxiapatita en orientacion epitaxial, se seleccionara de acuerdo con la aplicacion prevista del material de sustitucion osea como implante en el cuerpo humano.

El espesor de la capa crecida epitacticamente de hidroxiapatita nanocristalina esta relacionado con la relacion en p/p de la estructura de colageno fibroso a los cristales cultivados epitacticamente de hidroxiapatita nanocristalina, dicha relacion que generalmente esta entre 5:95 y 95:5, preferentemente entre 10:90 y 90:10, mas preferentemente entre 20:80 y 60:40, en particular entre 30:70 y 70:30.

El material compuesto de colageno-hidroxiapatita biomimetico puede ser un material particulado o un granulado, las partlculas o granulos que tienen un tamano y forma deseados. Generalmente las partlculas o granulos son aproximadamente esfericos y tienen un diametro de 20 a 5000 pm.

El material compuesto de colageno-hidroxiapatita biomimetico tambien puede ser un cuerpo conformado con cualquier forma, por ejemplo, un bloque cubico o paraleleplpedo, una placa, un cilindro, una llave conica, un clavo, un tornillo, un perno o una estructura que tiene el perfil de una parte del cuerpo oseo tal como, especialmente, una cadera, una clavlcula, una costilla, una mandlbula o una parte del craneo. Un cuerpo conformado de este tipo puede tener una resistencia a la torsion suficiente para poderse atornillar, por ejemplo, a una parte del cuerpo oseo, es decir, una resistencia a la torsion de al menos 30 Ncm, en estado seco, preferentemente una resistencia a la torsion de al menos 50 Ncm, en estado seco.

El material compuesto de colageno-hidroxiapatita biomimetico tambien puede ser un cuerpo con forma de membrana.

Una estructura de colageno adecuado para un cuerpo en forma de membrana es la membrana Bio-Gide® (Geistlich Pharma AG, Suiza) fabricada de acuerdo con el proceso descrito en la patente EP-B1-1676592, que tiene un lado fibroso que permite el crecimiento hacia el interior de celulas formadoras de hueso y un lado liso que actua como barrera contra el crecimiento hacia el interior de las celulas no formadoras de hueso. Dicha membrana generalmente esta recubierta solo sobre la parte fibrosa con nanocristales de hidroxiapatita cultivados epitacticamente, proporcionando de ese modo sobre ese lado condiciones muy favorables para la formacion de hueso.

El material compuesto de colageno-hidroxiapatita biomimetico de la invencion se puede utilizar como implante o protesis para la formacion de hueso, la regeneracion osea, la reparacion osea y/o la sustitucion de hueso en un sitio con un defecto oseo, en particular sitio con un defecto de un hueso grande, en un sujeto humano o un animal.

La invencion tambien se refiere a:

- el uso de ese material compuesto de colageno-hidroxiapatita biomimetico como implante o protesis para la formacion de hueso, la regeneracion osea, la reparacion osea y/o la sustitucion del hueso en un sitio con un defecto en un sujeto humano o un animal y

- un metodo para promover la formacion de hueso, la regeneracion osea y/o la reparacion osea en un sitio con un defecto en un sujeto humano o un animal mediante la implantacion de un material compuesto de colageno- hidroxiapatita biomimetico.

Se puede usar un cuerpo en forma de membrana de material compuesto de colageno-hidroxiapatita biomimetico de la invencion en el que solo se reviste un lado con nanocristales de hidroxiapatita cultivados epitacticamente como implante para la regeneracion combinada de hueso y cartllago, el lado revestido que esta orientado de tal manera que esta frente al defecto del hueso y el lado no recubierto que esta orientado de tal manera que esta frente al defecto del cartllago.

La invencion por tanto tambien se refiere al uso de un cuerpo en forma de membrana de material compuesto de colageno-hidroxiapatita biomimetico como implante para la regeneracion combinada de hueso y cartllago.

La invencion se refiere ademas a un proceso para preparar el material compuesto de colageno-hidroxiapatita biomimetico definido anteriormente que comprende las etapas de:

a) sumergir una estructura de colageno al menos parcialmente fibroso que incluye fibras maduras nativas de colageno que poseen triple helicidad como se muestra por espectroscopla de dicrolsmo circular en una solucion acuosa saturada de Ca2+/HxPO4(3"x) saturado para llevar a cabo el proceso de formacion del material de implante compuesto, mediante el cual se forman nanocristales de hidroxiapatita cultivados epitacticamente sobre las fibras

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maduras nativas de colageno, los nanocristales cultivados epitacticamente que tienen la misma morfologla y el mismo tamano que el mineral oseo humano,

b) detener la formacion de nanocristales de hidroxiapatita cultivados epitacticamente mediante la separacion del material solido de la solucion acuosa, el lavado con agua y el secado, y

c) opcionalmente esterilizar el material seco separado procedente de la etapa b).

La estructura de colageno al menos parcialmente fibroso generalmente es una matriz de colageno derivado de un material natural o una matriz de colageno semi-artificial o artificial, que tiene una pre-forma compatible con la forma final deseada para el material compuesto biomimetico y un grado de reticulacion suficiente para las propiedades mecanicas deseadas del material compuesto biomimetico. Si es necesario, la preparacion de dicha estructura de colageno incluira una etapa para darle la pre-forma deseada y una etapa de reticulacion para darle una cohesion y una resistencia suficientes.

Antes de realizar la etapa a) la estructura de colageno al menos parcialmente fibroso generalmente se limpia en un alcohol tal como por ejemplo etanol e isopropanol y un eter tal como por ejemplo eter dietllico.

La solucion acuosa saturada de Ca2+/HxPO4(3-x) saturada puede ser una solucion de tampon fosfato (PBS) que contiene alfa-TCP, beta-TCP, TTCP, pentahidrato de fosfato de octacalcio, fosfato dicalcico o fosfato dicalcico dihidrato finamente dispersos. Dicha dispersion de un fosfato de calcio en una solucion de PBS permite que la solucion permanezca saturada en Ca2+/HxPO4(3-x) cuando los iones de Ca2 + y HxPO4(3-x) se consumen para formar hidroxiapatita.

La solucion acuosa saturada de Ca2+/HxPO4(3-x) saturada tambien puede ser una solucion de tampon fosfato a la que se anaden iones de Ca2+ y HxPO4(3-x) para compensar su consumo en la formacion de hidroxiapatita, por ejemplo, por goteo de una solucion que contiene dichos iones en el medio de reaccion.

La solucion de tampon fosfato generalmente tiene una concentracion de 0,1 a 1,0 M, en particular de 0,2 a 0,8 M.

El pH de la solucion acuosa saturada de Ca2+/HxPO4(3-x) saturada generalmente permanece durante la etapa a) dentro de un intervalo de 5,5 a 9,0, preferentemente de 6,5 a 8,0.

La etapa a) generalmente se lleva a cabo a temperatura entre 25 y 45 °C, preferentemente entre 35 °C y 42 °C.

La etapa a) se lleva a cabo durante un tiempo suficiente como para permitir el crecimiento epitactico de cantidades sustanciales de cristales de hidroxiapatita sobre las fibras maduras nativas de colageno. El crecimiento epitactico en efecto esta favorecido termodinamicamente dando la configuracion de energla mas baja, pero se necesita tiempo para que se establezca. En general, un tiempo suficiente es al menos aproximadamente 12 horas, preferentemente al menos aproximadamente 24 horas.

Esas condiciones de la etapa a), cerca de las condiciones de formacion de hueso en el cuerpo humano, permiten el crecimiento epitactico sobre fibras de colageno de nanocristales de hidroxiapatita que tienen la misma morfologla y tamano que el mineral oseo humano.

La etapa a) generalmente se lleva a cabo durante un tiempo al menos suficiente para que sobre las fibras maduras nativas de colageno este presente un recubrimiento cerrado de al menos una capa nanocristalina de hidroxiapatita: Ese tiempo se selecciona de acuerdo con las propiedades deseadas para el material de colageno-hidroxiapatita biomimetico, en particular, el numero deseado de capas nanocristalinas y la relacion en p/p de la estructura de colageno a las capas cultivadas epitacticamente de hidroxiapatita nanocristalina.

En la etapa b) la formacion de nanocristales de hidroxiapatita cultivados epitacticamente se detiene mediante la separacion del material solido de la solucion acuosa, el lavado con agua y el secado.

En general, se lleva a cabo una etapa c) opcional adicional de esterilizacion del material seco separado procedente de la etapa b).

Ventajas del material compuesto de colageno-hidroxiapatita biomimetico de la invencion

Gracias a la fuerte union epitactica, como en el hueso natural, entre la estructura de colageno y los nanocristales de hidroxiapatita, el material compuesto de colageno-hidroxiapatita biomimetico sintetico o parcialmente sintetico de la invencion tiene excelentes propiedades mecanicas, en particular una alta resistencia a la tension mecanica, en particular una alta resistencia a la torsion (al menos 30 Ncm, generalmente aproximadamente 60 Ncm), una alta resistencia a la compresion y una alta capacidad de recuperacion. Gracias a estas excelentes propiedades mecanicas, los cuerpos moldeados de material compuesto de colageno-hidroxiapatita biomimetico de la invencion son atornillables, especialmente en partes del cuerpo oseos, y tambien mantienen permanentemente el volumen bajo tension mecanica: Por lo tanto estan adaptados idealmente para la reparacion de defectos de huesos largos.

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El material compuesto de colageno-hidroxiapatita biomimetico de la invencion es colonizado facilmente por celulas formadoras de hueso con un bajo nivel de citotoxicidad (vease el ejemplo 4 d) a continuacion) y muestra excelentes propiedades de osteoconductividad y osteointegracion en el cuerpo humano, en particular gracias al hecho de que los nanocristales de hidroxiapatita tienen la misma morfologla y el mismo tamano que el mineral oseo humano, como se muestra por siguiente tabla 1:

Tabla 1

Comparacion del tamano y la morfologla de cristal de hidroxiapatita para el material compuesto de implante biomimetico de la invencion y mineral oseo humano

Ejes cristalograficos (grupo espacial hexagonal P63/m): Material compuesto de colageno-hidroxiapatita biomimetico de la invencion preparado a pH y temperatura fisiologica. Tamano del cristal + [nm] Mineral oseo humano natural Tamano del cristal + [nm]

a (1,0,0): 18 (± 4) 14-25

b (0,1,0): 18 (± 4) 14-25

c (0,0,1): 38 (± 8) 30-50

El analisis del tamano de cristal se ha realizado usando TEM (microscopla electronica de transmision), as! como el refinamiento de los datos de difraccion de rayos X mediante el metodo de Bragg y la tecnica de Warren-Averbach.

Los siguientes ejemplos ilustran la invencion sin limitar su alcance. La siguiente descripcion se comprendera mejor haciendo referencia a:

- La Figura 1 que representa una microfotografla MEB de la parte fibrosa de la estructura de colageno en forma de membrana del Ejemplo 1c), recubierta como se describe en el Ejemplo 3 b) con una concentracion de PBS 0,2 M durante un tiempo de reaccion del recubrimiento de 12 horas,

- La Figura 2 que representa una microfotografla MEB de la parte fibrosa de la estructura de colageno en forma de membrana del Ejemplo 1c), recubierta como se describe en el Ejemplo 3 b) con una concentracion de PBS 0,8 M durante un tiempo de reaccion del recubrimiento de 24 horas, y

- La Figura 3 que representa una microfotografla MEB de la parte fibrosa de la estructura en forma de membrana de colageno del Ejemplo 1c), recubierta como se describe en el Ejemplo 3 b), que ha sido colonizada con celulas similares a osteoblastos MG63.

Ejemplo 1 Preparacion de una estructura de colageno al menos parcialmente fibroso

a) Preparacion de una estructura de colageno fibroso cilindrico derivado de una preparacion de Bio-Gide® de piezas cilindricas de colageno seco compactado

Una membrana Bio-Gide® (Geistlich Pharma AG, Suiza) se tritura finamente usando un molino de ultracentrlfuga y se tamizo en un tamiz de 2,0 mm. Se puso 0,2 g del colageno tamizado en 5 ml del 99,9 % de etanol y la masa de colageno se puso con unas pinzas en un pocillo de una placa de 24 pocillos y se compacto con un cilindro de Teflon de 2,0 mm de diametro, despues se extrae del pocillo con una herramienta de ajuste de 2,0 mm de diametro y se seco durante 4 horas en una campana qulmica. Estas operaciones se realizaron 6 veces en paralelo para as! obtener 6 piezas cilindricas de colageno seco compactado.

Reticulacion de las piezas cilindricas de colageno seco compactado

3,571 ml de una solucion en etanol de EDC (clorhidrato de 1-etil-3-[3-dimetilaminopropil] carbodiimida) se pipetearon en un matraz volumetrico de 100 ml y el volumen se completo hasta 100 ml con el 99,9 % de etanol, despues se vertio en un matraz de extraccion de 200 ml en el que se anadieron las 6 piezas de colageno seco obtenido anteriormente. El etanol se evaporo durante 1 minuto a vacio en un desecador, y a continuacion, el desecador se puso a presion atmosferica. La mezcla se reticulo con agitacion a 110 rpm durante 10 minutos usando un agitador horizontal. La solucion de EDC se decanto y los cilindros de colageno se pusieron en un vaso de precipitados de 200 ml al que se anadieron 100 ml de PBS (solucion de tampon fosfato) y se eliminan durante 1 minuto a vacio. Los cilindros de colageno se limpiaron con 100 ml de PBS con agitacion a 50 rpm durante 5 minutos, y el PBS se decanto sin evaporacion a vacio. Este proceso se repitio 2 veces. Los cilindros de colageno se limpiaron con 100 ml del 99,9 % de etanol con agitacion a 50 rpm durante 5 minutos y el etanol se decanto sin evaporacion a vacio; el proceso se repite dos veces. Los cilindros de colageno se limpiaron con 100 ml de eter dietilico sin agitacion y se secaron durante 14 horas en una campana qulmica.

Se realizaron otros experimentos con un tiempo diferente (hasta 240 minutos) para la reaccion de reticulacion.

El % de fibras maduras nativas de colageno que poseen triple helicidad (como se muestra mediante espectroscopla de dicrolsmo circular) de la estructura de colageno cilindrica, como se determina por analisis de imagen utilizando el software Phenom Pro (FEI Phenom Pro Tabletop MEB S/N: 0342; Phenom Pro Suite V. 1.1.0.920; Phenom

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b) Preparacion de una estructura de colageno esponjoso cilindrico parcialmente fibroso derivada de una esponja de colageno de tipo I y tipo II

Preparacion de una esponja de colageno:

Se preparo una matriz de colageno extracelular esponjoso reabsorbible a partir de cartllago congelado de cerdos recien sacrificados por obtencion de la grasa, seguido de tratamiento basico y acido como se describe en el Ejemplo 1 de la patente EP-B1-810888. Por metodos inmunologicos se demostro que esa matriz contiene una mezcla de colageno de tipo I y tipo II.

Preparacion de piezas cilindricas de colageno esponjoso seco compactado

La matriz esponjosa se trituro finamente usando un molino de ultracentrlfuga y se tamizo en un tamiz de 2,0 mm. Se puso 0,2 g del colageno tamizado en 5 ml del 99,9 % de etanol y la masa de colageno se puso con pinzas en un pocillo de una placa de 24 pocillos y se compacta con un cilindro de Teflon de 2,0 mm de diametro, despues se extrae del pocillo con una herramienta de ajuste de 2,0 mm de diametro y se seco durante 4 horas en una campana qulmica.

Entrecruzamiento de las piezas cilindricas de colageno esponjoso seco compactado

Las piezas cilindricas de colageno esponjoso compactado seco obtenido anteriormente se reticularon con EDC, se limpio con PBS, etanol y eter dietllico, de forma analoga al proceso descrito anteriormente en a) para la estructura de colageno cilindrico fibroso. El % de fibras nativas maduras que poseen triple helicidad en la estructura de colageno esponjoso cilindrico parcialmente fibroso, segun lo determinado por el software de analisis de imagen Phenom Pro, en microfotograflas de MEB de 5000 aumentos, fue de aproximadamente el 5 %.

c) Preparacion de una estructura de colageno fibroso en forma de membrana derivada de Bio-Gide®

Una membrana Bio-Gide® (Geistlich Pharma AG, Suiza) se limpio con 100 ml del 99,9 % de etanol con agitacion a 50 rpm durante 5 minutos y el etanol se decanto sin evaporacion a vacio; el proceso se repite dos veces. A continuacion, la membrana de colageno se limpio con 100 ml de eter dietllico sin agitacion y se seco durante 14 horas en una campana quimica.

El % de fibras nativas maduras que poseen triple helicidad en la parte fibrosa, segun lo determinado por el software de analisis de imagen Phenom Pro en microfotograflas de MEB de 5000 aumentos, era aproximadamente del 100 %.

Ejemplo 2 Preparacion de un material sinterizado grueso de a-TCP

Para una mezcla de 500 g (peso en seco), se mezclaron 360 g de polvo de fosfato dicalcico anhidro, 144 g de polvo de carbonato de calcio y 220 ml agua desionizada durante 7 minutos a 500 rpm utilizando un agitador de laboratorio. La suspension del proceso de mezcla se transfirio inmediatamente a una copa de platino estable a alta temperatura. La copa de platino llena se coloca en un horno frio. El horno se calento a 1400 °C utilizando una velocidad de calentamiento de 60 °C por hora. El proceso de calentamiento se detuvo despues de 72 horas desconectando el horno. La muestra se enfrio hasta temperatura ambiente dentro del horno. El material a granel sinterizado (fase pura de a-Ca3(PO4)2) se retiro del horno y de la copa de platino. El producto a granel del proceso de sinterizado tenia un peso de 420 g (perdida de peso del 16,7 %).

El control de pureza de la fase se realizo mediante analisis de difraccion de rayos X en polvo.

Ejemplo 3 Recubrimiento de una estructura de colageno fibroso con cristales cultivados epitacticamente de hidroxiapatita nanocristalina en una solucion de PBS en presencia de una dispersion de particulas finas de a-TCP.

a) Recubrimiento de las piezas cilindricas de colageno fibroso obtenidas en el Ejemplo 1 a) Preparacion de una solucion de PBS 0,5 M: se preparan 100 ml de una solucion de NaH2PO4 ■ H2O 0,5 M (solucion A) disolviendo 6,9 g de NaH2PO4 ■ H2O en agua desionizada esteril a temperatura ambiente con agitacion a 250 rpm durante 30 minutos y a 600 rpm durante 4 horas. Se preparan 100 ml de una solucion de Na2HPO4 ■ 2H2O 0,5 M (solucion B) disolviendo 8,9 g de Na2HPO4 ■ 2H2O en agua desionizada esteril a temperatura ambiente con agitacion a 250 rpm durante 30 minutos y a 600 rpm durante 4 horas. Se mezclaron 19 ml de la solucion A con 81 ml de la solucion B, para dar una solucion de PBS 0,5 M que tiene un pH entre 7,3 y 7,4.

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Trituracion de a-TCP en particulas finas: El producto a granel del Ejemplo 2 se trituro utilizando una trituradora de mandlbulas (tamano de ranura de 4 mm) Los granulos gruesos se tamizaron usando una maquina de tamizado e insertos de tamiz con una abertura de malla de 2 mm y 0,25 mm. Los granulos tamizados se molieron adicionalmente utilizando un molino planetario hasta un tamano final de menos de 10 pm.

Recubrimiento de los cilindros de colageno fibroso obtenidos en el Ejemplo 1 a) con cristales cultivados epitacticamente de hidroxiapatita nanocristalina:

5 g de particulas finas de a-TCP y 100 ml de una solucion de PBS 0,5 M obtenida como se ha descrito anteriormente y los cilindros de colageno fibroso obtenidos en el Ejemplo 1 a) se anadieron a una botella de pesaje de vidrio que se puso en un desecador a vaclo durante 5 minutos, y a continuacion, a presion atmosferica. La reaccion del recubrimiento se llevo a cabo con agitacion a 37 °C durante 3 dlas al poner la botella en un agitador horizontal operado a 5-50 rpm en un compartimento termostatico.

La observacion visual mostro que la estructura de colageno retiene su forma cillndrica pero estaba cubierta con una sustancia cristalina blanca.

Otros experimentos de recubrimiento de los cilindros de colageno fibroso obtenidos en el Ejemplo 1 a)

Se realizaron otros experimentos de recubrimiento de los cilindros de colageno fibroso obtenidos en el Ejemplo 1 en el extremo de a) variando la concentracion de la solucion de PBS de 0,2 M a 0,8 M y el tiempo de reaccion del recubrimiento de 12 horas a 4 dlas. La observacion visual mostro que la estructura del colageno retiene su forma cillndrica pero estaba cubierta con una sustancia cristalina blanca.

El analisis MEB mostro que el crecimiento de los cristales, asi como el tamano, la morfologia y el habito de los ensamblajes de cristal de hidroxiapatita se pueden controlar variando la concentracion de la solucion de PBS y el tiempo de reaccion del recubrimiento. En los experimentos anteriores la relacion en p/p de la estructura de colageno fibroso a los cristales cultivados epitacticamente de hidroxiapatita nanocristalina en los cilindros de colageno fibrosos recubiertos fue de 90/10 a 30/70.

b) Recubrimiento de la estructura de colageno esponjoso cilindrico parcialmente fibroso obtenido en el Ejemplo 1) b) y la estructura de colageno fibroso en forma de membrana obtenida en el Ejemplo 1 c) con cristales cultivados epitacticamente de hidroxiapatita nanocristalina:

Se llevaron a cabo experimentos de recubrimiento de los cilindros de esponja de colageno cilindrico parcialmente fibroso obtenidos en el Ejemplo 1 b) o el recubrimiento de la parte fibrosa de la estructura de colageno fibroso en forma de membrana del Ejemplo 1c), variando la concentracion de la solucion de PBS de 0,2 M a 0,8 M y el tiempo de reaccion del recubrimiento de 12 horas a 4 dias.

La observacion visual mostro que la estructura de colageno retuvo su forma pero estaba cubierta con una sustancia cristalina blanca.

El analisis MEB mostro que el crecimiento de los cristales, asi como el tamano, la morfologia y el habito de los ensamblajes de cristal de hidroxiapatita se pueden controlar variando la concentracion de la solucion de PBS y el tiempo de reaccion del recubrimiento. En los experimentos anteriores la relacion en p/p de la estructura de colageno fibroso a los cristales cultivados epitacticamente de hidroxiapatita nanocristalina fue de 90/10 a 30/70 para los cilindros de esponja de colageno parcialmente fibrosos revestidos obtenidos en el Ejemplo 1b) y de 90/10 a 50/50 para la estructura de colageno en forma de membrana recubierta.

Ejemplo 4 Propiedades de la estructura de colageno al menos parcialmente fibroso recubierto con cristales de hidroxiapatita nanocristalina cultivados epitacticamente

a) Propiedades fisico-auimicas:

La porosidad medida (volumen de poros) fue del 96 % en v/v para las piezas cilindricas de colageno fibroso obtenidas en el Ejemplo 1a) (variando las condiciones de reticulacion) y del 85 al 95 % en v/v para las piezas cilindricas recubiertas de hidroxiapatita obtenidas en el Ejemplo 3) a).

La superficie especifica medida por porosimetria de mercurio fue de 1,5 a 2,5 m2/g para las piezas cilindricas de colageno fibroso obtenido en el Ejemplo 1a) (variando las condiciones de reticulacion) y de 20 a 60 m2/g para las piezas cilindricas recubiertas de hidroxiapatita obtenidas en el Ejemplo 3) a).

La porosidad medida (volumen de poros) era de aproximadamente el 96 % en v/v para la estructura cillndrica de esponja de colageno preparada en el Ejemplo 1 b) y del 88 al 92 % para los cilindros de esponja de colageno recubierta de hidroxiapatita obtenidos en el Ejemplo 3 b). La superficie especifica medida por porosimetria de mercurio fue de 2 m2/g para la estructura cillndrica de esponja de colageno preparada en el Ejemplo 1 b) y de 25 a

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b) Propiedades mecanicas:

b1) Resistencia a la compresion

La resistencia a la compresion (resistencia a la presion), es decir, la presion maxima que se aplicara para una compresion de los cilindros del 50 % de su altura original, se midio utilizando una maquina de ensayo de compresion mecanica (Proline Z010 fabricada por Zwick/Roell).

La resistencia a la compresion medida en estado humedo fue de 0,3 a 0,7 MPa para las piezas cillndricas de colageno fibroso obtenidas en el Ejemplo 1a) (variando las condiciones de reticulacion) y de 1,1 a 3,5 MPa para las piezas cillndricas recubiertas de hidroxiapatita obtenidas en el Ejemplo 3) a), la resistencia a la compresion aumenta con el % de hidroxiapatita presente en las piezas cillndricas recubiertas de hidroxiapatita.

b2) Resiliencia

La capacidad de recuperacion, es decir, el % de la altura original, recuperada despues de la compresion al 50 % de su altura original, se midio utilizando una maquina de ensayo de compresion mecanica (Proline Z010 fabricada por Zwick/Roell).

La resistencia medida en el estado humedo fue del 95 al 99 % para las piezas cillndricas de colageno fibroso obtenidas en el Ejemplo 1a) (variando las condiciones de reticulacion) y del 92 al 100 % de las piezas cillndricas con recubrimiento de hidroxiapatita obtenidas en el Ejemplo 3) a), el % de hidroxiapatita presente en esas piezas recubiertas de hidroxiapatita que parece no influir en la capacidad de recuperacion.

b3) Resistencia a la torsion

Se utilizo un protocolo similar al Metodo de fijacion de bloque oseo Straumann® (cf.
http://www.straumann.ch/ch- index/products/products-biologics/products-bone-block-fixation.htm).

En resumen, usando un perforador para hacer un agujero de 0,9 mm en un cilindro de Teflon (que tiene propiedades mecanicas comparables a las del hueso maxilar inferior de cerdo) y en algunas de las piezas cillndricas secas de colageno fibroso obtenido en el Ejemplo 1a) (variando las condiciones de reticulacion) y algunas de las piezas cillndricas recubiertas de hidroxiapatita seca obtenidas en el Ejemplo 3) a), 2, y un destornillador magnetico (Klinge FTI Mikro Schr Kreuzschl, Ref. 75.23.19 disponible en Medicon) que comprende un tornillo de 1,5 x 12 mm, se midio el par maximo al que se pueden atornillar las piezas cillndricas al cilindro de Teflon sin romperse.

Todas las piezas cillndricas sin recubrimiento analizadas de colageno fibroso obtenido en el Ejemplo 1a mostraron una resistencia a la torsion de 20 Ncm, mientras que todas las piezas cillndricas recubiertas de hidroxiapatita analizadas obtenidas en el Ejemplo 3) a) mostraron una resistencia al par de torsion de mas de aproximadamente 60 Ncm, el % de hidroxiapatita presente en esas piezas recubiertas de hidroxiapatita que no parece influir en la resistencia a la torsion. Una resistencia a la torsion de aproximadamente 30 Ncm generalmente en la tecnica se considera suficiente para atornillar una pieza a una parte del cuerpo oseo.

El aumento drastico en la resistencia al par se debido a la fuerte union epitactica entre la hidroxiapatita y la estructura de colageno.

De hecho, en experimentos comparativos realizados sobre las estructuras de colageno reticulado donde de acuerdo con las condiciones de la hidroxiapatita de la tecnica anterior se precipitaba sobre o dentro de la estructura de colageno y por tanto estaban debilmente unidas a este ultimo por adsorcion, la resistencia a la torsion no aumento significativamente.

c) Morfologia del ensamblaje de cristal de hidroxiapatita como se determina por MEB

Las Figuras 1 y 2 representan microfotograflas de MEB de la parte fibrosa de la estructura de colageno en forma de membrana del Ejemplo 1c) recubierta como se describe en el Ejemplo 3 b) con una concentracion de PBS de 0,2 M para un tiempo de reaccion del recubrimiento de 12 horas y colageno 0,8 M para un tiempo de recubrimiento de 24 horas.

En la Figura 1 se pueden observar pequenos ensamblajes de cristales de hidroxiapatita de plaquetas de cristal de tamano nanometrico finamente distribuidas con simetrla hexagonal estrechamente interconectadas a fibrillas de colageno y en la Figura 2 pequenos agregados similares a rosetas de tamano micrometrico de los ensamblajes de cristales de hidroxiapatita hexagonales que cubre por completo la estructura de las fibras de colageno.

d) Ensayos de colonizacion de celulas formadoras de hueso

Se mostro que las celulas MG63 similares a osteoblastos humanos colonizan con una alta tasa de proliferacion todos los sitios de la estructura de colageno en forma de membrana recubierta obtenida en el Ejemplo 3 b). Vease la 5 Figura 3.

En ensayos de citotoxicidad, la estructura de colageno en forma de membrana recubierta obtenida en el Ejemplo 3 b) mostro resultados comparables a los obtenidos con la membrana Bio-Gide®.

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REIVINDICACIONES

1. Material compuesto de colageno-hidroxiapatita biomimetico que comprende una estructura de colageno al menos parcialmente fibroso que incluye fibras maduras nativas de colageno que poseen triple helicidad como se muestra por espectroscopla de dicrolsmo circular, en el que dichas fibras maduras nativas de colageno estan al menos parcialmente cubiertas con cristales cultivados epitacticamente de hidroxiapatita nanocristalina, con lo que los nanocristales cultivados epitacticamente tienen la misma morfologla que el mineral oseo humano y son del mismo tamano que el mineral oseo humano, es decir, una longitud de 30 a 50 nm y una anchura de 14 a 25 nm y en el que los cristales cultivados epitacticamente de hidroxiapatita nanocristalina forman una capa que tiene una espesor de al menos 30 ± 15 nm, determinado por analisis de difraccion de rayos X.
2. Un material compuesto de colageno-hidroxiapatita biomimetico segun la reivindicacion 1, en el que la estructura de colageno al menos parcialmente fibroso comprende en su superficie externa al menos el 2 % de fibras maduras nativas de colageno como se determina por analisis de imagen en microfotograflas de MEB y espectroscopla de dicrolsmo circular.
3. Un material compuesto de colageno-hidroxiapatita biomimetico segun la reivindicacion 1, en el que la estructura de colageno al menos parcialmente fibroso comprende en su superficie externa al menos el 10 % de fibras maduras nativas de colageno como se determina por analisis de imagen en microfotograflas de MEB y espectroscopla de dicrolsmo circular.
4. Un material compuesto de colageno-hidroxiapatita biomimetico segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 en el que la relacion en p/p de la estructura de colageno fibroso a los cristales cultivados epitacticamente de hidroxiapatita nanocristalina esta entre 5:95 y 95:5, preferentemente entre 10:90 y 90:10.
5. Un material compuesto de colageno-hidroxiapatita biomimetico segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que es un cuerpo conformado.
6. Un cuerpo conformado de la reivindicacion 5 que es un material de sustitucion osea, cuya estructura tiene el perfil de una parte del cuerpo oseo.
7. Un cuerpo conformado de la reivindicacion 5 o 6, que tiene una resistencia a la torsion de al menos 30 Ncm, en estado seco.
8. Un material compuesto de colageno-hidroxiapatita biomimetico segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que se encuentra en forma de membrana.
9. Un proceso de preparacion del material compuesto de colageno-hidroxiapatita biomimetico de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 que comprende las etapas de

a) sumergir una estructura de colageno al menos parcialmente fibroso que incluye fibras maduras nativas de colageno que poseen triple helicidad como se muestra por espectroscopla de dicrolsmo circular en una solucion acuosa saturada de Ca2+/HxPO4(3'x) saturada, que es una solucion de tampon fosfato (PBS) que contiene alfa- TCP, beta-TCP, TTCP, pentahidrato de fosfato de octacalcio, fosfato dicalcico o fosfato dicalcico dihidratado finamente dispersos, para llevar a cabo el proceso de formacion del material compuesto de implante con lo que se forman nanocristales de hidroxiapatita cultivados epitacticamente sobre aquellas fibras maduras nativas de colageno, nanocristales de hidroxiapatita crecidos epitacticamente que tienen la misma morfologla y el mismo tamano que el mineral oseo humano,

b) detener el proceso de formacion del material compuesto de implante por la separacion del material solido de la solucion acuosa, el lavado con agua y el secado, y

c) opcionalmente esterilizar el material separado procedente de la etapa b).
10. Un proceso de la reivindicacion 9 en el que en la etapa b) el pH de la solucion acuosa se mantiene dentro de un intervalo de 5,5 a 9,0.
11. Un proceso de la reivindicacion 9 en el que en la etapa b) el pH de la solucion acuosa se mantiene dentro de un intervalo de 6,5 a 8,0.
12. Un proceso de la reivindicacion 9 o 10 en el que la temperatura en la etapa b) se encuentra entre 25 y 45 °C.
13. Un proceso de la reivindicacion 9 o 10 en el que la temperatura en la etapa b) se encuentra entre 35 °C y 42 °C.
14. Un material compuesto de colageno-hidroxiapatita biomimetico segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 para su uso como implante o protesis para la formacion de hueso, la regeneration osea, la reparation osea y/o la sustitucion del hueso en un sitio con un defecto en un sujeto humano o un animal.
15. Un material compuesto de colageno-hidroxiapatita biomimetico en forma de membrana de acuerdo con la reivindicacion 8 para su uso como implante para la regeneracion combinada de hueso y cartllago.